大鼠肺微血管内皮细胞

大鼠肺微血管内皮细胞（共6篇）

大鼠肺微血管内皮细胞 篇1

肺微血管内皮细胞以紧密连接方式像地毯一样覆盖在肺血管腔表面,直接与血液接触。在20世纪70年代前,血管内皮一直被看作为血液和气体交换,水、小分子物质和细胞沟通的屏障。近20年来,内皮细胞研究取得了突飞猛进的进展,目前,内皮细胞已被认为是一个“代谢和内分泌器官”。内皮细胞参与调节血管张力,调节抗凝、凝血和纤溶,表达黏附分子,参与血管活性物质代谢等[1]。由于它广泛涉及多种疾病的发病机制,应用体外培养的微血管内皮细胞,可以构建多种实验模型来研究生理和病理情况下微血管内皮细胞的基因、表型和功能,探讨各种组织细胞相互作用及其调控机制。不同器官和组织起源的微血管内皮细胞在形态、基因、表型和功能方面有所差别[2]。近年来,有不少国内外文献报道肺微血管内皮细胞(pulmonarymicrovascularendothelialcells,PMVECs)的分离和培养方法[3,4,5],主要有组织块培养法和酶消化法,但经实际重复实验发现,仍存在不少问题,如污染问题、贴壁问题等,都影响了细胞培养的成功率。本研究对组织块法培养大鼠PMVEC的方法进行了某些方面的改进和可能详尽的介绍,使体外培养大鼠PMVEC的方法在简单易行的基础上,达到了重复性高、成功率高。

1材料与方法

1.1材料

雄性健康SD大鼠(二级清洁,由第四军医大学动物中心提供),体重180-220g。DMEM培养液胰酶等购自Gibco公司,胎牛血清购自Hyclone公司,两性霉素B购自Sigma公司,Ⅷ因子相关抗体购自Santa公司,25cm 2培养瓶和96孔板购自Costar公司。5%CO2培养箱(日本),倒置显微镜(Olympus),超净工作台,低温离心机,器械(R.D)。

1.2培养方法

1.2.1取材

在无菌缓冲间内,给大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠50mg/kg体重,肝素钠800U/kg体重。麻醉后,用75%酒精进行胸腹部的擦拭消毒。打开腹腔,腹主静脉放血。换器械后打开胸腔,剪去左心耳,放出肺循环中的血液。取出心肺,放入DMEM培养液(含100U/mL青霉素,100U/mL链霉素,两性霉素中备用。

1.2.2植块

在超净台无菌条件下,修剪心肺。除去心脏后,将肺组织移入新的DMEM培养液中进行清洗,然后移入干燥培养皿中,加DMEM培养液(含100U/mL青霉素,100U/mL链霉素,2.5μg/mL两性霉素B),以刚没过肺脏为宜。以下操作均在冰袋上进行。用细弯镊轻柔地撕去肺表面的胸膜后,剪下2—3mm宽的肺外边缘。将剪下的边缘组织移入干燥的培养皿中,将其剪成约1mm×1mm×1.5mm大小的组织块。然后用弯头滴管吸取组织块接种到25cm 2塑料培养瓶内,约2块/cm 2,种植壁用少量DMEM培养液(含20%胎牛血清,100U/mL青霉素,100U/mL链霉素,2.5μg/mL两性霉素B)预湿,以利于组织贴壁。将植块后的培养瓶倒置,加入5mLDMEM(含20%胎牛血清,100U/mL青霉素,100U/mL链霉素,2.5μg/mL两性霉素B)培养液,放入37℃,5%CO孵箱中。

1.2.3原代培养

组织块贴壁4h后,轻轻翻正培养瓶,继续培养,并不时在倒置显微镜下观察细胞迁出情况植块后最先游出的是血细胞,翻瓶后约24h,可见到明显的内皮细胞游出,数量不多,约36h后,更换培养液。约48h后,可见数量较多的内皮细胞爬出,60h后,轻轻吸掉组织块,更换培养液,继续培养。

1.2.4传代培养

原代培养8—9d后,细胞长满瓶壁的95%以上,进行传代。弃原培养液,加1—2mL不含血清的DMEM清洗后,加500μL含0.02%EDTA的0.25%胰酶消化液。消化约30s,待细胞收缩变圆,立即加入2mLDMEM培养液(含20%胎牛血清,100U/mL青霉素,100U/mL链霉素)中止消化,并用弯头吸管将细胞轻轻吹打下来,移入离心管中,1 000r/min,离心5min,弃上清,加适量DMEM培养液(含20%胎牛血清,100U/mL青霉素,100U/mL链霉素),将细胞吹散制成悬液,再根据需要按(1-2)×104/cm 2的接种密度传代。传代后视情况3d换一次培养液,约5—6d后细胞长满瓶壁80%右,再次传代。原代细胞传至4代以后生长速度慢,细胞形态发生变化,因此取2—4代用于实验研究。

1.3 MTT法测定细胞生长曲线

取第2代细胞接种于96孔板,接种密度1×104/cm 2。接种后每24hMTT法测细胞活性,连续测7d。加MTT(5g/L,溶于PBS)前,弃去孔内含FBS的DMEM培养基,加入200μL无血清的DMEM培养基,再加入20μLMTT,37℃,5%CO2孵箱中培养。4h后,弃孔内液体,加入150μLDM-SO,振荡10min后,放入ELISA测量仪中,490nm比色。以时间为横轴,吸光值为纵轴,绘生长曲线。

1.4形态学观察

倒置显微镜下观察原代细胞的形态特点,生长点。第2代细胞用于做透射电镜,观察细胞形态征。

1.5免疫荧光化学方法检测PMVECs第Ⅷ因子相关抗原

一抗为抗兔第Ⅷ因子抗体,二抗为FITC标记的羊抗兔抗体,均为Santa公司产品。方法:将原代细胞消化后接种于放置有盖玻片的培养皿中,待细胞汇成单层后,取出培养皿中盖玻片,PBS漂洗,5min×3次;40g/L多聚甲醛固定,4℃,20min取出,PBS漂洗,5min×3次;甩干后,中性树胶将其粘于载玻片上,隔夜放置;羊血清封闭,30min后弃去;一抗(1∶20稀释)滴加,4℃过夜,PBS漂洗,5min×3次;二抗(1∶100稀释)滴加,避光,37℃,30min,PBS漂洗,5min×3次;缓冲甘油(甘油与PBS按1∶1稀释)封片,荧光显微镜观察。

2结果

2.1生长曲线

如图1所示,接种后48h内,细胞增长不明显,处于停滞期;48—144h内,细胞增殖旺盛,处于对生长期,适于实验研究;144h以后,细胞生长基本停止,活力有所降低,进入平台期。

2.2 细胞形态学特点

植块后24 h,可见少量PMVECs爬出(图2),60 h后,大量细胞爬出(图3)。原代培养后8 d,细胞融合成单层,低倍镜下,PMVECs的形态为多边形、短梭形,呈典型的 “鹅卵石”、“铺路石”样排列(图4)。高倍光镜下可见PMVECs呈扁平状,长椭圆形,核仁显著(图5)。透射电镜下(图6)可见PMVECs胞内特有的Weibel-Pallade小体及细胞连接,正在生长的内皮细胞粗面内质网较丰富,吞饮小泡不明显。

2.3 PMVECs第Ⅷ因子相关抗原检测

将固封后的盖玻片在荧光显微镜下观察。结果如图7所示,呈现典型的胞浆黄绿色着色(图7)。

3 讨论

目前用于血管内皮细胞的培养方法主要有酶消化法、组织块法等。其中,酶消化法主要用于大血管内皮细胞的培养,且较其他方法昂贵、操作复杂、技术要求较高,同时还存在对细胞的化学污染和机械损伤[2,3]。与此相比,组织块法则简单、快捷、经济。在大鼠PMVEC的培养过程中,多种因素均可影响细胞培养的成功率。为此,我们从多个细节上对RPMVEC的体外培养方法进行了改进,使体外培养RPMVEC更加可靠、有效。①动物的选择及处理:有研究表明,幼年鼠的肺组织细胞增殖能力旺盛,生长状态较成年鼠的细胞好。然而,经实验发现,幼年鼠肺脏小,胸膜薄,很难除去,而去胸膜是为了让细胞更充分地爬出组织块。因而,我们采用体重180-220 g的刚成年大鼠,胸膜发育完全,柔韧性好,易于剥去。同时,在取心肺前,给动物注射肝素钠是为了延长凝血时间,好让肺循环里的血液充分流出。未采用肺循环灌流冲洗,是为了减少对血管的损伤,且经对照实验发现,灌流并不能减少血细胞的污染。②培养基的改进:培养基常规添加的青链霉素只能抑制细菌的生长,然而,在实验中发现,组织块法经常会发生霉菌污染,基本都是肺组织本身的污染,而非操作的人为污染。因而,添加抗真菌药两性霉素B,可以降低微生物污染的机会,提高了成功率。③植块方法的改进:植块能否牢固贴壁并成活是植块培养成功与否的关键。为了使植块更好贴壁,不能将已剪碎的组织块过度冲洗,只能在干燥的培养皿中滴加2-3滴含血清的培养基,并尽可能在短时间内将组织块平铺到培养瓶内。为了保持组织活性,所有操作均在4℃冰袋上进行。培养瓶不需特殊处理,只需用含血清培养基预湿瓶壁。采用塑料培养瓶,依靠静电力贴壁。翻身时动作轻柔。经过上述改进,组织块贴壁率达90%以上,污染几率大大降低,细胞生长状态好、数量多。

到目前为止,由于还没有公认的微血管内皮细胞的特异蛋白或标志。因此,微血管内皮细胞的鉴定大多是根据器官和组织的起源,从形态、表型、生化和功能等方面进行综合评价。本研究应用透射电镜观察内皮细胞内的特殊结构Weibel-palade小体,同时结合免疫荧光法检测第Ⅷ因子相关抗原呈阳性表达,均证明培养的细胞为PMVEC[6,7]。

综上所述,本研究应用组织贴块法,并加以改进,建立了大鼠PMVEC的原代培养技术,成功地培养出大鼠PMVEC。此法成功率高、细胞产量高、寿命长、增殖旺盛,且能够持续传代培养。同时,细胞纯度高,鲜见成纤维细胞污染现象,因为成纤维细胞对血清没有内皮细胞敏感,因而在高浓度血清的培养条件下,成纤维细胞的爬出明显落后于内皮细胞。而最早爬出的血细胞,传代后即可除去,获得高纯度的PMVEC。整个培养过程简单有效、为深入研究PMVEC在疾病过程中的病理生理作用奠定了方法学基础。

摘要：实验应用SD雄性大鼠的外周肺组织,进行大鼠肺微血管内皮细胞(RPMVEC)的原代培养和传代培养,并从实验动物、培养基、操作条件、剪块方法、植块方法等细节方面对组织块法培养RPMVEC的方法进行探讨改进。同时,对培养细胞进行Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学鉴定,通过光镜和透射电镜观察细胞形态和超微结构,通过MTT观察细胞生长情况。体外培养的原代RPMVEC在光镜下呈多角形或梭形,胞核清晰,呈卵圆形。细胞单层呈典型的铺路石样排列。细胞生长状态良好、抗Ⅷ因子相关抗原染色阳性。透射电镜可见Weibel-Palade小体。改进后的组织块培养法获取RPMVEC的成功率高,污染几率低,细胞活力好,纯度高,数量大,同时保有了PMVEC的结构和功能,可用于进一步的实验研究。

关键词：大鼠肺微血管内皮细胞,培养方法,组织

参考文献

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[7]谢崧,杨晓静,钱桂生,等.大鼠肺微血管内皮细胞培养及鉴定.中国应用生理学杂志,1997;13(2):189—190

大鼠肺微血管内皮细胞 篇2

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

SD大鼠36只,雌雄不限,体重250～300 g,购自东南大学实验动物繁殖中心。

1.1.2 主要试剂

伊文蓝购自美国Sigma公司,VEGF酶联免疫吸附测定(ELISA)检测试剂盒购自德国R&D公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与肺缺血再灌注损伤模型的建立

36只SD大鼠随机分为假手术组和模型组(各18只),每组动物又分为VEGF检测、肺毛细血管通透性检测、肺干/湿重比检测3个亚组(每组各6只)。模型组大鼠称重后,按50 mg·kg-1腹腔内注射戊巴比妥钠全身麻醉,将其固定在动物支架上,尾静脉穿刺接输液泵,静脉输注乳酸林格液10 ml·kg-1·h-1;行气管插管,接小动物呼吸机(ASV,691-001型,美国),调整参数如下:容量控制通气,潮气量6 ml·kg-1,PEEP 5 cmH2O (1 cmH2O=0.098 kPa),呼吸频率 60～70 次·min-1,持续中等流量给氧 。在胸骨左外侧第3、4、5肋骨处切开皮肤,去除部分肌肉组织,暴露肋骨,平行于胸骨外缘切断3、4、5肋骨,暴露左侧胸腔,伸入平镊牵拉肺组织,暴露肺门,夹闭肺门,40 min后松开血管钳并开始计时,2 h时处死动物。假手术组组动物只切断3、4、5肋骨,暴露左侧胸腔,不闭合肺门。

1.2.2 肺灌洗液的获取

处死动物后,剪断气管,完整分离出肺脏。止血钳夹闭右主支气管,从主气管插入冲洗管(注射针皮条做成),用2 ml 注射器抽取1.5 ml PBS注入支气管,然后回抽;如此重复3次,收集3次的灌洗液用于VEGF检测。

1.2.3 肺组织蛋白抽提

取待检肺组织100 mg,加组织细胞裂解液1 ml,于匀浆器中制成匀浆液,以10 000 r·min-1 离心10 min后取上清液,经Brodfard法蛋白定量后用于ELISA测定。

1.2.4 VEGF检测

采用ELISA法。取出包被的酶标板,加入待测样品和标准品稀释液,每孔100 μl;封板纸覆盖酶标板,37 ℃孵育1 h;将酶标板内液体全部弃去,加入洗板液300 μl洗板,重复5次;加入生物素化的抗VEGF抗体,每孔100 μl,37 ℃孵育1 h;每孔加入100 μl HRP工作液。盖上盖板,37 ℃孵育30 min;每孔加入100 μl TMB工作液,盖上盖板,37 ℃避光孵育30 min;各孔加入中止液100 μl,混匀30 s;酶标仪测定450 nm光密度值;空白标准曲线计算出VEGF浓度。

1.2.5 肺毛细血管通透性检测

处死大鼠0.5 h前按20 mg·kg-1经尾静脉注射1%伊文蓝溶液,处死后,取出肺脏,将肺表面水分吸尽后称重,剪开左心房,自右心室内推注平衡盐液,冲洗肺血管内伊文蓝,直至流出液体清亮。而后将肺组织浸入4 ml甲酰胺溶液中,37 ℃恒温水浴中抽提24 h,离心,取上清液,用722型分光光度计在620 nm波长处读取吸光度值,通过标准曲线计算出提取的染料量,以单位组织中染料提取量反映肺毛细血管通透性。

1.2.6 肺干/湿重比检测

处死动物后,取左肺部分组织称重后,放入60 ℃恒温烤箱中72 h至恒重,再次称重,两次肺组织的净重比值即干/湿重比(W/D),可粗略反映肺水肿程度即血管外肺水测定。

1.3 统计学处理

所得数据应用t检验处理,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 肺灌洗液VEGF含量

见表1。

pg·g-1蛋白质

表1显示,模型组鼠肺VEGF的平均含量为2.640 pg·g-1蛋白质,假手术组的平均含量为1.450 pg·g-1蛋白质,经检验,两组肺灌洗液VEGF含量差异有统计学意义(t=3.10,P<0.05)。

2.2 肺组织VEGF含量

见表2。

pg·g-1蛋白质

表2显示,模型组鼠肺VEGF的平均含量为9.435pg·g-1蛋白质,假手术组的平均含量为8.64 pg·g-1蛋白质,经检验,两组肺组织VEGF含量差异无统计学意义(t=1.08,P>0.05)。

2.3 两组肺毛细血管通透性

见表3。

×10-3 mg·kg-1

表3显示,模型组鼠肺的伊文蓝平均含量为7.98×10-3 mg·kg-1,假手术组动物为4.39×10-3 mg·kg-1,经检验,两组动物肺毛细血管通透性差异有统计学意义(t=6.41,P>0.05)。

2.4 两组肺干/湿重比

见表4。

表4显示,模型组鼠肺干/湿重比值平均为 0.170,假手术组动物为0.207,经检验,两组动物肺肺干/湿重比差异有统计学意义(t=2.95,P<0.05)。

3 讨 论

VEGF又称为血管通透因子(vascular permealility factor,VPF),它包括几种作用相似的因子,即VEGF- A、VEGF- B、VEGF- C、VEGF- D。各种亚分子构成的氨基酸数目有一定的差异。VEGF家族通过3种高亲和力酪氨酸激酶受体(VEGFR)发挥作用,分别为:VEGFR- 1、 VEGFR- 2和VEGFR- 3受体[4,5,8]。一般认为,VEGFR- 1主要介导血管的通透性,VEGFR- 2主要介导血管内皮的新生,VEGFR- 3则主要维持正常的血管功能。VEGF及其受体在正常胚胎发育中发挥重要作用,可维持血管内皮细胞的存活。VEGF通过与其高亲和的受体结合后,导致细胞蛋白的酪氨酸磷酸化,从而调节细胞的各种功能,其中,缺血缺氧是VEGF mRNA表达的最强刺激因素[8]。

正常情况下,VEGF在肺组织中分布广泛,主要分布于Ⅱ型肺泡上皮细胞、血管内皮细胞、外周细胞、气管及支气管的上皮细胞等部位。应激条件下,如低氧、缺血、感染等均能引起VEGF的大量释放,同时介导VEGF的合成增加[9]。

临床及实验已经证实,在急性肺损伤过程中,血管渗透性明显增强,VEGF在其中起到十分重要的作用[10,11,12]。在人类的急性呼吸窘迫综合征,VEGF的作用明显增强[13]。另外,Carpenter等发现,低氧环境下感染的鼠使用VEGF的受体抑制剂可以明显减轻肺组织的水肿[14],从而更进一步明确了VEGF在肺组织损伤中的作用。

本实验发现,模型组动物肺组织伊文蓝的浸出明显增加,表明肺缺血再灌注后血管的通透性明显增加;同时,模型组鼠肺干/湿重比明显小于假手术组,表明模型组鼠肺含有更多的液体成分。我们推测是由于再灌注后血管的通透性增加,导致大量液体释放滞留于肺泡及肺间质,从而导致干/湿重比降低。

肺缺血再灌注后组织的水肿有多种因素,一般认为缺血后的低氧、活性氧族(ROS)及活性氮族(RNS)的大量产生,以及一些炎症介质的释放都是导致血管渗出性增加的重要因素,而VEGF作为肺组织中分布广泛、功能活跃的重要的生物介质,也可能起到一定的作用。Mura等[3]通过肺缺血再灌注造成急性肺损伤的模型检测到肺灌洗液中VEGF蛋白明显增加,肺组织中VEGF的mRNA表达明显增加,提出了VEGF是诱发肺组织水肿的重要因素,Carpenter等[14]则观察到,在低氧环境下病毒感染的鼠肺VEGF蛋白和mRNA表达都有明显的增加,认为其是导致肺组织水肿的主要原因。

大鼠肺微血管内皮细胞 篇3

1 材料与方法

1.1 实验动物

3d内的Wistar新生大鼠,雌雄不拘。由天津市山川红实验动物科技有限公司提供(合格证号:0004036)。

1.2主要试剂和仪器

胰蛋白酶(sigma),Ⅱ型胶原(gibco),DMEM-F12(hyclone),胎牛血清(bioind),肝素钠,内皮细胞生长因子(ECGF,sigma),第Ⅷ因子相关抗原抗体(北京博奥森)及免疫组化SABC染色试剂盒(北京索莱宝)。恒温二氧化碳培养箱(Thermo),倒置相差光学显微镜(Leica),新颖立式小容量恒温摇床(上海世平实验设备有限公司),高速冷冻离心机。

1.3 实验方法

1.3.1 CMEC的原代培养

取1d~3d龄Wistar大鼠,于含75%酒精的无菌小烧杯中浸泡5s~6s后迅速取出置于无菌培养皿中,无菌开胸,暴露心脏,于心脏收缩期剪下心脏,放于预冷的盛有PBS缓冲液和少量1%双抗的培养皿中,清洗三次,去除残留血液,第二次清洗时去掉结缔组织、心房组织及部分血管。三遍清洗后,将其转移至锥形瓶瓶口中,将心室肌剪为1mm3碎块,加入0.1%胶原酶和0.06%胰蛋白酶的混合酶5mL,新颖立式小容量恒温摇床37℃,转速110次/分,震荡5min,吸取第一次消化后的上清液,弃去,因其含有残留血细胞和部分坏死心肌细胞碎片等,于第二次消化时收集上清液,200目细胞筛过滤至预冷的盛有5mL完全培养基的50mL离心管里,反复消化4次~5次,至组织消化成半透明状时终止继续消化,1 000r/min,10min离心后倒掉上清,加入适量完全培养基小心轻柔重悬细胞沉淀,将混匀的细胞悬液转入75cm2培养瓶中,放入恒温二氧化碳培养箱内,差速培养1h30min后取出,去除未贴壁细胞,重新加入完全培养基(90%DMEM/F12培养基,10%胎牛血清以及1%双抗,1%ECGF,1%肝素)培养,隔日换液,直到长至单层细胞铺满80%以上的瓶底即可传代。根据实验目的,调整细胞密度至合适浓度,轻柔吹打均匀后种板或加入培养瓶培养,首次2d换液1次,以后隔天换液。本次实验取1mL加入12孔板内,板内含有预先用多聚赖氨酸包被的圆形盖玻片,用于免疫组化纯度鉴定。

1.3.2 CMEC的传代培养

传代时,弃去旧培养液,PBS清洗3次后,以适量的0.25%胰酶-EDTA消化液消化约2min(镜下观察细胞状态以控制消化时间),并轻轻吹打制成细胞悬液,离心800rm/min,8min,再以完全培养基重悬细胞,转种于培养瓶中,此为第一代细胞,等细胞生长至铺满大部分培养瓶底部,约80%融合时即可进行下一次传代。

1.3.3 CMEC生长曲线绘制

以适量细胞密度接种于24孔培养板中培养,共21孔,每24h取3孔细胞进行细胞计数,求其平均值作为指标数值,连续7d绘制生长曲线。

1.4 CMEC的形态学观察

原代培养3d后,无菌条件下取出经多聚赖氨酸包被的细胞玻片,4%多聚甲醛固定30min,PBS清洗2次,0.5%TritonX-100通透20min。室温5%BSA封闭30min,用SABC法检测Ⅷ因子相关抗原的表达。兔抗鼠Ⅷ因子相关抗原抗体浓度为1∶100,4℃孵育过夜,37℃下二抗孵育20min,DAB显色。

2 结果

2.1 CMEC生长曲线

通过细胞计数法所绘制的细胞生长曲线大致成倒S形,说明生长过程分三个时期,潜伏期、指数生长期、平台期。

2.2 倒置显微镜下观察细胞形态

原代培养乳鼠CMEC最初分离时为贴壁圆形,细胞形态不明显;2d~3d时呈短梭形、多边形,之后迅速增长至融合状态,呈铺路石样。

2.3 CMEC鉴定

通过免疫细胞化学SABC法检测Ⅷ因子相关抗原,胞浆中有棕黄褐色着色,即呈阳性反应。

3 讨论

不同管径、组织的血管内皮细胞在结构、功能、表面分子等方面具有不同的功能特性,因此,研究某一器官或组织的微血管病变,应采用该器官组织的微血管内皮细胞[1,2]。在缺血性心血管疾病中,微血管内皮细胞是重要的靶细胞,而市面出售的微血管内皮细胞株价格较贵且传代次数有限,因此,建立CMEC离体培养模型,对于细胞损伤的分子机制及药物保护等的研究有重要意义。由于在微血管内皮细胞的分离过程中不可避免地会伴随有非血管内皮细胞的污染,因此,微血管内皮细胞的纯化是决定微血管内皮细胞培养成功与否的关键。本实验采用胰酶和胶原酶等体积混合消化,两种酶共同作用,能促使纤维母细胞等非内皮细胞的破坏,提高内皮细胞的纯度[3]。CMEC与大血管内皮细胞不同,需要在培养基中添加生长因子,这种生长因子提供了CMEC生长所需的成分,同时可抑制其他细胞的生长,促进CMEC优势生长,为体外培养该细胞的生长增殖创造特定的微环境。CD31是很好的内皮细胞标记物,但在培养过程中只有HUVEC和肺内皮细胞能将其保留下来,其他类型的细胞常丢失[4],故本实验选用另一经典特征第Ⅷ因子相关抗原作为鉴定指标。在整个取材、分离、剪碎的过程中,要注意始终保持低温操作,以保证细胞活性。尽量缩短取下心脏至剪成碎块时间。消化过程尽量控制在半小时至一小时内。整个操作流程必须严格遵循无菌原则。

本实验提供了体外培养乳鼠CMEC的简便方法,为进一步探讨心脏微环境的生理及病理生理改变的研究提供了实验基础。

摘要：目的 建立乳鼠心脏微血管内皮细胞(CMEC)体外培养研究模型。方法 采用混合酶(0.06%胰蛋白酶和0.1%Ⅱ型胶原酶均量混合)消化法和差速贴壁法纯化细胞,倒置显微镜对所培养的细胞进行形态学观察,以Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色法进行细胞鉴定。结果 通过形态学特征及微血管内皮细胞相关特异性抗原检测证实,得到高纯度乳鼠心脏微血管内皮细胞。结论 利用混合酶消化法成功分离并培养乳鼠的CMEC,该方法简单易行,可用于进一步的科学研究。

关键词：心脏微血管内皮细胞,原代培养,乳鼠

参考文献

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大鼠肺微血管内皮细胞 篇4

1材料与方法

1.1 实验动物及分组

雄性SD大鼠54只, 体重 (200±20) g, 由浙江中医药大学动物实验中心提供, 随机分为6组, 正常对照组、模型组、血府逐瘀汤预防组、血府逐瘀汤治疗组、硝苯地平预防组、硝苯地平治疗组, 每组9只。

1.2 实验药物及试剂

血府逐瘀汤:按照《医林改错》原方组成药味, 由浙江中医药大学中药制剂室制成流浸膏, 生药含量2.2g/ml;硝苯地平片:浙江万马药业有限公司, 批号:080103。MCT:Sigma公司;PCNA抗:丹麦DAK0公司;Caspase-3抗:美国LabVision (Thermo scientfic) 公司。

1.3 造模与给药方法

将野百合碱充分溶解于2∶8乙醇生理盐水中, 配制成1%浓度。模型组、血府逐瘀汤预防组、血府逐瘀汤治疗组、硝苯地平预防组和硝苯地平治疗组按60mg/kg剂量腹腔一次性注射野百合碱溶液, 正常组腹腔注射等剂量的2∶8乙醇生理盐水, 两预防组从造模第2天开始分别予血府逐瘀汤 (8.75g/kg·d-1) 和硝苯地平 (10mg/kg·d-1) , 直到第28天;两治疗组从造模第15天开始分别予血府逐瘀汤 (8.75g/kg·d-1) 和硝苯地平 (10mg/kg·d) -1, 直到第28天, 正常组及模型组予等量生理盐水。均采用灌胃给药, 每日1次。末次给药后1小时采集标本。实验过程中模型组大鼠死亡1只。

1.4 观察指标检测

1.4.1 肺小动脉病理形态学观察

取右下叶肺组织, 右肺门横断取材, 常规石蜡制片, HE染色观察肺小动脉形态学改变, 采用图象分析仪测量与终末细支气管伴行的肺小动脉管腔内径 (ID) 、外径 (ED) , 管腔面积 (VA) , 血管总面积 (TAA) , 然后分别计算出管壁厚度 (WT) =管腔外径-内径, 管壁面积 (MA) =血管总面积-管腔面积, 最后计算管壁厚度与血管外径比值 (WT%) 和管腔面积与血管总面积比值 (VA%) , 每张切片均选取3个小动脉进行定量分析, 并取其平均值进行统计学分析。

1.4.2 PCNA蛋白表达的检测

免疫组织化学染色方法检测。利用图像分析系统 (Image-ProPlus 5.0) 在200倍光镜下观察PCNA免疫组化染色切片, 每份标本随机观察20根管径在15～100μm的血管, 计数血管壁上所有细胞数和PCNA染色阳性细胞数。PCNA增殖度 (%) = (PCNA染色阳性细胞数/总细胞数) ×100%。

1.4.3 Caspase-3蛋白表达的检测

免疫组织化学染色方法检测。利用图像分析系统, 200倍光镜下, 观察Caspase-3免疫组化染色切片, 每份标本随机观察20根管径在15～150μm的血管, 计数血管壁上所有染色阳性细胞数和血管壁总细胞数。 Caspase-3染色阳性率 (%) = (血管壁上染色阳性细胞数/血管壁总细胞数) ×100%。

1.5 统计方法

所得数据以均数±标准差undefined表示, 采用SPSS13.0统计软件包进行处理。多样本均数比较采用单因素方差分析, 方差齐性两两比较采用SNK法检验, 方差不齐性则两两比较采用Tamhane’s T2法;以P<0.05作为差异具有统计学意义。

2实验结果

2.1 各组大鼠肺小动脉病理形态学比较

光镜下见正常组大鼠肺小动脉管壁薄, 内皮细胞扁平连续, 厚薄较一致;模型组大鼠肺小动脉管腔变小、不规则, 内皮细胞变性肿胀, 平滑肌细胞增生肥厚明显;各药物组大鼠肺小动脉血管壁稍增厚、管腔略有变窄, 见图1～6。

各组大鼠图像分析结果显示:模型组小动脉管壁增厚、管腔狭窄明显, WT%明显增大, VA%则明显减小, 与正常组比较有统计学意义 (P<0.01) ;与模型组比较, 各药物组管壁增厚、管腔狭窄不明显, 肺小动脉 WT%均明显降低, VA%均明显增大, 其差异均有统计学意义 (P<0.01～0.05) ;各药物组间差异无统计学意义 (P>0.05) , 见表1。

与正常组比较△P<0.05, △△P<0.01;与模型组比较*P<0.05, **P<0.01

2.2 各组大鼠肺血管壁PCNA、Caspase-3蛋白表达的比较 见表2。

与正常组比较△P<0.05, △△P<0.01;与模型组比较*P<0.05, **P<0.01

与正常组比较, 模型组PCNA增殖度明显升高, 差异有统计学意义 (P<0.01) ;与模型组比较, 各药物组PCNA增殖度明显减少, 差异有统计学意义 (P<0.01) , 各药物组之间差异无统计学意义 (P>0.05) 。

与正常组比较, 模型组Caspase-3染色阳性率明显下降, 差异有统计学意义 (P<0.01) ;与模型组比较, 各药物组Caspase-3染色阳性率明显升高, 差异有统计学意义 (P<0.01～0.05) , 各药物组之间差异无统计学意义 (P>0.05) 。

3讨论

目前认为肺血管重构是肺动脉高压不可逆发展的基本因素, 如何阻止肺血管重构是治疗肺动脉高压的关键所在[3], 内皮细胞功能紊乱和肺动脉平滑肌细胞增殖是导致血管重构进而出现肺动脉高压的主要原因。在正常情况下, 肺动脉平滑肌细胞的增殖和凋亡之间保持着一种相对平衡, 当血管平滑肌细胞增殖凋亡失衡后, 会出现一系列病理改变, 是肺血管发生重构的重要因素, 因此抑制肺动脉平滑肌细胞的增殖、促进其凋亡是干预肺血管重构的研究方向之一。增殖细胞核抗原 (PCNA) , 不仅和DNA的复制和修复有关, 而且在细胞周期的调控中起重要作用[4], 是反映细胞增殖状态的良好指标;Caspase-3是一种效应Caspase, 活化后可直接切割细胞内广泛的蛋白质递质, 引发细胞凋亡, 是各条凋亡通路的枢纽[5]。本实验结果提示模型组大鼠PCNA增殖度明显升高, Caspase-3阳性率明显下降, 而血府逐瘀汤各组均能逆转两者的失衡, 故能达到干预肺血管重构的目的。

肺血管重构, 中医认为属肺脏久病, 肺肾两虚, 病邪由气入血而病络, 或邪气直接扩散入于肺络, 络气亏虚, 气虚无力推动血及津液的正常运行而致血停成瘀, 津聚为痰, 痰浊、瘀血有形之邪阻塞肺络, 致肺络改变, 病理因素主要为是“痰”和“瘀”, 故活血化瘀法应贯穿于各证型治疗之中。

血府逐瘀汤出自《医林改错》, 是清代王清任用以治疗“胸中血府血瘀”所致诸症的经验方。方中以桃红四物汤活血化瘀而养血, 防纯化瘀之伤正, 四逆散疏理肝气, 使气行则血行;加桔梗引药上行达于胸中, 并宣肺祛痰, 牛膝引瘀血下行而通利血脉;诸药相合, 构成理气活血之剂。本方具有活血化瘀而不伤血, 理气而不耗气的特点, 广泛用于由瘀血阻滞所致的各种病证[6,7,8,9]。通过本实验观察发现血府逐瘀汤能有效减轻肺血管重构, 病理上表现为减轻管壁增厚及管腔狭窄, 其机制可能与调节平滑肌细胞增殖与凋亡有关。

摘要：目的:观察血府逐瘀汤 (XFZYT) 对野百合碱 (MCT) 诱导肺血管重构大鼠肺血管平滑肌细胞增殖与凋亡的干预作用, 并探讨其作用机制。方法:雄性SD大鼠54只, 随机分为正常对照组、模型组、血府逐瘀汤预防组、血府逐瘀汤治疗组、硝苯地平预防组、硝苯地平治疗组, 采用一次性腹腔注射MCT (60mg/kg) 复制肺血管重构大鼠模型。药物干预后观察各组大鼠肺血管病理形态学变化, 并采用免疫组化技术检测大鼠肺血管增殖细胞核抗原 (PCNA) 及Caspase-3蛋白表达情况。结果:与模型组比较, 各药物组均能使肺小动脉管壁有不同程度变薄、管腔变大 (P<0.05～0.01) ;血管增殖细胞核抗原 (PCNA) 增殖度下降, Caspase-3蛋白阳性率升高 (P<0.05～0.01) 。结论:血府逐瘀汤能有效减轻大鼠肺血管重构, 其机制可能与调节平滑肌细胞增殖与凋亡有关。

关键词：血府逐瘀汤/药理学,肺血管重构/病理学,肌, 平滑, 血管/药物作用,细胞凋亡,大鼠

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大鼠肺微血管内皮细胞 篇5

IFN-γ是一种具有多种生物学功能的免疫活性分子, 具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等多方面功能[3]。体外培养的内皮细胞 (ECs) , 用IFN-γ刺激后, 低浓度时IFN-γ诱导细胞增殖, 而浓度增加到约50 U/mL时抑制细胞增殖, 但未发现细胞凋亡现象。研究表明, IFN-γ可上调多种细胞表面ICAM-1的表达。在局部应用IFN-γ可诱导毛细血管ECs上ICAM-1表达增高2～3倍, 在非实质的ECs及上皮细胞上亦可见ICAM-1表达的增高。IFN-γ可以单独或协同其他细胞因子提高ICAM-1在MVECs表面的表达。但尚未见IFN-γ对大鼠肠黏膜MVECs表达ICAM-1的研究报道。因此, 试验以体外培养的大鼠肠黏膜MVECs为研究对象, 采用流式细胞技术研究IFN-γ对大鼠肠黏膜MVECs表面表达ICAM-1的影响。研究结果不仅可以解释IFN-γ的作用机理, 还有利于揭示MVECs的免疫功能, 从而为IFN-γ与MVECs之间的关系提供试验依据。

1 材料

1.1 试验动物

青年Sprague-Dawley (SD) 大鼠, 购自中国农业科学院遗传与发育生物学研究所动物中心, 雌雄不限, 75%乙醇消毒, 颈椎脱臼处死后剖开腹腔取出小肠, 放入Hank’s 液内, 备用。

1.2 试验设备

流式细胞仪 (COULTER EPICS XL) 、低温冰箱 (MPR-414F) 、细胞培养箱 (MCO-17AC) , 日本Sanyo公司生产;倒置荧光显微镜 (IX71) , 日本奥林帕斯实业集团有限公司生产;超净工作台 (DL-CF-IND) , 哈尔滨东联电子技术开发有限公司生产;低速离心机 (KA-1000) , 上海安亭科学仪器厂生产;超纯水仪 (Milli-Q A10) , 日本Millipore公司生产;酸度计 (UB-7) , 北京赛多利斯仪器系统有限公司生产;高压灭菌器 (TMQR-3850) , 山东新华医疗器械股份有限公司生产;恒温干燥箱 (202-2A) , 天津市泰斯特仪器有限公司生产;恒温水浴锅 (DK-S24) , 上海森信实验仪器有限公司生产;漩涡混合仪 (QL-901) , 江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司生产;数码相机 (Coolpix4500) , 日本Nikon公司生产;电子天平 (BS124S) , 德国赛多利斯科学仪器公司生产;超声波清洗器 (KQ5200DV) , 昆山市超声仪器有限公司生产;眼科手术器械, 苏州六六视觉科技股份有限公司生产;微孔滤膜, 上海兴亚净化材料厂生产;细胞培养板, 美国Costar公司生产。

1.3 主要试剂

DMEM干粉 (高糖, H2693) 、胰蛋白酶 (批号为2750018) , 美国Gibco 公司生产;胎牛血清 (FBS, 批号为A15108-1479) , 奥地利PAA公司生产;ECGS (批号为E2759) 、胶原酶Ⅱ (批号为C2674) 、Hank’s干粉 (批号为H6648) 、L-谷氨酰胺 (批号为036k0099) , 美国Sigma公司生产;青霉素钠粉针剂 (批号为E0409136) 、链霉素粉针剂 (批号为N0402106) , 华北制药股份有限公司生产;兔抗Ⅷ因子相关抗原多克隆抗体 (批号为sc14014) , 美国Santa Cruz公司生产;PE标记的抗大鼠ICAM-1单克隆抗体 (批号为MR150075) 、PE标记的mouse IgG1 (批号为B112609) , Antigenix公司生产。

2 方法

2.1 大鼠肠黏膜MVECs的培养

试验用大鼠肠黏膜MVECs, 由北京市兽医学 (中医药) 重点实验室提供, 对大鼠肠黏膜MVECs进行第Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学鉴定, 呈阳性, 可用于生物学功能的进一步研究。

2.2 流式细胞技术

纯化传代培养细胞12～14 d, 细胞长满后用不含血清的维持培养基培养24 h, 选取浓度为 20 ng/mL和40 ng/mL的IFN-γ分别刺激2 h、6 h和12 h, 同时设空白对照组和同型对照组。将培养细胞用0.25%胰蛋白酶消化3～5 min, 至光镜下见到贴壁细胞间出现筛状间隙为止, 弃去消化液, 加PBS液。用移液器将细胞从培养板壁上轻轻吹打下来, 并移入离心管中, 800～1 000 r/min离心5 min。弃上清液, 加pH值为7.4的PBS液5～8 mL洗涤, 轻轻吹打细胞上百次, 混匀, 800～1 000 r/min离心3～5 min, 重复上述步骤2～3次, 以去除细胞悬液中的细胞碎片, 用PBS制成单细胞悬液并调整细胞浓度为1×106/mL。加100 μL PBS, 将沉淀细胞轻轻吹打均匀, 低温保存, 备用。向处理组细胞和空白对照组中加入荧光标记的细胞因子单克隆抗体, 同型对照细胞中加入10 μL PE标记的抗大鼠ICAM-1单克隆抗体, 混匀;避光室温放置30 min。用流式细胞仪检测荧光值, 每管计数10 000个细胞。

3 结果与分析

3.1 流式细胞技术

当IFN-γ浓度分别为20 ng/mL和40 ng/mL时, ICAM-1阳性细胞百分率和阳性细胞荧光强度, 见表1、图1、图2。

3.2 图表分析

当IFN-γ浓度分别为20 ng/mL和40 ng/mL时, ICAM-1阳性细胞百分率的对比结果见图3, 阳性细胞荧光强度的对比结果见图4。

由图3和图4可知:当IFN-γ浓度为20 ng/mL时, 加入PE标记的抗大鼠ICAM-1单克隆抗体后, 阳性细胞百分率与空白对照组相比, 明显升高, 即ICAM-1的表达有明显上调, 6小时时阳性细胞百分率达到最高值 (98.68%) , 即表达量达到高峰, 随后有微弱下降;加入PE标记的抗大鼠ICAM-1单克隆抗体后, 阳性细胞荧光强度同样明显升高, 并在6小时时达到峰值 (70) 。

当IFN-γ浓度为40 ng/mL时, 加入PE标记的抗大鼠ICAM-1单克隆抗体后, 阳性细胞百分率与空白对照组相比, 明显升高, ICAM-1表达量的变化趋势与20 ng/mL组相似, 在6小时时达到最高值 (98.65%) ;加入PE标记的抗大鼠ICAM-1单克隆抗体后, 阳性细胞荧光强度也明显升高, 但在2, 6, 12小时时变化平稳, 没有最高峰。

4 讨论

MVECs是一种多功能分泌细胞, 能够分泌或表达数十种局部激素和细胞因子, 也是这些激素或细胞因子作用的靶细胞[4]。在MVECs的诸多生理功能中, 其免疫学特性越来越受到关注。MVECs通过抗原呈递, 产生各种细胞因子和表达细胞表面黏附分子来调控机体的免疫反应。MVECs不仅可以成为免疫反应的启动部位, 而且是免疫反应重要的效应部位和调控部位。大多数生理及病理过程均发生在MVECs的水平, MVECs是许多病毒和细菌攻击的主要靶点[5]。肠黏膜MVECs是机体抵御肠道病原体感染的第一道防线, 在许多重要疾病的发病机制中起关键作用。ICAM-1为免疫球蛋白超家族的成员之一, 在各种有核细胞的表面广泛地表达, 如白细胞、VECs、成纤维细胞等[6]。ICAM-1通过与炎性细胞表面同簇型配体之间相互作用来介导细胞与细胞、细胞与基质蛋白的黏附, 特别是ECs与白细胞的黏附, 在免疫监视、免疫逃逸、炎症反应、吞噬过程和免疫调节等过程中起非常重要的作用[7]。IFN-γ是一组具有多种功能的活性蛋白质 (主要是糖蛋白) , 具有广谱的抗病毒、影响细胞的生长及分化、调节免疫功能等多种生物活性, 是机体防御系统的重要组成部分[8]。IFN-γ是一种广谱抗病毒剂, 并不直接杀伤或抑制病毒, 而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白, 从而抑制病毒的复制;同时还可增强自然杀伤细胞 (NK细胞) 、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力, 从而起到免疫调节作用, 并增强抗病毒能力[9]。

试验研究了IFN-γ对诱导大鼠肠黏膜MVECs表达ICAM-1的影响。研究表明:适宜浓度的IFN-γ对MVECs表面ICAM-1有明显上调作用, 且随着作用时间的延长表达量呈现先升高后降低的趋势。IFN-γ可能通过调节MVECs表面ICAM-1影响黏附其上或穿越内皮层的免疫细胞功能, 从而参与机体的免疫功能, 这也进一步阐明了MVECs的免疫功能以及IFN-γ在炎症、免疫反应中的作用, 如研究下调细胞ICAM-1表达的因素有利于寻找防治炎症、免疫性疾病和器官移植排斥反应的新途径[6]。

5 结论

IFN-γ对诱导大鼠肠黏膜MVECs表达ICAM-1有明显上调作用。

参考文献

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[8]马利军, 王海燕.细胞粘附分子:基础与临床[J].国外医学:泌尿系统分册, 1994 (14) :101.

大鼠肺微血管内皮细胞 篇6

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

海带多糖为本实验室自行提取[5],用生理盐水稀释备用;肾上腺素(adrenalin,Adr)、血管性假血友病因子(Von Willebrand factor,v WF)检测试剂盒系武汉华美公司产品。一氧化氮(NO)试剂盒购于Cayman Chemical Company;内皮素(endothelin,ET)、6-酮-前列环素F1α(6-Keto-PGF1α)、血栓素B2(thromboxane B2,T×B2)试剂盒购于北方放射免疫生物技术公司。苯肾上腺素(phenylephrine,PE)、去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)购于上海禾丰制药有限公司;乙酰胆碱(acetylcholine,Ach)购于上海三爱思试剂有限公司。雄性SD大鼠(200~250 g)由广西医科大学实验动物中心提供。

1.2 仪器设备

i MARK型全自动酶标仪,美国Bio Rad公司;γ放射免疫计数器,合肥众成机电技术开发有限公司;张力换能器及Powerlab/4sp生物信号采集处理系统,埃德仪器国际贸易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 心理应激大鼠模型的复制

将大鼠随机分为对照组、模型组、海带多糖低剂量组(LP-L组)、海带多糖高剂量组(LP-H组)、低分子肝素组。药物组分别腹腔注射海带多糖(1 mg/kg或5 mg/kg)或低分子肝素(1 IU/kg),对照组和模型组同法注射等量生理盐水,每日2次,连续10 d。对照组大鼠群居饲养,不给予情绪应激,其余各组复制愤怒心理应激模型[6,7]。

1.3.2 大鼠血浆肾上腺素、v WF、NO、ET、6-Ke-to-PGF1α、T×B2水平检测

取血抗凝后3 000r/min离心10 min,取上清-80℃存放。分别以化学法和放射免疫法检测血浆中肾上腺素、v WF、NO、ET、6-Keto-PGF1α、T×B2的水平。

1.3.3 胸主动脉环的制备及血管环舒张实验

各组大鼠取血后迅速取其胸主动脉,置于预先氧饱和的4℃K-H液中,制成3 mm宽的血管环,并放入含K-H液(37℃恒温,并持续通入95%氧气和5%二氧化碳的混和气体)的浴槽内,用2个L型不锈钢小钩小心贯穿入血管环管腔,一端固定与浴槽底部,另一端通过丝线链接于张力换能器。血管环在0.5 g张力下稳定30 min后给予1.5 g张力平衡90 min开始实验,期间每15 min换K-H液1次。平衡后予以10-6mol/L PE预收缩至最大收缩张力并稳定后,先后分别加入累积浓度Ach(10-8~10-4mol/L)和NE(10-9~10-5mol/L),记录血管环的张力,分别记录血管环的舒张张力和收缩张力,并计算血管舒张百分比和收缩百分比[8,9]。

1.4 统计学处理

采用SPSS13.0统计软件进行统计分析,所有数据采用均数±标准差表示,组间比较用单因素方差分析,以P<0.05为组间差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心理应激后各组大鼠的血浆肾上腺素水平

与对照组比较,模型组、LP-L组、LP-H组和低分子肝素组血浆肾上腺素水平明显增高(P<0.05);与模型组比较,LP-L组、LP-H组和低分子肝素组的血浆肾上腺素水平差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

2.2 海带多糖对心理应激大鼠血浆中v WF水平的影响

与对照组比较,模型组、LP-L组血浆v WF水平明显增高(P<0.05);与模型组比较,LP-H组的血浆v WF水平显著降低(P<0.05)。见图2。

2.3 海带多糖对心理应激大鼠血浆中NO、ET的影响

1)与对照组比较,P<0.05;2)与模型组比较,P<0.05

与对照组比较,模型组血浆NO水平显著降低,血浆ET水平显著升高,NO/ET比例显著降低(P<0.05)。与模型组比较,LP-H组血浆NO水平显著升高,血浆ET水平显著降低,NO/ET比例显著升高(P<0.05)。见表1。

注:1)与对照组比较,P<0.05;2)与模型组比较,P<0.05

2.4 海带多糖对心理应激大鼠血浆中6-Keto-PG F1α、TXB2的影响

与对照组比较,模型组血浆6-Keto-PGF1α水平显著降低,6-Keto-PGF1α/T×B2比例显著降低(P<0.05)。与模型组比较,LP-H组血浆6-KetoPGF1α水平显著升高,6-Keto-PGF1α/T×B2比例显著升高(P<0.05)。各组间TXB2比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

注:1)与对照组比较,P<0.05;2)与模型组比较,P<0.05

2.5 海带多糖对心理应激大鼠离体血管环内皮依赖性舒张反应的影响

与对照组比较,模型组、LP-L组和低分子肝素组对累计剂量乙酰胆碱(Ach)诱导的血管内皮依赖性舒张反应显著降低(P<0.05)。与模型组比较,LP-H组血管内皮依赖性舒张反应明显增高(P<0.05),LP-L组和低分子肝素组与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

2.6 去甲肾上腺素对血管环收缩反应的影响

与对照组比较,模型组对去甲肾上腺素(NE)诱导的血管内皮依赖性收缩反应显著增强(P<0.05),其余各组差异无统计学意义(P>0.05);与模型组比较,LP-H组血管内皮依赖性收缩反应显著减弱(P<0.05),LP-L组和低分子肝素组与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。

注:1)与对照组比较,P<0.05;2)与模型组比较,P<0.05

1)与对照组比较,P<0.05,2)与模型组比较,P<0.05

3 讨论

本研究采用的动物模型参考了MEGAN[6,7]的实验方法,实验大鼠长期孤独饲养而具有攻击性,能够本能地对侵入者发起攻击从而保卫自己的领地,产生愤怒心理和行为。该模型躯体刺激已减少到极小,主要是心理应激成分在起作用,是一种更接近人类发怒的愤怒动物模型[10]。应激时交感神经兴奋,下丘脑-垂体-肾上腺轴和肾素-血管紧张素系统引起各种应激激素如肾上腺素、皮质醇等的释放。本研究中发现肾上腺素、皮质醇升高,与KATZ等[11]报道研究相似,说明本研究应激模型复制成功。

v WF是由血管内皮细胞和巨核细胞产生的一种糖蛋白,当血管内皮细胞受损,v WF合成增加并大量释放入血,使血浆v WF浓度升高[12]。本研究显示,模型组血浆v WF水平明显增高,提示心理应激可能导致了大鼠血管内皮细胞的损伤。通过海带多糖干预,大鼠血浆中v WF水平明显降低,说明海带多糖对心理应激导致的血管内皮细胞的损伤具有一定的保护作用。

血管内皮细胞可分泌多种血管舒缩因子如NO、ET、T×A2和PGI2等,以调节血管正常的舒缩状态,从而维持基础张力的稳定[13]。NO是内源性血管舒张因子的主要活性成分,参与维持内皮依赖性舒张活性;防止内膜形成血栓等。ET是目前认为收缩血管最强的因子,当血管内皮细胞释放NO减少时,又可进一步促进内皮细胞合成释放ET增加,从而导致NO/ET比例失调,导致血管收缩功能障碍[14,15]。VEC合成的另一对调节血管张力的细胞因子是T×A2和PGI2,二者在血液中不稳定,检测其代谢产物T×B2和6-keto-PGF1α能较好地反映体内前者的水平。T×A2则具有促进血小板聚集和引起血管收缩的作用,PGI2具有强烈的抑制血小板聚集和舒张血管的作用。NO/ET、6-keto-PGF1α/T×B2之间的平衡被打破从而导致血栓形成和血管痉挛的发生,成为冠状动脉粥样硬化性心脏病心绞痛发生的另一重要因素[16]。本研究显示,模型组血浆NO、6-ketoPGF1α水平显著降低,ET水平显著升高,并且NO/ET、6-Keto-PGF1α/T×B2比例显著降低,说明心理应激造成的内皮损伤导致血管的舒缩因子释放失衡,其原因可能是由于肾上腺素分泌增多,肾上腺素在A型单胺氧化酶作用下,脱氨生成甲醛、过氧化氢和氨[17,18,19]等毒性产物,对内皮细胞产生氧化损伤。而海带多糖干预后,血管内皮释放的NO、6-keto-PGF1α水平显著升高,ET水平显著降低,NO/ET-1、6-Keto-PGF1α/T×B2比例显著升高,提示海带多糖可能通过保护血管内皮细胞维持血管舒缩因子的释放平衡。

Ach通过作用于内皮细胞,使其合成和释放NO增加,引起邻近的血管平滑肌松弛。NE也可以刺激内皮细胞释放NO,从而调节血管的收缩[20]。离体胸主动脉血管环实验也说明,心理应激导致大鼠血管环内皮依赖性舒张反应降低,内皮依赖性收缩反应增强,这可能与心理应激导致大鼠血管内皮细胞损伤,从而使其释放内皮源性舒缩因子失衡有关,而海带多糖能够有效地维持血管环的内皮依赖性舒缩反应,进一步说明海带多糖对血管内皮细胞的保护作用能够维持血管舒缩因子的释放平衡,从而维持血管的舒缩功能。低分子肝素对内皮细胞具有一定的保护作用[21],但本研究显示其对心理应激所致的血管内皮细胞损伤的保护作用弱于海带多糖。

综上所述,心理应激导致血管内皮细胞的损伤,使血管内皮释放舒缩因子NO/ET、6-Keto-PGF1α/T×B2失衡,导致了血管内皮依赖性舒缩反应异常。海带多糖能够调节内皮舒缩因子释放平衡,从而维持了正常的血管内皮依赖性舒缩反应,能够保护心理应激诱导的血管内皮细胞损伤。

摘要：目的 探讨海带多糖对心理应激大鼠血管内皮细胞释放血管舒缩因子的调节作用。方法 采用心理应激方法复制血管内皮损伤模型,大鼠随机分为对照组、模型组、海带多糖低剂量组(LP-L组)、海带多糖高剂量组(LP-H组)及低分子肝素组。造模后取血,用ELISA法检测血浆肾上腺素、血管性血友病因子(vWF)、一氧化氮水平,用放射免疫计数法检测血浆内皮素(ET)、6-酮-前列环素F1α(6-Keto-PGF1α)、血栓素B(2T×B2)水平,用离体胸主动脉环实验观察血管内皮依赖性舒缩反应。结果 与对照组比较,模型组、LP-L组、LP-H组及低分子肝素组血浆肾上腺素水平显著升高;LP-H组血浆NO、6-Keto-PGF1α水平显著升高,血浆vWF、ET水平显著降低,血管环内皮依赖性舒缩功能明显改善。结论 海带多糖可以调节血管内皮细胞舒缩因子的释放,该机制与其保护血管内皮细胞的作用有关。