肾血管性高血压大鼠

肾血管性高血压大鼠（共7篇）

肾血管性高血压大鼠 篇1

化学合成药物是目前治疗中、重度高血压以及高血压危象的首选药物, 对肾血管性高血压有降压显效快、疗效明确等优势, 但也具有不可避免的副作用, 尤其易导致血压变化过快和药源性低血压。众所周知, 血压骤然升降对于存在血管硬化的患者有导致血管破裂出血的潜在风险, 因此, 寻找降压平稳且能有效维持血压的药物有着重大的临床意义。文献报道, 黎药青葙子具有降压作用[1], 但其降压机制至今尚未明确。因此, 研究黎药青葙子的降压机制, 有助于阐明其可能的作用靶点, 对该药物在高血压领域的应用提供相应的理论基础。

青葙 (Celosia argentea) 是苋科一年生草本植物, 生于田野、路旁和荒地, 为旱地常见杂草[1]。青葙的种子称为青葙子, 为常用黎药, 味苦、性微寒, 有清肝明目、降血压的功效[2]。林介鸿[3]报道, 青葙子单用可治疗高血压。青葙子与车前子、牛蒡子和女贞子组成“四子汤”, 青光眼病人用后有明显利尿作用[4]。但是, 尚未见有关青葙子降低肾血管性高血压大鼠血压的实验研究报道。而Ang II水平的降低既可使血压降低, 又可以利尿、减轻钠水潴留[5]。因此, 本实验以自制肾血管性高血压大鼠模型为对象, 将青葙子与生理盐水对大鼠血压及血浆Ang II的影响进行了比较, 通过这一实验了解青葙子对肾血管性高血压大鼠血压及血浆Ang II水平的影响。

1 实验材料与方法

1.1 动物实验

SD雄性大鼠35只, 体重150～180 g, 购于长沙市开福区东创实验动物科技服务部。动物饲料购于广东省医学实验动物中心。饮水为居民生活用水, 每天换一次新鲜水。所有动物实验按照临床外科操作指南进行。采用2K1C方法建立肾血管性高血压模型[6,7,8,9,10,11,12]。用3%的戊巴比妥钠 (1 ml/kg) 腹腔注射麻醉SD大鼠。把直径为0.25 mm的针灸针与左侧肾动脉血管长轴紧贴平行放置, 用无菌丝线扎紧左侧肾动脉 (使管径变为原来的3/4, 肾动脉缩窄直径, 即为0.25 mm) 和针灸针打结固定后抽出针灸针。术后第5周筛选出建模成功的大鼠, 高血压的判断标准为:建模处理后凡血压比处理前高20 mm Hg, 且尾动脉收缩压 (SBP) 高于115 mm Hg为肾血管性高血压大鼠[12]。建模成功的大鼠共14只, 随机分为两组:对照组为肾血管性高血压大鼠 (4只) , 给予生理盐水灌胃4周;实验组为肾血管性高血压大鼠 (10只) , 给予青葙子 (5.25 g/kg) 灌胃4周, 每天一次, 每周7天。同时, 每周定时测量一次大鼠尾动脉收缩压 (SBP) 和平均动脉压 (MAP) 。根据人用有效剂量按公斤体重折算为动物有效剂量后, 大鼠有效剂量选5.25 g/kg。采用煎制中药的方法[13], 将青葙子加入蒸馏水中煎煮, 水煎两次, 滤液混合, 于4℃冰箱保存, 用时取所需量。限于课题的经费不足, 本实验动物数量较少, 只设计了一个空白对照组, 没有进行半数有效量和半数致死量实验来确定青葙子的剂量, 人用有效剂量按公斤体重折算为动物有效剂量, 实验过程中未发现大鼠有异常行为。

1.2 实验用药及主要试剂

青葙子 (玉林市华济中药饮片有限公司, 批号:10010050) 。大鼠血管紧张素Ⅱ (AngⅡ) 酶联免疫检测试剂盒 (上海继锦化学科技有限公司, 批号:20110701A) 。

1.3 实验器械

酶标仪 (x Mark, 序列号:10112) 、制冷高速离心机 (德国eppendorf) 和-128℃深冷保存箱 (海尔公司) 。

1.4 血压测量

于术前、术后每周一次、药物干预后每周一次采用BP-6无创血压测量系统 (成都泰盟科技有限公司) 测量大鼠清醒状态下尾动脉压。设置加热箱的温度为35℃, 将大鼠置于加热箱内, 然后将大鼠尾巴穿过光电脉搏探测器的阻断端, 从另一端穿出;预热10分钟直至可以看出较好的脉搏波形;将传感器接口插到对应机箱内的连接器上;使用专用连线连接加热箱控制面板脉搏传感器接口与通用8道系统。测量3次, 每次5 min, 取其平均值, 连续测量9周[8,9,10,11,12,13,14]。药物干预4周后取血, 取血前经右侧颈总动脉插管法动态监测大鼠颈动脉血压[15] (BL-420F生物机能实验系统, 成都泰盟科技有限公司) 。

1.5 血样标本采集及AngⅡ测定

在药物干预最后一天处死大鼠。处死前麻醉大鼠, 打开腹腔, 从腹腔静脉采血4 ml, 离心 (制冷高速离心机, 参数设置:4℃, 2 000 rps, 10 min) , 采用大鼠AngⅡ酶联免疫检测试剂盒测定Ang II水平, 严格按照试剂盒的说明操作。

1.6 统计学分析

全部数据均采用SPSS 18.0 (SPSS Inc) 软件分析, 数据以平均数±标准差 (x±s) 表示。两组间比较采用成组设计的独立样本t检验, 同一组干预处理前、后比较采用配对t检验, P<0.05, 有统计学意义。

2 结果

2.1 肾动脉缩窄术后大鼠尾动脉收缩压的变化

BP-6无创血压测量系统结果显示, 肾动脉缩窄手术后, 从建模手术后第1周开始, 随着时间推移, 14只大鼠尾动脉收缩压逐渐升高, 到术后第3周在高水平维持基本稳定 (见图1) 。由于在建模阶段 (药物处理前) 本实验尚未分组, 所有大鼠都只做了相同处理 (建模手术) , 图1所反映的血压是所有实验大鼠的尾动脉收缩压的平均值。2K1C法建模手术后大鼠尾动脉收缩压的平均值与术前比较有显著性差异。

2.2 青葙子对肾血管性高血压大鼠MAP尾和SBP尾的影响

BP-6无创血压测量系统结果显示, 对照组动物药物干预后与干预前的血压差值与实验组动物相应差值比较, 其 (MAP尾B-MAP尾A) 和 (SBP尾B-SBP尾A) 均无统计学意义的差异 (见表1) 。

注:与对照组相比, *P>0.05。A指建模后干预处理前的血压, B指干预后的血压

2.3 青葙子对肾血管性高血压大鼠mCAP、SBP颈和Ang II水平的影响

BL-420F生物机能实验系统和酶标仪结果显示, 实验组与对照组比较, 其m CAP、SBP颈和Ang II均无统计学意义的差异 (见表2) 。

注:与对照组相比, *P>0.05。mCAP指颈动脉平均压

3 讨论

本次实验显示, 青葙子对肾血管性高血压大鼠 (SBP尾B-SBP尾A) 的降低作用不明显, 这与林介鸿[1]的研究结果不一致。本次实验的对象很明确, 为肾血管性高血压大鼠, 而林介鸿学者的研究对象为高血压病人, 且没有说明其是原发性高血压还是肾血管性高血压, 这可能与人和大鼠对青葙子的反应有差别以及高血压的类型有关。此外, 林介鸿学者的研究为临床疗效观察, 没有随机对照实验的支持, 其样本只含5例高血压病人, 观察时间仅为一周, 而青葙子是黎药, 通过口服其疗效在短时间内难以确定[5], 其研究结果的准确性可能会受到一定的质疑。

本次实验同时还观察了大鼠的 (MAP尾B-MAP尾A) 、m CAP和SBP颈, 实验组和对照组比较, 均无统计学意义, 也与林介鸿学者的研究结果不一致。颈动脉压的测定受外界因素影响小于尾动脉压的测定, 收缩压的波动也比平均动脉压大, 故 (MAP尾B-MAP尾A) 、m CAP和SBP颈可更准确地反映大鼠的动脉血压, 这进一步支持青葙子对肾血管性高血压大鼠降压作用不明显这一结果。

肾血管性高血压, 由肾实质和 (或) 肾血管病变引起的高血压。而本次试验建立的高血压模型是由肾血管狭窄引起的。肾血管狭窄导致肾缺血, 肾灌注压降低, 交感神经系统兴奋性升高及到达致密斑处的小管液中的钠离子浓度降低时, 激活肾素-血管紧张素系统, 肾素分泌增加, 血浆Ang II水平升高[16], Ang II通过直接收缩血管和间接引起钠水潴留等作用而导致血压升高。然而, 青葙子作用后, 青葙子组的Ang II水平与对照组相比, 无显著差异, 这表明青葙子对肾血管性高血压大鼠的Ang II水平无明显影响。

本次实验是根据大鼠建模后最后一次 (高血压形成期第4周) 测定的SBP尾进行高血压大鼠成功模型筛选和分组的, SBP尾也是最后观察青葙子疗效的一个重要指标, 因为SBP尾数据比其他各指标数据更加齐全。虽然颈动脉压和Ang II水平的测定受内、外界因素影响更小, 但取样过程中有部分大鼠死亡, 对照组只测到2只大鼠的颈动脉压、3只大鼠的Ang II水平, 实验组测到9只大鼠的颈动脉压和Ang II水平, 导致样本数更少, 且颈动脉压和Ang II水平只在取样时测过一次, 这也从一定程度上减少了本实验的说服力。限于课题的经费不足, 本实验动物量较少, 只设计了一个空白对照组, 没有剔除部分应激反应很厉害的大鼠, 且没有进行半数有效量和半数致死量实验来确定青葙子的剂量, 只是将人用有效剂量按公斤体重折算为动物有效剂量。以上因素都有可能增加本次实验的结果为假阴性的可能性。因此, 要得出更具说服力的实验结果, 有待开展规模更大、对照更加完整、实验设计更加周全的实验。

摘要：目的 观察青葙子对肾血管性高血压大鼠的血压及血浆血管紧张素I (IAng II) 的影响。方法 利用两肾一夹 (2K1C) 法建立肾血管性高血压大鼠模型, 模型组给予青葙子5.25g/kg、一日一次, 灌胃4周;对照组给予生理盐水同法处理。4周后用无创血压测量方法 (尾套法) 、颈动脉插管法测血压, 酶联免疫分析法测定大鼠血浆Ang II的变化。结果 干预后, 青葙子组与对照组颈动脉压 (SBP和mCAP) 、Ang II水平均无显著差异 (P>0.05) 。两组大鼠干预后与干预前的尾动脉压差值比较以及同一组大鼠自身干预前与干预后的血压比较, 均无显著差异 (P>0.05) 。结论 在5.25g/kg的给药剂量和灌胃4周的疗程上, 未见青葙子对2K1C型肾血管性高血压大鼠血压及血浆Ang II水平产生影响。

关键词：青葙子,肾血管性高血压大鼠,两肾一夹 (2KlC) ,血管紧张素Ⅱ (AngⅡ)

肾血管性高血压大鼠 篇2

1 临床资料

本组62例病人中, 男39例, 女23例;年龄41岁～78岁 (63.5岁±3.1岁) ;经造影证实单侧肾动脉狭窄48例, 双侧肾动脉狭窄14例;其中伴冠心病27例, 糖尿病22例。

2 介入治疗方法

常规消毒铺巾, 1%利多卡因局部麻醉, 行右侧股动脉穿刺, 置入8F动脉管鞘, 送入6FJR4造影导管行选择性肾动脉造影, 明确肾动脉狭窄部位、程度。对肾动脉狭窄>50%、病变远近端压力阶差>30 mmHg (1 mmHg=0.133 kPa) 者行支架置入术。通过导引导丝, 送入球囊至狭窄段, 进行预扩张, 然后根据病变情况放置不同型号的支架, 释放支架后, 再次肾动脉造影, 证实支架扩张良好、肾动脉血流通畅后拔管, 送回CCU病房观察12 h。

3 护理

3.1 术前护理

3.1.1 心理护理

由于病人对PTRA+stent术不熟悉, 往往存在焦虑等心理问题, 因此必须注重术前的健康教育及心理护理, 解除病人的思想顾虑, 使其在良好的心理状态下接受治疗。

3.1.2 病人准备

①术前24 h服用氯吡格雷 (波立维) 300 mg;②术前备皮, 更换手术衣服, 了解过敏史, 做碘过敏试验;③术前1 d进行床上排尿训练, 术前排空膀胱;④精神紧张者在送导管室前可按医嘱予镇静药;⑤手术当日停用降血压药物。

3.1.3 物品及用物准备

①备好各项化验单、检查项目结果, 了解重要脏器的功能状况;②备好急救物品、药品及抢救器械;③备好介入手术所需的导管、球囊、支架。

3.2 术中护理

①病人入导管室后, 做好解释工作, 告诉病人如何与医护人员密切配合;②术中保持静脉输液通道通畅, 以备急救顺利进行;③对病人行心电监护, 密切监测生命体征, 并做好记录;④密切观察支架置入后血压的变化。

3.3 术后护理

3.3.1 严密监测生命体征

病人术后回CCU病房, 肾动脉扩张成功后, 肾脏组织血流灌注改善, 肾素的分泌减少, 部分病人血压明显下降, 如不及时调整用药, 就会引起低血压, 甚至休克等。因此要做到术后24 h持续床旁心电、血压监测, 密切观察意识及呼吸的变化, 准确记录生命体征, 严格交接班, 发现异常及时处理。

3.3.2 穿刺局部观察及护理

徒手压迫穿刺口上方1 cm～2 cm处15 min～30 min, 无活动性出血后, 可绷带8字形包扎压迫, 再上压1.5 kg砂袋6 h～8 h, 患肢平伸直制动12 h。随时观察穿刺部位有无出血、血肿, 并监测足背动脉搏动情况。本组2例出现局部小血肿, 未经特殊处理, 自行吸收。

3.3.3 术后并发症的观察及护理

PTRA+stent术可能因扩张血管形成假性动脉瘤甚至破裂出血、高血压危象、再狭窄甚至阻塞等并发症。护理人员需严密监护, 及时发现并发症, 以便及时妥善处理。

3.3.4 用药护理

①术后抗凝药物按医嘱采用皮下注射低分子肝素, 服用氯吡格雷 (波立维) 、肠溶阿司匹林联合抗凝。在用药过程中, 注意观察黏膜、皮肤等处有无出血点, 穿刺点有无渗血及血肿, 有无呕血、便血等情况, 尽量避免有创性检查。监测出凝血时间, 以将凝血酶原时间 (PT) 控制在正常值的1.5倍～2.0倍为宜。②应用抗生素预防感染3 d。

3.4 出院指导

病人出院时, 应交代清楚相应的注意事项:①嘱其按时服药, 特别是服用的抗凝剂不能间断, 并定期到医院复查。同时要教会病人自我观察有无出血倾向。②告知病人术后3个月、6个月、12个月各进行1次超声检查, 以后每年做1次超声检查。③出院后注意劳逸结合, 预防感染, 戒烟, 低胆固醇饮食。

4 讨论

肾动脉狭窄引起血压升高病人常规药物治疗效果差。PTRA+stent术是目前安全有效的治疗方法。本组病人经临床观察效果良好, 术后疗效均满意, 本组19例病人无需药物控制血压, 其余病人只服用1种或2种降血压药血压就能控制至正常或接近正常水平, 无严重并发症发生。由于PTRA+stent术价格昂贵, 技术要求相对较高, 需要护理人员的默契配合、严密监护, 使介入治疗能顺利开展, 减少或预防各种并发症的发生, 提高手术的成功率。另外PTRA+stent术治疗和护理方法还不为广大群众所熟悉, 作为医护工作者, 应主动向病人做好科学知识的宣传工作, 使之接受新知识、新疗法。让新的手术不但能得到病人的配合, 而且能更好地解除病人的疾患, 从而提高病人的生存质量。

肾血管性高血压大鼠 篇3

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 雄性自发性高血压大鼠(SHR)26只和同类正常血压大鼠Wistar-Kyoto(WKY)8只[许可证号:SCXK(京)2007-0001],体重230 g±20 g,均12周龄,购自北京维通利华实验动物技术有限公司。随机尿检测尿微量白蛋白(MA),以(20~200) mg/L为SHR早期肾脏损害标准。将符合条件的24只SHR随机分为3组:黄豆苷元组(Dai组,实验组)、咪达普利组(Imi组,药物对照组)和生理盐水组(NS组,空白对照组),每组8只。并设有正常对照组(WKY组)8只。

1.2 实验方法及生化指标测量

1.2.1 药物干预 Dai组:给予黄豆苷元粉(黄豆苷元 辽宁康泰药业有限公司)13.50 mg/(kg·d);Imi组:给予咪达普利粉(天津田边制药有限公司)0.90 mg/(kg·d),将药混于2 mL生理盐水中灌胃处理;NS组和WKY组只给予等量的生理盐水,每天1次,连续4周。

1.2.2 血压测量 实验结束时每只大鼠采用经颈总动脉插管,用BL-420F成都泰盟生物技能实验系统测颈总动脉收缩压,待数据稳定后每4 s测1次,共测10次,取平均值。

1.2.3 尿β2-微球蛋白(β2-MG)检测 于实验前及结束时分别收集大鼠上午随机尿,采用放射免疫法检测尿β2-MG,试剂盒购于天津九鼎医学生物工程有限公司。

1.2.4 肾组织超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)测量 用分光光度法测肾组织SOD活性和MDA含量。SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法测定,MDA含量采用硫代巴比妥酸比色法测定。蛋白含量采用考马斯亮蓝蛋白法测定。试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

1.3 统计学处理 SPSS 11.5系统软件分析数据,计量资料以均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$表示,多组比较采用方差分析,组内比较采用 t 检验,P<0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 血压的测量

实验结束时经颈动脉测量收缩压(SBP),与同期NS组比较,Dai组和Imi组显著降低(P<0.01),提示黄豆苷元和咪达普利均有降压作用。详见表1。

2.2 对肾功能的影响

实验前, NS组、Dai组和Imi组尿液中MA和β2-MG检测均显著高于WKY组(P<0.01),提示SHR在13周龄时就已出现肾功能的损害。用药后,NS组尿液中β2-MG较实验前升高(P<0.05),Imi组较实验前显著降低(P<0.05),而Dai组较实验前明显降低(P<0.05),提示黄豆苷元和咪达普利均能降低尿液中的β2-MG含量,两组与同期NS组比较有统计学意义(P<0.01),Dai组和Imi组间无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

2.3 肾组织SOD活性和MDA含量比较

与WKY组比较,NS组肾组织SOD显著降低(P<0.01),而MDA显著升高(P<0.01),说明17周龄SHR肾脏中氧化应激存在并有脂质过氧化的发生;与NS组比较,Dai组和Imi组SOD均明显升高而MDA则明显降低(P<0.05或P<0.01),提示黄豆苷元和咪达普利均有抗氧化应激作用,并且作用相当。详见表2。

3 讨 论

在高血压早期,肾脏内部出现血流自身调节功能紊乱、肾小球高灌注、内皮功能损伤及氧化应激激活等病理状态。在肾小球轻度受损时尿液中MA就可明显升高,标志着肾小球滤过膜电荷选择性屏障损伤,是肾小球早期损害的敏感指标[3],其升高程度与肾损害和心血管病危险性成正比[4,5]。β2-MG是起源于人体间质、上皮细胞和造血系统正常细胞的单链多肽低分子球蛋白,能自由经肾小球滤过,99%由近端肾小管重吸收。当肾小管重吸收功能受损时,尿中的β2-MG增多,是反映近端肾小管功能的敏感指标之一[3]。尿MA和β2-MG联合检测可以判断肾损害的部位和程度。随着周龄和血压的增高,高血压肾脏损害不断加重,说明定期检查对于高血压肾损害的早期发现和防治至关重要[6,7]。高血压患者处于高氧化应激状态[8,9],由内皮和血管平滑肌等细胞产生过多的活性氧(ROS),如氧自由基、过氧化氢、羟基等,同时在体内清除系统功能减低的情况下,如清除氧自由基的SOD活性减低[10],通过脂质过氧化、消耗一氧化氮、影响基因表达等引起内皮功能障碍、血管重塑,从而造成心脏、肾脏等细胞结构功能的损伤[11],是造成早期肾脏损害的机制之一。脂质过氧化主要是氧自由基攻击生物膜中的多聚不饱和脂肪酸并产生一系列终末代谢产物的病理过程,其中MDA含量与氧自由基的量及脂质过氧化的程度呈正比,是反映脂质过氧化程度的指标。本实验结果显示与WKY组相比,NS组的肾脏组织中MDA含量显著升高,而SOD活性显著降低,证实高血压大鼠清除氧自由基能力降低和氧化应激的增强[12]。本实验应用黄豆苷元和咪达普利治疗,结果两药均可降低尿β2-MG和MDA水平(P<0.05或P<0.01),并提高肾组织SOD的活性,提示两药都有降低氧化应激和脂质过氧化的作用[13,14],对肾损害具有保护功能[8]。其作用机制,目前研究认为血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)是通过对AngⅡ的抑制作用而达到抗氧化作用[11],而黄豆苷元抗氧化作用可能是通过降压及提高体内SOD来实现的。

经实验研究初步发现黄豆苷元能明显降低高血压大鼠尿β2-MG,缓解改善高血压肾损害,在与咪达普利对照中可以看出黄豆苷元与之有着相当的保护高血压靶器官的功能,但起效性能比之缓慢。

摘要：目的探讨黄豆苷元对自发性高血压大鼠(SHR)肾损害的保护作用及其机制。方法将符合条件的24只SHR随机分为黄豆苷元组(Dai组)、咪达普利组(Imi组)和生理盐水对照组(NS组),同时以8只同龄WistarKyoto(WKY)大鼠作为正常对照组。前两组分别用黄豆苷元13.50mg/(kg.d)和咪达普利0.90mg/(kg.d)灌胃,NS组及正常对照组只给予等量的生理盐水。用药4周后用放射免疫法测定尿β2微球蛋白(β2MG),颈动脉插管法测收缩压,分光光度法测定肾组织超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)。结果与正常对照组比较,各组血压、尿β2MG显著增多(P<0.01),肾组织内的SOD活性降低。药物干预4周后与同期NS组比较,黄豆苷元明显降低尿β2MG和MDA水平(P<0.05),并能明显提高肾脏组织内的SOD活性;咪达普利则显著降低尿β2MG和MDA水平(P<0.05或P<0.01),亦显著提高肾组织SOD活性(P<0.01),但两组比较无统计学意义(P>0.05)。结论黄豆苷元能明显改善高血压肾损害,其机制可能是通过清除自由基、抗脂质过氧化和保护内皮作用实现的,其作用与咪达普利相似。

肾血管性高血压大鼠 篇4

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

所有实验大鼠均购自中科院阜外医院动物中心。其中3个月龄雄性正常血压大鼠(WKY)16只,随机分为3个月龄正常对照组(WKY 3个月,8只)和8个月龄正常对照组(WKY 8个月,8只),分别于3个月龄和8个月龄处死,并留取标本。3月龄雄性高血压大鼠(SHR)26只,随机分为3个月龄非治疗组(SHR 3个月),8只,不治疗,于3个月龄处死、留取标本;8个月龄非治疗组(SHR 8个月),10只,不治疗,于8个月龄处死,留取标本;8月龄Perindopril治疗组(SHR-P 8个月),8只,3个月龄始饲Perindopril 2 mg/(kg·d)(施维雅公司),连续5个月,于8个月龄处死,留取标本。

1.2 检测方法

1.2.1 大鼠血压

采用大鼠尾血压计测量。

1.2.2 生化指标

处死前24 h用代谢笼收集24 h尿,用ELISA方法检测尿白蛋白浓度,处死后迅速从主动脉及心腔抽血、离心后取血清用血生化自动分析仪检测肌酐(Cr)浓度。

1.2.3 血清及肾组织NO检测

提取血清以酶比色法测量NO2-/NO3-(代表一氧化氮水平)浓度;同时取肾组织100 mg用4℃生理盐水0.9 m L匀浆,4℃下10 000 r/min离心10 min,取上清液,沸水浴3min,10 000 r/min离心5 min,取上清0.1 m L以酶比色法测NO2-/NO3-浓度。

1.2.4 组织病理

在腹主动脉建立血管灌流系统以100 cm H20压力用2%多聚甲醛和2.5%戊二醛的磷酸缓冲液将肠系膜动脉作初步固定;取2 mm肠系膜动脉和肾皮质部置于含2%多聚甲醛和2.5%戊二醛的磷酸缓冲液中继续固定2 h,并切成1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm的小块。将以上初步固定的标本用0.2磷酸缓冲液充分漂洗后,按生物样品常规处理,制成切片,于透射电镜下观察。体视学上体积的测量采用体密度作指标。即在参照系单位体积内平均某结构所占的体积。

1.3 仪器及试剂

JEM-1200EX透射电镜,HITACHI 7170A自动生化分析仪,HX-Ⅱ型小动物血压测量计,LMS-2R型二道热笔式生理记录仪,Avanti30离心机,DU640分光光度仪。尿白蛋白、血肌酐检测试剂购自北京中生生物工程高技术公司,NO2-/NO3-浓度检测试剂购自北京晶美生物工程有限公司。

1.4 统计学方法

采用SPSS 11.0统计软件对数据进行统计分析,实验数据以示,多组间比较采用One-Way ANOVA方差分析,两组间比较用组间t检验,相关统计采用Pearson's相关分析,以P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 各组大鼠收缩压、尿白蛋白和血肌酐的比较

与3个月龄正常血压大鼠比较,3个月龄高血压大鼠收缩压和尿白蛋白浓度升高(P<0.05及P<0.01)。与8个月龄正常血压大鼠比较,8个月龄高血压大鼠收缩压和尿白蛋白浓度升高(P<0.05及P<0.01)。8个月龄正常血压大鼠与3个月龄正常血压大鼠相比,尿白蛋白浓度增高(P<0.01)。8个月龄高血压大鼠与3个月龄高血压大鼠相比,收缩压和尿白蛋白浓度增高(P<0.05及P<0.01)。与8个月龄高血压大鼠相比,培哚普利治疗组收缩压和尿白蛋白明显降低(P<0.01)。各组大鼠24 h尿量和血肌酐差异无显著性。见表1。

注:1)与WKY 3个月组比较,P<0.05;2)与WKY 3个月组比较,P<0.01;3)与WKY 8个月组比较,P<0.05;4)与WKY 8个月组比较,P<0.01;5)与SHR 3个月组比较,P<0.05;6)与SHR 3个月组比较,P<0.01;7)与SHR 8个月组比较,P<0.01。

2.2 各组大鼠血清和肾组织NO浓度的比较

与3个月龄正常血压大鼠比较,3个月龄高血压大鼠血清和肾组织NO浓度降低(P<0.05)。与8个月龄正常血压大鼠比较,8个月龄高血压大鼠血清和肾组织NO浓度降低(P<0.05)。与8个月龄高血压大鼠相比,培哚普利治疗组血清和肾组织NO浓度明显升高(P<0.01)。见表2。

注:1)与WKY 3个月组比较,P<0.05;2)与WKY 8个月组比较,P<0.05;3)与SHR 8个月组比较,P<0.01

2.3 各组大鼠肾组织电镜下结构的比较

与3个月龄正常血压大鼠比较,3个月龄高血压大鼠血管内皮细胞体密度和肾小球基底膜厚度增大(P<0.05及P<0.01)。与8个月龄正常血压大鼠比较,8个月龄高血压大鼠血管内皮细胞、肾小球系膜细胞体密度及肾小球基底膜厚度增大(P<0.05及P<0.01)。8个月龄正常血压大鼠与3个月龄正常血压大鼠相比,血管内皮细胞和肾小球系膜细胞体密度增大(P<0.05及P<0.01),肾小球基底膜厚度增大(P<0.01)。8个月龄高血压大鼠与3个月龄高血压大鼠相比,血管内皮细胞和肾小球系膜细胞体密度增大(P<0.05),肾小球基底膜厚度增大(P<0.01)。与8个月龄高血压大鼠相比,培哚普利治疗组血管内皮细胞和肾小球系膜细胞体密度减小(P<0.01),肾小球基底膜厚度减小(P<0.01)。与8个月龄正常血压组比较,培哚普利治疗组血管内皮细胞体密度减小(P<0.05)。见表3。

注:VEd:血管内皮细胞,MC:肾小球系膜细胞,BM:肾小球基底膜1)与WKY 3个月组比较,P<0.05;2)与WKY 3个月组比较,P<0.01;3)与WKY 8个月组比较,P<0.05;4)与WKY 8个月组比较,P<0.01;5)与SHR 3个月组比较,P<0.05;6)与SHR 3个月组比较,P<0.01;7)与SHR 8个月组比较,P<0.01

2.4 高血压大鼠尿白蛋白与收缩压、一氧化氮浓度和病理指标的相关性分析

3个月龄:尿白蛋白浓度与SBP呈正相关(r=0.848,P<0.05);与血清和肾组织NO浓度度呈负相关(分别r=-0.692,P<0.05;r=-0.724,P<0.05);与VEd体密度呈正相关(r=0.851,P<0.01);与MC体密度和BM厚度无显著相关(分别r=0.160,P>0.05;r=0.565,P>0.05)。

8个月龄:尿白蛋白浓度与SBP无显著相关(分别r=0.027,P>0.05);与血清和肾组织NO浓度呈负相关(分别r=-0.627,P<0.05;r=-0.665,P<0.05);与VEd体密度、MC体密度和BM厚度呈正相关(分别r=0.870,P<0.01;r=0.885,P<0.01;r=0.633,P<0.05)。

3 讨论

经典理论认为,高血压肾损害是由于高血压使肾脏血流自身调节功能紊乱,造成肾小球高灌注、高滤过,它引起肾小动脉、肾小球毛细血管和肾小管的负荷增加,导致肾脏功能及器质性损伤。近来大量研究表明,高血压肾损害还与内皮功能障碍关系密切[1]。NO是内皮功能的重要影响因子,它由血管内皮细胞产生,它的失平衡引起内皮功能障碍,这可能是导致高血压肾损害的重要因素[2,3]。

本研究显示高血压大鼠在3个月龄已有血管内皮结构、血清和肾皮质NO浓度的改变,而肾组织结构的变化并不明显,仅有尿白蛋白浓度升高,尿白蛋白浓度与血压及血管内皮病变较密切。继续观察发现,8个月龄大鼠血管内皮和肾组织结构的损害普遍加重,血清和肾皮质NO浓度的改变也更为明显,但此阶段尿白蛋白与血压的相关性并不显著,而与肾小球病变及与血清和肾皮质NO浓度密切相关。这与国外报道一致,高血压早期蛋白尿的主要决定因素是血压负荷,后期则与靶器官的损害有关[4,5]。无论3个月龄还是8个月龄高血压大鼠均有内源性NO不足,尤其是肾组织局部NO浓度下降明显,NO浓度与尿蛋白浓度和血管内皮改变密切相关,这提示高血压大鼠可能存在内皮功能障碍,且内皮功能障碍与蛋白尿密切相关,与电镜下肾组织的改变相符。可见,高血压蛋白尿的形成机制除了经典的“三高”,即高灌注、肾小球内压力升高、蛋白滤过增多外,血管内皮功能障碍、肾小球对蛋白的通透性增大也参与了高血压蛋白尿的形成[6]。

血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin-converting enzyme inhibitor,ACEI)可以减少尿蛋白,是公认的有效的肾保护药物。其药理作用一方面是减少血管紧张素生成,降低肾血管阻力,改善肾小球高灌注、高滤过状态;另一方面可以通过抑制血管紧张素转换酶的活性,减少该酶对缓激肽的代谢分解,缓激肽作用于血管内皮及其他靶细胞膜上的缓激肽受体,激活细胞内一氧化氮合酶,促进NO的合成[7]。NO是较强的血管舒张因子,它能保护内皮细胞的稳定性,改善血管内皮功能。这对肾局部血流动力学是有利的,包括增加有效肾血浆流量、稳定肾小球滤过率、滤过分数下降等[8,9]。

本实验将高血压大鼠自3月龄起持续应用Perindopril进行干预,结果发现Perindopril能显著减少大鼠的尿白蛋白排泄,血清和肾组织的NO水平明显提高,血管内皮和肾组织形态学有明显改善。这提示,Perindopril可以减少高血压大鼠尿蛋白的形成,有助于抑制甚至逆转血管内皮和肾组织形态学的改变,Perindopril通过调节NO水平,促进血管内皮功能改善,这可能是高血压肾损害的保护机制之一。

综上所述,高血压早期肾损害(如尿蛋白的形成)是全身内皮功能障碍在局部的表现,Perindopri对高血压肾的保护,不仅包括降低血压、阻断AngⅡ的增殖效应,还与血清及肾组织NO浓度提高、血管内皮功能的改善有关。

摘要：目的通过观察培哚普利(Perindopril)对高血压大鼠一氧化氮及血管内皮功能的影响,探讨其对高血压肾损害保护的可能机制。方法将正常血压大鼠(WKY)随机分为3个月龄(WKY3个月)、正常对照组和8个月龄正常对照组(WKY8个月);高血压大鼠(SHR)随机分为3个月龄非治疗组(SHR3个月)、8个月龄非治疗组(SHR8个月)、8个月龄Perindopril治疗组(SHR-P8个月)。测量各组大鼠24h尿白蛋白浓度、血清和肾组织一氧化氮(NO)浓度,并用电镜观察各组大鼠血管内皮和肾小球形态学改变。结果SHR3个月组大鼠电镜下已见血管内皮细胞增生,肾小球基底膜轻度增厚,与WKY3个月组相比血清和肾组织NO浓度均下降、尿白蛋白浓度增高;SHR8个月组大鼠血管内皮细胞显著增生,肾小球系膜细胞肥大,基底膜明显增厚,尿白蛋白水平增高更为明显;高血压大鼠尿白蛋白浓度与血清和肾组织NO浓度呈明显负相关,与血管内皮细胞体密度、肾小球系膜细胞体密度和肾小球基底膜厚度呈正相关。Perindopril组与SHR8个月对照组大鼠相比,尿白蛋白水平明显下降,血清和肾组织NO浓度增高,血管内皮细胞和系膜细胞体密度减小,肾小球基底膜厚度减小。结论Perindopril对高血压大鼠肾脏的保护,可能是通过提高血清和肾组织NO水平,改善肾脏血管内皮功能来实现的。

关键词：培哚普利,高血压,肾,一氧化氮

参考文献

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肾血管性高血压大鼠 篇5

1材料与方法

1.1 实验动物6 周龄健康雄性SD大鼠50 只, 体重160~200 g, 清洁级。

1.2 药物与试剂马来酸依那普利 (扬子江药业集团江苏制药股份有限公司, 批号:国药准字H32026568) , 缬沙坦 (北京诺华制药有限公司, 批号:国药准字H20040217) , 螺内酯 (海南海神同洲制药有限公司, 批号:国药准字H46020690) 。TRIzol (life technologies) , Fast Quant c DNA第一链合成试剂盒 (北京天根) , Super Real荧光定量预混试剂 (北京天根) 。

1.3 方法

1.3.1 分组和建模50 只健康雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、依那普利组、缬沙坦组和螺内酯组, 每组10 只。模型组、依那普利组、缬沙坦组及螺内酯组大鼠用10% 水合氯醛 (3 m L/kg) 腹腔注射麻醉, 仰卧位固定, 75% 乙醇消毒, 腹部正中左侧纵行切口, 分离左侧输尿管, 于中上1/3 处结扎并剪断输尿管, 使左侧肾脏完全梗阻, 逐层缝合, 正常组大鼠打开腹腔后只分离但不结扎和剪断输尿管。术后腹腔注射青霉素 (10 U/d, 连续3 d) , 造模前24 h- 造模后14 d, 依那普利组用血管紧张素转化酶抑制剂依那普利10 mg/ (kg·d) , 缬沙坦组用血管紧张素Ⅱ的Ⅰ型受体拮抗剂缬沙坦10 mg/ (kg·d) , 螺内酯组用醛固酮受体拮抗剂螺内酯100 mg/ (kg·d) 灌胃, 正常组和模型组用2 m L/d 0.9% 氯化钠溶液灌胃。

1.3.2 肾组织标本采集造模后14 d处死所有大鼠, 快速取出左肾, 去除包膜, 用0.9% 氯化钠溶液将左肾积存的血液冲洗干净, 按冠状位纵行剖开, 一半肾组织置于4% 甲醛固定液固定, 用于HE染色;另一半肾组织快速置于-80 ℃低温冰箱保存, 用于RT-PCR[6]。

1.3.3肾功能指标检测造模后13 d (处死前1 d) , 将大鼠置于代谢笼, 留取大鼠24 h尿液, 送检验科检测24 h尿蛋白定量。造模后14 d处死所有大鼠, 经腹主动脉采血5 m L, 室温静置1 h, 3000 r/min, 4℃离心15 min, 取上层血清检测血清Scr、BUN。

1.3.4肾组织病理检查肾组织标本用4%甲醛固定液固定, 常规脱水, 石蜡包埋, 切片4μm, 行HE染色, 光镜观察肾小球、肾小管的病理变化及炎症细胞浸润的情况。按肾间质损伤8项指标评分:肾小管上皮细胞空泡变性、肾小管扩张、肾小管萎缩、红细胞管型、蛋白管型、间质水肿、间质纤维化、间质细胞浸润, 计算其均值, 作为该标本的肾小管间质损伤指数[7]。

1.3.5 肾组织TGF-β1、AGT、ACE、ALD m RNA检测采用RT-PCR法, TRIzol提取肾组织总RNA, 按TRIzol说明书步骤提取。 用Fast Quant c DNA第一链合成试剂盒合成c DNA, 取4 μL c DNA为模板按PCR试剂盒说明进行PCR扩增, 总体系为20 μL, 以GAPDH为内参, 引物及内参序列由上海生工设计及合成。引物序列:TGF-β1: 上游5’CTTTGTACAGCACCCGC3’, 下游5’TAGATTGCGTTGCGGTC3’;AGT: 上游5’CTGGAGCTAAAGGACACACAGA3’, 下游5’GTGGATGTATACGCGGTCCC3’;ACE: 上游5’GCTTGACCCTGGATTGCAGC3’, 下游5’CTCCGTGATGTTGGTGTCGT3’;ALD: 上游5’GAAGTTCGATCTGGGGCCAA3’, 下游5’AGGGTCATATAGGGTCGCTGA3’;GAPDH: 上游5’GGCAAGTTCAACGGCACAGT3’, 下游5’AAGACGCCAGTAGACTCCACG3’。

1.4 统计学处理采用SPSS 19.0 软件对所得数据进行统计分析, 计量资料用 (x-±s) 表示, 比较采用t检验, 组间比较采用单因素方差分析, 以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组肾功能指标检测结果比较各组大鼠24 h尿蛋白比较差异均无统计学意义 (P>0.05) ;模型组、依那普利组、缬沙坦组及螺内酯组肌酐、尿素氮均较正常组升高, 其中模型组升高最为明显, 依那普利组、缬沙坦组及螺内酯组间比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 见表1。

2.2 各组肾脏组织病理改变结果比较光镜显示正常组大鼠肾小球、肾小管及间质大小或形态结构均正常;模型组肾间质大量炎症细胞浸润, 间质间隙增宽, 细胞外基质成分增多, 并可见肾小管上皮细胞水肿、变性、坏死, 管腔内可见脱落坏死的上皮细胞, 肾小管扩张;依那普利、缬沙坦及螺内酯组上述病理改变明显减轻, 见图1。与正常组的肾间质损伤指数 (1.67±0.58) 比较, 模型组 (6.00±1.00) 、依那普利组 (3.67±0.58) 、缬沙坦组 (4.00±1.00) 及螺内酯组 (3.66±1.15) 均有不同程度地升高, 比较差异均有统计学意义 (P<0.05) ;与模型组比较, 依那普利组、缬沙坦组及螺内酯组肾间质损伤指数均不同程度地降低, 比较差异均有统计学意义 (P<0.05) 。

2.3 各组大鼠TGF-β1m RNA、AGT m RNA、ACE m RNA、ALD m RNA的表达结果RT-PCR结果显示, 输尿管结扎后大鼠肾脏TGF-β1m RNA、AGT m RNA、ACE m RNA及ALD m RNA表达均较正常组有不同程度地增加。依那普利组、缬沙坦组及螺内酯组TGF-β1m RNA、AGT m RNA、ACE m RNA、ALD m RNA的表达较模型组大鼠明显减少 (P<0.05) , 但三组间比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 见图2。

3 讨论

肾间质纤维化是以肾小管萎缩或扩张, 肾间质炎性细胞浸润, 成纤维细胞形成与积聚及细胞外基质在肾间质中过度沉积为特征的不可逆的发展过程[8]。肾间质的病变程度是决定10 年肾脏存活率最重要的影响因素, 对肾脏疾病预后的影响较肾小球病变更为重要[9]。UUO模型是以进行性肾间质纤维化为特征的实验性肾病模型, 持续输尿管梗阻引起的慢性炎症和间质纤维化可导致肾功能的进行性丧失[10]。

目前研究认为, 肾间质纤维化是各种细胞、细胞因子及炎症因子相互作用, 导致细胞外基质代谢失衡, 在肾间质异常集聚所致, 其中转化生长因子β1 (transforming growth factor β1, TGF-β1) 是促进细胞增殖和间质纤维化的重要因子[11]。大量的动物实验和临床研究表明, 肾小管上皮细胞、成纤维细胞及系膜细胞等肾脏固有细胞TGF-β1表达上调通常与肾间质纤维化密切相关。作为一种强效的致纤维化因子, TGF-β1在肾间质纤维化的发生发展中起重要作用。TGF-β1主要的致纤维化作用表现在: (1) 可趋化炎症细胞在肾间质浸润, 促使肾小管上皮细胞转化为成纤维细胞, 进而产生大量的细胞外基质; (2) 抑制多种细胞外基质降解酶的活性, 促进金属蛋白酶组织抑制因子-l及纤溶酶原激活抑制因子-1 的表达, 抑制细胞外基质的降解; (3) 增加ECM的受体如整合素的表达, 从而增加ECM与细胞的相互作用[12,13,14]。本实验结果显示, 模型组、依那普利组、缬沙坦组及螺内酯组的TGF-β1表达较正常组明显增加, 但依那普利组、缬沙坦组及螺内酯组的TGF-β1表达较模型组又明显降低, 表明TGF-β1在肾间质纤维化的过程中起促进作用, 且依那普利 (ACEI) 、缬沙坦 (ARB) 及螺内酯 (醛固酮拮抗剂) 对肾间质纤维化有一定的防治作用。

肾素- 血管紧张素- 醛固酮系统 (RAAS) 是人体内重要的体液调节系统, RAAS除了存在于循环系统中, 还存在于许多组织器官中, 如心脏、肾脏、肾上腺等, 称为局部RAAS, 其主要与组织纤维化和/ 或重构过程有关。研究表明, 随着肾脏的受损, 可观察到RAAS的成分如血管紧张素原、血管紧张素转换酶、血管紧张素I和血管紧张素Ⅱ的上调或重新分布。肾脏局部RAAS在肾间质纤维化的形成中具有重要的促进作用, 其效应分子血管紧张素Ⅱ (Ang-Ⅱ) 和醛固酮是重要的致炎因子, 可促进成纤维细胞增殖和细胞外基质的合成, 促进肾间质纤维化[15]。AngⅡ是RAAS的主要生物活性成分, 是一种重要的细胞因子, 具有多重生理学效应, 可通过诱导细胞因子、生长因子和黏附分子等的表达发挥其促纤维化作用[16]。有研究表明, AngⅡ可激活肾小管上皮细胞及成纤维细胞, 促进TGF-β1的合成和释放, 致使肾间质细胞外基质成分的过度产生[17,18]。血管紧张素转化酶抑制剂 (依那普利) 能有效抑制AngⅡ的合成, 减少体内AngⅡ的含量, 从而减轻肾间质纤维化的程度[19]。血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂 (缬沙坦) 有效地阻断AngⅡ与其受体 (AT1) 相结合, 亦可达到减轻肾间质纤维化的效果。近几年的研究显示, 醛固酮不仅可以致水钠潴留, 而且可以促进组织胶原沉积和纤维化, 是肾间质纤维化过程中的一个重要因素, 在进展性肾脏损害中发挥重要的作用。有研究表明, 醛固酮是有丝分裂和胶原合成的强烈刺激剂, 可以促进肾脏纤维化[20]。本研究结果表明, 与模型组比较, 依那普利组、缬沙坦组、螺内酯组TGF-β1表达明显下调, 肾功能明显好转, 肾损伤指数明显降低, 表明依那普利、缬沙坦、螺内酯对肾间质纤维化具有负性调节作用, 通过下调TGF-β1的表达, 减少细胞外基质的沉积, 阻止肾间质纤维化的进展, 延缓肾功能的恶化。

肾血管性高血压大鼠 篇6

高血压是脑梗死和脑出血最重要的危险因素,其中血管壁病变是脑卒中发病的基本条件之一。血压的升高通过对血管壁的剪切力以及氧化应激等损伤血管内皮细胞增强ICAM-1的表达而引起炎症反应[1,1],加剧高血压血管损害。目前还不清楚ICAM-1升高的始动因素及调控机制。有研究表明,在高血压血管病变的过程中有核转录因子(nuclear factor kappa B,NF-κB)的激活。通过对ICAM-1基因结构的分析发现,其启动子包含有特异性与NF-k B等转录因子结合的位点[2]。为了解高血压脑卒中形成过程中NF-kB与ICAM-1的表达变化规律及其相互关系,我们应用免疫组化方法通过对易卒中型肾血管性高血压大鼠(stroke-prone renovascular hypertensiverats,RHRSP)模型脑卒中形成过程中脑血管中NF-kB与ICAM-1表达的动态变化,为寻找延缓高血压脑卒中发生发展的方法提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

羊抗大鼠ICAM-1单克隆抗体、兔抗NF-kBp65多抗、小鼠和兔SP试剂盒(福州迈新生物技术公司),其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 动物与模型

选取100只鼠龄2、3个月,体重80～120 g的雄性Spraque-Dawley大鼠(由南华大学动物部提供),其中60只大鼠按双肾双夹法复制RHRSP模型[3,3],术后2周血压较术前增高20 mm Hg以上为手术成功标准,在饲养过程中出现脑卒中症状和体征剔除4只,随机取出30只作为RHRSP组。另取30只假手术大鼠作为对照组。其余大鼠备用。两组大鼠分别再以手术日为起点随机分成2周(手术日后2周,2周)、4周、6周、8周、12周、16周组共6个亚组,每亚组5只。以颗粒型普通大鼠饲料喂养,饮用自来水,动物房温度控制在20℃左右,光照周期为12 h,模拟正常昼夜节律。以鼠尾测压仪(HX2-1型)(中南大学湘雅医学院)测量血压,每2周1次。

1.3 标本及切片的制取

大鼠经心脏4%多聚甲醛灌注后断头取脑,自视交叉处开始向后取冠状切片,石蜡包埋,连续切片6张,分别行常规HE染色及NF-kB与ICAM-1免疫组织化学染色。

1.4 免疫组织化学法染色步骤

石蜡切片脱蜡至水,3%甲醇-双氧水室温孵育10 min,磷酸缓冲液(PBS)洗5 min×3次,0.1M椽酸缓冲液(pH 6.0)微波抗原修复98℃20min,自然冷却至室温,PBS洗5 min×3次,用10%正常山羊血清封闭37℃30 min,滴加一抗NF-kB和I-CAM-1(l∶50稀释),4℃冰箱过夜,PBS洗5 min×3次,滴加生物素标记的二抗IgG工作液,37℃,30min,PBS洗5 min×3次,滴加辣根酶标记链霉卵白素(SP)工作液,37℃孵育30 min。PBS洗5 min×3次。DAB显色,自来水终止。常规梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。阴性对照用PBS替代一抗,其余步骤同上。

1.5 统计学分析

每张切片显微镜下分别随机选取4个视野,进行NF-kB与ICAM-1阳性血管数计数,再分别进行t检验、方差分析及相关分析,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 血压变化

对照组的收缩压(SBP)随年龄增长无明显变化,各时间点之间差异无统计学意义。RHRSP组术后血压迅速升高,第8周时达高峰,与对照术组比较,术后第2、4、6、8、12和16周差异都有极显著性(P<0.001)。且RHRSP组术后各期均明显高于术前(P<0.001)。见表1。

注:†在同一时间内和假手术及术前组比较,P<0.001

2.2 形态学改变

HE染色后,光镜下假手术组大鼠脑内小动脉均表现为管腔平滑,管壁不厚;而RHRSP组大鼠脑内小动脉有不同程度透明变性、硬化、动脉壁增生性反应而致管壁增厚、管腔狭窄,有时可见微血栓和微动脉瘤形成。

2.3 NF-kB和ICAM-1的表达

假手术组大鼠脑血管均未见NF-k B和I-CAM-1的表达。RHRSP组大鼠脑动脉壁在术后2周即可见NF-kB表达明显增加,随之ICAM-1表达也迅速增加。NF-kB在术后6周基本达最高峰,I-CAM-1表达在术后8周达最高峰,并且二者一直持续至术后16周,见图1～4。阳性颗粒主要位于内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞NF-kB在胞浆及胞核内均有表达,ICAM-1则只在胞浆表达,NF-kB在神经胶质细胞也可见大量表达。RHRSP组NF-k B和ICAM-1阳性微血管数的各个对比组的两两比较,2～16 W组和假手术组间P<0.001,12W和16W与8 W组间P>0.05。

注:1)各组NF-kB阳性微血管数,F=28.964,P<0.01;2)各组ICAM-1阳性微血管数,F=32.486,P<0.001

2.4 血压、NF-kB和ICAM-1间的相关分析

2W至16W组共30只高血压大鼠作直线相关分析,血压分别与NF-kB和ICAM-1,以及NF-k B与ICAM-1均密切相关。血压与NF-kB和ICAM-1的r值分别为0.862,0.835(P<0.05),NF-kB和I-CAM-1的r值为0.683(P<0.05)。

3 讨论

黏附分子是一类介导细胞间、细胞与细胞外基质间黏附作用的膜表面糖蛋白,参与多细胞生物体各种生理、病理过程。ICAM-1是一种淋巴细胞功能相关抗原-1的配体,可以介导白细胞与血管内皮细胞之间的黏附及白细胞穿出血管壁。正常动脉内皮及内膜平滑肌细胞不表达或轻微表达ICAM-1,高血压通过对血管壁的剪切力以及氧化应激等损伤血管内皮细胞,以时间和压力依赖方式增强I-CAM-1的表达,导致大量单核细胞黏附至内皮,上调单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)m RNA的转录和表达,从而引起炎症反应[1,1]。通过对ICAM-1基因结构的分析发现,其启动子包含有特异性与NF-kB等转录因子结合的位点[2]。有研究认为,NF-kB在调控ICAM-1的表达中起着重要作用[4,5]。但NF-kB与ICAM-1的表达变化规律及其相互关系至今仍不十分清楚。本研究中,笔者首次应用易卒中型肾性高血压大鼠模型,通过免疫组化方法在蛋白水平分别观察了高血压血管病变过程中NF-kB与ICAM-1表达的动态变化,结果发现,实验组大鼠脑动脉壁在术后2周即可见NF-kB表达明显增加,随之I-CAM-1表达也迅速增加。NF-kB在术后6周基本达最高峰,ICAM-1表达在术后8周达最高峰,并且二者一直持续至术后16周。

NF-kB是一种诱导基因表达的DNA结合蛋白,它能够和特定基因的启动子或增强子区域固定核昔酸序列结合而启动该基因转录,在机体的免疫应答、炎症反应及细胞的生长调控等方面发挥重要作用。已有研究证明,脑缺血、TNF-α和IL-1能诱导NF-κB表达增加,后者使ICAM-1基因表达上调,进而使ICAM-1蛋白合成增加,其调控机制可能与缺血区产生的细胞因子启动了蛋白激酶-NF-κB-ICAM-1间的信号通路有关[6]。

本实验结果表明,随着血压上升,NF-k B活性升高,ICAM-1表达也迅速增加,在术后8周基本达最高峰,并持续至术后4个月,两者呈正相关;提示血管病变水平于第8周时达高峰,以后维持在此水平继续加重血管病变,这与既往研究发现RHRSP 8周后自发性中风率升高和较易诱发中风相符。因而提示,NF-κB和ICAM-1的表达增强可能是高血压炎症反应,血管重塑,最后形成脑卒中的重要原因之一。本研究发现,NF-κB维持在高水平不下降,与部分研究具有相似性[7]。也有研究发现,在大鼠动脉瘤模型中,肾性高血压形成早期,NF-kB活性升高,2个月后逐渐下降到正常水平[8,8]。笔者认为,动脉瘤是在高血压状态下受到高速血流的冲击形成的,是一种局部病变,NF-kB在达到一定水平后可能为负反馈所抑制而逐渐下降;而高血压脑卒中血管病变是一个慢性全身性的炎症过程,NF-κB促进ICAM-1的生成,导致炎症反应[7],而炎症因子如:TNF-α和IL-1反过来诱导NF-κB表达增加,对抗ICAM-1等细胞因子对NF-κB的负反馈抑制。当然,经过长时间的炎症反应血管病变达到一定程度后,NF-κB是否有一个逐渐下降的过程目前还不清楚。

目前认为NF-kB和ICAM-1主要与动脉硬化、缺血性脑血管病有关;但在有基础病变的血管,在血压突然升高等条件诱发下更易出现脑出血。本实验结果表明,NF-kB和ICAM-1的活性表达异常升高参与了高血压血管重塑的发生发展过程,是脑卒中发生的重要机制之一。由于NF-κB是炎症过程的主要调控因子,包括调节免疫应答和细胞的存活;也参与对血管重塑起重要作用的酶)———基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)的调控。因此,应用NF-κB拮抗剂有可能成为预防高血压脑卒中的新的药物治疗靶点。

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肾血管性高血压大鼠 篇7

本研究参照Ross和Campbell贴壁法, 获得了大量纯度较高、生长状态良好的VSMC从而为细胞水平上研究高血压的发病机制提供理想的细胞模型。培养均是在标准的、可控的条件下进行观察、研究其生物学行为。

1 材料和方法

1.1 实验材料和试剂

实验于2013年5-12月在山西医科大学国家重点实验室完成。选择自发性高血压大鼠5只, 雌雄不限, 体重质量190~210g由北京维通利华实验动物中心提供, 鼠尾血压监测收缩压 (170±12) mmHg, 舒张压 (98±7) mmHg。胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、青霉素和链霉素 (GIBCO公司) , 3- (4, 5-二甲基-2-噻唑) -2, 5二苯基溴化四氮唑蓝[3- (4, 5-dimethy-2-thiahiazo) -2, 5-diphenylterazoliumbromide, MTT]、二甲基亚砜 (dimethysulfoxide, DMSO) 均为Sigma公司产品, 羊抗鼠a-平滑肌肌动蛋白 (a-smoothmuscleaction, a-SMActiion) 、异硫氰酸罗丹明 (tetraethyrhodamineisothiocyanate, TRITC) 标志兔抗羊二抗均为SantaCruz公司, 六孔板 (Nikon公司) 。

1.2 仪器和设备

数显鼓风干燥箱 (GZX-9246MBE山海博讯实业有限公司医疗设备厂) 、高压蒸汽灭菌锅 (SANYOLABOAUTOCLAVE MLS-3780) 、数显恒温水浴锅 (HH-2国华电器有限公司) 、DL-CJ-1N医用型洁净工作台 (北京东联哈尔仪器制造有限公司) 、LDZ5-2医用离心机 (北京医用离新机厂) 、酶标检测仪 (德国Beckman) 、CKX31倒置显微镜 (OLYMPUS) 、细胞培养箱 (Thermoelectroncorporation3111 FormaSeriesⅡWater JacketedCO2Incubator) 。组织剪、止血钳、眼科剪、眼科镊 (上海医疗器械集团有限公司手术器械厂) 。

1.3 动物取材

1.3.1 无菌获取鼠主动脉:

取清洁SHR一只, 用8%的水合氯醛以浓度0.5ml/100g下腹部倾斜进针腹腔麻醉后, 浸入到75%的乙醇2~3min, 为避免过度刺激使大鼠清醒应保持头部暴露在乙醇外面。移入缓冲间, 无菌条件下仰卧固定四肢, 使用无菌手术剪和止血钳钝性分离皮肤、皮下组织, 依据解剖结构依次剥离心脏、双肺组织, 暴露脊柱可在脊柱旁边见胸主动脉, 更换手术器械, 沿主动脉弓之膈面下剪下主动脉, 用无菌PBS缓冲液反复冲洗, 洗净血凝块等杂质后, 置于盛有青霉素和链霉素的DMEM培养皿的冰袋上减慢代谢速度, 迅速移入到超净工作台进行进一步操作[3]。

1.3.2 中膜制备:

更换手术器材, 袖套样剥离血管外膜及粘连的组织, 清除血管外脂肪、结缔组织, 使用无菌眼科剪纵向切开血管, 使内膜向上平铺于无菌培养皿中, 用一次性无菌医用棉签擦拭内膜, 由上到下擦拭3~4遍清除内膜, 移入0.5mlEP管中, 滴入少量DMEM培养液, 防止组织块干燥, 用眼科剪在EP管中血管剪切成1mm×1mm的边缘整齐的肉糜组织块, 使用玻璃弯头吸管将切好的组织块均匀分装置于无菌一次性培养瓶中, 内膜面向上, 使组织块间距0.5cm, 于37℃、5%CO2孵箱内放置3~4h左右使组织块干涸并粘附后, 缓慢加入DMEM培养液, 使组织块完全浸入培养液, 置于CO2孵箱中继续静置3~5d, 避免振动和移动, 待有细胞从组织块周围游出后换液, 除去漂浮组织块并更换新鲜培养液[4]。

1.3.3 传代培养:

7d左右大部分细胞周围出现细胞晕, 待与相邻细胞晕相接触后, 然后迅速加入2%预热的胰蛋白酶消化1~2min, 待倒置显微镜下观察到多数细胞收缩变圆且漂浮后, 向培养瓶中加入20%的胰蛋白酶中止消化, 再用吸管吸取瓶中培养液轻轻捶打培养瓶壁, 使细胞尽可能多的脱落下来, 然后将培养瓶中的液体移入离心管, 以1000r/min离心, 5min后, 弃去上清液, 加入含有10%的胎牛血清制成的均匀细胞悬液, 按1∶2的比例将细胞悬液移入培养瓶, 每3d换液1次, 每次换2/3量, 保留1/3原培养, 放回培养箱中继续培养, 待细胞长至融合状态后, 可再传代。

2 主要观察指标

(1) 倒置相差显微镜观察VSMC形态; (2) 细胞成活率检测及生长曲线; (3) MTT法测VSMC增殖; (4) 免疫组织化学法观察VSMC形态。

2.1 VSMC形态

贴壁细胞光镜特征:×100镜下观察, A组摄于第5天, B组摄于第7天, C组摄于第11天。见图1。

注:A组摄于第5天, B组摄于第7天, C组摄于第11天。

2.2 成活率及生长曲线

取消化后重新混悬的原代细胞18ul, 加入浓度为0.4%台盼蓝溶液2μl, 使用一次性吸管反复抽吸混悬均匀后吸取10μl于计数板上, 镜下观察, 存活的细胞为不着色细胞, 蓝色细胞为异常或者死亡细胞, 存活细胞均在96%以上。绘制传代细胞生长曲线:将对数生长期的细胞采用传代培养方法制成单细胞悬液, 调解细胞密度1×106/L接种于六孔板上贴壁24h后第1天收集1孔计数, 第2天收集第2孔细胞, 第3天同上, 培养第4天给未记细胞换液, 每次重复3孔, 使细胞生长曲线的测定更准确。

2.3 MTT法测血管平滑肌细胞增殖

调整细胞数1×105接种于96孔板, 孵育24h后避光条件下, 加入浓度为5mg/ml的MTT溶液, 每孔加入20μl, 培养箱中继续培养4h, 形成蓝色结晶, 每孔加入150ulDMSO溶液, 待结晶充分溶液后即可上机检测。采用酶标仪在490nm处测定各孔观察值密度。连续9d测定VSMC增殖能力, 光密度 (D490nm) 分别为:1d0.073±0.012, 2d0.071±0.010, 3d0.110±0.016, 4d0.133±0.010, 5d0.209±0.011, 6d0.215±0.015, 7d0.226±0.014, 8d0.232±0.012, 9d0.221±0.014。

2.4 培养细胞鉴定

第2、4代VSMC悬液接种于24孔板中分别进行爬片的制备, 待细胞生长亚融合时, 取出细胞爬片进行细胞免疫化学染色。分为实验组 (滴加一抗) 与空白对照组 (不加一抗) 。吸出培养基, PBS清洗1遍, 4%多聚甲醛室温固定20min, PBS清洗3遍, 0.2%Tritonx-100室温透膜10~15min。PBS清洗3遍, 0.1%山羊血清室温封闭30min, PBS清洗3遍, a-SMA (vsmc) , 一抗稀释为1∶250, 吸除一抗, PBS清洗3遍, 每遍3min, 加辣根过氧化物酶标记的抗兔/鼠通用型二抗, 室温孵育1h。PBS清洗3遍后, DAB显色3~5min。PBS清洗3遍, 去除DAB。选染色均匀的区域, 在100倍视野下计数着色细胞占视野细胞总数的百分数, 共计数5个视野, 取平均值, 按着色细胞占视野细胞总数的百分比分别计1~4分, 1分为小于30%, 2分为30%~69%, 3分为70%~89%, 4分为90%~100%, 按细胞着色强弱 (Staininginrensity, SI) 记0~3分, 0分为不着色, 1分为着色弱, 2分为中等着色, 3分为强着色, 观察者为单盲计分, 每张切片的积分为PP×SI值, 每组取5张切片, 取均数做统计学处理。

3 结果

3.1 VSMC形态

光镜观察原代第5天左右即可见数个组织块周围出现细胞晕, 单个细胞以垂直的方向从组织块边缘游出, 以三角形、梭形多见, 每日在相差显微镜下观察细胞的贴壁、生长形态变化并拍摄照片。继续培养7~8d后, 细胞分裂增殖迅速, 进入对数生长期, 细胞呈多层、极性排列, 第11天后, 在组织块附近首次出现血管平滑肌细胞特征性的“谷-峰”结构, 峰:即多层细胞丘呈多层重叠、高低起伏状, 谷:即稀疏、单层排列的细胞如图1。

3.2 VSMC生长曲线

生长前2d无明显增殖 (P>0.05) , 提示此段时间细胞增殖能力较弱, 3~4d时较前2d变化显著 (P<0.05) , 提示此段时间细胞出现增殖, 5~8d变化与3~4d变化比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 提示此段时间细胞增殖旺盛, 与VSMC生长曲线结果一致, 所以于第5天传代为最佳时机, 7~8d为细胞分裂增殖高峰, 9d增殖速度减慢, 如图2。

3.3 免疫组化结果

第2代VSMC的a肌动蛋白免疫组织化学染色显著且广泛, 呈强阳性表现, 其PP与SI乘积均值为8.68±2.33, 培养至第4代时a肌动蛋白染色显著变浅, 稀疏。其PP与SI乘积均值为7.04±1.13, 与2代细胞免疫组化结果差异显著 (P<0.05) 。

注:*P<0.05。

4 讨论

已经证实VSMC是构成血管壁组织结构、功能的物质基础, 自身的改变是导致高血压的病理学基础[5,6]。随着分子生物学, 细胞生物学的研究进展, VSMC细胞表型的可塑性、增殖、迁移、分化、凋亡和细胞外基质的合成和分泌等方面的认识不断的深化[7]。

原代培养的细胞大小不一, 细胞周期为7~10d, 呈典型的“峰-谷”, 少量的为扁平的多角细胞, 细胞间紧密相靠, 呈“铺石路”样外观[8]。从细胞生长曲线观察, 可见细胞在第5天换液后呈显著增殖, 考虑与自身分泌的多种生长因子促进细胞增殖, 所以在第5天换液时建议保留1/3原液。MTT法进一步证实VSMC增殖高峰在7~8d左右, 建议可以在此期进行实验干预最佳。a-SMActiion在所有真核细胞中表达均高度保守, 公认是VSMC表型转化标志[9]。免疫组化差异提示细胞在体外培养时可能发生了生理、生化、免疫、形态学及表型间转化, 尤其后者会导致细胞表面特异性的标志蛋白表达的差异, 导致第2代与第4代免疫组化的差异, 但这些改变具体有哪些?是否对实验结论产生质的影响?在传代过程中能否保持平滑肌细胞的一般特性?这些问题有待以后探讨解决。

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