血管内皮生长因子基因（共8篇）
血管内皮生长因子基因 篇1
毛囊作为皮肤主要附属物,构成及生理过程极为复杂,经历着生长期、退行期和休止期周期性循环过程,对应着毛发生长、脱落与再生的生理阶段,是动物体唯一终生经历周期性转化的器官[1]。毛囊周期性生长与自我更新是一个极为复杂的生理过程,众多细胞因子参与其生理过程的调节[2]。作为血管增殖关键性细胞因子,血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)在毛囊周期性生长中发挥着重要的作用[3,4,5]。研究结果表明,人斑秃头皮组织中VEGF表达量显著低于正常头皮组织[6],能显著促进毛发生长的各类生发剂均能促进皮肤VEGF的分泌[7,8]。体外培养的皮肤毛囊组织,在培养液中添加VEGF同样可提高毛发的生长速度,正常皮肤组织中通过特异性抗体阻断VEGF则可完全抑制毛发生长[9,10,11]。在硬皮病小鼠模型中,通过转基因方法特异性地在皮肤组织中表达VEGF 165基因,可使得小鼠皮肤真皮组织厚度增加,新生血管增加,皮肤毛发生长恢复[12]。
VEGF是一类分子质量为34~45 ku的分泌性糖蛋白。现已发现的人VEGF家族成员包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盘生长因子(placenta growth factor,PLGF),其核心的功能是促进血管内皮细胞增殖、增强血管通透性及改变细胞外基质、诱导血管生成,但各家族成员间分子功能的细微差别及相互作用关系目前尚不得而知[13]。VEGF-D与VEGF-C的结构相似,除了含有1个VEGF同源区外,一样也有长的C端和N端,C末端富含半胱氨酸残基,N末端有高度疏水区,是蛋白分泌的信号序列特异结构[14]。VEGF-D与VEGF-C以相同的方式通过水解掉C端和N端形成一种截短的成熟形式分泌出来,提示VEGF-D与VEGF-C功能可能存在着一定的相似性。
小尾寒羊与新吉细毛羊分别作为粗毛羊与细毛羊的典型代表,在毛囊密度、毛囊周期、毛囊生长发育及羊毛品质等性状上存在显著差异,迄今为止尚无有关绵羊VEGF-D基因研究的报道。为探讨VEGF基因家族在两个品种绵羊中分子行为的差异及是否影响毛用性状差别,试验成功地克隆出小尾寒羊、新吉细毛羊VEGF-D基因并进行了组织表达谱分布分析,为揭示VEGF-D基因与两品种羊毛用性状差异奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验动物
新吉细毛羊和小尾寒羊,雌性,在9~10月龄之间,其中新吉细毛羊为吉林省农业科学院畜牧科学分院选育的超细型新品系,纯种小尾寒羊为市售。
1.2 主要试剂
RNAlater,购自QIAGEN公司;TRIzol,购自Invitrogen公司;p MD18-T载体、Prime Script 1st Strand c DNA Synthesis Kit、Agarose Gel DNA Purification Kit和Ex Taq酶,均购自大连Ta KaRa公司;定量PCR试剂Light cycler 480 SYBR GreenⅠMaster,购自罗氏公司;大肠杆菌工程菌DH5α,吉林省农业科学院畜牧科学分院动物生物技术所分子遗传实验室保存。
1.3 引物的设计与合成
由于目前Gen Bank中尚未有绵羊VEGF-D基因mRNA数据信息,仅有预测的c DNA序列,试验以预测序列为模板(Gen Bank登录号为XM_004021929),采用Oligo7.0软件设计扩增绵羊VEGF-D基因mRNA的引物VEGFD-C,待克隆产物测序成功后设计定量RT-PCR引物VEGFD-Q,荧光定量内参引物为GAPDH,具体引物序列见表1。引物合成委托北京华大基因生物公司完成。
1.4 试验样品的采集与保存
试验所用样品主要包括肩胛后皮肤组织和其他实质组织器官。是在不同季节偶数月中旬采集皮肤组织样品,采集方法为经过局部剪毛、消毒,剪切0.5 cm2的皮肤样品。其他实质组织器官样品主要包括心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠、下丘脑、卵巢等,在屠宰场采集,所有样品浸入RNAlater保存液中,运送至实验室-80℃保存。
1.5 总RNA的提取与c DNA一链的合成
新吉细毛羊与小尾寒羊皮肤毛囊组织用液氮研磨后采用TRIzol法提取总RNA,其他组织器官用组织匀浆器研磨后采用TRIzol法提取总RNA。琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性,用紫外分光光度计检测其纯度与浓度,-70℃保存,备用。c DNA第一链合成反应参照Prime Script反转录试剂盒进行,具体步骤按说明书进行。
1.6 RT-PCR与基因克隆
RT-PCR扩增反应体系为:dd H2O 16.8μL,10×PCR Buffer 2.5μL,2.5 mmol/L d NTP Mix2.5μL,10μmol/L引物F 1μL,10μmol/L引物R1μL,0.5U/μL Taq酶0.2μL,c DNA模板1μL。反应条件为:94℃2 min;94℃30 s,62℃30 s,72℃30 s,共35个循环。KAP8-1基因扩增以皮肤毛囊组织为模板,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测进行胶回收、T载体连接等后续试验,阳性菌落经过测序,将结果进行生物信息学分析。
1.7 QRT-PCR反应
反应体系(20μL):dd H2O 8.6μL,c DNA模板1μL,Light cycler 480 SYBR GreenⅠMaster 10μL,正、反向引物各0.2μL。PCR反应条件:95℃10 min;94℃15 s,64℃30 s,共40个循环,扩增反应结束后进行熔解曲线分析。每个品种检测2个个体,每个样品重复进行3次。以GAPDH引物为内参,检测结果利用2-△△Ct法进行数据分析并绘制柱形图[8]。
2 结果
2.1 绵羊VEGF-D基因克隆与序列测定结果
应用克隆引物,以小尾寒羊与新吉细毛羊皮肤c DNA为模板,经RT-PCR扩增、电泳检测,结果表明两组c DNA样品均成功扩增出特异性片段,大小约为1 400 bp。阳性克隆菌经双向测序,用Seqmen软件对测序结果进行拼接,BLAST N比对结果表明,该基因为绵羊VEGF-D基因。该基因全长为1 487 bp,ORF Finder分析显示该基因包含完整的ORF,长度为1 065 bp,编码354个氨基酸。小尾寒羊VEGF-D基因核苷酸见图1。
2.2 不同物种VEGF-D基因同源性分析结果
应用DNAStar软件将所克隆到的小尾寒羊与哺乳动物(人、牛、小鼠和大鼠)、爬行及两栖类(壁虎、蛇和青蛙)、鱼类(包括鲑鱼和斑马鱼)等mRNA序列及氨基酸序列进行同源性分析,结果(见表2)表明,无论是在核苷酸还是氨基酸水平上,物种间VEGF-D基因的同源性并不高。相对于其他动物,哺乳动物VEGF-D同源性则较高,而亲缘关系更近的牛和羊两个物种间则表现出更高的同源性。
不同物种间VEGF-D基因氨基酸分子进化分析结果表明,该基因进化关系与真实物种间进化关系相一致(见图2),表现为哺乳类、爬行类、两栖类和鱼类由高到低的进化顺序。哺乳类中啮齿类又独立成为一支,绵羊与同属于偶蹄目反刍类的牛聚为一类,说明VEGF-D基因与物种间的协同进化关系。
2.3 绵羊VEGF-D基因核苷酸与氨基酸变异分析结果
选择小尾寒羊与新吉细毛羊各5个个体,采用RT-PCR扩增,每个个体挑选1个克隆进行测序分析,结果表明,两个品种绵羊VEGF-D基因均存在显著差异,品种内尚未发现VEGF-D基因存在基因多态性,提示该基因在群体内部存在较大的选择压力。小尾寒羊与新吉细毛羊VEGF-D基因核苷酸突变位点与所对应的氨基酸突变见表3。
从表3中可以看出,VEGF-D基因位于c DNA编码区的核苷酸突变均引起氨基酸序列的改变,这些核苷酸及氨基酸突变是否具有品种特异性目前不得而知。VEGF基因家族主要通过血小板衍生生长因子(PDGF)结构域行使功能[15],为了探寻氨基酸突变是否影响PDGF结构域的形成,通过SMART在线软件(http://smart.embl-heidelberg.de/)[16]对两个品种绵羊VEGF-D基因蛋白序列进行蛋白结构域分析,发现上述氨基酸突变并未对PDGF结构域的形成产生影响,但上述突变位点主要集中于PDGF结构域的两侧(见图3),蛋白酶切位点分析(http://web.expasy.org/cgi-bin/peptide_cutter/)结果表明,小尾寒羊与新吉细毛羊VEGF-D蛋白73位、126位和236位并未引起蛋白酶切位点的改变。而205位由精氨酸(R)突变为甘氨酸(G)导致新吉细毛羊VEGF-D蛋白该位点精氨酸内肽酶(Arg C)、梭菌蛋白酶(Clost)和胰蛋白酶(Tryps)位点的缺失,218位由丝氨酸(S)向脯氨酸(P)突变导致脯氨酸内切酶位点的增加,但导致前一位组氨酸(H)位点酶蛋白酶位点(Ch_lo)的消失。由于VEGF-D蛋白成熟过程需要水解掉PDGF结构域两端前导肽,这些蛋白酶突变是否直接影响VEGF-D蛋白的成熟过程尚需进一步验证。
2.4 VEGF-D基因组织表达分布分析结果
VEGF基因家族与血管生成密切相关,因此在血管丰富的组织器官,VEGF家族各基因表现为具有较高的表达水平,如脾脏和肾脏[16]。为验证绵羊VEGF-D基因是否具有同样的组织表达模式,提取小尾寒羊与新吉细毛羊心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、肌肉及皮肤毛囊组织,通过RT-PCR方法检测VEGF-D基因在不同组织器官中的表达情况,结果表明该基因在各组织中广泛表达(见图4)。以肌肉组织中VEGF-D基因的表达量为基准,QRT-PCR方法分析各组织器官的相对表达量,结果表明,VEGF-D基因在两个品种羊不同组织器官表达模式存在一定的相似性(见图5),均表现为在肺脏和脾脏中具有较高的表达水平,在心脏中则表达量有所降低。说明绵羊VEGF-D基因的表达模式与其他物种类似。尽管如此,小尾寒羊与新吉细毛羊两个品种间VEGF-D基因的表达谱分布也存在一定的差异性,主要表现在:小尾寒羊脑组织中VEGF-D基因表达量与肌肉组织相类似,而新吉细毛羊脑组织中相对于肌肉组织则上调有20倍之多。另外,在肺脏与脾脏组织中小尾寒羊VEGF-D基因的表达量也显著地低于新吉细毛羊;而在皮肤组织中,新吉细毛羊较小尾寒羊仅有2倍左右的差距。组织表达分布结果提示VEGF-D基因在两个品种中存在着细微的差异。
1.皮肤;2.肌肉;3.脑;4.肾脏;5.肺脏;6.脾脏;7.肝脏;8.心脏。
小尾寒羊与新吉细毛羊在皮肤组织结构、毛囊发育周期等各个方面存在显著差异,为验证两个品种羊皮肤组织中VEGF-D基因的表达规律是否存在差异,通过QRT-PCR方法对不同季节皮肤组织中VEGF-D基因进行检测,结果(见图6)表明,VEGF-D基因在两个品种羊中同样表现为相似的表达模式,总体表现为秋冬季节维持较高表达水平,随着季节变化呈现不同的表达趋势,具体表现为10,12,2月份维持在较高的表达水平,而4,6,8月份呈现出逐渐下降的表达趋势,8月份为表达的最低点,经计算不到10月份表达量的10%。总结不同季节VEGF-D基因的表达变化,似乎可以看出该基因表达与气温存在某些相关性。
3 讨论
毛囊及毛发生长发育存在着周期性,毛囊周期由生长期、静止期和休眠期组成,在不同的时期毛囊组织存在复杂的结构重塑过程,与此同时伴随着毛囊周围毛细血管的新生与退化过程[17]。而血管的新生与退化过程是众多细胞因子、生长因子综合调控的结果[18],其中VEGF作为重要的血管增殖调控因子直接参与毛囊周围血管新生与退化过程,从而间接调控毛囊及毛发的生长发育过程[19]。VEGF是一个多基因家族,目前不清楚VEGF家族不同基因间在毛囊血管新生与退化过程中的相互作用关系。VEGF家族基因在绵羊中研究较少,本研究以显著毛用性状表型差异的小尾寒羊与新吉细毛羊为研究对象,通过克隆VEGF-D基因及其分子行为,为阐释其在两个品种羊毛囊发育中的分子功能奠定基础。
VEGF基因家族VEGF-D与VEGF-C相似,除表现在具有相似的蛋白结构外,其蛋白成熟过程也相同,均表现为蛋白酶对N端及C端前导肽的水解。VEGF-D蛋白成熟首先从水解C末端开始,最后切割掉N末端形成成熟肽。由于VEGF-D蛋白以首尾互补的二聚体的形式存在,因此在水解过程中可出现复杂的水解中间态,随着水解程度的不断深入,蛋白C端和N端对受体结合区的屏蔽作用逐渐减弱,VEGF-D蛋白逐渐获得与受体高亲和力结合的能力,从而促进其功能的行使[20]。VEGF-D蛋白的成熟过程同样是其功能调节过程,本研究中所发现的绵羊VEGF-D基因多态位点恰好位于PDGF结构域的两侧(见图3),其中位于PDGF结构域C端的多态位点可引起部分蛋白酶切位点的改变(见表3),但是否影响VEGF-D蛋白的成熟过程尚需进一步验证,改变蛋白酶切位点可能作为VEGF-D蛋白功能调控的重要手段。
毛囊周期过程中毛细血管的新生与退行变化主要表现在生长期血管增生、分支增加、血管内皮细胞核增大呈卵圆形、管腔增大等增殖变化[21]。毛囊休止期表现为密度降低、内皮细胞核呈扁平狭长形、管腔变小等退行变化,微血管密度(MVD)周期性变化是与毛囊组织的营养需求相匹配,这是VEGF基因家族参与毛囊组织周期性变化的机制之一。有研究表明,生长期毛囊中VEGF mRNA表达上调,尤其是中1/3处角质形成细胞中VEGF mRNA含量最高,但在真皮、皮下组织和毛乳头中均未检测到,VEGF的表达变化较毛囊周围毛细血管增殖启动早3 d左右,而通过转基因方法可以直接证明VEGF基因能够直接诱导毛囊周围血管的形成[22]。VEGF基因家族成员众多,本研究通过对不同季节绵羊皮肤组织中VEGF-D基因的表达分析发现,不同季节该基因存在不同的表达变化(见图6),表现为与气温与季节变化相关,似乎与毛囊周期变化趋势并不一致。事实上,作为毛囊主要供养器官,毛囊周围血管新生和退行与毛囊周期并非同步,而是要早于毛囊周期,因此VEGF-D基因在毛囊休止期的高表达可能在为下一次毛囊周期做准备。
较之与皮肤毛囊周期调节,有研究表明VEGF-D基因似乎更倾向参与肿瘤或其他组织血管的增殖过程。与其他物种类似,绵羊VEGF-D基因同样具有多组织器官的表达模式,并且表达主要集中于肺脏和肝脏(见图4、图5),提示VEGF-D基因可以参与多种组织器官血管的维持过程。研究表明,VEGF家族中VEGF-C和VEGF-D基因结构和功能最为接近,并且拥有共同的受体分子VEGFR-2和VEGFR-3[23]。VEGF-C和VEGF-D结合VEGFR-3受体主要促进血管和淋巴管的生成,有研究表明,VEGFR-3信号转导通路在胚胎时期的血管分化和形成是一个基本条件,但成熟血管中该信号通路则“关闭”,表明VEGFR-3信号仅对新生血管具有重要作用。在血管肿瘤或实体瘤周围血管内皮细胞中VEGFR-3信号则处于持续“开通”状态,因而成为肿瘤血管的重要分子标记物[24]。VEGFR-2受体主要增强血管壁的通透性,促进营养物质的输送,在毛囊生长发育过程中可通过ERK信号途径促进毛囊根外髓鞘的增殖[25]。尽管有直接证据表明VEGF细胞因子参与毛囊生长发育调节,但由于VEGF家族基因众多,各基因在毛囊生长发育中的确切功能及相互作用关系尚不明确,有待进一步深入研究。
摘要：为了克隆小尾寒羊与新吉细毛羊血管内皮生长因子D(VEGF-D)基因,检测其多态性及组织表达分布规律,探讨两个品种绵羊毛用性状差异是否与该基因存在必然联系,试验提取小尾寒羊与新吉细毛羊皮肤及不同组织总RNA,采用RT-PCR方法克隆VEGF-D基因并进行生物信息学分析,定量PCR方法分析两个品种间该基因的表达差异。结果表明:成功克隆出小尾寒羊与新吉细毛羊VEGF-D基因,该基因全长1 487 bp,含有完整的开放阅读框(ORF),长度为1 065 bp,编码354个氨基酸。绵羊VEGF-D基因无论在核苷酸还是氨基酸水平上与亲缘关系更近的牛具有较高同源性。小尾寒羊及新吉细毛羊品种间VEGF-D基因存在较多的多态位点,且相应突变位点均引起氨基酸的改变,提示该基因在品种间存在较大的选择压力,上述突变位点主要位于PDGF结构域两侧,提示其可能通过影响VEGF-D蛋白的水解过程来调控其功能。绵羊VEGF-D基因为各组织广泛表达基因,但其主要在肺脏与脾脏中高表达。不同季节绵羊皮肤组织VEGF-D基因表达模式不同,主要表现为寒冷季节高表达,而气温升高表达量逐渐降低。说明小尾寒羊与新吉细毛羊两个品种中VEGF-D基因存在较高的多态性,不同组织器官与不同季节皮肤组织表达分布相类似。
关键词：血管内皮生长因子D(VEGF-D),新吉细毛羊,小尾寒羊,基因克隆,表达分析
血管内皮生长因子基因 篇2
[关键词]米非司酮；子宫肌瘤；雌激素；孕激素
[中图分类号]R256.42[文献标识码]A[文章编号]1009-6019-(2010)05-20-02
子宫肌瘤是最常见的妇科肿瘤，育龄妇女子宫肌瘤的患病率为20％-40％，约50％的肌瘤患者有症状“)。近年来的研究表明，子宫肌瘤是一种激素依赖性肿瘤，雌激素、孕激素在子宫肌瘤发病中起重要作用。雌激素孕激素通过多个环节促进肌瘤生长，其中包括促进肌瘤的血管生成。而血管内皮生长因子(vasclllar endothelial growth factor，VEGF)是血管生成的核心因子，对肌瘤的生长起着举足轻重的作用。目前该病的治疗仍以手术为主且逐渐向保留子宫方向发展，药物治疗可以明显改善症状及缩小肌瘤。因此本研究探讨米非司酮对子宫肌瘤患者血清雌孕激素及血管内皮生长因子受体(VEGFR)影响以及治疗子宫肌瘤的临床效果。
1资料与方法
1.1研究对象
2009年1月-2009年12月在华北煤炭医院附属开滦医院经妇科和B超检查诊断为子宫肌瘤的患者90例，平均年龄45.5岁。所有患者均符合“妇产科学”关于子宫肌瘤的诊断标准，病理排除子宫内膜恶性病变，无脑、心脏、肝、肾等重要脏器疾病。90例患者均有不同程度的月经过多、月经周期缩短、经期延长、痛经等临床表现，患者自愿要求药物治疗，肝肾功能正常，3个月内未服用任何药物。
1.2研究方法
1.2.1治疗方法
每晚睡前服米非司酮12.5rag，每日1次，自月经第1 3d开始，连服3个月为1疗程。用药前后分别行盆腔及妇科检查，彩色超声测量子宫及肌瘤的三维径线，计算其体积大小。
1.2.2检测指标
抽血采用放射免疫法测定雌激素(E2)、孕酮(P)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)，各激素测定的批内、批间误差均<10％。用药期间每月复查血、尿常规及肝功能。用药1个疗程后停药，随访6个月。
1.3统计学分析
采用EXCEL建立数据库，用sPs$13.0统计软件进行数据整理和分析。采用独立样本的t检验的统计方法。其中P<0.05，具有统计学意义。
2结果
2.1治疗前后激素的变化
服用米非司酮治疗后E2、P和VEGFR水平均明显下降，且差异具有统计学意义(P<0.05)，服药期间尿常规及肝功能检查均正常。
2.2治疗前后子宫肌瘤体积的变化
用药前后子宫体积由(332.5±39.8)cm3缩小为(245.2±14.9)crn3，肌瘤体积亦明显缩小，治疗前后的差异具有统计学意义(P<0.05)。
3讨论
子宫肌瘤是卵巢甾体激素依赖性肿瘤，在肌瘤组织中。发现有雌孕激素受体，并明显高于子宫肌肉组织，故分析肌瘤的发生、发展与雌激素、孕激素及雌孕激素受体的含量有关。近年来研究证实，子宫肌瘤组织中雌、孕激素受体(ER、PR)增多及过度表达是肌瘤生长的主要原因，Rein等研究证实孕激素(P)和血管内皮生长因子受体(VEGFR)在子宫肌瘤的发生、发展中起重要作用，这使抗孕激素治疗成为治疗子宫肌瘤的理论基础。由于肿瘤细胞能通过旁分泌途径来促使其周围微血管的生长及肿瘤细胞的转移，因此在许多子宫肌瘤的患者外周血液中可检测到VEGF。在人子宫内膜、肌层和肌瘤组织中已鉴定出VEGF的存在，在内膜和肌层中的表达随月经周期的不同阶段而变化，对其表达有促进作用，呈时间一剂量依赖性。
米非司酮(mifepristone，RU486)是一种作用在受体水平的抗孕酮和抗糖皮质醇的类固醇，通过与PR结合达到阻断孕酮作用的目的，同时它又有通过非竞争性抗雌激素作用抑制下丘脑—垂体—性腺轴，使子宫肌瘤萎缩，诱发闭经。作为合成的类似孕激素和糖皮质激素的化合物，是炔诺酮的衍生物。与炔诺酮相比有更强的与PR相结合的能力，使自然的孕激素难以与受体结合而不能发挥其生物效应。米非司酮在拮抗体内P作用的同时还使肌瘤组织中PR及E减少，使肌瘤组织中雌、孕激素效应明显降低，导致肌瘤体积缩小。
有研究表明ER、PR在转录水平上由雌激素诱导产生，而孕激素可以在转录和转录后水平上使其下调，黄体期短期用药子宫内膜ER、PR上调，推测米非司酮直接拮抗孕激素作用使ER、PR持续维持在较高水平。而卵泡早期开始长期用药因性腺轴受抑制，卵泡发育不良，低雌激素状态可能使ER、PR的生成减少，但另一方面无排卵而无孕激素生成。内膜长期暴露于无对抗雌激素的环境中又可能使ER、PR下调减少，因此使ER、PR维持在增殖早中期水平。
血管内皮生长因子基因 篇3
1 材料与方法
1.1 临床材料
收集唐山市工人医院2010年12月~2011年12月手术切除的乳腺癌标本60例, 年龄35~72岁, 中位年龄49岁。其中浸润性癌56例, 小叶原位癌4例。肿瘤TNM分期, I期12例, II期21例, III期18例, IV期9例。直径范围1~7 cm, 淋巴结转移者27例, 无转移者33例。所有病例术前均未采用放疗、化疗及内分泌疗;术后均经病理检查确诊。同时收集同期的乳腺纤维腺瘤标本和正常乳腺组织标本各20例作为对照。
1.2 试剂
兔抗人HSG单克隆抗体购自美国Sigma公司, 鼠抗人CD34单克隆抗体、二步法免疫组化试剂盒PV-9000、DAB及枸橼酸盐均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.3 免疫组织化学检测
采用PV-9000二步法免疫组化检测系统 (北京中杉金桥生物技术有限公司) 进行染色。一抗选用兔抗人HSG单克隆抗体 (稀释度1∶500) 、鼠抗人VEGF单克隆抗体 (稀释度1∶200) 。用已知的乳腺癌阳性组织切片做阳性对照, 用PBS代替一抗做空白对照。具体实验步骤参照北京中杉二步法免疫组化试剂盒PV-9000说明书进行。微血管密度 (MVD) 采用CD34 (工作浓度1∶50) 标记的微血管数量表示。
1.4 结果判定
HSG阳性染色主要集中于细胞质, 呈棕黄色颗粒, 细胞核有少量表达, VEGF阳性产物主要位于细胞浆或胞膜, 癌巢边缘细胞染色程度较中心部位深, 间质炎细胞及邻近微血管内皮细胞也有不同程度的表达。采用阳性细胞百分比法进行半定量分析, 计数100个细胞呈现的阳性细胞数, 结合显色强弱分别为:阴性 (-) 不显色, 弱阳性 (+) <25%, 中度阳性 (++) 26%~50%, 强阳性 (+++) >50%。微血管密度 (MVD) 首先在低倍镜 (40×) 下观察全部视野, 在每张切片上选择3个富含血管组织的“热点”区, 即棕黄色染色密度最高的区域, 然后在中倍镜 (200×) 下计数热区CD34表达血管数, 由计算机自动标记及分析, 并求和取平均值作为该例MVD。
1.5 统计学方法
所有数据用SPSS 13.0软件包, 对其进行卡方检验, t检验, 单因素方差分析和LSD多重比较及Spearman等级相关分析, 以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 不同乳腺组织中HSG、VEGF和MVD的表达及关系
HSG阳性染色主要集中于细胞质, 呈棕黄色, 细胞核有少量表达。HSG在乳腺纤维腺瘤和正常乳腺组织中阳性表达率分别为75.0%和80.0%, 明显高于乳腺癌组43.3%。VEGF阳性染色主要在细胞浆和细胞膜, 在乳腺纤维腺瘤和正常乳腺组织中少量表达, 其阳性表达率分别为15.0%和5.0%, 明显低于乳腺癌组织中的表达48.3%。CD34阳性产物呈棕黄色的颗粒, 主要定位于肿瘤细胞间质的内皮细胞, 呈环状或点状。在乳腺癌组织中, 围绕着癌巢的新生血管数量明显增加, 血管排列紊乱、密集、扭曲。60例乳腺癌MVD平均为 (28.34±8.79) , 乳腺纤维腺瘤和正常乳腺组织中MVD平均值分别为 (10.23±5.67) 和 (11.53±7.29) , 经单因素方差分析和LSD多重比较, 乳腺癌组与乳腺纤维腺瘤和正常乳腺组比较, 差异有显著性 (P<0.05) 。
2.2 乳腺癌组织中HSG、VEGF和MVD的表达关系
乳腺癌组织中HSG阳性组中MVD的样本均数为 (25.57±6.83) , 阴性组为 (29.56±5.49) , MVD在HSG阳性表达组低于阴性表达组, 差异有显著性 (P<0.05) 。相反, 乳腺癌组织中VEGF阳性组中MVD的样本均数为 (30.69±7.24) , 阴性组为 (23.87±7.09) , MVD在VEGF阳性表达组明显高于阴性表达组, 差异有显著性 (P<0.05) 。Spearman等级相关分析表明在乳腺癌组织中HSG与VEGF的表达呈负相关 (r=-0.795, P<0.05) 。
2.3 乳腺癌组织中HSG、VEGF和MVD的表达与临床病理参数之间的关系
在60例乳腺癌组织中HSG与乳腺癌患者的年龄、肿瘤大小和临床分期无关, 而淋巴结转移组的HSG阳性率明显低于未转移组, 差异有显著性 (P<0.05) 。VEGF和MVD与乳腺癌患者的年龄和临床分期无关, 而随着肿瘤的增大和淋巴结的转移VEGF和MVD的表达明显增高 (P<0.05) 。 (见表1) 。
3 讨论
一直以来, 细胞过度增殖被认为是肿瘤发病的重要原因。增殖抑制基因 (HSG) 是CHEN等[2]利用m RNA差异显示技术从正常血压和高血压大鼠的血管平滑肌细胞中发现的新基因。有研究发现HSG过表达可以诱导血管平滑肌细胞 (VSMC) 周期停滞在G0/G1期, 同时在球囊血管成形术后立即定向局部转染r HSG的措施能够抑制新生内膜的生长和血管壁的重塑, 从而有效的预防再狭窄的发生。最近李鹏飞等[5]的研究也发现过表达大鼠增殖抑制基因 (r HSG-1) 可以上调周期调控蛋白p27Kip1和p21Cip1的表达、下调PCNA的表达、阻滞细胞于G0/G1期, 从而抑制了细胞增殖。提示HSG对认识和治疗包括血管疾病在内的细胞增殖性疾病有重要的启示。另有实验证明[6]HSG与平滑肌α (smooth muscle, SMα) 相互作用, 在血管平滑肌细胞 (vascular smooth muscle cell, VSMC) 迁移过程中发挥一定作用, 提示HSG可能参与VSMC细胞骨架构成及收缩。本研究发现HSG在乳腺癌组织中的表达明显低于乳腺纤维腺瘤和正常乳腺组织, 且乳腺癌组织中HSG低表达MVD高表达, 在HSG阳性表达组MVD明显低于阴性表达组, 差异有显著性 (P<0.05) 。同时HSG与MVD在淋巴结转移组呈明显负相关 (r=-0.3528, P<0.05) 。这些表明在乳腺癌组织中HSG表达下调, 肿瘤细胞的增殖得不到很好的抑制, 同时周围微血管增生MVD增高, 但新生成的肿瘤血管内皮细胞和平滑肌细胞发育不良, 使血管的通透性增加, 进一步促进了乳腺癌侵袭和转移。
乳腺癌的侵袭和转移是一个十分复杂的过程, 肿瘤的生长不仅肿瘤细胞需要增殖, 而且肿瘤组织需要更多血管为肿瘤细胞增殖和生长提供营养。因此肿瘤组织内的新生血管是肿瘤细胞生长、侵袭和转移的基础[3]。血管内皮生长因子 (VEGF) 是刺激肿瘤血管生成最为关键的生长因子, 其通过旁分泌的形式作用于血管内皮上的特异受体, 引起内皮细胞的增殖、迁移、诱导血管生成, 从而促进肿瘤的生长和转移。同时VEGF也是一种血管通透性诱导因子, 可增加微血管特别是毛细血管后静脉和小静脉的通透性。因此, VEGF是肿瘤微血管生成和侵袭转移的关键因素。顾宇等[7]的细胞体外侵袭实验显示, 在人肝癌SMMC-7721细胞中外加VEGF培养后, 细胞侵袭力明显增强, 提示VEGF可通过自分泌机制上调肝癌细胞的MMP-9表达, 进而促进肿瘤的浸润转移。在正常乳腺导管上皮中VEGF低表达, 而在乳腺癌组织中表达明显增高。本研究发现VEGF和MVD与乳腺癌患者的年龄和临床分期无关, 而随着肿瘤的增大和淋巴结的转移VEGF和MVD的表达明显增高, 差异有显著性 (P<0.05) 。提示VEGF在某种程度上可促进乳腺癌的转移, 这与TOI和李宏江等的研究结果一致[8,9]。
另有研究发现HSG基因能抑制血管内皮生长因子 (VEGF) , 从而抑制内皮细胞的增殖与迁移, 最终引起血管生成抑制而抑制肿瘤生长[10]。同时也有研究表明HSG可能在乳腺癌的发生侵袭及转移过程中发挥着重要作用, 且在乳腺癌组织中HSG的表达与表皮生长因子 (EGF) 和表皮生长因子受体 (EGFR) 的表达呈负相关[11,12]。本研究表明, 在乳腺癌组织中HSG与VEGF的表达呈负相关 (r=-0.795, P<0.05) , 且MVD在VEGF阳性表达组明显高于阴性表达组, 差异有显著性 (P<0.05) 。表明HSG的低表达和VEGF的高表达促进了肿瘤新生血管的生长, 从而促进了肿瘤细胞的增殖和转移。最近夏耘等[13]研究发现, 转染外源性的HSG后, 肿瘤细胞的增殖明显受到抑制, 且不依赖于内源性HSG水平的高低。提示HSG和VEGF可能与乳腺癌的侵袭和转移密切相关。
血管内皮生长因子基因 篇4
Ferrara等[4]于1989年从牛垂体星状细胞中分离出了一种糖蛋白, 该糖蛋白能够特异性的与血管内皮细胞结合, 促进血管内皮的生长同时诱导血管形成, 并且在体内和体外均能发挥其促进作用, 所以称其为VEGF。VEGF是由两个分子量相同的23kD的亚基组成, 两个亚基间以二硫键连接, 形成糖蛋白二聚体, 相对分子质量为34×103～45×103, 许多哺乳类动物的胚胎和成年组织, 如骨组织均可产生, 人类的胚胎和成体组织也能产生VEGF[5]。目前发现有6种单体, 具有基本相同的生物活性, VEGF有两种经典的受体:VEGFR-1 (flt-1) 和VEGFR-2 (KDR flk-1) , VEGF和其受体有极高的亲和力, 可以促进内皮细胞的分裂、增殖与迁移;此外, 通过旁分泌机制, VEGF表达产物还可促进形成新生血管, 增加血管通透性, 对血管正常状态和完整性的维持均有积极作用[6]。
在整个骨折愈合的过程中VEGF均有表达, 这一点已在实验中得到验证。在骨折愈合的不同阶段, VEGF在骨痂中均有不同程度的表达, 并且参与表达的细胞所含VEGF种类也有所不同[7]:骨折早期, 骨膜、骨及骨的邻近软组织血管破裂, 出血形成血液肿块, 造成骨折部位局部血供不良, 此阶段VEGF表达程度降低, 骨细胞是其主要的表达部位;随后进入骨折修复期, 在骨折修复过程中, 肉芽组织生长, 肉芽长入血肿, 肉芽携带软骨细胞和成骨细胞随肉芽进入血肿, 此时骨化发生在软骨内及膜内, 在此阶段, 组织修复的耗氧量很高, 骨折局部的氧分压降低, 低氧分压造成的低氧张力对VEGF的表达有强烈的诱导。在这一过程中, 除成骨细胞外, VEGF-mRNA及VEGF的表达产物在炎性细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞内均可大量的检测到;进入改造塑形期, 在VEGF与其他成血管因子的共同作用下, 血管内皮细胞发生增殖与分化, 形成血管, 骨折局部的低氧状态可以得到改善, 随后VEGF-mRNA及其蛋白的表达开始减弱[8,9]。
目前医学界认为, 骨折愈合的前提是骨折局部形成血管, 恢复骨折端供血[10], VEGF在血管生成过程中的作用至关重要, 在整个骨折愈合过程里起着关键作用[11], 血管再生也是一个非常复杂的过程, 血管再生涉及内皮细胞的分裂、血管基底膜发生, 同时, 细胞外基质降解、内皮细胞的迁移等也均在此过程中发生。VEGF在血管再生的各个环节都直接或间接的影响着血管组织的发生和组织连接:通过自分泌或旁分泌机制, VEGF的表达产物与血管内皮细胞表面受体特异性的结合, 诱导内皮细胞增殖, 促进形成新生血管, 并在此基础上建立新生血管体系, 改善骨折局部的微环境, 加强骨折段的供氧、营养物质输送及代谢废物的运输;其次, 成骨细胞表面有能够特异性结合VEGF的flt-1受体, 成骨细胞表达的flt-1受体与VEGF作用, 可以刺激成骨细胞募集、生存和活性[12], 在VEGF作用下, 新的成骨细胞聚集在骨折部位并发生分化, 碱性磷酸酶被激活, 活性增强, 局部产生钙盐的沉积作用, 促进骨折的愈合;此外, 骨折周围软组织的血供环境也在VEGF的作用下得以改善, 促进软组织的修复, 使骨折愈合速度加快。
血管内皮生长因子基因 篇5
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择驻马店市中心医院神经外科于2011年1月～2014年12月收治的经病理学证实并行手术切除的脑膜瘤患者38例,其中男22例,女16例；年龄20～70岁,中位年龄56岁；主要症状：头痛36例,头晕38例,呕吐10例,肢体无力10例,视物不清5例,抽搐或某些精神症状3例；依据WHO提出的脑膜瘤分级标准[1],Ⅰ级22例,Ⅱ级10例,Ⅲ级6例。
1.2 VEGF的测定及结果评定
采用免疫组化S-P法测定38例脑膜瘤组织中VEGF的表达,以PBS代替一抗作为阴性对照,抗体及试剂盒为福州迈新生物技术有限公司产品,其结果评定为(±)、(+)、(++)、(+++),后三者均为阳性。
1.3 统计学方法
用SPSS20.0统计学软件处理数据。计数资料以率(%)表示,实施χ2检验。检验水准α=0.05,P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
VEGF主要表达于脑膜瘤细胞的细胞膜和(或)细胞浆。见图1。38例脑膜瘤组织VEGF的阳性率为42.1%(16例),其中Ⅰ级为22.7%[(±)17例,(+)4例,(++)1例,(+++)0例],Ⅱ级为50.0%[(±)5例,(+)4例,(++)1例,(+++)0例],Ⅲ级为100.0%[(±)0例,(+)0例,(++)0例,(+++)6例],不同级别脑膜瘤组织中表达率差异有统计学意义(P<0.05),随分级的进展VEGF的阳性率逐渐增高。
3 小结
血液供应是肿瘤生长的必要条件,提供肿瘤生长所必须的营养成分和氧等,研究[1]证实,肿瘤组织中新生血管的情况决定了肿瘤的生长快慢,如果新生血管不能满足肿瘤生长所需的血液供应,肿瘤组织就会坏死。另外,脑组织是人体血供丰富,且对血液供应变化最为敏感的器官之一,脑膜瘤的生长对血液供应的依赖也非常明显。VEGF是目前已知作用最强的促血管新生的因子,主要通过与血管内皮细胞表面的受体结合,促进机体新血管形成,在肿瘤的发生发展及浸润转移过程中具有重要作用,在胃癌、肝癌、卵巢癌、结直肠癌、乳腺癌脑膜瘤等实体肿瘤中已经得到证实[1,2,3]。本文通过对不同级别脑膜瘤组织中VEGF表达的差异进行分析发现脑膜瘤组织中VEGF的阳性率为42.1%,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级分别为22.7%、50.0%、100.0%,随分级的进展VEGF的阳性率逐渐增高,这与文献[1]一致,提示,脑膜瘤组织中存在VEGF的高表达,其与脑膜瘤的浸润转移有关。
摘要：目的 探讨脑膜瘤组织中血管内皮生长因子(VEGF)的表达与脑膜瘤分级的关系。方法 采用免疫组化S-P法测定38例脑膜瘤组织中VEGF的表达。结果 脑膜瘤组织中VEGF的阳性率为42.1%,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级分别为22.7%、50.0%、100.0%,随分级的进展VEGF的阳性率逐渐增高,不同级别脑膜瘤组织中VEGF阳性表达率,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 脑膜瘤组织中存在VEGF的高表达,其与脑膜瘤的浸润转移有关。
关键词：脑膜瘤,免疫组化,血管内皮生长因子
参考文献
[1]Baumgarten P,Brokinkel B,Zinke J,et al.Expression of vascular endothelial growth factor(VEGF)and its receptors VEGFR1 and VEGFR2 in primary and recurrent WHO gradeⅢmeningiomas.Histol Histopathol,2013,28(9):1157-1166.
[2]于乐,丁雪贞,孙雅静,等.CD90和VEGF在肝细胞癌组织中的表达.肿瘤基础与临床,2014,27(2):102-104.
血管内皮生长因子在肝癌中的作用 篇6
1 VEGF结构和作用
VEGF是1989年由Ferrara发现的, 是最重要的血管生成调节因子。VEGF家族属于血小板源性生长因子 (PDGF) /VEGF超家族成员, 有同源二聚体结构, 在单体肽链上含有8个半胱氨酸残基。VEGF家族至少包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、胎盘生长因子 (PIGF) 以及T.f. svVEGF等7个成员, 其中T.f. svVEGF是最近在蛇毒中发现的[1]。
人VEGF基因位于染色体6P21.3, 全长28 kb, 由8个外显子和7个内含子组成, 其cDNA基因长14 kb, 编码相对分子质量为34~45 000的同源二聚体糖蛋白。亚基之间通过二硫键相连, 如果二硫键断裂, 则丧失所有生物学活性。VEGF基因经过转录水平的剪切可产生5种不同的转录子, 人类至少有5种VEGF, 分别由121、145、165、259和206个氨基酸组成。其中VEGF206含有全部8个外显子序列, VEGF189和VEGF165分别缺失部分或全部第6外显子, VEGF121缺失第6、7外显子, VEGF145则保留了第1、8外显子, VEGF165的表达有某种优势。VEGF的N端含有26个疏水性氨基酸组成的信号肽, 主要由基因结构中的第1外显子编码。除VEGF121和VEGF145外, 其余的VEGF均部分或全部与细胞表面含肝素的蛋白聚糖结合。VEGF165是发挥生物学效应的主要成分, 通过与VEGFR结合而发挥生物学作用。
VEGF是一种高度特异的血管内皮细胞有丝分裂素, 其生理学上主要功能有: (1) 选择性增强血管内皮细胞有丝分裂, 刺激内皮细胞增殖并促进血管形成; (2) 增强血管尤其是微小血管的渗透性, 使血浆蛋白等大分子外渗沉积在血管外的基质中, 为新生毛细血管网的建立提供营养。VEGF对肿瘤的影响机制可能有[2]: (1) 促进肿瘤血管形成, 这与VEGF能增加血管通透性、促进血管内皮细胞增殖、促进血管支持物生长有关。VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D及其受体VEGFR-1、VEGFR-2等均参与此机制。 (2) 促进肿瘤淋巴管生长, 参与此功能的主要为VEGF-C、VEGF-D及受体VEGFR-3, 与肿瘤生长和淋巴管转移密切相关。 (3) 对肿瘤细胞的细胞动力影响。目前VEGF对肿瘤细胞增殖的影响还存在着争论, 但对抑制肿瘤细胞凋亡的作用已获得一定的共识, VEGF可诱导抗凋亡蛋白Bcl-2的表达, 直接抑制肿瘤细胞的凋亡。 (4) 增强肿瘤细胞对放疗的耐受性及影响免疫功能。VEGF降低癌细胞对放射线的敏感性, 可能与血管的形成相关。而对免疫功能的影响则主要是VEGF诱导造血干细胞的分化和成熟。
2 VEGFR结构和作用
VEGFR家族包括VEGFR-1 (Flt-1) 、VEGFR-2 (KDR/Flk-1) 和VEGFR-3 (Flt-4) 3个成员, 其中VEGFR-1和VEGFR-2结合VEGF-A, 在血管化的调控中起至关重要的作用。VEGFR-3结合VEGF-C和VEGF-D, 作用是刺激淋巴管发生[3]。
VEGFRs胞外区有7个免疫球蛋白结构域, 胞内区有酪氨酸激酶活性, 该酪氨酸激酶的活性通过受体和配体结合而激活, 由受体磷酸化而引起细胞内许多酶发生反应, 在细胞的生长和分化中起重要作用。
VEGFRs主要在内皮细胞上表达, 少数一些细胞如滋养层细胞、单核细胞、造血干细胞及某些肿瘤细胞也表达VEGFR, 缺氧和VEGF作用使VEGFR, 特别是VEGFR-1和VEGFR-2在内皮细胞和肿瘤组织表达上调。不同VEGFR被VEGF活化后产生的效应不同, VEGFR-1不仅在血管内皮细胞上表达, 而且在单核-巨噬细胞中也有表达, 作用是刺激骨髓源性细胞的迁徙。巨噬细胞即通过VEGFR-1信号迁徙到肿瘤或炎症组织中刺激血管和淋巴管的生成[4]。还有报道说VEGFR-1能促进成骨细胞分化以及调节急性淋巴细胞性白血病细胞在骨髓中的定位, 调节它们在循环中的存活[5]。VEGFR-2对血管增殖比VEGFR-1重要, 是血管形成的主要信号, VEGFR-2信号在血管系统发育中是必须的。VEGFR-3主要表达在淋巴内皮细胞, 调控淋巴发生以及其配体VEGF-C和VEGF-D[6], 对淋巴系统增殖非常重要, 人类VEGFR-3酪氨酸激酶结构域上的无义突变导致由于缺乏淋巴管的发育而发生家族性淋巴水肿综合征 (Milroy disease) 。新发现的神经纤毛蛋白1是一个独立的VEGFR, 其与VEGF165特异性结合, 可促进VEGF与VEGFR-2的结合, 发挥更有效的生物学作用。此外, 尚存在可溶性VEGFR, 研究得较多的是可溶性VEGFR-1, 它是由VEGFR-1 mRNA不同剪接而产生的, 仅有细胞外序列, 其在哺乳动物、鸟类及两栖动物中都是保守存在的, 所以推测和胚胎发育有关。
3 VEGFR的信号通路
VEGFR-1和VEGFR-2所引起的信号转导级联反应有所不同, 这两种受体共同调节病理性和生理性血管的生成。VEGFR-1扮演双重角色, 在胚胎时期负性调节血管生成, 而在成人却是正性调节酪氨酸激酶活性, 可能与调节内皮细胞间作用、内皮细胞与基底膜作用以及内皮细胞的迁移相关。VEGFR-2 (KDR/Flk-1) 有强激酶活性, 此受体激酶有效地激活内皮细胞中PLCγ (磷脂酶Cγ) 和PKC通路以及其下游的c-Raf-MEK-MAP-激酶通路[7]。另外, 自磷酸化位点1175酪氨酸的信号, 对于PLCγ的结合和激活PLCγ-PKC通路是至关重要的, 此位点上酪氨酸突变为苯丙氨酸的小鼠 (flk-1 1173F/1173F小鼠) 由于缺乏血管的发育导致胚胎死亡[8]。
VEGFR-2产生很多的血管发生信号不仅仅是导致内皮细胞增殖, 而且导致细胞迁徙及形态建成包括管状结构的形成。951酪氨酸结合接头蛋白TSAd从而调节细胞迁徙[9]。Nrp1是VEGF-A165的联合受体, 其与VEGF-A165结合后可以增加VEGF-A165结合VEGFR-2的亲和力, 并且增强了信号转导。对于VEGFR-3的信号通路还没有完全的认识, 报道较多的是PLCγ-PKC通路, Ras通路的激活也是有报道的, 两条通路在信号活化中起同样作用还是其中某一条起主要作用还需要研究。
4 VEGF在肝癌中的表达及其意义
肿瘤生成和转移受诸多因素的影响和制约, 血管形成是主要因素之一。肿瘤血管形成也是一个极为复杂的过程, 涉及蛋白酶分解基底膜、内皮细胞迁移和增生及毛细血管网形成。在初始阶段, 肿瘤细胞释放血管形成因子激活内皮细胞, 同时产生蛋白酶使基底膜降解, 促进内皮细胞增殖和迁移。另一方面, 内皮细胞旁分泌某些生长因子刺激瘤细胞生长, 内皮细胞和瘤细胞相互作用最终形成毛细血管样结构。由于肿瘤诱发的血管不同于正常血管, 其结构与功能异常, 易引起局部坏死。另外, 肿瘤组织微血管基底膜不完整, 血管壁缺乏平滑肌支持, 血管壁很薄, 易通透, 瘤细胞产生的各种因子和蛋白酶类易渗透至细胞间隙;而瘤细胞易穿透到血管内使瘤细胞顺血流到远端部位, 形成微小转移灶。肿瘤组织诱导的血管生成是一复杂的多因素调节过程, 已陆续发现多种血管生成因子, 其中以VEGF的作用最为突出。
4.1 VEGF在肝癌中的表达
VEGF与肿瘤的血管形成关系密切, 并与肿瘤的复发、转移有关, 在肝癌中也不例外。Brodsky等[10]使用免疫组化分析以及Western-blot的方法来研究正常肝组织、肝硬化和肝癌中VEGF表达和血管密度的关系, 发现与正常肝组织比较, 肝癌组织中的血管密度是增高的 (185%) , 并且在血管密度和VEGF表达之间有明显的关联 (r=0.98, R2=0.969 6) 。说明了VEGF与肝癌的发生、发展密切相关。
4.2 肝癌中VEGF的生成
VEGF的生成受多种因素的影响, 其中可以上调其表达的有缺氧、雌激素等, 最主要的因素是缺氧。缺氧通过两种机制影响VEGF的合成: (1) 缺氧可以导致HIF-1升高, 而HIF-1是缺氧诱导肿瘤组织VEGF高表达的主要因素, 可以导致VEGF转录水平的提高和VEGF mRNA稳定性的增强[11]。 (2) 在缺氧状态下, bcl-2表达显著上调, 增强了VEGF mRNA的稳定性, bcl-2通过HIF-l转录因子增强了VEGF启动子的活性, 从而诱导VEGF高表达[12,13]。另有研究显示缺氧使得HIF-α蛋白避免了被泛素蛋白降解, HIF-α可以诱导肿瘤组织中VEGF生成[14], 而肿瘤自分泌的转化生长因子可刺激肿瘤周围组织细胞以旁分泌的形式分泌VEGF。此外, 某些细胞因子和生长因子如白细胞介素 (IL) -1β、IL-6、干扰素 (IFN) -α、IFN-γ、表皮生长因子 (EGF) 、血小板源性生长因子 (PDGF) 等均有协同作用, 可加强肝癌细胞中VEGF的表达。一些癌基因和抑癌基因的突变也可使VEGF表达增加。
4.3 肝癌中VEGF/VEGFR的类型
肝癌组织中VEGF的表达主要是VEGF121和VEGF165。蒋扬富等[15]通过逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR) 研究发现, 在肝癌、肝硬化和正常肝组织中均以VEGF165表达为主。Yasuda等[16]利用免疫组化的方法对28例肝癌组织标本研究后认为, 在肝癌组织中VEGFR的表达以KDR/flk-1为主。LeCouter等[17]认为肝癌血管中的内皮细胞表达VEGFR-1和VEGFR-2, 并且可以形成互相刺激的循环。
4.4 肝癌中VEGF的分泌形式
An等[18]研究发现, VEGFR在肝癌细胞和肝癌组织中的内皮细胞表面均有表达, 表达水平为正常肝组织的7倍;并发现肝癌病例的非癌组织和肝癌组织中、转移性肝癌病例的非癌组织和肝癌组织中均有VEGF的表达, 提示了VEGF的旁分泌机制。但是最近越来越多的证据显示, 肿瘤中可能存在VEGF的自分泌机制, 即肿瘤细胞分泌的VEGF在作用于血管内皮细胞调节肿瘤血管形成的同时, 也作用于肿瘤细胞自身, 通过某种机制调节肿瘤细胞的分裂增殖。VEGF必须通过其特异性受体才能发挥生物学功能, 自分泌途径也不例外。在人类卵巢癌、黑色素瘤、血管瘤、艾滋病卡氏肉瘤、乳腺癌、前列腺癌、神经胶质瘤以及膀胱肿瘤中相继发现, 不仅肿瘤血管内皮细胞有VEGFR的表达, 瘤细胞中也有Flt-1和KDR的表达 (其中多数肿瘤细胞以表达KDR为主) , 这是肿瘤中VEGF自分泌机制存在的物质基础。
艾军华等[19]使用RT-PCR方法研究发现, 肝癌细胞株MHCC97-H、MHCC97-L和SMMC-7721都有VEGFR-1 mRNA表达, 且高转移潜能的MHCC97-H表达最强, 3种肝癌细胞株中转移潜能最低的SMMC-7721表达最弱, 而在肝癌细胞株HepG-2和正常肝细胞株L-02未检测到VEGFR-1 mRNA的表达。在检测的4种肝癌细胞株和L-02中都有VEGF-B mRNA表达。使用Western-blot方法研究MHCC97-H、MHCC97-L、SMMC-7721和HepG-2 4种细胞株发现都有VEGF-B的表达;使用ELISA方法研究发现, 4种肝癌细胞株的培养上清液中均能检测到VEGF-A, 从而证明了肝癌细胞可以通过自分泌机制产生VEGF。
4.5 VEGF对于肝癌的临床意义
手术切除被认为是肝癌治疗的首选方法, 但肝癌早期诊断率低, 一般发现都是晚期, 手术切除率低, 并且术后转移和复发是影响患者术后长期生存的首要原因。因此, 早期诊断和早期判断复发是治疗的关键。
Kamel等[20]在比较肝癌、肝纤维化患者治疗前与健康者血浆VEGF和MMP-9水平时发现, 有门静脉侵犯和转移的肝癌患者其血浆VEGF、MMP-9水平较无门静脉侵犯和转移的明显升高, 并且发现血浆VEGF水平在肿瘤>5 cm和<5 cm的患者之间存在明显差异, 但是MMP-9却不随肿瘤的大小而变化。因此, 肝癌患者治疗前血浆VEGF、MMP-9水平可能是肝癌血管侵袭和转移的潜在标志物, 血浆VEGF可以作为肿瘤大小的一个分子标志物。Yao等[21]的研究显示肝癌患者血中VEGF水平也增高, 正常人, 肝炎、肝硬化和肝癌患者血VEGF的水平依次增加, 肝癌组与其他组有明显差异, 而对照组与肝炎组和肝硬化组却无显著性差异, 且血浆VEGF的水平是确定肝转移的有效指标, 其特异性、敏感性和准确性均高。
VEGF mRNA表达肝癌组织明显高于癌旁组织, 且与肝癌发生关系密切, 因此可以用于肝癌的临床诊断和预后判断。Sheen等[22]通过RT-PCR对肝癌术后切除的非癌性肝组织中VEGF mRNA进行检测后认为, 非癌性残余肝组织中VEGF165的高表达可以作为术后复发的预测指标, 且能反映复发的恶性程度, 而VEGF121则不能。
VEGF表达水平反映肝癌生长速度和转移倾向, 但更确切的关系有待研究。针对VEGF及其受体的抗血管治疗已经从实验走向临床。苏拉明可选择性地结合亲肝素血管生长因子, 抑制VEGF与受体结合, 达到抑制VEGF诱导血管内皮细胞增殖的目的。
5 展 望
血管内皮生长因子基因 篇7
1 VEGF与进展期胃癌的关系
VEGF是从牛垂体滤泡星状细胞纯化分离到的1种肝素结合因子, 能刺激肿瘤细胞的有丝分裂;同时它能特异性地作用于血管内皮细胞, 引起血管内皮细胞分裂增殖和血管构建, 促进新生血管形成。Feng等[3]在探讨VEGF与临床胃病关系的研究中, 应用免疫组化测定了胃癌、胃良性病变及正常胃黏膜的VEGF表达, 发现正常胃黏膜和慢性浅表性胃炎无VEGF表达, 慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生、发育不良组织和胃癌组织有VEGF阳性表达, 并且其阳性率由慢性萎缩性胃炎到胃癌呈递增趋势;同时发现, 胃癌中VEGF阳性表达率与TNM分期有关, Ⅲ、Ⅳ期比Ⅰ、Ⅱ期明显升高。张频等[4]研究发现, VEGF在正常胃黏膜组织、癌旁组织和胃癌组织中的表达呈递增趋势, 以胃癌组织中VEGF表达最高, 正常胃黏膜组织最低;有远处转移胃癌组织VEGF的表达较无转移高。尹清云等[5]应用免疫组化方法探讨了VEGF在胃癌组织中的表达与预后以及预测辅助化疗疗效的关系, 发现VEGF阳性率在肿瘤>4cm组, Ⅲ-Ⅳ期明显高于<4cm组、Ⅰ-Ⅱ期, 表明VEGF阳性表达与胃癌的肿瘤大小, 临床分期, 浸润深度等密切相关。有研究显示VEGF阳性表达与胃癌的浸润深度、淋巴结转移以及预后密切相关[6]。
2 MVD与进展期胃癌的关系
在胃癌组织中, 新生血管管腔扩张、狭窄或变形, 微血管分布紊乱呈异质性, 内皮细胞形态各异, 呈现肿瘤新生血管的特征[7]。此外, 微血管密度最高区域多位于癌巢之间、周围的间质组织内或癌组织与正常组织交界处, 即所谓“浸润边缘”。因该处为肿瘤细胞生长浸润最活跃的部位, 提示高密度的微血管能给周边癌细胞提供更充足的养分, 从而加强其浸润能力。而癌旁区到正常区的微血管形态则逐渐规整, 数量也逐渐减少。胃癌的MVD显著高于癌旁胃组织, 而癌旁胃组织的MVD也显著高于正常胃组织, 提示胃癌的发生发展可能是血管依赖性的[7]。血管生成不仅为肿瘤细胞离开原发灶进入循环提供途径, 也为转移瘤的生长创造条件, 肿瘤细胞侵袭性与诱导血管形成能力是平行的。Ohta等[8]的研究表明, 血管生成与肿瘤的淋巴结转移有关。首先, 肿瘤血管生成能促使癌细胞通过静脉-淋巴管吻合处, 从血液进入淋巴管。其次, 血管生成可能伴随着淋巴管生成, 更有利于肿瘤细胞直接浸润淋巴管, 促进肿瘤向淋巴结转移。研究发现, 淋巴结转移组的MVD显著高于淋巴结未转移组, 并且随着肿瘤浸润深度的增加, 胃癌的MVD也逐渐增加[7], 说明肿瘤的微血管生成与其侵袭能力有关, 有助于肿瘤的浸润及转移。同时, 胃癌的MVD与TNM分期密切相关, 随着TNM分期增高, 胃癌的MVD也逐渐增加, 因此, 胃癌的微血管密度与胃癌的恶性生物学特性密切相关, 可作为胃癌的一项预后指标。Maede等[9]研究表明, 具有高MVD的胃癌组, 其预后显著差于低MVD组;胃癌中高MVD组的生存期及生存率均低于低MVD组, 进一步说明了胃癌中MVD的增加与其预后不良密切相关。MVD作为一项指标, 可以提示胃癌的复发、转移潜能以及远期生存率。
3 MVD与VEGF表达在进展期胃癌进展中的关系
研究表明在胃癌组织中, VEGF表达具有明显异质性, 癌旁组织中表达最强。因为癌旁组织中癌细胞增生活跃, 癌细胞分泌释放大量VEGF[10]。VEGF表达阳性率随着胃癌浸润深度、肿瘤分期的升高而增加, 提示VEGF促进胃癌肿瘤血管形成, 有利于癌细胞生长增殖, 促进肿瘤细胞向深层浸润。研究证实, 血管生成因子 (含血管内皮生长因子) 可促进肿瘤微血管生成, 丰富的肿瘤新生血管必然会加速实体瘤的生长、浸润及转移。因此肿瘤血管形成将成为判断恶性肿瘤转移及预后的1个独立指标[11]。MVD被认为是能反映肿瘤血管生成程度的1个指标, 而VEGF表达与MVD关系密切, 二者与胃癌浸润、生长、转移及预后有密不可分的关系。Takahashi等[12]报道, 肿瘤MVD值及VEGF阳性表达随低分化髓样腺癌进展而升高, 认为这种类型胃癌是血管依赖性的。Maede等[11]观察到新生血管计数在VEGF阳性胃癌中明显高于VEGF阴性胃癌, 而且VEGF阳性患者比VEGF阴性患者预后不良。有研究检测了45例胃癌组织及20例浅表性胃炎标本中VEGF的表达及MVD值, 将MVD与胃癌TNM临床分期、病理特征进行回顾分析, 同时取浅表性胃炎作对照组, 结果显示:VEGF在胃癌组织中有较强阳性表达, 其在胃癌组织阳性表达率显著高于浅表性胃炎, 二者之间差异具有统计学意义[13]。胃癌组织内MVD值明显高于浅表性胃炎的MVD值, 二者之间差异也具有统计学意义。说明VEGF异常表达、癌组织中MVD值增高与胃癌促血管形成密切相关。随着胃癌逐渐发展, MVD值也逐渐增加, 肿瘤血管增生活跃。
血管内皮生长因子基因 篇8
血管内皮生长因子 (VEGF-A或VEGF) , 过去称为vasculotropin或血管渗透性因子 (vascular perme-abilityfactor, VPF) , 属多潜能细胞因子家族中的一员, 还包括VEGF-B、-C、-D、-E和胎盘生长因子。VEGF是由2条相同的多肽链通过二硫键相连而构成的二聚体糖蛋白, 由2个相同的分子质量为23×103的亚基通过二硫键结合成二聚体, 基因定位于染色体的6p21.3, 全长28kb, 编码VEGF的基因长14kb, 由8个外显子和7个内含子构成。目前已知6种VEGF的单体:121、145、165、189、206、183[1]。VEGF的生物学作用主要包括: (1) 促进内皮细胞增殖:许多研究表明, 在肾小球中最重要的血管促成因子是VEGF[2], VEGF是内皮细胞增生和存活的因子, 它通过内皮细胞上的特殊受体在血管生成过程中扮演重要的角色; (2) 增加血管通透性:VEGF是目前所发现的最强的血管通透剂, 它在1mmol/L浓度下即有活性, 其活性是组胺的5000倍; (3) 血管生成及维持功能:不论是在生理还是病理情况下, VEGF对血管生成都起非常重要的作用。VEGF对整个血管系统的内皮细胞均有促有丝分裂作用, 是目前所知最有选择性的血管内皮细胞促有丝分裂剂, 此外, VEGF可刺激内皮细胞生成一氧化氮, 起到血管维持的功能; (4) 细胞质的聚钙作用:VEGF选择性直接作用于血管内皮细胞膜上的两种特异性受体FMS样的酪氨酸激酶1 (Flt1) 受体和含激酶插入区 (KDR) 受体后, 最先观察到的生物学效应即胞质钙离子的增加, VEGF在几秒内可使钙离子浓度升高4倍以上。
2 VEGF在正常肾脏的表达及作用
外周血及组织中的VEGF含量与病变的程度相关, 对肾脏病的发生、发展、预后均起重要作用。生理状态下, 无论成人或成年小鼠和大鼠的肾组织, 均能检测到VEGF在足突和集合管上皮细胞的持续表达, 从而调节肾小球滤过膜的通透性。VEGF由肾小球脏层上皮细胞及远端集合管上皮细胞合成与分泌, 特别是近髓及髓放线处的肾小球足突细胞及小管上皮细胞。而其受体分布在肾小球内皮细胞和间质血管内皮细胞, 足突细胞分泌VEGF量与内皮细胞VEGF受体的表达量一致。
VEGF在肾脏发育尤其肾小球形成中起重要作用。在人肾发育过程中, 肾小球、肾小管结构形成的同时, 肾的血管化也开始发生, 起诱导分化作用的间质产生血管发生因子, 分化的肾小球上皮细胞产生VEGF, 集合管上皮细胞产生VEGF, 皮髓质肾小管周毛细血管内皮细胞存在VEGF受体, 促使肾小管周毛细血管发生。肾小球足突细胞参与合成肾小球基底膜 (GBM) [3], 推测足突细胞产生VEGF, 以旁分泌形式结合于表达VEGF受体的小球内皮, 参与局部调节, 两种细胞互相作用使GBM保持完整性和正常功能。集合管上皮分泌的VEGF与肾小管周毛细血管的受体结合, 可能影响它们的通透性, 从而影响肾髓质的渗透压梯度。
3 影响肾VEGF表达的因素
缺氧是VEGF的最强刺激因子, 有研究显示急性血管闭塞 (急性缺氧) 能刺激肾脏VEGF表达。VEGF生成也受糖类、几种细胞因子和生长因子包括转化生长因子β (TGF-β) 、成纤维细胞生长因子 (FGF) 、血小板源生生长因子 (PDGF) 血管紧张素Ⅱ (AT-Ⅱ) 、胰岛素样生长因子1 (IGF-1) 及活性氧簇等影响。此外, VEGF的生成还受组织、细胞类型及培养条件的影响。NO与VEGF间存在着密切关系, 抑制NO的合成能明显的加速肾瘢痕化, 这与血管生成反应受损, 肾小球和肾小管周毛细血管减少、内皮组织及动脉平滑肌细胞增殖有关[4]。此时肾小管细胞 (髓袢升枝粗段) VEGF表达明显降低, 而血管平滑肌细胞VEGF表达增加;近来Ostendorf等[5]在Thy1肾小球肾炎的鼠模型中, 用选择性诱生的一氧化氮合酶 (inducible NO synthase, i NOS) 的抑制剂L-N6- (1-iminoethyl) -lysin (L-NIL) 后, 明显降低了VEGF的表达, 减少了内皮细胞的增殖。这些都提示了NO通过对VEGF的调整在维持肾微血管中起了重要作用。
4 VEGF在不同类型肾疾病中的表达
4.1 VEGF与肾小球肾炎
在肾小球肾炎时, 肾小球可高表达VEGF以维持肾小球结构。肾小球足突细胞分泌VEGF, 肾小球内皮细胞表面存在VEGF受体, VEGF能够减少肾小球基底膜阴离子数目, 诱导肾小球内皮细胞的小窗形成, 故VEGF可能通过同时影响肾小球基底膜的电荷屏障及机械屏障而调节肾小球通透性, VEGF分泌的异常增加可以导致肾小球滤过膜对血浆蛋白的通透性增加, 从而导致蛋白尿的形成。在微小病变患者肾组织中VEGF m RNA表达明显高于正常对照人群, 并与蛋白尿水平呈正相关[6]。有不同的研究证实, 体外培养的人系膜细胞上有VEGF受体。因此VEGF可能作为小球内旁分泌信号从其主要产生部位小球上皮细胞作用于靶细胞, 即内皮、系膜细胞, 而且VEGF可能通过对系膜细胞作用调节基质合成、降解。在血栓形成的微血管病变, 肾脏切除和系膜增生性肾小球肾炎等几种肾脏疾病的实验模型中, VEGF能调控内皮细胞增殖[7]。
近年研究表明, VEGF与相应受体结合可能参与了急慢性肾衰竭、原发性肾小球疾病及代谢疾病、血管性疾病、系统性疾病等所致的肾脏病变的发病过程。在鼠模型中注入VEGF能增加肾小管周围血管的密度, 从而减少了肾纤维化, 改善肾功能[8]。在新生的鼠中, VEGF在肾血管的形成中起到重要的作用。Miyamoto等在有轻度肾小球损害的鼠模型中, 用VEGF/VPF121或VEGF/VPF161治疗后保护了肾小球内皮细胞, 促进了肾小球的修复。在进行性坏死和新月体形成的抗基底膜肾小球肾炎的鼠模型中, 用VEGF治疗后, 控制了肾小球的炎症, 也促进了肾小球的修复[9]。不同肾脏疾病中VEGF的表达有所不同, 在进一步探讨VEGF的功能的基础上, 采用干预VEGF及其受体的方法, 可能对治疗多种肾脏疾病具有非常重要的意义。有文献报道[10], 在鼠模型中, 抑制VEGF的表达后, 阻止了毛细血管的修复, 导致了进行性的肾损害。在肾切除的鼠模型中, 用VEGF治疗后保护了肾小球毛细血管袢的数目, 减少了小管间质纤维化的严重性, 从而稳定了肾功能。
4.2 VEGF与糖尿病肾病
VEGF在糖尿病肾病 (DN) 、神经病变、视网膜病变和微循环疾病的发病机制中扮演了重要角色[11]。推测DN时, 肾小球足突上皮细胞晚期糖基化终末产物 (AGEs) 受体上调, 足突细胞VEGF的表达和分泌增加, 增加的VEGF可能主要经旁分泌形式与肾小球内皮细胞上的VEGF受体结合而发挥其促血管通透性增强的作用, 从而调节肾小球滤过膜的通透性 (可能是通过同时影响肾小球基膜的电荷屏障及机械屏障调节肾小球通透性) , 导致蛋白尿的形成。另一方面, VEGF导致肾小球内的单核巨噬细胞迁移/活性增加, 系膜活化TGF-β产生增加, 细胞外基质堆积, 促进肾小球硬化。
有研究表明, VEGF与糖尿病患者或动物的内皮功能紊乱的发生密切相关。Bailey等[12]用非放射性同位素杂交的方法发现与糖尿病肾病发生相关的是24h尿蛋白及每个肾小球表达EGF m RNA的细胞数, 而VEGF m RNA几乎是由肾小球上皮细胞表达, 糖尿病肾病轻微病变与表达VEGFm RNA的细胞数异常明显相关, 故分析VEGF表达的量可以早期诊断糖尿病肾病。糖尿病患者尿VEGF的排泄随蛋白尿程度加重而显著增加, 并与血清肌酐、肌酐清除率、蛋白尿相关。高血糖、氧化应激、终末期糖基化产物 (AGE) 和缺氧均可增加VEGF的表达。关于VEGF在糖尿病视网膜增生病变和黄斑水肿中的作用已被广泛接受, 糖尿病肾病的进展也与此相联系。Cha等[13]观察到VEGF m RNA在早期糖尿病肾病中表达增加, 而这与尿VEGF排泄增加相关联。在糖尿病患者肾脏中产生过剩的VEGF可能参与了早期的糖尿病肾病的发病机制。
4.3 VEGF与肾脏肿瘤
肾癌是一种较易发生转移的肿瘤, 临床上诊断时往往有30%的患者已发生了转移, 其转移方式主要是淋巴和血行转移。肿瘤的浸润转移是一个极其复杂的动态过程, 其中涉及许多肿瘤相关因子的参与和调控。VEGF是近年来发现的与实体瘤生长和转移关系最为密切的血管形成调节因子, 以旁分泌的形式刺激肾癌血管形成, 间接促进肿瘤的发展。另外, 晚期肾癌的VEGF表达水平明显高于早期肾癌, 提示VEGF可以作为肾癌疾病活跃的一个指标, 可能对于肾癌的预后有一定的意义。
VEGF在VHL肾细胞癌及散发型肾细胞癌中含量上升, 它除了有促进内皮细胞的有丝分裂活性外还能诱导血管的通透性增加, 从而导致血管外蛋白及纤维的沉积而支持并营养肿瘤细胞, 促进肿瘤的形成, VEGF在肾细胞癌 (RCC) 中的表达明显增高, 对RCC血管生成具有重要的促进作用, 且p53与VEGF的表达无统计学上的相关性。Kurodak等[14]报道, 肾素瘤的血管及小管成分是通过VEGF自分泌作用促使瘤的增生。
4.4 VEGF与肾脏微血管变化
在慢性肾脏疾病中, 在局灶节段性肾小球硬化中, 肾小球VEGF表达是减少的, 慢性间质性瘢痕形成如慢性排斥反应中, 肾小管的VEGF表达也是减少的, 在人类慢性间质性肾炎中, 在肥大的肾小管处VEGF表达基本不变, 而在萎缩的小管处VEGF表达是减少的。在老年化相关的肾脏疾病中, 足突细胞及髓质外层的肾小管VEGF表达明显减少, 而且肾小管VEGF表达下降与肾小管周围毛细血管减少程度密切相关。在急性肾小球肾炎、急性移植排斥反应中VEGF有急速的增高现象。用Con A刺激Ig A肾病患者外周血单核细胞, 可引起血浆VEGF水平升高。在体外实验中, IL-12和IL-15可增加外周血单核细胞VEGF的分泌, 而IL-4、IL-10或IL-13能抑制VEGF的释放, 并呈剂量依赖性。Matsumoto等研究发现人系膜细胞中一氧化氮合酶 (i NOS) 活性增加可通过介导血清变体糖基化Ig A生成而抑制VEGF基因表达, 减少VEGF的合成和释放。NO的供体硝普钠, 对VEGF的合成有双向调变的作用:低浓度 (0.0001nmol/L) 可促进VEGF的生成, 而较高浓度 (1000nmol/L) 则可抑制VEGF表达。因此, VEGF合成减少可能引起或加重Ig A肾病肾小球硬化, 并损伤血管的修复机制[15]。
5 展望
近年研究表明, VEGF与相应受体结合可能参与了急慢性肾衰竭、原发性肾小球疾病及代谢疾病、肿瘤、血管性疾病、系统性疾病等所致的肾脏病变的发病过程, 不同肾疾病中VEGF的表达有所不同。VEGF与肾疾病的相关研究起步不久, 许多问题有待深入探索。通过应用重组的内皮因子或抗内皮因子抗体甚至基因工程方法加强或减弱局部组织血管生成素和VEGF的表达将有可能成为今后治疗肾脏疾病的一种选择。值得一提的是, 通过测定血清、尿中的血管内皮因子的水平可能成为一种有效的疾病监测的方法。进一步明确不同肾疾病条件下, VEGF的表达及作用是一个非常有意义的课题, 通过干预VEGF, 减轻肾脏损伤, 改善肾功能的作用, 并为肾疾病的诊断治疗开辟新的途径。
摘要：血管内皮生长因子 (VEGF) 是一种促进血管内皮生长及渗透的因子, 具有增加血管通透性、促进内皮细胞增殖及血管维持功能。VEGF与相应受体结合可能参与了急慢性肾衰竭、原发性肾小球疾病及代谢疾病、肿瘤、血管性疾病、系统性疾病等所致的肾脏病变的发病过程, 不同肾疾病中VEGF的表达有所不同, 通过测定血清、尿中的血管内皮生长因子的水平可能成为一种有效的疾病监测的方法。检测VEGF的表达, 对探讨肾脏疾病的发病机制、观察病情进展、指导临床治疗及判断预后有重要意义。