肾组织血管病变

肾组织血管病变（精选3篇）

肾组织血管病变 篇1

高血压肾损害是原发性高血压引起的良性小动脉性肾硬化和恶性小动脉性肾硬化及其伴有相应临床表现的疾病。高血压肾损害主要表现为血管的损害和肾间质纤维化。结缔组织生长因子 (Connective Tissue Growth Factor, CTGF) 是转化生长因子β1 (Transform Growth Factorβ, TGF-β1) 下游的重要致纤维化因子之一, 早期干预CTGF表达, 能阻止纤维化进程[1,2]。那么当归补血颗粒 (Danggui Buxue granules, DG) 早期干预对高血压肾损害的血管病变有无治疗作用, 早期用药是否与CTGF表达相关, 本研究将对此进行探讨。

1 资料与方法

1.1 一般资料

36只成年雄性自发性高血压大鼠 (Spontaneously Hypertensive Rats, SHR) 及10只同源雄性 (Wistar-Kyoto, WKY) 大鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司。大鼠试喂养1周, 根据用药时间分早期组和晚期组, 早期组选用8周龄SHR大鼠, 晚期组选用12周龄SHR大鼠, 并设置同龄WKY组大鼠为正常对照。早期组包括当归补血颗粒治疗组 (DG组, 10只) 和生理盐水对照组 (NS组, 8只) 和同龄WKY大鼠 (5只) ;晚期组包括当归补血颗粒治疗组 (DG组, 10只) 和生理盐水对照组 (NS组, 8只) 和同龄WKY大鼠 (5只) 。早期DG组6 g/ (kg·d) 灌胃, 直至28周龄;晚期组以同样DG灌胃, 直至28周龄;NS组以等量生理盐水灌胃, WKY大鼠不做任何处理。各组大鼠血压采用无创性尾套式大鼠血压计监测, 每周1次, 在大鼠清醒状态下测定尾动脉收缩压, 每鼠测量3次, 取均值, 每周测血压两次。测血压前大鼠经37℃预热15 min。

1.2 主要材料

当归补血颗粒购自河南省中医院配方颗粒药房, 选用黄芪30 g, 当归6 g;尿β2微球蛋白按照放射免疫试剂盒由中国原子能科学研究所生产;总RNA提取试剂盒 (RNeasy Mini Kit试剂盒) 购自美国Qiangen公司, 逆转录试剂盒购自美国Promega公司, real-time PCR试剂盒 (q-PCR Mixture) 购自日本Ta Ka Ra公司, 荧光探针实时定量PCR仪 (ABI7900HT) 购自美国Applied Biosystems公司, real-time PCR所用引物由上海生物工程有限公司合成, 羊抗CTGF多克隆抗体购自美国Abcam公司, 鼠抗β-actin单克隆抗体购自美国Sigma公司, 二抗均购自美国Sigma公司, 增强化学发光 (ECL) 显色液购自美国Pierce公司。

1.3 观察指标及检测方法

1.3.1 生物化学指标检测

各组大鼠在28周龄时处死, 处死前1 d, 代谢笼收集24 h尿液, -20℃保存。处死时经心脏取血2 m L, 冰上静置10 min, 加入抗凝管, 3000 r/min离心5 min, 取上清液。尿素氮和肌酐由HI-TACHI7150A自动生物化学分析仪检测, 尿β2微球蛋白按照放射免疫试剂盒说明书进行检测。

1.3.2 组织病理学染色

1.3.2. 1 肾脏组织HE染色

肾组织以4%多聚甲醛固定, 常规包埋、切片, 做HE染色观察肾组织病理变化, 每张标本低倍镜下单盲依序观察左上、右上、左下、右下、中间5个肾小管间质视野, 依据肾小管上皮细胞空泡变性、肾小管扩张、肾小管萎缩、红细胞管型、蛋白管型、间质水肿、间质纤维化、间质炎性细胞浸润等8项指标来观察肾间质病理改变并进行肾小管间质损伤指数评分[3]。

1.3.2. 2 血管病变检测及评分

肾脏组织HE染色, 规定皮质区的动脉横切面>5个, 于光镜下对不同的管径动脉实际横断面总数进行计数。如果动脉管径在30~100μm, 其中膜肌层未低于2层, 则该动脉属于小动脉;如果动脉管径<30μm, 同时平滑肌的细胞超过一层, 则该动脉属于微动脉。借由计算机辅助病理分析系统、显微镜的目镜测微尺, 对动脉内膜厚度、肾内的小动脉外径、微动脉的外径、动脉中膜的厚度、小动脉的内径以及微动脉的内径等进行准确测量。

参照Katafuchi等[4]的方法, 肾间质小血管病变按光镜下的形态学特点分为4型: (1) 透明变性 (Hyalinosis, HL) 型:动脉内膜透明样变或玻璃样物质沉积, 可见弹力层分层, 血管壁无坏死、无炎细胞浸润, 无血管内膜增厚; (2) 动脉硬化 (Arteriosclerosis, AS) 型:动脉血管内膜增厚、管腔不同程度狭窄及弹力层分层, 管壁无坏死, 可伴有动脉壁透明变性; (3) 炎细胞浸润 (Celluar infil-tration, CI) 型:血管壁炎细胞浸润, 可伴有管壁增厚、透明样变, 无管壁坏死、内膜增厚; (4) 纤维素变性坏死 (Fibroid necrosis, FN) 型:血管壁以纤维素样变性和/或坏死为主要表现, 可伴有管腔狭窄。

动脉壁增厚的定义为:横断面肾内动脉内径<1/2外径。

肾动脉病变的半定量分级标准:0:无损害;1:<25%;2:25%~50%;3:≥50%。

1.3.3 Real-time PCR检测大鼠肾组织CTGF表达

1.3.3. 1 组织总RNA的提取

按照用RNeasy Mini Kit试剂盒提取组织总RNA, 抽提的总RNA用紫外分光光度计测OD值, 比值在1.9~2.0, 取3μL RNA用1%琼脂糖凝胶电泳, 可见5、18、28 s 3条清晰的RNA带, 提示RNA无污染和降解。

1.3.3. 2 c DNA的合成

按照用逆转录试剂盒合成c DNA, 再以此c DNA为模板进行real-time PCR反应操作。Real-time PCR的引物序列如下:β-actin上游5'-GGCCAACCGTGAAAAGATGA-3', 下游5'-GACCAGAGGCATACAGGGACAA-3';CTGF上游5'-CCTGTGAAGCTGACCTAGAGGAAA-3', 下游5'-ACA-GAACTTAGCCCGGTAGGTCTT-3'。

1.3.3. 3 Real-time PCR检测

在ABI 7900型荧光定量PCR仪上进行扩增, 96孔板加样, 设计复孔和标准曲线, 用Se-quence Detection System软件分析各检测样本的Ct值 (达到一定荧光阈值的循环数) , 计算2-△△Ct评价TGF-β及CTGF在肾组织中的表达水平。

1.3.4 Western Blot检测肾组织CTGF蛋白表达

1.3.4. 1 肾皮质总蛋白质的提取

取组织块100 mg加入组织总蛋白提取液1 m L匀浆, 冰上裂解30 min, 4℃以12 000 r/min离心15 min, 取上清, 按Bio-rad蛋白定量试剂盒方法进行蛋白定量, 取80μL上清加5×变性缓冲液20μL混匀, 100℃下变性10 min。

1.3.4. 2 免疫印迹检测

灌制10%的分离胶和4%的堆积胶, 取总蛋白100μg行上样电泳, 电泳结束后260 m A电转印90 min至PVDF膜。封闭液 (5%牛奶) 摇床上封闭2 h, 加入羊抗CTGF多克隆抗体 (1∶200) , 4℃摇床过夜。洗膜后再加相应的二抗, 室温孵育1 h, 加ECL液后显影、定影, 以β-actin为内参照。将胶片扫描后, 采用Quantity One软件分析各条带灰度值, 将各目的条带灰度值除以同一标本内参照β-actin条带灰度值得到一比值, 将该比值除以同一胶片上假手术组的比值作为该目的蛋白表达量的半定量结果。

1.4 统计学处理

采用SPSS 17.0软件进行分析, 计量资料采用 (±s) 表示, 组间比较采用单因素方差分析, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血压、血肌酐、尿素氮和尿β2微球蛋白 (β2MG) 水平比较

SHR血压较WKY大鼠明显升高, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。经治疗后, DG组大鼠血压较NS组差异无统计学意义 (P>0.05) , 说明DG无降压作用。早期组治疗后, DG组血肌酐、尿素氮和尿β2MG水平均较NS明显降低, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。晚期组治疗后, DG尿β2MG与NS比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;DG组血肌酐、尿素氮与NS比较, 有下降趋势但差异无统计学意义 (P>0.05) , 见表1。

*与同时间NS组比较, P<0.05;△与SHR组比较, P<0.05

2.2 肾间质纤维化和血管病变评分

SHR肾间质损害及血管病变较WKY大鼠明显增加, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;经治疗后, DG组大鼠肾间质损害及血管病变均较NS组明显降低, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;早期组经DG治疗后, 间质纤维化和血管病变程度均较生理盐水对照组明显好转, 差异有统计学意义 (P<0.01) , 治疗效果优于晚期组, 各组比较见表2。

2.3 各组大鼠治疗前后肾组织CTGF m RNA和蛋白表达

SHR肾组织CTGF m RNA和蛋白表达均较WKY大鼠明显增加, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;晚期组经治疗后, DG组大鼠肾间质损害及血管病变均较NS组明显降低, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;早期组经DG治疗后, 间质纤维化和血管病变程度均较NS组明显好转, 差异有统计学意义 (P<0.01) , 治疗效果优于晚期组, 见表2、图1。

分

*P<0.05, #P<0.01, 与同时间NS组比较;△与SHR组比较, P<0.05

*P<0.05, #P<0.01, 与同时间NS组比较;△与SHR组比较, P<0.05

注:1:WKY大鼠;2:早期DG组;3:早期NS组;4:晚期DG粒组;5:晚期NS组

3 讨论

高血压肾损害主要表现为血管的损害和间质纤维化, 血管损害典型病理表现为肾小动脉的肌内膜肥厚和/或细小动脉的玻璃样变。高血压造成的压力改变, 引起肌型小动脉内膜胶原纤维及弹力纤维增生, 内弹力膜分裂, 中膜平滑肌细胞增生肥大, 同时伴纤维组织增生, 造成血管壁增厚, 管腔狭窄。高血压造成的细动脉反复痉挛, 内皮细胞受损, 内皮间隙扩大, 血浆蛋白渗入内皮下间隙;同时内皮细胞及中膜平滑肌细胞分泌细胞外基质增多、平滑肌凋亡, 最终管壁被上述物质替代, 发生细小动脉玻璃样变, 进而导致肾小球及肾小管的缺血性改变, 后期表现为肾小球废弃性或固化性硬化, 以及肾小管萎缩及间质纤维化。

CTGF是TGF-β1促纤维化作用的重要下游介质, 在人体心、脑、肺、肝、肾、肌肉、胎盘、结缔组织中均有表达, 可抑制细胞外基质 (Extracellular Matrix, ECM) 降解, 促进ECM生成、沉积, 并可通过促进细胞有丝分裂、增殖来诱导、刺激成纤维细胞活化、增殖[5,6,7]。CTGF在许多疾病的致纤维化作用中介导了TGF-β1的许多功能。但是TGF-β1的生物学作用广泛, 阻断TGF-β1可能会影响重要功能而产生不良反应, 而对下游的因子, 如CTGF阻断和干预, 则更具特异性。

当归补血汤是一首来自金元时代李东垣《内外伤辩惑论》的经典益气补血方剂, 由黄芪和当归两味药以5:1比分组成。该方在配伍时重用黄芪大补脾肾之气, 以资气血生化之源, 配以当归苷辛而温, 养血和营, 黄芪为君, 当归为臣, 目前临床上多使用当归补血颗粒。黄芪甲苷是黄芪的主要成分之一, 是评价黄芪药材质量的优劣标准, 有抑制肾间质纤维化的作用[8];阿魏酸为非胍类内皮素受体拮抗剂, 是当归的主要有效成份之一, 为其活血成分的主要物质基础, 阿魏酸具有抗血小板聚集、抗炎、抗氧化、抗纤维化的作用。

黄芪当归配伍有明确的科学依据。黄芪甲苷难溶于水, 生物利用度差, 而阿魏酸能明显促进黄芪甲肝在大鼠十二指肠的吸收作用[9]。芪归配比5:1组阿魏酸析出比例最高, 大鼠免疫功能及抗炎能力改善影响最大[10,11,12]。

SHR的血压升高是由多基因遗传决定的, 与人类高血压病十分类似, SHR出生后血压随鼠龄不断升高, 3~4个月时为高血压确立期, 6个月时血压升到最高水平, 幼年SHR交感活性增高, 随血压升高进一步出现心、脑、肾等并发症。本研究选用8周为SHR大鼠早期干预点, 这时SHR血压已开始升高但尚未出现明显并发症;选用12周为晚期干预点, 这时SHR血压已经出现明显升高, 各种并发症开始出现。

本研究发现, 当归补血颗粒早期干预能明显降低SHR血肌酐和尿素氮水平、减少尿β2MG水平, 改善高血压肾间质纤维化程度和肾血管病变程度, 当归补血颗粒的这一作用与降低肾组织CTGF m RNA和蛋白表达相关, 早期用药效果优于晚期;当归补血颗粒对大鼠血压无影响, 说明当归补血颗粒治疗作用与血流动力学无关。当归补血颗粒能通过早期干预CTGF表达缓解高血压肾损害肾血管病变和间质纤维化水平。本研究为当归补血颗粒在高血压肾损害早期治疗方面的临床应用提供了试验参考。

摘要：目的:探讨当归补血颗粒早期干预结缔组织生长因子 (CTGF) 在防治高血压肾损害肾间质纤维化及肾血管病变中的意义。方法:自发性高血压大鼠 (SHR) , 根据用药时间分为早期组和晚期组, 早期组选用8周龄SHR, 晚期组选用12周龄SHR, 并设置同龄WKY大鼠为正常对照组。早期组包括当归补血颗粒治疗组 (DG组) 和生理盐水对照组 (NS组) , 晚期组包括当归补血颗粒治疗组 (GD组) 和生理盐水对照组 (NS组) 。早期组以当归补血颗粒6 g/ (kg·d) 灌胃, 直至28周龄;晚期组以同样剂量当归补血颗粒灌胃, 直至28周龄。尾动脉无创测压法观察各组大鼠血压情况, 生化方法测定治疗前后各组大鼠的血肌酐、尿素氮和尿β2微球蛋白水平, 组织病理学染色观察大鼠肾间质纤维化及肾血管病变情况, Real-time PCR和Western Blot检测各组大鼠的CTGF表达。结果:早期组DG治疗后SHR血肌酐、尿素氮、尿β2 MG、肾间质纤维化指数、血管病变评分、CTGF m RNA和蛋白表达均较NS组明显降低, 差异有统计学意义 (P<0.01) 。晚期组治疗后, DG组尿β2 MG、肾间质纤维化指数、血管病变评分、CTGF m RNA和蛋白表达与NS组比较均下降, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 早期组的治疗效果优于晚期组;当归补血颗粒治疗对SHR血压无影响 (P>0.05) 。结论:当归补血颗粒早期干预治疗能明显改善高血压肾损害大鼠肾功能和肾间质纤维化病变及血管病变程度, 这一作用与干预肾组织CTGF表达相关, 与血流动力学无关。

关键词：结蹄组织生长因子,肾血管损害,肾脏纤维化,自发性高血压大鼠,当归补血颗粒

肾组织血管病变 篇2

关键词：心绞痛,超声检查, 介入性,体层摄影术, 螺旋计算机,冠状血管造影术,虚拟组织学

冠状动脉造影是诊断冠心病、评价管腔狭窄严重程度的“金标准”, 但是随着对冠心病发病机制的深入研究, 易损斑块的概念被提出来并成为国际、国内冠心病研究领域的热点。易损斑块也称不稳定斑块、活动性斑块或高危斑块, 循证医学表明易损斑块破裂是不稳定型心绞痛 (unstable angina pectoris, UAP) 的主要原因[1]。冠状动脉造影能够描述管腔边界, 却不能评价斑块负荷、形态和组成成分, 不能识别易损斑块。血管内超声是评价在体冠状动脉粥样斑块的“金标准”。虚拟组织学血管内超声 (virtual histology intravascularultrasound, VH-IVUS) 是一种近年来发展起来的能够对斑块进行形态学分析的新技术, 能够对斑块性质及其组成成分进行准确的分辨。因此本研究应用此种方法观察稳定型心绞痛 (stable angina pectoris, SAP) 和UAP患者罪犯血管的斑块构成差别, 从而指导临床医师采取合适的临床治疗策略, 以降低急性心血管事件的发生率。

1资料与方法

1.1研究对象收取2011-07~2013-06在泰达国际心血管病医院心内科住院的心绞痛患者199例, 其中男145例, 女54例;年龄18~75岁, 平均 (61±9) 岁。所有患者均符合2013年美国心脏病学会 / 美国心脏协会公布的SAP及UAP治疗指南中提出的诊断标准[2,3,4]。SAP满足以下标准:近期内心绞痛发作的频率、持续时间、诱因或缓解方式没有变化;无近期心肌损伤的证据。UAP包括静息心绞痛、新发心绞痛、快速进展心绞痛。排除标准:排除左主干病变、再狭窄、血栓病变、严重钙化病变、慢性闭塞病变、桥血管病变、伴严重心力衰竭或心源性休克、严重肝肾功能不全者。按临床表现、心电图及心肌酶学将患者分成SAP组 (101例) 和UAP组 (98例) 。本研究经医院伦理委员会批准, 所有患者均在入组前签署知情同意书。

1.2仪器与方法所有患者均于入院后采集一般临床资料, 询问患者有无高血压、糖尿病、高脂血症、吸烟等危险因素。入院后次日清晨空腹采肘静脉血3 ml, 使用日立全自动生化分析仪7600测空腹血糖、三酰甘油、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇;以25 mm/s纸速同步记录体表12导联心电图。完善术前检查, 无手术禁忌证, 入院后第2天行冠状动脉造影检查。所有入选患者均采用Judkins法进行选择性冠状动脉造影, 判定冠状动脉病变部位、狭窄程度, 记录冠状动脉造影图像。“罪犯”血管为缺血相关的冠状动脉。“罪犯”血管的判定:结合心电图, 由冠状动脉造影确定血管内狭窄最严重处为“罪犯”血管, 同时行血管内超声检查。

1.3灰阶血管内超声及VH-IVUS的检查方法所有患者均于入院后第2天冠状动脉造影结束后进行灰阶血管内超声及VH-IVUS检查。应用波士顿科学公司的i Lab血管超声显像仪及图像分析系统。在常规追加肝素抗凝及冠状动脉内注射硝酸甘油后, 将导引钢丝送至“罪犯”血管远端, 沿导引钢丝送入血管内超声探头导管, 通过“罪犯”病变远端血管, 连接血管超声显像仪, 使用自动回撤装置, 以1 mm/s的匀速回撤探头至病变近端, 测定“罪犯”病变血管处以及距病变10 mm的近端、远端参考血管 (参考血管定义为“罪犯”病变近 / 远端含有少量斑块且没有分支的血管) , 采集“罪犯”病变血管及参考血管图像数据, 应用VHIVUS技术对血管斑块的结构和组成进行自动分析。本研究中有关参考血管的各项指标均采用远端和近端参考血管的平均值。

1.4 VH-IVUS检测指标测量病变部位及参考部位血管的外弹力膜面积、管腔横截面积、斑块面积、斑块负荷、斑块最厚处直径及其对侧斑块最薄处直径。重构指数为病变部位血管的外弹力膜面积 / 参考血管的外弹力膜面积, 重构指数≥1.05为正性重构, ≤0.95为负性重构, 介于两者之间为无重构。斑块偏心指数 = (斑块最厚处直径-斑块最薄处直径) / 斑块最厚处直径;斑块偏心指数≤0.5为向心性斑块, >0.5为偏心性斑块。根据VH-IVUS软件所构建的组织图像对斑块成分进行分析, 白色代表钙化组织, 绿色代表纤维组织, 黄色代表脂质组织, 红色代表坏死组织。VH-IVUS软件利用每个切面获得的数据计算出每种成分在斑块中所占的比例。

1.5统计学方法采用SPSS 13.0软件, 计量资料组间比较采用成组t检验, 计数资料组间比较采用χ2检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1一般临床特征UAP组低密度脂蛋白胆固醇明显高于SAP组, 差异有统计学意义 (t=2.099, P<0.05) 。两组年龄、性别、合并高血压及2型糖尿病的发生率比较, 差异无统计学意义 (t=-1.051、0.013、1.944、2.367、1.190, P>0.05) 。UAP组冠状动脉造影诊断的单支病变、双支病变及三支病变比例分别为35%、42% 和23%, SAP组冠状动脉造影诊断的单支病变、双支病变及三支病变比例分别为51%、34% 和15%, UAP组多支病变多见, SAP组单支病变多见。两组一般临床资料比较见表1。

注:UAP:不稳定型心绞痛;SAP:稳定型心绞痛;“-”为无数据

2.2两组灰阶血管内超声影像检查结果的比较两组在最小管腔面积处测量的管腔外弹力膜面积、管腔面积、斑块和中膜面积、偏心指数、重构指数比较, 差异无统计学意义 (t=1.392、-0.345、1.921、0.378、0.857, P>0.05) 。见表2。

2.3两组VH-IVUS影像检查结果的比较在最小管腔面积处测量的斑块组成方面, UAP组坏死核心 (红色) 面积明显高于SAP组, 差异有统计学意义 (t=2.361, P<0.05) 。两组纤维面积、脂质面积、钙化面积比较差异无统计学意义 (t=1.045、1.884、0.787, P>0.05) 。在斑块成分分布百分比方面, UAP组纤维斑块面积百分比明显低于SAP组 (t= - 2.418, P<0.05) , 坏死核心面积明显高于SAP组 (t=2.602, P<0.05) , 两组脂质面积及钙化面积比较差异无统计学意义 (t= - 0.551、0.085, P>0.05) , 见表3。SAP和UAP患者VH-IVUS影像各1例, 见图1、2。

注:在最小管腔面积处测量;UAP:不稳定型心绞痛;SAP:稳定型心绞痛

3讨论

血管内超声是无创性的超声技术和有创性的导管技术相结合的一种的诊断方法。利用导管将一高频微型超声探头导入血管腔内进行探测, 再经电子成像系统来显示心血管组织结构和几何形态的微细解剖信息。不仅可以了解管腔的形态, 还可以直接显示管壁的结构, 并根据病变的回声特点判断病变的性质, 精确测定管腔、血管的大小及病变的狭窄程度, 被认为是血管检查的新“金标准”。VH-IVUS是一种比较新的血管内超声后处理技术, 它的基本原理是利用反向散射的超声射频信号, 通过功率频谱的处理, 对斑块组织进行彩色编码, 叠加在灰阶血管内超声图像上, 得到重建的实时斑块组织图, 对斑块进行病理组织学分类[5]。VH-IVUS综合反映了超声波的振幅和频率信息, 其识别富含脂质坏死核的敏感度和特异度分别为91.7% 和96.6%[6,7]。冠心病的不同临床分型处理策略不同, 临床预后也不同, 因此有必要了解临床诊断的冠心病的不同分型和VH-IVUS所测量的斑块组成之间的关系, 对指导临床医师采取正确的治疗策略及评价预后有重要意义。

注:在最小管腔面积处测量;VH-IVUS:虚拟组织学血管内超声;UAP:不稳定型心绞痛;SAP:稳定型心绞痛

图1 男, 65岁, 稳定型心绞痛。稳定斑块, 以纤维成分为主 (90.67%) , 坏死成分所占的面积很小 (5.06%)

图2 男, 67岁, 不稳定型心绞痛。不稳定性斑块, 斑块破裂, 纤维组织所占面积为76%, 坏死组织所占面积为14%

本研究应用VH-IVUS方法评价了SAP及UAP患者病变血管最狭窄处斑块负荷及斑块组成的特点及差别。与SAP组相比, UAP组在最小管腔面积处有更小的管腔面积, 更大的外弹力膜面积、斑块面积, 偏心指数及重构指数, 但是两组之间无统计学差异。Hong等[8]对急性冠状动脉综合征患者和SAP患者的上述指标进行了比较, 结果表明急性冠状动脉综合征组在外弹力膜面积、斑块面积及重构指数方面均明显高于SAP组, 考虑与研究人群差异有关。Hong等[8]还入组了一部分急性心肌梗死的患者, 这部分患者病变血管斑块负荷更高。在斑块构成方面, UAP组坏死核心面积明显高于SAP组。在斑块成分分布百分比方面, 两组之间在脂质面积及钙化面积方面差异无统计学意义。SAP组纤维斑块面积百分比明显高于UAP组, 坏死核心面积明显小于UAP组, 两组之间差异有统计学意义。Hong等[8]也对这方面进行了研究, 结果急性冠状动脉综合征组坏死核心面积明显高于SAP组, 与本次研究结果一致。研究结果表明与SAP相比, UAP组斑块负荷更重, 斑块组成中坏死组织所占面积更大, 所占比例更高, 坏死组织大小与斑块破裂有关[9], 说明斑块含坏死组织越大, 冠状动脉病变越不稳定, 越容易出现各种不良的心血管事件, 因此更需要强化他汀类等药物治疗。当然VH-IVUS作为一种新技术还不完美, 仍有很多不足的地方, 由于VH-IVUS要把整个斑块区分为4种组织, 因此对不同斑块成分的边界精确的界定是非常重要的, 另外它不能确定冠状动脉内的血栓形成, 也不能识别支架的存在, 因此, 对于冠状动脉内急性血栓形成的患者和支架内再狭窄的患者, VH-IVUS分析目前还不具备明确的指导价值, 当然本研究并未纳入这部分患者。

本研究结果表明UAP组斑块负荷更重, 斑块组成中坏死组织所占面积更大, 更容易发生临床事件, 对这部分患者要给予足够重视。VH-IVUS方法在评价病变血管斑块的稳定性方面有独特的优势, 有助于临床医师选择合适的治疗方案, 减少甚至避免临床不良事件的发生, 使患者最大程度地获益。

参考文献

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肾组织血管病变 篇3

高血压是脑梗死和脑出血最重要的危险因素,其中血管壁病变是脑卒中发病的基本条件之一。血压的升高通过对血管壁的剪切力以及氧化应激等损伤血管内皮细胞增强ICAM-1的表达而引起炎症反应[1,1],加剧高血压血管损害。目前还不清楚ICAM-1升高的始动因素及调控机制。有研究表明,在高血压血管病变的过程中有核转录因子(nuclear factor kappa B,NF-κB)的激活。通过对ICAM-1基因结构的分析发现,其启动子包含有特异性与NF-k B等转录因子结合的位点[2]。为了解高血压脑卒中形成过程中NF-kB与ICAM-1的表达变化规律及其相互关系,我们应用免疫组化方法通过对易卒中型肾血管性高血压大鼠(stroke-prone renovascular hypertensiverats,RHRSP)模型脑卒中形成过程中脑血管中NF-kB与ICAM-1表达的动态变化,为寻找延缓高血压脑卒中发生发展的方法提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

羊抗大鼠ICAM-1单克隆抗体、兔抗NF-kBp65多抗、小鼠和兔SP试剂盒(福州迈新生物技术公司),其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 动物与模型

选取100只鼠龄2、3个月,体重80～120 g的雄性Spraque-Dawley大鼠(由南华大学动物部提供),其中60只大鼠按双肾双夹法复制RHRSP模型[3,3],术后2周血压较术前增高20 mm Hg以上为手术成功标准,在饲养过程中出现脑卒中症状和体征剔除4只,随机取出30只作为RHRSP组。另取30只假手术大鼠作为对照组。其余大鼠备用。两组大鼠分别再以手术日为起点随机分成2周(手术日后2周,2周)、4周、6周、8周、12周、16周组共6个亚组,每亚组5只。以颗粒型普通大鼠饲料喂养,饮用自来水,动物房温度控制在20℃左右,光照周期为12 h,模拟正常昼夜节律。以鼠尾测压仪(HX2-1型)(中南大学湘雅医学院)测量血压,每2周1次。

1.3 标本及切片的制取

大鼠经心脏4%多聚甲醛灌注后断头取脑,自视交叉处开始向后取冠状切片,石蜡包埋,连续切片6张,分别行常规HE染色及NF-kB与ICAM-1免疫组织化学染色。

1.4 免疫组织化学法染色步骤

石蜡切片脱蜡至水,3%甲醇-双氧水室温孵育10 min,磷酸缓冲液(PBS)洗5 min×3次,0.1M椽酸缓冲液(pH 6.0)微波抗原修复98℃20min,自然冷却至室温,PBS洗5 min×3次,用10%正常山羊血清封闭37℃30 min,滴加一抗NF-kB和I-CAM-1(l∶50稀释),4℃冰箱过夜,PBS洗5 min×3次,滴加生物素标记的二抗IgG工作液,37℃,30min,PBS洗5 min×3次,滴加辣根酶标记链霉卵白素(SP)工作液,37℃孵育30 min。PBS洗5 min×3次。DAB显色,自来水终止。常规梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。阴性对照用PBS替代一抗,其余步骤同上。

1.5 统计学分析

每张切片显微镜下分别随机选取4个视野,进行NF-kB与ICAM-1阳性血管数计数,再分别进行t检验、方差分析及相关分析,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 血压变化

对照组的收缩压(SBP)随年龄增长无明显变化,各时间点之间差异无统计学意义。RHRSP组术后血压迅速升高,第8周时达高峰,与对照术组比较,术后第2、4、6、8、12和16周差异都有极显著性(P<0.001)。且RHRSP组术后各期均明显高于术前(P<0.001)。见表1。

注:†在同一时间内和假手术及术前组比较,P<0.001

2.2 形态学改变

HE染色后,光镜下假手术组大鼠脑内小动脉均表现为管腔平滑,管壁不厚;而RHRSP组大鼠脑内小动脉有不同程度透明变性、硬化、动脉壁增生性反应而致管壁增厚、管腔狭窄,有时可见微血栓和微动脉瘤形成。

2.3 NF-kB和ICAM-1的表达

假手术组大鼠脑血管均未见NF-k B和I-CAM-1的表达。RHRSP组大鼠脑动脉壁在术后2周即可见NF-kB表达明显增加,随之ICAM-1表达也迅速增加。NF-kB在术后6周基本达最高峰,I-CAM-1表达在术后8周达最高峰,并且二者一直持续至术后16周,见图1～4。阳性颗粒主要位于内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞NF-kB在胞浆及胞核内均有表达,ICAM-1则只在胞浆表达,NF-kB在神经胶质细胞也可见大量表达。RHRSP组NF-k B和ICAM-1阳性微血管数的各个对比组的两两比较,2～16 W组和假手术组间P<0.001,12W和16W与8 W组间P>0.05。

注:1)各组NF-kB阳性微血管数,F=28.964,P<0.01;2)各组ICAM-1阳性微血管数,F=32.486,P<0.001

2.4 血压、NF-kB和ICAM-1间的相关分析

2W至16W组共30只高血压大鼠作直线相关分析,血压分别与NF-kB和ICAM-1,以及NF-k B与ICAM-1均密切相关。血压与NF-kB和ICAM-1的r值分别为0.862,0.835(P<0.05),NF-kB和I-CAM-1的r值为0.683(P<0.05)。

3 讨论

黏附分子是一类介导细胞间、细胞与细胞外基质间黏附作用的膜表面糖蛋白,参与多细胞生物体各种生理、病理过程。ICAM-1是一种淋巴细胞功能相关抗原-1的配体,可以介导白细胞与血管内皮细胞之间的黏附及白细胞穿出血管壁。正常动脉内皮及内膜平滑肌细胞不表达或轻微表达ICAM-1,高血压通过对血管壁的剪切力以及氧化应激等损伤血管内皮细胞,以时间和压力依赖方式增强I-CAM-1的表达,导致大量单核细胞黏附至内皮,上调单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)m RNA的转录和表达,从而引起炎症反应[1,1]。通过对ICAM-1基因结构的分析发现,其启动子包含有特异性与NF-kB等转录因子结合的位点[2]。有研究认为,NF-kB在调控ICAM-1的表达中起着重要作用[4,5]。但NF-kB与ICAM-1的表达变化规律及其相互关系至今仍不十分清楚。本研究中,笔者首次应用易卒中型肾性高血压大鼠模型,通过免疫组化方法在蛋白水平分别观察了高血压血管病变过程中NF-kB与ICAM-1表达的动态变化,结果发现,实验组大鼠脑动脉壁在术后2周即可见NF-kB表达明显增加,随之I-CAM-1表达也迅速增加。NF-kB在术后6周基本达最高峰,ICAM-1表达在术后8周达最高峰,并且二者一直持续至术后16周。

NF-kB是一种诱导基因表达的DNA结合蛋白,它能够和特定基因的启动子或增强子区域固定核昔酸序列结合而启动该基因转录,在机体的免疫应答、炎症反应及细胞的生长调控等方面发挥重要作用。已有研究证明,脑缺血、TNF-α和IL-1能诱导NF-κB表达增加,后者使ICAM-1基因表达上调,进而使ICAM-1蛋白合成增加,其调控机制可能与缺血区产生的细胞因子启动了蛋白激酶-NF-κB-ICAM-1间的信号通路有关[6]。

本实验结果表明,随着血压上升,NF-k B活性升高,ICAM-1表达也迅速增加,在术后8周基本达最高峰,并持续至术后4个月,两者呈正相关;提示血管病变水平于第8周时达高峰,以后维持在此水平继续加重血管病变,这与既往研究发现RHRSP 8周后自发性中风率升高和较易诱发中风相符。因而提示,NF-κB和ICAM-1的表达增强可能是高血压炎症反应,血管重塑,最后形成脑卒中的重要原因之一。本研究发现,NF-κB维持在高水平不下降,与部分研究具有相似性[7]。也有研究发现,在大鼠动脉瘤模型中,肾性高血压形成早期,NF-kB活性升高,2个月后逐渐下降到正常水平[8,8]。笔者认为,动脉瘤是在高血压状态下受到高速血流的冲击形成的,是一种局部病变,NF-kB在达到一定水平后可能为负反馈所抑制而逐渐下降;而高血压脑卒中血管病变是一个慢性全身性的炎症过程,NF-κB促进ICAM-1的生成,导致炎症反应[7],而炎症因子如:TNF-α和IL-1反过来诱导NF-κB表达增加,对抗ICAM-1等细胞因子对NF-κB的负反馈抑制。当然,经过长时间的炎症反应血管病变达到一定程度后,NF-κB是否有一个逐渐下降的过程目前还不清楚。

目前认为NF-kB和ICAM-1主要与动脉硬化、缺血性脑血管病有关;但在有基础病变的血管,在血压突然升高等条件诱发下更易出现脑出血。本实验结果表明,NF-kB和ICAM-1的活性表达异常升高参与了高血压血管重塑的发生发展过程,是脑卒中发生的重要机制之一。由于NF-κB是炎症过程的主要调控因子,包括调节免疫应答和细胞的存活;也参与对血管重塑起重要作用的酶)———基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)的调控。因此,应用NF-κB拮抗剂有可能成为预防高血压脑卒中的新的药物治疗靶点。

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