人冠状动脉平滑肌细胞（共7篇）
人冠状动脉平滑肌细胞 篇1
摘要：目的研究三磷酸腺苷 (ATP) 敏感性钾 (KATP) 通道与人肺动脉平滑肌细胞外信号调节激酶1和2 (ERK1/2) 磷酸化的关系。方法原代培养人肺动脉平滑肌细胞, 用Western-blot方法检测磷酸化细胞外信号调节激酶1和2 (p-ERK1/2) 。对照组不予干预, 实验组分别加入内皮素-1 (ET-1) 、ET-1+埃他卡林、吡那地尔或格列本脲等孵育。结果①在2～30 min, ET-1呈时间依赖性促进人肺动脉平滑肌细胞ERK1/2磷酸化, 10 min时最明显。②埃他卡林和吡那地尔可拮抗ET-1对ERK1/2磷酸化的影响。③特异性KATP通道阻断剂格列本脲可逆转埃他卡林和吡那地尔的作用。结论KATP通道开放剂可能通过激活KATP通道, 抑制ET-1诱导的原代培养人肺动脉平滑肌细胞ERK1/2磷酸化, KATP通道可能是研发新型治疗肺动脉高压药物的重要靶分子。
关键词：ATP敏感性钾通道,人肺动脉平滑肌细胞,细胞外信号调节激酶1和2,磷酸化
肺动脉平滑肌细胞由中膜向内膜迁移, 增殖凋亡失衡, 表型由收缩型向合成型转变, 血管壁不适重构, 最终导致肺动脉高压。研究表明活化的细胞外信号调节激酶1和2 (extracellular signal regulated kinase 1/2, ERK1/2) 在血管平滑肌细胞的增殖和调节平滑肌细胞的表型中起重要作用[1,2]。ERK1/2信号转导通路激活主要介导细胞的增殖、分化、迁移等[3,4], 可能在肺动脉重构中起重要作用。
三磷酸腺苷 (ATP) 敏感性钾 (KATP) 通道是一类在体内广泛分布的内向整流性钾通道 (inwardly rectifying potassium channel, Kir) , 是由Kir6.x家族和磺酰脲受体 (sulfonylurea receptor, SUR) 家族组成的异源性八聚体 ([SUR/Kir6.x]4) 。研究表明, 肺动脉平滑肌细胞膜KATP通道是肺血管内皮细胞分泌的多种舒缩血管物质的共同作用环节[5], 可能是研发新型治疗肺动脉高压药物的重要靶分子。本课题组先前的研究结果显示, KATP通道开放剂可通过开放KATP通道抑制肺动脉平滑肌细胞增殖[6,7,8,9]。但其作用的分子生物学机制不甚明了。本研究应用Western-blot技术检测ERK1/2磷酸化产物, 了解KATP通道与肺动脉平滑肌细胞ERK1/2磷酸化之间的关系, 探讨KATP通道开放剂抑制内皮素-1 (ET-1) 诱导的人肺动脉平滑肌细胞增殖的分子生物学机制。
1 材料和方法
1.1 药品和试剂
ET-1 (Sigma公司, 美国) 和埃他卡林 (iptakalim, IPT, 军事医学科学院药理和毒理研究所研制合成) 生理盐水配制;格列本脲 (glibenclamide, GLI, Sigma公司, 美国) 生理盐水配制后再用氢氧化钠10 μmol/L滴定pH值为8.5;吡那地尔 (pinacidil, PIN, Sigma公司, 美国) , 二甲基亚砜和生理盐水按1∶3配制;胎牛血清 (FBS) (GIBCO公司, 美国) , M231、平滑肌细胞生长因子 (SMGS) (Cascade公司, 美国) 。磷酸化ERK1/2 (p-ERK1/2) 和ERK1/2一抗均为多克隆兔抗人抗体 (CST公司, 美国) , 二抗为辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的多克隆羊抗兔抗体 (CST公司, 美国) , 电化学发光 (ECL) 液 (Pierce公司, 美国) , 放射免疫沉淀测定 (RIPA) 裂解液、二羧基联喹啉二钠 (BCA) 蛋白浓度测定试剂盒 (上海碧云天生物技术有限公司) , α-肌动蛋白单克隆鼠抗人抗体 (福州迈新生物技术有限公司) 。
1.2 方法
1.2.1 原代培养人肺动脉平滑肌细胞:
在无菌条件下取因各种原因行肺叶切除术的非肺动脉高压患者肺叶 (经医院医学伦理委员会批准及患者知情同意) , 分离正常肺组织中3～4级肺小动脉, 立即置入磷酸盐缓冲液 (PBS) (NaCl 138.0 mmol/L, KCl 5.0 mmol/L, Na2HPO4 0.3 mmol/L, KH2PO4 0.3 mmol/L, NaHCO3 4.0 mmol/L, 含Pinicilin 105 U/L和Streptonycin 100 mg/L) 。去除血管内外膜, 按组织贴块法, 将血管平滑肌层剪成1 mm3 大小, 置于含20%FBS的M231培养液的培养瓶中, 37 ℃ 5%CO2孵箱 (Thermo Scientific Forma公司, 美国) 培养, 每周换液2次, 0.25%胰蛋白酶消化传代后用含10% FBS的M231培养液培养, 取4～6代为实验用细胞。
1.2.2 人肺动脉平滑肌细胞鉴定:
在倒置相差显微镜下, 肺动脉平滑肌细胞融合呈梭形重叠生长, 呈现典型的“谷与峰”样特征。α-actin细胞荧光免疫染色阳性。无内皮细胞、成纤维细胞污染。
1.2.3 细胞总蛋白提取及Western-blot检测:
用RIPA裂解液裂解各组细胞, 提取总蛋白, 用BCA法测各组蛋白浓度, 每个泳道加入总蛋白90 μg, 进行70 V恒压电泳, 经湿转印迹到二氟化树脂 (PVDF) 膜 (Amresco公司, 美国) , 5%BSA-TBST 4 ℃封闭过夜, 分别加入p-ERK1/2和ERK1/2多克隆兔抗人抗体 (1∶1000稀释) , 4 ℃孵育过夜, 再加入HRP标记的多克隆羊抗兔抗体IgG (1∶1000稀释) , 37 ℃孵育40 min, TBST洗涤, ECL化学发光试剂自显影, p-ERK1/2相对含量用p-ERK1/2与ERK1/2灰度比值表示。
1.3 分组
1.3.1 ET-1对ERK1/2磷酸化的影响:
将实验用细胞在不含FBS的M231培养液孵育24 h, 同步化后随机分为:对照1 (不予干预) ;ET-1组:培养液中加入ET-1 10 nmol/L, 分别孵育1、2、5、10、30、60 min。
1.3.2 IPT对ET-1诱导的ERK1/2磷酸化的影响:
实验用细胞在不含FBS的M231培养液孵育24 h, 同步化后随机分为:对照2 (不予干预) ;A组:培养液中加入ET-1 10 nmol/L+ IPT 10 μmol/L , 分别孵育1、2、5、10、30、60 min。
1.3.3 GLI对IPT和PIN作用的影响:
实验用细胞在不含FBS的M231培养液孵育24 h, 同步化后随机分为:对照3 (不予干预) ;B组:培养液中加入ET-1 10 nmol/L;C组:培养液中加入ET-1 +PIN 10 μmol/L;D组:培养液中加入ET-1 + IPT 10 μmol/L;E组:培养液中加入ET-1 + PIN + GLI 10 μmol/L;F组:培养液中加入ET-1 + IPT + GLI 。B、C、D、E、F组分别孵育10 min。
1.4 统计学处理
实验数据均以均数±标准差undefined表示, 使用SPSS 13.0软件进行统计分析, 各组间差异比较采用方差分析, 各实验组间两两比较采用q检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
ET-1组在第2、5、10、30 min时, p-ERK/ERK灰度比值明显高于对照1 (P<0.05) , ET-1呈时间依赖性促进ERK1/2磷酸化, 10 min时达到高峰。第1 min和第60 min p-ERK/ERK灰度比值与对照1比较差异无统计学意义 (P>0.05) 。 IPT 10 μmol/L非时间依赖性地抑制ET-1诱导的ERK1/2磷酸化, A组各时间点ERK1/2磷酸化水平与对照2比较差异无统计学意义 (P>0.05) 。见表1。
在本实验条件下, 特异性KATP通道阻断剂GLI可拮抗IPI和PIN对ET-1诱导的ERK1/2磷酸化的影响, 即E组、F组p-ERK/ERK灰度比值分别与对照3、C组、D组比较差异均有统计学意义 (P<0.05) , 与B组比较差异均无统计学意义 (P>0.05) ;C组和D组分别与B组比较, 差异均有统计学意义 (P<0.05) , D组与C组比较差异无统计学意义 (P >0.05) , 见表2。
注:与对照1比较, *P<0.05;与10 min时比较, △P<0.05
注:与对照3比较, *P <0.05;与B组比较, #P <0.05
3 讨论
ERK1/2是一种进化高度保守的蛋白, 是多种生长因子如表皮生长因子 (EGF) 、神经生长因子 (NGF) 、血小板源性生长因子 (PDGF) 等的下游蛋白, 在所有的真核细胞中都表达。ERK1/2通路通过以下4条途径激活:①受体酪氨酸激酶对Ras的激活:生长因子受体→酪氨酸激酶→Ras→Raf (MAPKKK) →MAPKK→ERK1/2。②Ca2+对Ras的激活:Ca2+可通过不同的作用机制激活Ras。③蛋白激酶C (PKC) 对ERK1/2通路的活化:PKC的同工酶可通过不同的机制调节ERK1/2的活性。④鸟嘌呤核苷酸结合蛋白 (G蛋白) 耦联受体对ERK1/2通路的激活:G蛋白耦联受体可通过Ras依赖性的和Ras非依赖性的通路激活ERK1/2[10]。ERK1/2被激活后, 转位进入核内, 引起下游转录因子如Jun、Fos或Ets等的激活, 这些转录因子是细胞由G0期向G1期转变所必需的。ERK1/2活化被阻断后, bcl-2 (一种抗凋亡蛋白) 的表达减少, 引起凋亡增加[1]。
研究表明, 活化的ERK1/2在血管平滑肌细胞的增殖中起到重要作用。ERK1/2除了作用于平滑肌细胞的增殖和凋亡外, 还可调节平滑肌细胞的表型改变。血管平滑肌细胞具有2种表型:收缩型和合成型。正常情况下, 这2种细胞维持着一定的比例, 病理状态下, 这种平衡被打乱。在肺动脉重构过程中, 平滑肌细胞表型转变起到了至关重要的作用, 血管受损后, 平滑肌细胞由收缩型转化为合成型, 内质网和高尔基复合体等合成型细胞器增多, 细胞外基质成分随之增多[1], 加之平滑肌细胞向内膜迁移、过度增殖, 最终导致肺动脉高压。
钾通道在肺动脉高压的发生发展中发挥了重要作用。人肺血管平滑肌细胞存在钾通道, 包括: (1) KATP通道; (2) 电压依赖性钾 (Kv) 通道; (3) Kir通道; (4) Ca2+激活性钾 (Kca) 通道。其中, KATP通道是一类在体内广泛分布的Kir通道, 血管平滑肌由SUR2B 和Kir6.1或Kir6.2形成, 但SUR2B/Kir6.1的功能占主导地位。KATP通道只在病理情况下代偿性开放, 参与调节肺动脉平滑肌细胞的收缩、增殖[11,12,13]。
ET-1是导致肺动脉高压时肺动脉平滑肌细胞收缩、增殖和肺动脉重构的重要血管活性物质之一。低氧直接或通过ET-1抑制肺动脉平滑肌细胞膜钾通道功能, 使细胞膜去极化, 激活电压依赖性钙通道, 肌浆网钙储释放Ca2+, 细胞内游离Ca2+升高, 进一步促进肺动脉平滑肌细胞增殖[7]。本实验应用ET-1成功建立了人肺动脉平滑肌细胞体外培养的增殖模型。结果表明在2～30 min, ET-1呈时间依赖性促进人肺动脉平滑肌细胞ERK1/2磷酸化, 再进一步促进人肺动脉平滑肌细胞增殖、迁移和细胞表型的转变, 于10 min时最明显。而KATP通道开放剂IPT和PIN在浓度均为10 μmol/L时可明显抑制ET-1 (10 nmol/L) 诱导的人肺动脉平滑肌细胞ERK1/2磷酸化, 且IPT (10 μmol/L) 非时间依赖性地抑制ET-1 诱导的ERK1/2磷酸化, 表明KATP通道开放剂可激活肺动脉平滑肌细胞膜KATP通道, 使K+外流增加, 细胞膜超极化或复极化, 抑制电压依赖性钙通道的开放;减少Ca2+从胞浆池释放;降低细胞内游离Ca2+[7], 抑制ERK1/2磷酸化, 减少c-myc、c-fos和生长因子的表达, 进一步抑制肺动脉平滑肌细胞增殖、迁移和细胞表型的转变。特异性KATP通道阻断剂GLI浓度为10 μmol/L时可完全逆转IPT 10 μmol/L和PIN 10 μmol/L的作用, 说明IPT和PIN均是一种KATP 通道开放剂, 均通过激活KATP通道发挥作用。
本课题组先前的研究结果证实新型KATP通道开放剂IPT和经典KATP通道开放剂PIN均通过激活KATP通道, 抑制ET-1诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖[7]。本研究结果显示, ET-1可激活人肺动脉平滑肌细胞ERK1/2信号转导通路, 呈时间依赖性促进ERK1/2磷酸化;KATP通道开放剂IPT和PIN拮抗ET-1对ERK1/2磷酸化的作用, 抑制人肺动脉平滑肌细胞ERK1/2信号转导通路;特异性KATP通道阻断剂GLI可拮抗IPT和PIN的作用。因此, KATP通道开放剂可能通过激活人肺动脉平滑肌细胞KATP通道, 减少ERK1/2磷酸化, 抑制人肺动脉平滑肌细胞增殖、迁移和细胞表型的转变, 减轻肺动脉重构。KATP通道可能是研发新型治疗肺动脉高压药物的重要靶分子。
人冠状动脉平滑肌细胞 篇2
1 材料与方法
1.1 动物分组和预处理
选用4～6月龄,质量为25～35 kg的小型猪6只,随机分为TES组和BES组,手术前1 d给予阿司匹林300 mg、氯吡格雷300 mg顿服。
1.2 支架和涂层
TES组的TES是由金属裸支架(BMS)经喷涂川芎嗪单体(四甲基砒嗪纯度为99%,购于上海华美制药厂)制成,为双涂层,其内层为甲基丙烯酸甲酯共聚物及川芎嗪颗粒,质量比为50∶50,涂层厚度为210～310 μm,含川芎嗪200 μg,外层为聚乙醇酸(PGA)。BMS组采用相同结构金属裸支架。两组支架均为不锈钢316 L金属管形网状支架,支架大小均为(2.5～3.0)/16 mm。
1.3 冠脉内支架植入
猪术前予氯胺酮12 mg·kg-1肌肉注射基础麻醉,3%戊巴比妥钠20 mg·kg-1术前和术中间断静脉注射强化麻醉。备皮及皮肤消毒后穿刺股动脉,插入6 F动脉鞘,注入肝素150～200 U·kg-1,常规行冠状动脉造影,为避免局部药物释放干扰,对同一头猪左前降支中段及回旋支各植入2枚相同类型的支架,支架球囊与血管直径比值为(1.1～1.2)∶1,10～15 atm(1 atm=101.325 kPa)扩张30 s,形成冠状动脉狭窄模型[2]。术后每日喂阿司匹林100 mg、氯吡格雷75 mg,并予普通饮食喂养。
1.4 支架内再狭窄的分析
术后第28天行冠状动脉造影后处死动物,剥离冠状动脉,固定24 h后切片、染色。对内膜、中膜和外膜进行组织学分析,应用计算机图像分析系统测定血管狭窄程度。
1.5 免疫组化测定增殖细胞核抗原(PCNA)
组织切片脱蜡至水,用3%H2O2灭活内源性过氧化物酶,PBS洗涤,置入柠檬酸盐缓冲液中放入微波炉,95 ℃维持10 min。滴加1∶50稀释的鼠抗人PCNA(DaKo公司产品)4 ℃过夜,PBS洗涤后滴加EnVision TM试剂(DaKo公司产品),37 ℃放置30 min,PBS洗涤,滴加0.05% DAB后再加0.01% H2O2,显色5～15 min,镜下控制终止显色反应。最后苏木素衬染,常规脱水,封片镜检。每个标本观察8个高倍镜视野,计数阳性细胞数占总观察细胞数的百分比。
1.6 TUNEL法测定VSMC凋亡
组织切片常规脱蜡,加入蛋白酶K(20 U·ml-1),消化后洗涤,滴加TUNEL标记液(Roche公司产品),TdT酶和荧光素标记的dUTP混合液(1∶29),37 ℃湿盒中孵育1 h,PBS洗涤。缓冲甘油封片,置荧光显微镜下观察。计算VSMC的凋亡数(取10个视野的平均值)。
1.7 统计学方法
两组数值均采用undefined表示,两组间用独立样本t检验,用SPSS 12.0统计软件进行分析。
2 结果
2.1 支架植入情况
6只猪均成功在左前降支及左回旋支冠状动脉中段各植入支架2枚,支架植入术后即刻行冠状动脉造影证实管腔通畅,无充盈缺损、管壁夹层、栓塞、支架移位或远端冠状动脉痉挛,无急性血栓形成。所有动物均顺利完成术后第28天的复查。
2.2 支架植入第28天冠状动脉内膜增殖情况
见表1。TES组与BMS组相比,支架内面积无显著差异。但管腔面积、新生内膜面积、平均面积狭窄百分比两组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。
2.3 PCNA及平滑肌细胞凋亡情况比较
TES组内膜PCNA阳性率较BMS组明显减少[(17.00±2.28)% vs (22.83±1.94)%],差异有统计学意义(P<0.01),见图1。TES组较BMS组单位面积内VSMC凋亡数明显增加[(16.67±3.88)vs (6.33±2.42)],差异有统计学意义(P<0.01),见图2。
3 讨论
川芎嗪是中药川芎(ligusticum Chuanxiong)的有效成分四甲基吡嗪,它具有多种药理作用,可以与其它中药组成方剂,广泛用于高血压、冠心病等的防治。已有临床试验证实,PCI术后经6～12个月随访,口服芎嗪组再狭窄发生率明显低于对照组,提示口服芎嗪具有防治PCI术后再狭窄的良好临床效果[3]。动物实验亦显示,TES组与BMS组相比,新生内膜面积明显减少,管腔面积明显增大,TES能抑制内膜增殖,无致栓性,具有良好的生物相容性[4]。PCI术后由于内皮损伤,VSMC增殖并呈激活状态,细胞凋亡减少,PCNA、Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、血小板源生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、Bcl-2和c-myc的表达增高,而Bax表达降低。血管内皮损伤后VCMC的迁移、增殖、凋亡及细胞外基质的分泌和堆积,受到多种细胞因子、生长因子和基因调控的介导,参与了局部血管重建和再塑过程[5]。而川芎嗪具有典型钙离子拮抗剂的特性,通过拮抗Ca2+,降低细胞内钙调蛋白(CaM)、钙调神经磷酸酶(CaN)活性,干预CaN依赖的信号转导途径,进而下调细胞内c-myc、PCNA表达水平,从而显著抑制VSMCs增殖[6]。c-myc基因表达DNA结合蛋白,可促进与细胞增殖有关的基因开放,从而产生细胞增殖效应,c-myc基因的激活被认为是增殖的始动环节之一,而川芎嗪能够抑制凝血酶诱导的VSMC表达c-myc基因[7]。川芎嗪通过抑制VSMC Ⅰ型和Ⅳ型胶原、FGF、PDGF表达,抑制c-myc基因表达,达到抑制VSMC增殖的作用[8]。VSMC迁移增殖的前提是局部基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)活性增强,降解VSMC周围的细胞外基质。MMP的活性可被组织型金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases,TIMPs)所抑制,局部过表达TIMP可以抑制新生内膜的形成[9]。而川芎嗪具有提高受损动脉管壁TIMP-1 mRNA表达的作用,因此推测川芎嗪通过增加受损动脉管壁TIMP-1 mRNA表达来提高TIMP-1含量,拮抗MMPs对细胞外基质的降解,从而在早期抑制新生内膜的形成[10]。平滑肌细胞中骨桥蛋白mRNA的表达量与平滑肌细胞的迁移能力有密切关系,PDGF刺激了骨桥蛋白mRNA高表达,其中PDGF-BB作用是最强的,川芎嗪也可以通过下调PDGF-BB刺激的骨桥蛋白mRNA的表达,削弱VSMC的迁移能力而防治PCI后再狭窄的发生[11]。本实验亦证实,内膜PCNA阳性率TES组较BMS组明显减少,提示TES可以抑制新生内膜VSMC的增殖及迁移。
支架植入的早期VSMC增殖活性较高,后期伴随VSMC的持续增殖,逐渐出现VSMC凋亡,从而抑制VSMC的进一步增加,提示在支架植入后早期阶段对凋亡进行适当的诱导有可能抑制支架内再狭窄的发生[12]。细胞凋亡的调节有赖于促凋亡基因(如bax、bad)和抗凋亡基因(如bcl-2、bcl-x1)的平衡。内皮损伤后Bcl-2的表达增高,而Bax表达降低,川芎嗪通过抑制bcl-2的表达,促进Bax的表达,从而促进VSMC的凋亡[5]。本实验亦证实,TES组较BMS组单位面积内VSMC凋亡数明显增加,提示TES能够诱导VSMC凋亡。
由本实验可知,TES通过抑制VSMC增殖、迁移并促进VSMC凋亡的作用,降低支架植入术后再狭窄的发生,这是一种防治再狭窄的新策略。
摘要：目的观察川芎嗪洗脱支架(TES)对平滑肌细胞增殖和凋亡的影响。方法在6只小型猪冠状动脉分别植入TES与金属裸支架(BMS),术后第28天处死动物,用组织病理学方法检测内膜增殖情况,用免疫组化和TUNEL法观察TES对平滑肌细胞增殖和凋亡的影响。结果TES组较BMS组冠状动脉管腔面积增加、支架内新生内膜面积和面积再狭窄百分比减小(P<0.05),BMS组较TES组增殖细胞核抗原(PCNA)细胞阳性率明显增加(P<0.05),TES组较BMS组单位面积内平滑肌细胞(VSMC)凋亡数明显增加(P<0.05)。结论与EMS相比,TES可明显降低支架内再狭窄,显著抑制VSMC增殖、迁移并促进VSMC凋亡。
关键词：川芎嗪,药物洗脱支架,再狭窄
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人冠状动脉平滑肌细胞 篇3
血管平滑肌细胞在胚胎发生期来自中胚层, 在发育过程中, 逐渐分化为不同的细胞群, 并获得具有成年特征的分化表型。VSMC分化的特征是表达平滑肌特异的细胞骨架和可收缩蛋白变异体, 调节细胞外基质和细胞膜整合蛋白的构成。在高血压、动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄等血管病变, VSMC在新生内膜形成过程中暂时变成更接近胚胎期的未分化表型, 而在增厚的新生内膜中逐渐恢复为分化表型。在血管病变部位, 表型发生转化的VSMC在增殖的同时合成与分泌各种细胞因子和细胞外基质, 在AS斑块形成和RS发生过程中发挥重要作用。因此研究VSMC表型转化的分子机制, 对高血压RS和AS等血管疾病的防治具有重要意义。
正常的血管平滑肌细胞 (VSMC) 呈非增殖性的收缩表型, 在神经及激素的影响下调节血管壁张力、维持组织血流量。VSMC分化程度高, 呈典型的纺锤形或条带状, 胞质内有丰富的肌纤维, 可见致密体和致密斑, 粗面内质网和高尔基体等细胞器较少, 仅产生极微量的细胞外基质 (ECM) , 体积相对较小。主要通过表达一系列特异的收缩蛋白和骨架蛋白来维持收缩及调节血管张力、增殖、迁移能力。合成型VSMC分化程度低或未分化, 呈纤维母细胞样形态结构, 胞质内含极少肌丝, 但有大量粗面内质网、核糖体、高尔基体等细胞器, 具有强大的合成和分泌功能。细胞体积比收缩型大, 参与分泌细胞ECM和合成血管活性物质与血管壁的形成和损伤的修复以及在生长因子刺激下的分裂和增殖。
VSMC表型具有多样性和可变性的特点。在胚胎发育过程中, 由未分化表型逐渐分化为具有成年特征的分化表型。当血管受到损伤或体外培养的VSMC受到生长因子刺激时, VSMC又从分化型转化为去分化型并获得增殖能力, 这个过程称为表型转化。
2 影响VSMC表型转化的因素
血管平滑肌细胞 (VSMC) 的病理性增殖主要体现在其表型的转变, 即平滑肌细胞从收缩型向合成型的转变。VSMC表型受控于环境, 包括生长因子及其抑制剂、细胞外基质、机械性作用力、神经调节以及细胞间相互作用。
2.1 生长因子、细胞因子、心血管活性多肽和细胞外基质对VSMC表型转化的影响
血小板源生长因子就是一种较强的有丝分裂因子, 能促进平滑肌细胞的增殖和合成功能。有体外实验发现, 培养的平滑肌细胞由收缩表型转化为合成表型时, 合成胶原的量可增加20~30倍。研究发现, 血小板源生长因子作用后的平滑肌细胞含有更多的线粒体和粗面内质网, 表现为合成表型的平滑肌细胞, 细胞间质内有较多的胶原纤维分布。当肝素与血小板源生长因子同时作用于培养的平滑肌细胞时, 细胞浆内的肌丝成分较血小板源生长因子组的平滑肌细胞增多, 且线粒体、粗面内质网等减少, 细胞类同于收缩表型的特征。这提示血小板源生长因子能够促进平滑肌细胞向合成表型的转变, 而肝素可抑制此过程的发生。
2.2 收缩兴奋剂和神经递质对VSMC表型转化的影响
目前, 神经因素对VSMC表型转化的影响受到关注。去甲肾上腺素 (NE) 是交感神经的主要递质之一, 它作用于VSMC膜上的α1受体, 引起血管的收缩。刘斌等用NE分别作用于体外培养的和血清饥饿的血管平滑肌细胞, 用5-Brd U标记VSMC的增殖、RT-PCR检测VSMC表型标志基因SM22α和增殖负性调控基因高血压相关基因-1 (HRG-1) 的表达, 结果显示NE和OX-LDL分别作用血清培养的VSMC后, SM22α和HRG-1表达下降, 5-Brd U标记的阳性增殖细胞增多;NE分别与α1-肾上腺素受体拮抗剂 (α1-R-) 和β1-肾上腺素受体拮抗剂 (β1-R-) 共作用时, SM22α和HRG-1的表达明显上调。而当NE作用于血清饥饿VSMC时, NE上调, SM22α和HRG-1的表达。因此, NE对VSMC有促进表型转化和增殖的作用, 且这种作用呈现像神经样的可逆性调节作用, 其作用机制主要通过肾上腺受体α1和β1来实现。
2.3 机械性作用力对VSMC分化的影响
实验表明, 让VSMC在三维Ⅰ型胶原基质中伸展, 可使细胞内收缩性肌丝含量增加, 提示机械性作用力可促进VSMC分化。
3 VSMC表型转化的信号转导调节
目前研究最多的相关信号转导通路如下:磷脂酶C (PLC) /蛋白激酶C (PKC) 通路;Ca+/钙调蛋白 (Ca M) 依赖性蛋白激酶Ⅱ通路;丝裂原活化蛋白激酶通路;JAK/s TAT途径;NF-KB信号通路;磷脂酰肌醇3激酶 (PI3-K) /蛋白激酶B (PKB或AKT) 通路;TGF-β/Smad转导通路;环一磷酸腺苷通路。多条通路之间存在着广泛且复杂的交联机制, 形成一个复杂的信号网络。通过这一信号网络调控血管平滑肌细胞的增殖活动。
4 VSMC表型转化在动脉粥样硬化中的调控机制
VSMC表型转化的神经调节机制越来越受到关注, 主要推测血管交感神经对VSMC的调控作用, 其中NE因能促进动脉VSMC的增殖而成为主要的研究切入点。
在动脉粥样硬化的不同阶段, VSMC表型的转换具有重要的病理生理学意义。VSMC表型转化是一个渐进的过程, 虽然整体上人们将之分为收缩表型和合成表型, 但这两种表型代表的仅是两个极端, 大量过渡状态的中间类型可共存于同一血管壁内。VSMC在增殖过程中其表型由收缩型向合成型转变。合成型的VSMC移向内膜并吞噬内膜下的脂质变成泡沫细胞;另一方面各种损失因素导致血管壁受损, 继而释放各种生长因子和细胞因子, 激活VSMC表面受体, 并引起细胞内信号转导, 最终导致细胞核内某些基因的表达, 使VSMC大量增殖。同时合成型的VSMC还分泌大量的细胞外基质。
5 结论
正常情况下, 血管平滑肌细胞接受合适的刺激, 增殖, 迁移, 并合成分泌细胞外基质, 通过存活因子, 丝分裂素, 细胞间接触抑制及细胞基质间的相互作用正常调节细胞的增殖和死亡, 正常动脉的平滑肌细胞更新率很低, 凋亡及分裂指数也很低。病理条件下, 局部因素如炎性细胞因子, 炎性细胞和修饰型胆固醇, 全身因素如高血压等, VSMC表型由收缩型向合成型转变, 打破了细胞增殖和凋亡之间的相对平衡, 使血管壁发生病理改变。因此, 控制和逆转VSMC表型转化成为控制细胞异常增殖的关键性措施, 也为动脉粥样硬化疾病的治疗提供了新的理论思路。
参考文献
[1]庞玲品, 黄石安.血管平滑肌细胞表型转化相关因素及机制的研究进展[J].广东医学院学报, 2010, 28 (3) :312-314.
人冠状动脉平滑肌细胞 篇4
1 材料与方法
1.1 实验动物及标本制备
实验所用豚鼠(新疆自治区疾病控制中心动物饲养科提供,动物质量符合一级标准)雌雄不拘,重约200～300 g,在麻醉状况下放血处死,迅速取出肠系膜和脑,并置于生理盐溶液中。生理盐溶液成分如下(mmol/L):NaCl 138,KCl 5,CaCl21.6,MgCl21.2,Na-HEPES 5,HEPES 6,葡萄糖7.5。在生理盐溶液中,迅速取出脑动脉(brain artery,BA)和肠系膜动脉(mesenteric artery,MA)。
平滑肌细胞制备:将微动脉置于细胞分离液中20 min,细胞分离液成分为(mmol/L):NaCl 142,KCl5,CaCl20.05,MgCl21,Na-HEPES 4,HEPES 5,葡萄糖7.5。将微动脉剪成几段放入消化液后,在37℃温箱中消化20～25 min,消化液成分包括(mg/mL):木瓜蛋白酶0.75,胶原酶IA 1,牛血清白蛋白3.75,二硫苏糖醇0.3。1 000 r/min离心6 min后弃上清液,加入细胞分离液制成细胞悬浮液,如此反复替换3次后,将液体移至用多聚赖氨酸处理过的培养皿内,静置30 min使细胞贴壁。生理盐溶液冲洗30min后进行全细胞膜片钳实验。
1.2 全细胞膜片钳记录
在室温条件下(22～25℃)标本持续灌注生理盐溶液(0.2 m L/min)进行全细胞膜片钳实验。记录电极阻抗约为5 MΩ,由P-97拉制仪拉制。电极内液成分是(mmol/L):K-gluconate 130,NaCl 10,CaCl22.0,MgCl21.2,HEPES 10,EGTA 5,葡萄糖7.5。通过微操纵器接触到细胞后给予负压形成GΩ封接。补偿电极电容后给予瞬时较强负压或者电刺激击破细胞膜形成全细胞膜片钳,膜电流用10 kHz(-3 dB)低频滤过[8]。
1.3 实验所用药物
所用药物用生理盐溶液配制,通过开关控制药物灌流标本,保持灌流速度、温度和其他成分不变。所用药物有:氟灭酸、4-氨基吡啶和四乙胺由Sigma公司提供,其余试剂均为国产分析纯试剂。
1.4 统计学方法
应用SPSS 16.0统计学软件进行统计学处理,以均数±标准差表示,组间比较采用t检验,以P<0.05为有显著性差异。
2 结果
2.1 微动脉平滑肌细胞膜电流由BKCa通道和Kv通道介导
与前期研究一致[8],本实验中BA和MA平滑肌细胞膜电流呈外向整流,分别对电压依赖钾通道(voltage-gated K+channel,Kv)阻断剂4-氨基吡啶(1 mmol/L)和BKCa阻断剂四乙胺(1 mmol/L)敏感,提示微动脉平滑肌细胞膜电流的外向电流部分主要是通过激活Kv通道和BKCa通道引起。
2.2 氟灭酸浓度依赖增强平滑肌细胞膜电流
图1显示300μmol/L氟灭酸对BA平滑肌细胞膜电流的影响。300μmol/L氟灭酸显著增强平滑肌细胞膜电流的外向电流部分,氟灭酸对平滑肌细胞膜电流的影响具有电压依赖性,氟灭酸对平滑肌细胞I/V曲线中-60～0电压区间膜电流的影响很小,主要增强0～+40 m V电压区间的膜电流,其中对+40 m V阶跃电压激活电流的增强作用最强。
实验中预灌流不同浓度的氟灭酸,发现氟灭酸对BA和MA平滑肌细胞膜电流的增强具有浓度依赖性,100、300和1 000μmol/L氟灭酸分别使BA平滑肌细胞膜电流幅度(+40 m V)增强了(36±14)%、(136±26)%和(223±24)%(n=6)(图2A),使MA平滑肌细胞膜电流幅度(+40 m V)增强了(45±11)%、(166±24)%和(278±24)%(n=6)(图2B)。
氟灭酸增强的平滑肌细胞膜电流由何种通道介导?实验中背景灌流1 mmol/L四乙胺阻断BKCa通道后,300μmol/L氟灭酸对微动脉平滑肌细胞膜电流的增强作用被显著抑制(图3)。
1)与control组比较,差异有显著性,P<0.05,2)与control组比较,差异有显著性,P<0.01
3 讨论
微动脉是小动脉的末梢分支,和小动脉共同决定了血管的外周阻力。血管微动脉病变主要导致血管的舒缩功能障碍,而微动脉平滑肌细胞静息膜电位在血管舒缩调节上发挥重要的作用。K+通道激活引起的持续性K+外流是维持细胞膜静息电位的主要通道。平滑肌细胞膜输入阻抗很大(大约10 GΩ)[9],很小的膜电流将会引起很大的细胞膜电位的改变,而细胞膜电位改变可以调节电压依赖性Ca2+通道的活性,调控Ca2+的内流和细胞内游离Ca2+的浓度。研究发现,血管平滑肌细胞上主要表达内向整流K+通道(inward rectifier K+channel,Kir)、ATP敏感K+通道(ATP-sensitive K+channel,KATP)、Kv和BKCa[10]。本实验中平滑肌细胞膜电流呈明显的外向整流,Kv通道阻断剂4-氨基吡啶和BKCa通道阻断剂四乙胺对膜电流敏感,提示MA和BA平滑肌细胞膜电流主要由Kv和BKCa通道介导,与GUAN等人的研究一致[10,11]。
此外,本实验发现氟灭酸可以浓度依赖的增强微动脉平滑肌细胞膜电流,氟灭酸引起的净电流与1 mmol/L BKCa通道阻断剂四乙胺相似,且背景灌流四乙胺后氟灭酸对平滑肌细胞的增强作用显著被抑制,结果提示氟灭酸增强的平滑肌细胞膜电流由BKCa通道介导。Ca2+激活K+通道(Ca2+-activated K+channel,KCa)是一个大家族,根据电导值及药理特性不同分成大电导的BKCa、中电导的IKCa和小电导的SKCa。在血管平滑肌细胞上表达BKCa通道[6]。由于BKCa通道电导很大,平滑肌细胞膜上较少的BKCa通道开放对细胞静息膜电位产生较大的影响,在调节正常血管舒缩功能中发挥重要的作用[7]。疾病状态下BKCa通道的表达和功能也随之发生相应的改变,有证据显示高血压[12]或缺氧[13,14]时BKCa通道的功能和表达均增加,疾病状态下BKCa通道的功能或表达增加是机体自我保护机制,BKCa通道开放引起的K+外流,血管平滑肌细胞超极化,导致血管舒张,血管外周阻力降低,对抗由血压升高或缺氧引起的血管舒缩功能障碍,保障局部血流。本实验中发现氟灭酸可以浓度依赖的增强血管微动脉平滑肌细胞上BKCa通道,引起进一步拓展氟灭酸在血管微动脉上的药理作用。
摘要：目的 观察氟灭酸对微动脉平滑肌细胞电生理学特性的影响。方法 应用全细胞膜片钳技术在离体豚鼠脑动脉(BA)和肠系膜动脉(MA)的平滑肌细胞上,观察氟灭酸(1001 000μmol/L)对微动脉平滑肌细胞膜电流的影响。结果 4-氨基吡啶(1 mmol/L)和四乙胺(1 mmol/L)都可以部分抑制微动脉平滑肌细胞膜电流。氟灭酸可以浓度依赖的增强微动脉平滑肌细胞膜电流,100、300和1 000μmol/L氟灭酸分别使BA平滑肌细胞膜电流幅度(+40 mV)增强了(36±14)%、(136±26)%和(223±24)%,使MA平滑肌细胞膜电流幅度(+40mV)分别增强了(45±11)%、(166±24)%和(278±24)%。氟灭酸增强平滑肌细胞膜电流具有电压依赖性,氟灭酸主要增强0+40 mV电压区间的激活电流,其中对+40 mV激活电流的增强作用最强。背景灌流四乙胺(1mmol/L)能显著抑制氟灭酸对微动脉平滑肌细胞膜电流的增强作用。结论 氟灭酸可以浓度和电压依赖的激活微动脉平滑肌细胞膜上BKCa通道。
人冠状动脉平滑肌细胞 篇5
胞凋亡的影响及其抗动脉粥样硬化的可能机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物
54只健康雄性日本大耳白兔,购自西安交通大学医学院动物实验中心,体重1.5~2.5 kg。
1.2 实验用药
活血胶囊(主要成分为黄芪、桃仁、红花、牛膝、酸枣仁、川芎、赤芍、枳壳、地黄、桔梗、当归等),国药准字:B20020336,0.35 g/粒,西安大唐制药有限公司生产。辛伐他汀片,国药准字:H19990366,40 mg/片,杭州默沙东制药有限公司。戊巴比妥钠,批号:F20030816,中国医药集团上海试剂公司。
1.3 主要试剂与仪器
Bcl-2多克隆抗体,编号BA0412,Bax多克隆抗体,编号BA0315,武汉博士德生物工程有限公司;TUNEL检测试剂盒,编号G3250,美国Promega试剂公司。MOTIC Med 6.0 数码医学图像采集与分析系统,厦门麦克奥迪有限责任公司。
1.4 方法
1.4.1 动物分组及模型制备[3]
将54只大耳白兔随机分为正常对照组10只及造模组44只。正常对照组喂饲普通饲料,造模组喂饲由普通饲料+1%胆固醇粉+7.5%蛋黄粉+2%猪油配制的高脂饲料。所有实验兔均单笼饲养,自由饮水,每日每只予以150 g饲料。喂养10周,期间观察动物进食和行为变化,定期称量并记录体重,第10周末,将所有实验兔禁食12小时以上,经耳缘静脉抽取空腹血检测血清TC、TG及LDL-C水平,结果显示造模组血脂水平均显著升高;随机选取4只造模组兔处死后,剥离主动脉全长,剖开血管壁均可见明显隆起斑块,表明兔As模型建立成功。再依据随机数字表将造模组兔分为模型组、辛伐他汀组、活血胶囊高剂量及低剂量组,每组10只,各组继续喂饲相应的饲料10周。
1.4.2 给药方法
将辛伐他汀片研末、活血胶囊去壳后的内容物,分别用蒸馏水制备混悬液,经胃管给药。参照动物与人体体重等效剂量折算系数,依据每只实验兔的体重,计算出相应的给药剂量。每天1次,连续给药10周。每2周称量体重一次,据此调整给药剂量。其中辛伐他汀为阳性对照药,模型组用等容积的蒸馏水灌胃。干预过程中,有4只动物因误灌入气管死亡,3只因急性肠炎死亡,1只死因不明,解剖后发现肝脏多发肿块、破裂。
1.4.3 TUNEL法检测平滑肌细胞凋亡
留取主动脉瓣上至腹主动脉全长,用4%多聚甲醛固定、酒精梯度脱水、透明、石蜡包埋,连续切片,切片厚度5 μm,分别作HE染色和采用TUNEL法检测兔主动脉平滑肌细胞凋亡,在滴加PBS视野下,显微镜观察凋亡细胞形态学改变,以细胞核出现褐色者为阳性,每张玻片上随机选取10个不同区域,每个区域计数100个细胞,计算出每1000个细胞中阳性细胞的数量,作为每只实验兔的检测值,取每组实验兔的平均值,以凋亡细胞数占总细胞数的百分比为凋亡指数,进行统计分析。
1.4.4 SP免疫组化法检测Bcl-2和Bax蛋白表达
采用SP免疫组化法检测Bcl-2和Bax蛋白表达,阴性对照应用 PBS 代替一抗。每例切片随机观察 10 个不重叠的 400 倍视野,应用数码医学图像分析系统计算出Bcl-2、Bax阳性染色面积与染色强弱相结合的积分光密度(IOD值),取平均值作为每只实验兔的检测值。
1.5 统计学处理方法
所有数据均采用
2 结果
2.1 血管壁的组织形态学观察
模型组兔主动脉内膜面可见浅黄色斑块样突起,边缘清楚,大小不等,散在或融合成片,光镜下可见血管内膜增厚向管腔隆起,内含大量泡沫细胞和散在粥样坏死灶,血管中膜平滑肌排列紊乱、大量增殖迁入内膜,脂质空泡增多,内皮细胞大量脱落。相比之下,造模组兔主动脉As程度相对较轻。正常对照组光镜下血管结构清晰完整,内膜光滑,中膜平滑肌细胞排列整齐,未见泡沫细胞。
2.2 As兔血管平滑肌细胞凋亡结果分析
模型组及各给药组均可见凋亡的血管平滑肌细胞,发生凋亡的细胞体积缩小,核仁固缩,核染色加深,呈现黄褐色。统计血管平滑肌细胞凋亡数目:模型组平均(241.50±50.76)个/1000个,活血胶囊低剂量组平均(204.13±19.92)个/1000个,活血胶囊高剂量组平均(164.67±36.71)个/1000个,辛伐他汀组平均(164.86±28.32)个/1000个。以细胞凋亡指数作为评价平滑肌细胞凋亡水平指标,表1结果显示:模型组细胞凋亡指数最高,各给药组与模型组相比,平滑肌凋亡细胞指数明显减降低,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01),其中以活血胶囊高剂量组和辛伐他汀组细胞凋亡指数降低最为显著(P<0.01),活血胶囊高剂量组细胞凋亡指数较低剂量组降低幅度更明显(P<0.05),见表1。
注: 与模型组比较,aP<0.05,bP<0.01;与活血胶囊低剂量组比较,cP<0.05。
2.3 Bcl-2和Bax免疫组织化学光镜观察及图像分析结果
活血胶囊高、低剂量组,辛伐他汀组及模型组均可见染成棕黄色的Bcl-2 阳性表达信号,各给药组与模型组相比,Bcl-2表达均比模型组增多,差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01),以活血胶囊高剂量组和辛伐他汀组表达增多最显著(P<0.01),活血胶囊高剂量组的表达值略低于辛伐他汀组,但尚未达到统计学差异;活血胶囊高与低剂量组比较,差异具有统计学意义(P<0.05);同时各给药组均可见染成棕黄色的Bax阳性表达信号,以模型组Bax蛋白表达值最高,各给药组阳性表达值均比模型组减少,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01),以活血胶囊高剂量组和辛伐他汀组Bax表达减少最显著(P<0.01),两组间比较无显著性差异;活血胶囊高与低剂量组比较,差异具有统计学意义(P<0.05),见表2。
注: 与模型组比较,aP<0.05,bP<0.01;与活血胶囊低剂量组比较,cP<0.05。
3 讨论
血管平滑肌细胞位于血管壁中膜,是构成血管壁结构的重要组成部分,是维持血管张力和功能的主要细胞成分,其结构和功能的改变,是多种心血管疾病的病理生理学基础。近年的研究认为在As过程中细胞凋亡始终存在,而巨噬细胞和血管平滑肌细胞是凋亡细胞的主要来源,大量凋亡后的血管平滑肌细胞不能被及时清除,发生继发性坏死,使细胞内的脂质释放并堆积形成脂质池,血管平滑肌细胞凋亡失调和凋亡小体清除不足可能是加剧As发展的重要因素。细胞凋亡是受多种因素调控的过程,与其关系最密切的是B细胞淋巴瘤/白血病基因2(b cell lmyphoma/leukemia gene 2,Bcl-2)蛋白家族,可以分为两类:一类是抗细胞凋亡基因,代表基因是Bcl-2基因,其高表达可阻止多种凋亡因子所致的细胞死亡,延长细胞寿命;另一类是促细胞凋亡基因,代表基因是Bax基因,可通过其自身形成的同源二聚体促进细胞凋亡。Bcl-2和Bax在细胞内的表达是决定凋亡是否发生的重要因素[4],两者一正一负共同调节凋亡发生。
中医学认为As发生发展的主要病因病机是气虚血瘀,益气活血法是防治 As 的重要手段之一。大量药理学及中药复方的研究结果明具有益气活血化瘀功效的中药或复方能抑制炎症反应,从而减轻或延缓As的进程,增加斑块稳定性[5,6]。活血胶囊组方针对气虚血瘀这一最基本的病机,首选炙黄芪大补脾胃之元气,生地、当归补血活血,桃仁、红花、川芎、赤芍活血化瘀,全方共奏益气养血、活血化瘀理气安神等功效。前期的临床及动物实验研究表明其能够抗血小板聚集、降低血液黏度、改善微循环,能够有效调节血脂,抑制炎症反应,减少斑块内巨噬细胞浸润等作用[3]。
本实验发现,与正常对照组比较, As模型组动脉管腔明显狭窄,粥样斑块广泛形成,动脉内膜增厚,平滑肌细胞核固缩,可见成堆的泡沫细胞,平滑肌细胞凋亡率显著增高,抗凋亡基因蛋白Bcl-2表达显著下降,促凋亡基因蛋白Bax表达明显升高。活血胶囊能够有效升高血管平滑肌细胞及斑块内Bcl-2蛋白的表达,降低血管平滑肌细胞及斑块内Bax蛋白的表达,降低血管平滑肌细胞凋亡指数,并显示一定的量效关系,推断活血胶囊可能通过上调Bcl-2蛋白表达,下调Bax蛋白表达,减少血管平滑肌细胞凋亡,从而抑制动脉粥样硬化斑块的形成。
摘要：目的 探讨活血胶囊干预对动脉粥样硬化兔主动脉平滑肌细胞凋亡及凋亡相关因子Bcl-2、Bax蛋白表达的影响。方法 通过高脂饮食建立实验性动脉粥样硬化兔动物模型,采用TUNEL法检测平滑肌细胞凋亡,SP免疫组化法检测凋亡相关因子Bcl-2、Bax蛋白表达。结果 与模型组比较,活血胶囊低、高剂量组均能降低兔主动脉平滑肌细胞凋亡的凋亡指数(P<0.05,P<0.01),降低Bax蛋白表达(P<0.05,P<0.01),升高Bcl-2蛋白表达(P<0.05,P<0.01),并呈现一定的量效关系(P<0.05)。结论 活血胶囊可能通过上调Bcl-2蛋白表达,下调Bax蛋白表达,减少平滑肌细胞凋亡,从而抑制动脉粥样硬化斑块的形成。
关键词：活血胶囊,动脉粥样硬化,平滑肌细胞凋亡,Bcl-2,Bax
参考文献
[1]Lusis AJ.Atherosclerosis[J].Nature,2000,407(6801):233-241.
[2]Vannini N,Pfeffer U,Lorusso G,et al.Endothelial cell aging and apoptosis in prevention and disease:E-selectin expression and modulation as a model[J].Curr Pharm Des,2008,14(3):221-225.
[3]周洁,刘勤社,张晓艳,等.活血胶囊对家兔动脉粥样硬化斑块稳定性的影响[J].中药新药与临床药理,2011,22(5):528-531.
[4]Sukhotnik I,Voskoboinik K,Lurie M,et al.Involvement of the bax and bcl-2system in the induction of germ cell apoptosis is correlated with the time of reperfusion after testicular ischemia in a rat model[J].Fertil Steril,2009,92(4):1466-1469.
[5]莫新民,曾英,侯斌,等.稳斑方对模型兔动脉粥样硬化斑块稳定性的影响[J].中医杂志,2009,50(8):740-742.
人冠状动脉平滑肌细胞 篇6
1 材料与方法
1.1 动物
雄性新西兰兔32只,兔龄为2月龄,Ⅰ级(医动字第20-003号),体重(2.6±0.19)Kg,由湖南中医药大学实验动物中心提供。
1.2 主要试剂与药物
即用型SABC免疫组化染色试剂盒:武汉博士德生物工程有限公司。分析纯多聚甲醛:江苏星联化工厂。25%戊二醛水溶液:上海五联化工厂。普罗布考粉剂:山东齐鲁制药有限公司生产,批号:051005。羧甲基纤维素钠:广东汕头市西陇化工厂生产。
1.3 主要实验仪器
JY3002型电子天平:上海精密科学仪器有限公司。DMLB2型双目显微镜:德国LEICA公司。Haier医用微波炉:Haier集团。MIAS医学图象分析系统:北航公司。Shandon325型石蜡切片机:英国Shandon公司。2.0mm×20mm球囊导管:德国BBraun公司。电针G-6805Ⅲ治疗仪:上海医用电子仪器厂。
1.4 方法
1.4.1 兔髂动脉粥样硬化性狭窄模型制作(一次损伤)
采用右骼动脉3F Fogarty导管损伤术:25%乌拉坦(2ml/kg)从兔耳缘静脉注入,麻醉成功后,右侧肢备皮,常规消毒铺巾。解剖右膝部隐动脉,纵向切开管壁,向近端插入3F Fogarty导管约12～15cm达髂动脉分叉水平,向球囊内充注0.05～0.1ml的生理盐水后。将充气球囊沿右髂动脉上牵拉5～10cm至股动脉近端,反复3次。充分剥离髂动脉内皮细胞,结扎隐动脉,关闭伤口。术后每日肌注庆大霉素8万单位,连续3天。实验兔每天以胆固醇、猪油、蛋黄及普通饲料按1∶1.5∶3∶44.5的比例加工成颗粒料用,连续喂养12周,以造成动脉损伤部位动脉粥样硬化性狭窄。
1.4.2 兔髂动脉再狭窄模型制作(二次)
一次损伤术后12周,右髂动脉狭窄段球囊导管扩张术。随机抽取一次损伤的兔,双下肢动脉DSA造影术,明确术后及高脂饮食是否造成髂动脉管腔狭窄,如狭窄>50%,用2.0mm×20mm球囊导管进行扩张。按第一次手术切口部位上方切口,解剖股动脉。纵行切开管壁约0.2cm,球囊导管向近端探入10cm,然后接压力泵,注入生理盐水使压力达8个大气压充盈球囊,缓慢回拉导管至切口处回抽压力泵,重复操作3次,移出导管,结扎股动脉,9/0无损伤线缝合动脉切口,关闭伤口。术后每日肌注庆大霉素+青霉素,连续3～7天。
1.5 分组给药及针灸
再狭窄组(24只),先按体重分层,然后按随机数字表法随机分成模型组、实验组、药物对照组。药物组普罗布考以46.7mg/kg灌胃,连续14天。针刺组用针刺法,以家兔穴位局部出现电针频率一致的轻微颤动为宜,针刺内关(双侧)、厥阴俞(双侧)、心俞(双侧)、膻中、足三里(双侧)。每日1次,每次20分钟,疏波4Hz,密波20Hz,脉冲宽度0.5mm,输出电压20～30v。
1.6 取材
实验结束后,下腹部正中切口,沿腹主动脉下段解剖双侧髂动脉。病变动脉及对侧自身对照髂动脉取材,分3cm动脉段两段,分置新鲜配制的4%多聚甲醛、2%戊二醛磷酸缓冲液(pH7.4)中固定,用于血管壁病理学研究。
1.7 病理学检测
实验家兔的主动脉和冠状动脉、髂动脉标本,福尔马林固定,石蜡包埋,间断连续切片,切片厚4μm,HE染色,光镜下观察管腔面积、内膜厚度、中膜厚度及其比值。
1.8 c-foc蛋白表达的测定
采用免疫组化方法。
1.9 图像分析
将光学显微镜下免疫组化染色的切片图像输入图像分析测定系统,按照图像增强、分割、整理、识别、测量的步骤进行操作,对呈阳性反应的细胞在视野中所占面积(μm2)和积分光密度值(IOD)进行定量测定。每张免疫组化切片图像再放大40倍,观察6个视野,每个视野取测量值的平均值。所有标本均在统一光源亮度和图像灰度值下进行测量。
1.10 统计学方法
全部数据采用DELL家用电脑管理,使用SPSS13.0软件处理。数据皆为数值变量资料,故采用均数±标准差undefined表示,采用单因素方差分析。
2 结果
2.1 组织形态学观察
光镜下可见正常对照组髂动脉内腔面光滑,内皮细胞、内弹力层完整,平滑肌细胞及弹力纤维排列有序。模型组在损伤后内膜增生,内膜面积迅速增加。针刺组及药物组内膜面积增加轻微。见表1。
与正常组比较△P<0.05,△△P<0.01;与模型组比较*P<0.05,**P<0.01(下同)
2.2 血管平滑肌细胞中c-foc蛋白的表达
正常组血管平滑肌细胞的c-foc蛋白表达呈弱阳性,模型组血管平滑肌细胞中c-foc蛋白呈强阳性,针刺组c-foc蛋白为弱阳性,药物组c-foc蛋白呈中等阳性。见表2和图1～4。
3 讨论
针灸治疗冠心病及PTCA后RS,无论是临床还是机制研究都比较深入。我们前期研究结果显示,针刺能升高动脉再狭窄模型大鼠血清中6-keto-PGF1α水平,降低TXB2水平,降低TXB2/6-keto-PGF1α的比值;升高模型大鼠血清中一氧化氮(NO)及一氧化氮合酶(NOS)的活力;升高模型大鼠血浆中组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)的活性,降低PAI活性; 升高模型大鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)的活性,降低丙二醛(MDA)的含量。从而恢复血管平滑肌张力,清除氧自由基,抑制动脉去内皮损伤的内膜增生,影响动脉再狭窄的病理进程[5,6,7,8]。
血管平滑肌细胞异常增殖是动脉粥样硬化(AS)、血管再狭窄、高血压、冠心病等心血管疾病的关键因素。研究表明,各种因素引起增殖的VSMC中c-foc癌基因都有高程度表达。培养平滑肌细胞在100nmol/L血管紧张素II(AngII)作用下,15分钟c-foc表达即开始增加,30分钟高峰,2小时恢复正常,而c-myc表达变化出现在c-foc之后,在2小时才达高峰、约持续6小时,以后才出现细胞生长,这种变化与腹主动脉狭窄性高血压左心室肥厚c-foc及c-myc的表达相似,提示c-foc基因是细胞生长的触发因素,它可诱导c-myc基因的表达,进而促进细胞生长[9]。异常活化的c-foc癌基因不仅作为靶基因引起靶组织的异常增生,更重要的是可能作为一种中间信使将细胞内外的各种信息通过各种途径和方式传递至各靶组级别靶器官引起相应病理生理变化[10]。本实验观察到,模型组平滑肌细胞增殖及c-foc基因表达明显高于正常组(P<0.01);针刺组c-foc基因表达低于模型组(P<0.01)。因此,针刺能抑制再狭窄兔血管平滑肌细胞增殖,抑制c-foc基因表达,调节平滑肌凋亡,可能是针刺预防动脉再狭窄的作用机制之一。
摘要：目的:探讨针刺对家兔实验性动脉血管平滑肌细胞(VSMC)增殖、c-foc基因表达的影响。方法:家兔随机分为正常对照组和再狭窄组。再狭窄组应用PTCA球囊导管对实验兔行双侧髂动脉内膜剥脱以建立动脉粥样硬化模型,术后1月髂动脉造影示50%以上狭窄者再行PTCA球囊扩张术,以建立再狭窄模型。将造模动物随机分成模型组、针刺组、普罗布考组。自术前2天至术后14天为1疗程,针刺内关(双)、厥阴俞(双)、心俞(双)、膻中、足三里(双)等穴。观察各组血管平滑肌细胞增殖、c-foc基因表达。结果:模型组平滑肌细胞增殖及c-foc基因表达明显高于正常对照组(P<0.01);针刺能抑制血管平滑肌细胞增殖,其c-foc基因表达低于模型组(P<0.01)。结论:针刺能抑制再狭窄兔血管平滑肌细胞增殖,抑制c-foc基因表达,调节平滑肌细胞凋亡,可能是针刺预防动脉再狭窄的作用机制之一。
关键词：动脉再狭窄/针灸疗法,肌,平滑,血管/针灸效应,基因表达,兔
参考文献
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人冠状动脉平滑肌细胞 篇7
关键词：二十二碳六烯酸,白介素1β,基质金属蛋白酶-2,基质金属蛋白酶-9,组织金属蛋白酶抑制剂-1,组织金属蛋白酶抑制剂-2,Notch3
血管壁结构的改变是高血压病理改变的普遍特征。目前普遍认为, 高血压基本病理改变是血管重塑。动脉壁中膜肥厚是高血压血管壁增厚的主要原因, 这与血管平滑肌细胞 (vascular smooth muscle cells, VSMCs) 的增殖和迁移密切相关。研究表明多不饱和脂肪酸如二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸 (Docosahexaenoic Acid, DHA) 可降低心血管疾病的发病率和病死率[1]。DHA除了具有很好的降血脂作用外, 还可以通过影响内皮细胞和VSMCs的生物学行为进而调节血压。在炎性反应中DHA可降低VSMCs的增殖和迁移[2,3]。研究表明, 在高血压、血管再狭窄和动脉粥样硬化过程中VSMCs的增殖和迁移与基质金属蛋白酶 (matrix metalloproteinase, MMP) 降解细胞外基质密切相关[4]。当血管损伤后炎症因子高表达, 上调MMP-2和MMP-9, 使细胞外基质大量降解, 加速了VSMCs向血管内膜迁移, 导致血管壁增厚, 引起血压上升, 血栓形成[5,6]。目前, 有关DHA的降血压机制的研究尚不多见。本文通过研究DHA对VSMCs增殖及迁移的影响, 以及对基质金属蛋白酶及其抑制剂含量的变化探讨了DHA对高血压的影响及机制。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
雄性SD大鼠, 山东绿叶制药有限公司动物实验中心提供, 合格证号:20030020;干粉培养基 (DMEM) , 美国Gibco公司生产;Trizol, 加拿大Invitrogen公司提供;Quantscript RT kit, 总RNA提取试剂盒购自于Takara公司;琼脂糖购自于Bio West公司;RIPA裂解液, 购自于美国Millipore公司;DHA、噻唑蓝 (MTT) 、二甲基亚砜 (DMSO) 和胰蛋白酶购自于Sigma公司;水套式二氧化碳孵箱, 美国Nuaire公司生产;超净工作台, 苏州净化设备公司生产;PCR仪:MJ Research INC生产。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
8周龄的雄性大鼠, 颈椎脱臼处死, 取胸主动脉, 放入磷酸盐缓冲液 (PBS) 中清洗。剥去动脉外膜及内膜, 取血管的中层组织洗净后剪成1 mm2大小的组织块, 按组织贴块法接种于200 m L/L胎牛血清的DMEM培养液中, 于5%CO2、37℃下培养24 h。待细胞达到80%的融合后, 用2.5 g/L的胰蛋白酶消化传代。
1.2.2 实验分组处理
消化细胞并收集细胞悬液, 将细胞以1×105/孔接种于24孔细胞培养板中, 然后将细胞随机分为四组:对照组细胞加入50μL PBS培养48 h;IL-1β组细胞加入10 ng/m L IL-1β共培养48 h;DHA组细胞加入80μmol/L DHA培养48 h;IL-1β和DHA处理组细胞加入10 ng/m L IL-1β和80μmol/L DHA培养48 h。
1.2.3 MTT检测细胞增殖
细胞增殖采用MTT法进行检测。细胞消化后通过计数板计数, 将细胞以1×104/孔的密度接种至96孔培养板中。接种12 h后, 按上述分组方法进行培养。每组做6个重复。培养48 h后每孔加入5 g/L的MTT 20μL, 37℃恒温箱中培养4 h, 去上清, 每孔加入200μL DMSO, 振摇20 min, 用紫外分光光度计测定570 nm下的光密度值 (OD) 。
1.2.4 Transwell法检测细胞侵袭
在24孔Transwell上室聚碳酸酯膜 (膜孔径8μm) 上涂1 g/L的matrigel 70μL, 37℃, 60 min使之在微孔滤膜上重组为基底膜结构。取对数生长期的VSMCs, 以DMEM培养液[不加胎牛血清 (FBS) ], 调整细胞悬液中细胞数为l×105/m L, 取200μL细胞悬液接种于Transwell上室内, 下室加入10%FBS的DMEM培养液500μL, 37℃, 5%CO2培养24 h后, 将滤膜上层细胞用棉签抹去, 滤膜以甲醇固定, 然后用结晶紫染色15 min。100倍光镜下选择膜上、下、左、右、中5个不同视野的穿过膜细胞数, 求平均值。
1.2.5 q RT-PCR检测
VSMCs细胞分组处理48 h后, 利用PBS清洗细胞3遍, 然后胰酶消化收集细胞, 依据试剂盒说明, 采用Trizol (Invitrogen, CA) 抽提法提取总RNA, 提取出的RNA用紫外分光光度计测OD值, 以确定RNA的浓度和纯度;采用Quantscript RT kit反转录合成c DNA, PCR扩增。PCR扩增条件:94℃, 1.5 min;94℃, 1 min;64℃, 1 min;72℃, 1 min 40个循环, 最后在72℃下延伸10 min, 同样的方法扩增内参基因三磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPDH) 。引物信息见表1。
1.2.6 Western blotting检测蛋白表达
细胞分组处理48 h后, 利用PBS清洗细胞3遍, 然后胰酶消化收集细胞, 用RIPA细胞蛋白裂解液提取细胞中的蛋白, 二辛可酸 (BCA) 法测定蛋白浓度。蛋白样品经SDS-PAGE电泳, 上样量为40μg/行, 电泳完毕后, 电转移至PVDF膜进行如下处理:牛血清白蛋白 (BSA) 封闭过夜, 一抗 (1∶1000比例稀释) 室温抚育2 h, 磷酸盐吐温缓冲液 (PBST) 洗涤3次, 辣根过氧化物酶 (HRP) -Ig G (1∶100比例稀释) 室温抚育2 h, PBST洗涤3次, 电化学发光 (ECL) 显色, 暗室曝光。
注:MMP:基质金属蛋白酶;TIMP:组织金属蛋白酶抑制剂;GAPDH:甘油醛-3-磷酸脱氢酶
1.3 统计学方法
采用统计软件SPSS 13.0对实验数据进行分析, 计量资料数据以均数±标准差 (±s) 表示, 两两比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 VSMCs的增殖情况
MTT法检测VSMCs的增殖情况, 结果显示, DHA组VSMCs的相对增殖率与对照组比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) ;而IL-1β组VSMCs的相对增殖率显著增高 (P<0.05) ;IL-1β和DHA共处理组VSMCs的相对增殖率与IL-1β组VSMCs的相对增殖率相比显著下降 (P<0.01) 。见图1。
与对照组比较, *P<0.05;与IL-1β组比较, t=25.537, #P=0.003;IL-1β:白介素-1β;DHA:二十二碳六烯酸
2.2 VSMCs的迁移情况
Transwell法检测VSMCs的迁移, 结果显示, DHA组VSMCs的穿膜均数为 (18.24±5.31) 个, 与对照组[ (22.17±4.58) 个]比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) ;IL-1β组VSMCs的穿膜均数高达 (64.72±21.35) 个, 显著高于对照组, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;当经IL-1β处理的VSMCs与DHA共培养时, VSMCs的穿膜数量为 (38.94±8.45) 个, 显著低于IL-1β组VSMCs的穿膜数量, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。
2.3 VSMCs中MMP-2、TIMP-2、MMP-9和TIMP-1的表达
Western blotting检测MMP-2、TIMP-2、MMP-9及TIMP-1在VSMCs中的表达, 结果显示, 与对照组比较, DHA组VSMCs中MMP-2、TIMP-2、MMP-9、TIMP-1的表达量和MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1的比值改变不显著, 差异无统计学意义 (P>0.05) ;而IL-1β组的VSMCs中MMP-2、TIMP-2、MMP-9、TIMP-1的表达量和MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1的比值显著增高, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。当经IL-1β处理的VSMCs与DHA共培养48 h后, 细胞中的MMP-2、MMP-9的表达量和MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1的比值与IL-1β组相比有显著降低, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。见图2、3。
与对照组比较, *P<0.05;与IL-1β组比较, #P<0.01;IL-1β:白介素-1β;DHA:二十二碳六烯酸;MMP:基质金属蛋白酶;TIMP:组织金属蛋白酶抑制剂;GAPDH:甘油醛-3-磷酸脱氢酶
与对照组比较, *P<0.05;与IL-1β组比较, #P<0.01;IL-1β:白介素-1β;DHA:二十二碳六烯酸;MMP:基质金属蛋白酶;TIMP:组织金属蛋白酶抑制剂;GAPDH:甘油醛-3-磷酸脱氢酶
2.4 Notch信号通路关键调控因子Notch3在VSMCs中的表达
DHA组VSMCs中Notch3的表达量与对照组比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) ;Notch3在IL-1β组VSMCs中的表达量显著低于对照组, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;当经IL-1β处理的VSMCs与DHA共培养48 h后, VSMCs中的Notch3表达量与IL-1β组相比显著增高, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 提示DHA对VSMCs增殖和迁移的抑制作用是通过Notch信号通路实现的。见图4。
3 讨论
VSMCs是构成血管壁的重要组成成分, 其增殖过度是导致多种心血管疾病, 尤其是高血压、动脉粥样硬化、血管再狭窄等的关键环节[7,8]。正常成熟的血管中VSMCs处于分化状态, 当局部血管在炎症因子等刺激作用下损伤后, 局部释放大量细胞因子和生长因子, 使位于中膜的VSMCs表型发生改变, 导致细胞收缩功能消失, 并由中膜向内膜迁移、增殖, 同时分泌大量的细胞外基质 (extra-cellular matrix, ECM) 。本实验用炎症因子IL-1β对VSMCs进行了处理, 诱导VSMCs细胞发生炎性反应, 引起其大量增殖, 然后用DHA进行处理, 比较不同处理组VSMCs中MMP-2和MMP-9及其抑制剂的表达差异, 并对Notch信号途径中的主要调控因子Notch3进行了检测, 探讨DHA对VSMCs增殖和迁移的影响及机制。
与对照组比较, *P<0.05;与IL-1β组比较, t=39.235, #P=0.000;IL-1β:白介素-1β;DHA:二十二碳六烯酸;GAPDH:甘油醛-3-磷酸脱氢酶
MMPs是一类可降解ECM的锌蛋白酶家族, 以酶原的形式分泌, 由其他蛋白酶或炎症因子激活, 在组织重构及ECM的动态平衡中发挥着重要作用[9]。TIMPs是MMPs的主要抑制剂, 主要由肌成纤维细胞、VSMCs、激活的星形胶质细胞等分泌, 其分泌为基本的生理所需, 随MMPs的表达而表达, 二者维持在一定的比例, 调节ECM的动态平衡, 若二者的比例失衡, 将引起多种病理反应。本研究发现经IL-1β诱导的VSMCs的增殖及迁移能力显著增高, 且MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2的表达量显著上调, MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1的比值均显著增高, 比例失调。与DHA共培养后VSMCs的增殖及迁移能力显著下降, MMP-2和MMP-9的表达量及MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1的比值都表现为显著下调。说明VSMCs的增殖及迁移与MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1的比例失衡具有相关性, DHA可以降低MMP-2和MMP-9的表达量, 从而降低MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1的比值, 对抑制VSMCs的增殖及迁移发挥重要的作用。
Notch信号通路一条最初发现于果蝇、高度保守的信号转导途径, 广泛存在于各种生物体内。Armulik等[10]的研究发现Notch信号通路在调节VSMCs形态和功能中发挥重要作用。本研究发现:经IL-1β处理的VSMCs中低表达Notch3;经IL-1β处理的VSMCs与DHA共培养后Notch3的表达量表现为显著增高, VSMCs的增殖和迁移能力也显著降低, 说明Notch3在DHA抑制平滑肌细胞增殖和迁移中发挥重要作用。
DHA对VSMCs生理功能的调节作用已被多个研究所报道[11,12]。有研究认为ω-3不饱和脂肪酸特别是DHA一方面极易与膜磷脂或三酰甘油相融合并增加VSMCs膜固醇类的流动从而对与胞膜密切相关的信号分子产生影响[13], 而另一方面对细胞膜离子通道进行调控, 最终调节细胞内的信号转导[14]。