血管生成因子

血管生成因子（共7篇）

血管生成因子 篇1

目前进展期的非小细胞肺癌 (non-small cell lung cancer, NSCLC) 患者进行规范化疗的疗效仍不理想。肿瘤转移是导致患者治疗失败的主要原因。血管内皮生长因子 (vascular endothelial grow the factor, VEGF) 是最重要的血管生成因子, 也是已知最强的血管通透剂[1]。临床研究数据表明VEGF在肺癌组织中高水平表达, 并与肿瘤的增生、侵袭、转移密切相关[2]。以VEGF为靶点的抗血管新生治疗成为近年来NSCLC治疗的研究热点。现将抗VEGF治疗应用现状及展望简述如下。

1 VEGF和VEGFR家族

血管内皮生长因子 (VEGF) 是一种具有肝素结合活性的高度糖基化的碱性蛋白, 是由两个分子量为23KD的亚基组成的二聚体。人VEGF基因由8个外显子和7个内含子交替构成, 定位于染色体6p21.3上。其家庭成员还包括:胎盘生长因子 (placental growth factor, PLGF) 、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D。

VEGF通过与自身受体结合, 诱发一系列信号转导机制, 发挥生物学效应, VEGF受体VEGFR为酪氨酸激酶受体, 其信号转导与酪氨酸激酶的级联反应有关。目前发现的主要受体有VEGFR-1 (Flt-1) 、VEGFR-2 (KDR) 、VEGFR-3 (Flt-4) 3种。VEGF使血管细胞分裂、增殖、通透性增加主要通过KDR介导;Flt-1的表达与胚胎早期血管形成和伤口愈合有关;Flt-4仅与VEGF-C、D结合, 与淋巴侵袭和淋巴结转移有关。VEGFR家族还包括神经纤维网蛋白-1 (Neuropilin-1, np-1) 和神经纤维网蛋白-2 (np-2) [3]。

2 NSCLC的VEGF表达的临床意义

新生的肿瘤血管是肿瘤增殖的基本条件, 也是癌细胞浸润和血行转移的第一路径。VEGF的靶细胞是血管内皮细胞通过与之特异性结合增强血管通透性, 刺激血管内皮细胞增殖, 促进血管内物质的渗出, 抑制内皮细胞凋亡, 激活蛋白酶致使细胞外基质降解, 利于新生细胞生长及延伸, 为内皮细胞迁移和肿瘤细胞的转移提供形态学基础[4]。VEGF在肿瘤发展过程中全程表达[2], 其在肺癌组织中表达水平与原发肿瘤大小、癌细胞分化程度、淋巴结和远处转移状态、治疗反应、预后等有密切关系, 但与患者性别、年龄及肿瘤分期没有明显相关性[5]。

3 VEGF在NSCLC治疗中的研究

抗肿瘤新生血管的靶点是血管内皮细胞, 其基因相对稳定, 不易突变, 不易出现耐药株, 所以目前针对VEGF的靶向药物受到重视, 目前开发并进入临床研究的药物主要有以下几种。

3.1 VEGF单克隆抗体

目前应用于肺癌临床的贝伐单抗是一种重组人源化单克隆lgG抗体, 半衰期17～21d, 分子量149KD。贝伐单抗主要是通过与VEGF竞争性结合, 阻止、减弱VEGF与KDR的结合, 从而抑制内皮细胞增殖, 减少新生血管形成。同时, 贝伐单抗可使肿瘤及周围组织的血管分布正常化, 降低肿瘤组织间质压, 利于化疗药物的传递。临床试验证明, 化疗方案联合贝伐单抗治疗对晚期NSCLC患者的治疗反应率、存活期、无疾病进展生存期 (PFS) 均有明显增加。美国东部肿瘤协作组的Ⅲ期临床试验 (ECOG4599) 表明, 环磷酰胺+顺铂方案 (CP) +贝伐单抗方案较CP方案, 中位生存期延长2.3个月, PFS延长25%[6]。GP+贝伐单抗方案的Ⅲ期临床试验 (AVAIL) 显示贝伐单抗联合治疗晚期NSCLC提高了缓解率、延长pfs[7]贝伐单抗最严重的不良反应是肺部致命性大出血, 还引起血栓形成、蛋白尿、心脏毒性等毒副反应。以铂类药物为基础的化疗方案联合贝伐单抗可用于晚期非鳞状NSCLC患者的一线治疗;CP+贝伐单抗方案可作为不可切除、局部进展、复发或转移性的非鳞状的NSCLC患者的初始化疗方案[8]。贝伐单抗的推荐用药剂量为5～15mg/kg, 每3周给药1次。

3.2 VEGF抑制因子

血管内皮抑制素 (Endosta-tin, ES) 是目前被认为作用最强、效果最好、最广谱的肿瘤生成抑制剂。现用于临床的为重组人内皮抑素 (Endostar) , 商品名恩度 (rh-endostain, YH-16) 。ES通过特异性作用于新生血管的内皮细胞, 抑制细胞迁移, 诱导其凋亡, 阻碍VEGF诱导的新生内皮细胞管状结构的形成并破坏已经存在的结构, 抑制KDR酪氨酸磷酸化和细胞外信号调节激酶的活性并下调KDR的表达, 多靶点抑制血管生成。恩度联合去甲长春花碱+顺铂方案 (NP) 治疗晚期NSCLC的Ⅲ期临床研究结果:NP+YH-16方案与NP方案比较, 有效率增加15.9%、中位肿瘤进展时间延长2.7个月、临床获益率提高9.3%。恩度不增加化疗的毒副反应, 但可能会增加患者心律失常发生的几率, 使用时需严密监测[9]。作为NSCLC的一线用药, 恩度可以联合以铂类为基础的所有化疗方案, 临床常规使用剂量为7.5mg/㎡, 连用14d, 休息7d。

3.3 VEGF Trap

VEGF Trap (aflibercept) 是一种可溶性重组蛋白。VEGF Trap与VEGF-A的所有亚型具有高度亲和力, 这种亲和力是抗VEGF单克隆抗体亲和力的100～1 000倍。除VEGF-A外, VEGF Trap还可以与PIGF和VEGF-B结合。VEGF Trap通过结合和钝化血液循环的VEGF, 在血液中形成一种稳定的复合物而发挥作用。VEGF Trap治疗晚期NSCLC的Ⅰ、Ⅱ期临床试验显示其耐受良好, 严重不良反应少[10]。与化疗药物合用的Ⅲ期临床试验正在进行中。

3.4 酪氨酸激酶抑制剂

目前被美国FDA批准临床应用的酪氨酸激酶抑制剂有索拉非尼 (Sorafenib) 、舒尼替尼 (Sunitinib) 。索拉非尼为多靶点激酶抑制剂, 主要靶点为Raf、Kit、Fit-3、KDR、Flt-4和PDGFR-β。临床试验结果表明, 索拉非尼单药对晚期NSCLC患者有益, 但联合化疗不改善患者生存[11]。舒尼替尼是靶向于VEGFR-1、2、3、c-Kit, Ⅱ期临床试验证明作为二线药物治疗非小细胞肺癌具有较好疗效[12], Ⅲ期临床试验正在进行中。

4 展望

化疗在NSCLC的治疗中已经进入一个“平台靶分子治疗为肿瘤的治疗提供的一个全新的思路, 临床研究也确定了贝伐单抗联合化疗作为一线治疗的地位, 但在具体的临床使用中还存在问题, 如怎样增加靶向药物的特异性和针对性, 提高靶向药物的疗效;治疗方案如何选择能够真正实现患者治疗的个体化。目前三代化疗药+铂类仍为一线方案对治疗模式的变更需要进一步的研究

关键词：非小细胞肺癌,血管内皮生长因子,靶向治疗

血管生成因子 篇2

1 肿瘤血管生成的生理基础

1971年Folkman提出“肿瘤的生长及扩散依赖血管生成”这一概念,认为肿瘤的生长可分为无血管期及血管期。当瘤体<1 mm3,肿瘤聚集体可通过组织间弥散作用获得营养、氧气并转移代谢废物;而当体积>1 mm3,瘤体便无法仅依靠弥散作用获得维持生长所需的物质,维持局部微环境稳态,此时血管新生就显得尤为重要,若无新生血管向瘤体内长入,肿瘤便无法继续增长,甚至发生沉默或退化[1]。

通常对哺乳动物而言,除雌性生理周期外,血管系统在健康成年动物体内呈静止状态,而仅在外伤、肿瘤等特殊病理条件下,血管新生才被激活。基于这一规律,Hanahan等[2]提出“血管生成开关(angiogenic switch)”假说,认为血管新生过程受到血管生成诱导因子与抑制因子的“开关”调控,只有当诱导因子上调或抑制因子下调时,这一“开关”被激活,肿瘤血管新生才得以进行。

2 促血管生成相关因子

血管生成过程受多种促血管生长因子的调控,包括血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,b FGF)、血管生成素(angiopoietin,ANGPT)、环氧化酶(cyclooxygenase,COX)、血小板源性生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、survivin蛋白等。本文就相对重要的因子进行概述。

2.1 VEGF

VEGF是一类对内皮细胞具有高度特异性作用,在胚胎形成及人体正常生长发育过程中影响血管生成的重要因子,为心血管系统的正常构建奠定了基础[3]。通常在脉管系统形成后,VEGF在正常组织内低表达,而在实性肿瘤及部分造血源性肿瘤中过表达,且对于口腔鳞癌、乳腺癌、结肠癌、食管癌等恶性肿瘤,VEGF是评价其预后的重要指标[4]。其主要功能包括:(1)促进血管内皮及淋巴管内皮细胞的增殖;(2)调节血管通透性;(3)舒张血管;(4)对神经细胞、肺上皮细胞、心肌细胞等的营养作用[3]。

现阶段研究认为,VEGF与口腔鳞癌进展及转移关系密切。Kukreja等[5]发现,口腔鳞癌癌巢及瘤内上皮均可见VEGF表达,且表达水平与肿瘤病理分期呈正相关,同时癌组织中微血管密度(microvessel density,MVD)较正常组织及癌前病变显著升高。Sales等[6]发现,原发灶及癌周组织内VEGF-A及其m RNA表达显著高于正常组织,同时其在癌周组织中的表达明显高于原发灶,病变组织内VEGF-A表达水平与病变大小及淋巴结转移程度呈正相关,认为VEGF-A与口腔鳞癌转移相关,癌周组织参与了VEGF-A的生成。

2.2 ANGPT

ANGPT属于分泌型低聚糖蛋白,包含Ang-1、Ang-2、Ang-3、Ang-4四种亚型,其中以Ang-2与肿瘤血管生成关系最为密切。Ang-2由血管内皮细胞产生,作为酪氨酸激酶受体-2(tyrosine kinase receptor-2,Tie-2)部分激动剂,过表达的Ang-2可与Ang-1竞争结合Tie-2,抑制由Ang-1诱导的PI3K、Akt、Grb2等信号通路,降低血管基底膜的稳定性,抑制血管内皮细胞及管周细胞的相互作用及血管的自我修复作用[7],为口腔鳞癌血管新生创造条件。

Li等[8,9]发现,癌组织内MVD较正常及癌周组织明显升高,而血管成熟度明显降低,MVD及血管成熟度与Ang-2表达水平显著相关,认为Ang-2与口腔鳞癌内血管生成及成熟关系密切;并进一步发现,过表达的Ang-2可诱导TCA8113舌癌细胞产生波形蛋白并抑制黏钙素的表达,提高肿瘤细胞的迁移及局部浸润能力,同时Ang-2可诱导肿瘤细胞表达VEGF,促进瘤体内血管生成。梁博[10]发现,鳞癌组织内MVD显著高于正常组织,且Ang-2及其m RNA表达明显增高,Ang-2表达水平与MVD呈正相关,认为Ang-2是口腔鳞癌的血管生成的影响因子。

2.3 b FGF

b FGF在机体的创伤修复及血管生成中具有重要作用[11]。作为成纤维细胞生长因子成员之一,其几乎在所有细胞皆有表达,经与内皮细胞表面的酪氨酸激酶FGF受体-1/2(tyrosine kinase FGF receptor-1/2,TK-FGFR-1/2)、肝素硫酸蛋白多糖等结合后,可促进内皮细胞的增殖及迁移,诱导内皮细胞在基底膜上的改组并形成管腔样结构[12],同时可激活VEGF/VEGFR系统,协同促进肿瘤及胚胎的血管生成[11]。

大量研究表明,b FGF与口腔鳞癌转移关系密切。He[13]发现,口腔鳞癌内b FGF含量显著高于正常组织,其表达水平与瘤体内MVD呈正相关,与患者的年龄、病理分期、淋巴结转移程度关系密切。Hase等[14]发现,约67%的口腔鳞癌病例中,b FGF/FGFR1可见明显表达,其表达强度与肿瘤局部侵袭及淋巴结转移率呈正相关,认为b FGF/FGFR1的表达水平与口腔鳞癌浸润转移有关,是口腔鳞癌预后评估的依据。

2.4 MMPs

MMPs是一类Zn2+依赖的蛋白水解酶家族,根据作用底物的不同,MMPs可分为六类:胶原酶(collagenases)、基质溶解酶(matrilysins)、明胶酶(gelatinases)、膜基质金属蛋白酶(membrane-type MMPs)、间质溶解素(stromelysin)及其他基质金属蛋白酶。其作用主要包括:肿瘤细胞通过自分泌及释放VEGF等因子刺激内皮细胞产生MMPs,MMPs选择性作用于细胞外基质及血管基底膜,提高血管的通透性,协助肿瘤细胞迁移及扩散;同时为内皮细胞经血管间隙向血管外的出芽迁移,形成新生血管网提供条件[15]。

研究表明,MMP-2、MMP-9与口腔鳞癌血管生成关系密切[15]。Andishehtadbir等[16]发现,MMP-9在口腔鳞癌组织内高表达,且表达率与瘤内MVD呈正相关,认为MMP-9可促进口腔鳞癌血管生成。张壮等[17]发现,口腔鳞癌中MMP-2表达量与MVD呈正相关,且MMP-2、MVD与肿瘤大小及淋巴结转移程度呈正相关,认为MMPs可通过影响肿瘤血管生成促进肿瘤的发展及转移。Mishev等[18]发现,在口腔鳞癌进展的各阶段,瘤内MMP-2及MMP-9表达水平相对稳定,而MMP-7、MMP-13随肿瘤进展表达逐步下调,且其在癌组织的侵袭前沿及高度恶性区亦可见明显下调,认为MMPs表达水平可以帮助明确口腔鳞癌发展进程,并为预后评估提供依据。

2.5 COX

COX即前列腺素内过氧化物合成酶,是前列腺素合成过程中的重要限速酶,其作用在于将花生四烯酸代谢成为各种前列腺素产物,参与机体病理及生理过程。环氧化酶存在两种同功酶:COX-1及COX-2,其中COX-1作为结构酶,通常被认为仅参与调节机体正常的生理过程[19];COX-2作为诱导酶,主要表达于炎症、损伤及肿瘤组织,可影响局部微血管的生成,与口腔鳞癌的发生、发展及转移存在密切联系[20]。

Santoro等[20]发现,在口腔鳞癌组织中,COX-2的平均表达率呈高表达趋势,且与瘤内MVD呈正相关,认为癌细胞可高表达COX-2,促进瘤体内微血管生成及肿瘤细胞的局部浸润。Byatnal等[21]发现,口腔癌组织内均可见COX-2表达,且表达水平与淋巴结转移率、病变组织病理分期呈正相关,认为COX-2可作为评估肿瘤进展程度及患者预后的生物指标。

3 血管生成抑制因子

血管生成抑制因子与促血管生成因子的平衡是血管系统稳定的关键因素,目前发现的血管生成抑制因子包括血管抑素(angiostatin,AS)、内皮抑素(endo statin,ES)、白细胞介素、血小板反应素等,其中以AS、ES最为重要。

3.1 AS

AS是一种具有抗肿瘤潜力的血管生成抑制因子,在正常生理状态下并不表达,仅在肿瘤等疾病过程中,其可由MMPs及尿激酶降解血浆纤维蛋白溶酶(plasminogen,Pgn)形成,是一种可溶性的内肽片段[22]。作为Pgn的降解产物,AS包含Pgn的前四个Kringle片段,其中Kringle1-3可抑制内皮细胞的增殖,Kringle-4可抑制内皮细胞的迁移,因此AS的生物活性被认为是由多个Kringle片段联合作用的结果[23]。目前AS与口腔鳞癌之间的研究报道甚少。刘志刚[24]将AS注射至皮下舌癌TCA811后发现,瘤体内细胞凋亡指数和MVD、VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2蛋白及m RNA表达量明显下调,并在一定浓度范围内呈现剂量依赖性。认为AS可通过抑制VEGF/VEGFR系统抑制舌癌血管生成。

3.2 ES

ES是第一个被发现具有血管生成调控作用的细胞外基质蛋白,是胶原蛋白ⅩⅧ经MMPs等水解作用所形成的C-末端非胶原区的氨基酸片段。其通过抑制b FGF、VEGF-R2/KDR/Flk-1、整合素-α5β1等信号通路,抑制MMP-2/9/13等MMPs的活性,进而抑制内皮细胞的迁移;同时ES可通过下调细胞周期蛋白D1、细胞凋亡抑制基因、细胞周期调控基因、黏附斑激酶等基因的表达,抑制内皮细胞的增殖[25,26]。

研究表明,ES可影响口腔鳞癌组织中血管生成,并一定程度抑制肿瘤的局部侵袭。李刚等[27]发现,口腔鳞癌组织中ES表达率较正常组织高,且癌组织中ES阳性组的MVD低于阴性组。Alahuhta等[28]通过转染舌癌HSC-3细胞,使其过表达ES,发现ES可以抑制HSC-3细胞在3D胶原纤维模型中的局部侵袭。Hebert等[29]发现,口腔鳞癌细胞经ES处理后,VEGF及胶原蛋白ⅩⅧ表达下调,同时ES可抑制癌细胞的迁移,抑制强度与ES浓度呈正相关,认为ES具有一定的抗肿瘤侵袭潜能。

4 小结

肿瘤放化疗在临床治疗口腔鳞癌的过程中获得了不可否定的疗效,在缩小原发灶的基础上为术后局部组织缺损修复提供了有效的支持,并为患者预后奠定了良好的基础。但肿瘤的放化疗具有明显的非特异性,毒副作用明显,在杀伤肿瘤细胞的同时,对正常的组织、器官造成不同程度的损伤,部分患者在治疗过程中常出现严重的骨髓抑制、胃肠道刺激等不良反应,常常使综合序列治疗无法达到预期的效果。抗肿瘤血管生成作为一种新兴的治疗方法,具有较强的特异性,可在肿瘤发生早期破坏肿瘤微环境稳态,阻碍肿瘤的正常生长,同时在一定程度上限制肿瘤向癌周正常组织的侵袭及全身远处转移,为口腔鳞癌的综合序列治疗拓宽了思路,有望成为口腔鳞癌靶向治疗的重要途径。

摘要：肿瘤的发展及转移与血管生成关系密切,当肿瘤生长至一定程度,在多种因子的调节作用下,瘤体通过血管新生从宿主获取生长所需的营养及氧气,转运代谢产物,同时新生血管在一定程度上为肿瘤细胞的转移及扩散创造了条件。近年来,随着肿瘤与血管生成之间研究的不断深入,以抗血管生成为靶点的口腔鳞癌综合序列治疗日益引起重视。本文就影响血管生成的相关因子在口腔鳞癌中的研究现状进行综述。

血管生成因子 篇3

关键词：缺血耐受,血管内皮生长因子,血管生成素-1,缺血预处理

实验表明, 短暂性脑缺血预处理 (ischemia preconditioning, IP) 能够诱导产生内源性神经保护作用, 从而减轻其后发生的更为严重的缺血性脑损伤的程度, 该现象又称“脑缺血耐受”[1]。目前诸多研究探讨了脑缺血耐受的发生机制以及诱发神经保护的最佳时间窗, 但迄今尚无定论。研究发现, 在缺血性脑损伤过程中血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor, VEGF) 和血管生成素-1 (angiopoietin-1, Ang-1) 起着重要作用。脑缺血后, VEGF和Ang-1能够促进血管内皮细胞增殖和迁移, 从而参与血管形成;而且, 二者在神经发生和神经保护等方面也发挥重要作用[2]。本实验中, 我们首先建立大鼠脑缺血耐受模型, 然后动态检测IP后再灌注不同时间窗内缺血侧大脑皮层和纹状体VEGF及Ang-1的蛋白表达水平, 探讨二者在内源性脑保护中的作用, 为进一步阐明脑缺血耐受的发生机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂

随机选择99只成年健康雄性Wistar大鼠, 体质量250～300g, 清洁级。实验前大鼠适应环境1周, 自由进饮食, 室温控制在 (22±2) ℃, 室内相对湿度65%, 每天光照时间为12 h。兔抗大鼠VEGF多克隆抗体和Ang-1多克隆抗体、即用型SABC试剂盒、DAB显色试剂盒等实验材料均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及预缺血及再缺血模型的制备

将实验大鼠随机分成三组, 即缺血预处理 (IP) 组 (45只) , 非缺血预处理 (NIP) 组 (45只) , 假手术对照组 (9只) 。采用由ZeaLonga[3]改良的大脑中动脉 (MCA) 二次线栓法建立动物模型, 具体步骤如下:经左侧颈外-颈内动脉插线 (18.5±2) mm完全阻断MCA, 10 min后将线栓退出至颈外动脉, 并埋于皮下, 完成脑缺血预处理。根据再次给予大脑中动脉闭塞 (MCAO) 的时间, IP组又分为5个亚组 (每个亚组9只) , 即在IP后1, 3, 7, 14, 21 d用线栓法再次MCAO, 于本次缺血2 h后将线栓抽出至颈外动脉, 造成第2次缺血再灌注, 于再灌注22 h后将大鼠处死。NIP组也分为5个亚组 (每个亚组9只) , 但以假手术代替IP, 即第1次手术仅仅暴露颈总动脉及分叉处, 不插线阻断MCA。按前述不同时间点, 于假手术后实施MCAO2h, 再灌注22 h后将大鼠处死。假手术对照组, 两次均为假手术, 与以上两组的1d亚组同时间处死。模型制作成功的标准:大鼠清醒后出现右前肢不能伸展、爬行时向右侧转圈。

注:与NIP组比较, *P<0.01;与IP组14, 21d亚组相比, #P<0.05

1.2.2 脑梗死体积的测量

在每亚组中随机选取4只大鼠, 快速处死取脑。距额极2mm向后连续等距切片, 间距2mm, 共取5个冠状脑片, 37℃水浴, 避光, 置于体积分数0.01TTC磷酸缓冲溶液中染色30min。蒸馏水冲洗, 应用40g/L多聚甲醛固定脑片。逐层拍照, 正常脑组织染为红色, 梗死组织为白色。应用Adobe PhotoShop CS计算脑梗死面积, 脑梗死体积=各层脑梗死面积之和×层间隔。

1.2.3 VEGF和Ang-1蛋白表达的检测

将每组其余5只实验大鼠灌注固定, 断头取脑。取前囟后3～6mm间冠状脑组织, 常规石蜡包埋, 按片厚5μm进行切片。采用SABC免疫组织化学染色法检测大鼠缺血侧大脑皮层和纹状体VEGF和Ang-1蛋白的表达。DAB显色, 光镜下观察, 发现胞浆出现棕色颗粒则为阳性着色。先在低倍镜下选择视野, 分别于皮质区和纹状体区取4个象限, 然后在高倍镜下计数阳性细胞[4]。

1.3 统计学方法

应用SPSS l0.0软件包进行统计分析。计量资料采用均值±标准差表示。采用t检验和方差分析分别进行组间比较和组内比较。

2 结果

2.1 各组脑梗死体积的变化

假手术对照组脑组织无缺血灶, 呈均匀红染。NIP组与IP组均见白色缺血灶, 主要位于缺血侧的额顶颞叶大脑皮质, 在纹状体及海马部位亦见有缺血灶。NIP组之各亚组间比较, 脑梗死体积差异无显著性;IP组1, 3, 7 d亚组脑梗死体积较14, 21 d亚组明显减小 (P<0.05) , 其中3 d亚组变化最明显。组间比较显示, IP组1, 3, 7 d亚组梗死体积较NIP组之相应亚组明显减小 (P<0.01) 。详见表1。

2.2 各组VEGF和Ang-1蛋白表达水平的比较

假手术对照组未见VEGF阳性表达。NIP组与IP组VEGF蛋白阳性表达细胞较多, 胞浆棕黄色, 着色明显, 主要分布于缺血灶及周围的神经元、神经胶质细胞以及微血管内皮细胞, IP组之1, 3, 7 d亚组中VEGF蛋白表达水平明显高于NIP组之相应亚组 (P<0.05) , 其中以IP组3 d亚组变化最明显。详见表2。

注:与NIP组比较, *P<0.05;与IP 14 d亚组相比, #P<0.05;与IP21 d亚组相比, △P<0.05

各组均发现Ang-1蛋白阳性表达的细胞, 阳性细胞内出现棕黄色颗粒。位于缺血侧大脑皮质和纹状体区的神经元、神经胶质细胞以及内皮细胞。各组之间的比较显示, IP组之7 d亚组Ang-1蛋白表达水平明显高于NIP组之相应亚组 (P<0.05) 。详见表2。

3 讨论

3.1 IP诱导产生脑缺血耐受的时间窗

本实验显示, 大鼠脑缺血再灌注后出现不同程度的神经功能障碍, 缺血脑组织的神经细胞数量减少, 有些神经细胞呈现核固缩和破碎现象。而IP后, 梗死灶中心区明显减小, 脑水肿程度减轻, 周围区结构完整的神经细胞显著增多。IP组之1, 3, 7 d亚组脑梗死体积较NIP组之相应亚组明显减小, 提示IP诱发产生“脑缺血耐受”。

脑缺血耐受的发生机制无明确定论。以往研究表明, 可能涉及细胞防御机制的激活、兴奋性和抑制性神经递质动态平衡的改变、以及细胞因子的参与等[5]。而且, 不同时间窗内IP发挥神经保护作用的机制存有差异。IP的效果与其持续的时间密切相关, IP时间过短不足以诱导产生脑缺血耐受, 时间过长则可能导致神经损伤, IP只有持续“适当的时间”, 尚能刺激机体发挥最大限度的神经保护作用[6]。本研究中, IP诱导产生神经保护的最佳时间为IP后3 d, 持续1～7 d。

3.2 IP对大鼠VEGF蛋白表达的影响

研究表明, VEGF是一种特异性血管内皮细胞有丝分裂原, 为增加血管通透性的最强烈的物质之一。VEGF能够选择性作用于内皮细胞膜上的酪氨酸受体, 即血管内皮生长因子受体1 (VEGFR1) 和血管内皮生长因子受体2 (VEGFR2) , 诱发血管内皮细胞增殖、迁移、细胞间的相互作用以及管腔的形成, 从而促进机体血管新生。机体中的VEGF的表达受到诸多因素的调控, 有研究显示缺血和缺氧是VEGF表达增加的最主要的诱导因素[7]。Mu等[8]研究显示, 在脑缺血半暗带区域, “缺氧”激活了低氧诱导因子1α的表达, 后者不仅诱导了VEGF过量表达, 同时还刺激组织表达VEGF受体。VEGF与其受体结合后, 促使新生血管的生成, 改善局部的血液供应, 减轻缺血性脑损伤。另外, 在脑缺血的急性期, VEGF对神经细胞、雪旺细胞及星形胶质细胞等还发挥着直接的神经营养和神经保护作用, 并通过抑制神经细胞凋亡而保护神经元, 从而促进神经功能恢复[9]。

本实验显示, NIP组与IP组大鼠缺血侧脑组织均见较多的VEGF蛋白表达阳性细胞。VEGF蛋白在IP后1d即出现升高, 阳性表达的高峰期为IP后3 d, 持续时间为7 d。同时, IP组1, 3, 7 d亚组VEGF蛋白表达水平明显高于NIP组之相应亚组。VEGF蛋白表达水平的这些变化趋势与脑缺血耐受产生的时间是基本一致的, 提示VEGF可能参与了脑缺血耐受的发生机制。

3.3 IP对大鼠Ang-1蛋白表达的影响

Ang-1作为血管内皮细胞特异性受体酪氨酸激酶Tie-2的配体, 对血管内皮细胞能产生强力的趋化作用, 能够诱导内皮细胞出芽、迁移, 并形成管状结构;同时还能诱导释放纤溶酶, 抑制基质金属蛋白酶组织抑制剂-2的分泌, 从而提高二者的比例, 最终导致细胞外基质降解, 为细胞迁移创造条件。实验表明, 脑缺血发生后, Ang-1能够促进缺血脑组织周围侧支循环的形成, 加强内皮细胞间的紧密连结, 维持血脑屏障的完整性, 明显改善缺血脑组织的血流灌注;并能直接抑制神经细胞的凋亡, 保护缺血半暗带的神经细胞, 促进神经功能的恢复[10]。

本研究中, Ang-1在各组均有所表达。其中, 仅IP组之7d亚组的Ang-1蛋白表达明显高于NIP组之相应亚组。然而, 脑缺血耐受在IP后1d即开始出现, 其产生的高峰期在IP后3d, 持续至7d。上述结果提示, 在脑缺血耐受早期阶段Ang-1的表达并未呈现明显升高, 故Ang-1可能主要作用于脑缺血耐受的后期阶段。

综上所述, IP可诱导大鼠产生脑缺血耐受, VEGF在脑缺血耐受产生的时间窗内发挥重要作用, 而Ang-1则可能作用于脑缺血耐受的后期阶段。本研究对阐明脑缺血耐受的机制具有重要价值。

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[9]Vezzani A.VEGF as a target for neuroprotection[J].Epilepsy Curr, 2008, 8 (5) :135.

血管生成因子 篇4

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2003~2006 年贵阳医学院附属医院口腔颌面外科手术切除的口腔鳞癌标本48 例(患者术前未经任何针对肿瘤的治疗且标本经病理证实),男33 例,女15 例;年龄28~77 岁,平均年龄(54.4±8.7)岁;舌癌19 例,牙龈癌14 例,口底癌9 例,颊癌6 例;高分化30 例,中低分化18 例;肿瘤浸润至黏膜下层22 例,浸润肌层或骨组织(牙龈癌)26 例;淋巴结转移17 例,淋巴结未转移31 例。另取10 例正常口腔黏膜组织作为对照,男女各5 例(取自无烟酒嗜好的外伤患者)。以上标本均经4%甲醛溶液固定,常规石蜡包埋,连续切片,切片厚度4 μm(免疫组化)和6 μm(原位杂交),玻片经APES处理。

1.2 主要试剂

地高辛标记的TGF- β1寡核苷酸探针原位杂交试剂盒(针对人TGF- β1靶基因的mRNA序列为:①5'- CTTCTCCTGATGAGTCCG TGAGGACGAAAGCCTG- 3;②5'- CAGGCTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGGAGAAG

- 3'),以上试剂购自武汉博士德生物工程公司。鼠抗人CD31单克隆抗体(克隆系1A10,购自北京中杉金桥生物技术公司);免疫组化通用二步法(PV- 9000)试剂盒及DAB显色剂购自北京中杉金桥生物技术公司。

1.3 组织原位杂交检测TGF- β1 mRNA的表达

常规石蜡切片脱蜡至水化,3%过氧化氢室温孵育10 min以灭活内源性酶,胃蛋白酶消化30 min,以暴露mRNA核酸片段;1%多聚甲醛/0.1 mol/L PBS(pH 7.4)固定液室温固定10 min;滴加20 μl预杂交液,38 ℃恒温箱内预杂交3 h;甩去预杂交液,滴加20 μl杂交液,原位杂交专用盖玻片盖在切片上, 38 ℃恒温箱内杂交过夜;SSC洗涤后滴加封闭液, 38 ℃恒温箱30 min;甩去封闭液, 滴加生物素化鼠抗地高辛, 38 ℃恒温箱 1 h;滴加SABC, 38 ℃恒温箱20 min;滴加生物素化过氧化物酶, 37 ℃恒温箱20 min;DAB显色,苏木精复染,脱水,透明,封片。用预杂交液代替含探针的杂交液作空白对照。

1.4 免疫组化染色

正常组和口腔鳞癌组均进行免疫组化染色,采用PV- 9000二步法,微波抗原修复,DAB显色,鼠抗人CD31单克隆抗体(工作浓度为1∶50)标记血管内皮细胞,CD31采用高压抗原修复,按照试剂盒说明书进行操作,严格控制时间和温度,每次染色均设阳性和阴性对照,用正常动物血清代替一抗作阴性对照,并常规进行HE染色,确定肿瘤病理类型、分级及侵袭深度。

1.5 结果评定

TGF- β1 mRNA阳性表达值的评定参照Ibrahim[1]的方法进行。随机选取5个高倍镜视野(×400),每个视野以细胞质出现着色为阳性标记,将细胞染色强度和阳性细胞百分数分别分为4级:据细胞显色深浅分别评为0、 1、 2 、3 分;据阳性细胞<5%、5%~35%、36%~65%、≥66%分别评为0、 1、 2、 3 分,将两者评分相加除以2,5 个视野取其平均数作为最终评分。将0 分、 0.5~1 分、1.5~3 分分别定为TGF- β1 mRNA表达阴性、阳性和强阳性。

微血管计数参照Weidner[2]的方法,即任何与邻近的微血管、肿瘤细胞及其它相连组织有明显分界的棕染内皮细胞或内皮细胞簇均视为一个血管计数(不一定有血管腔样的结构)。首先在低倍镜(100 倍)下选取癌视野中微血管最密集的3 个区域,然后在高倍镜(400 倍)下进行血管计数,取平均值进行统计分析。

1.6 统计学处理

应用SPSS 13.0统计软件包进行统计学分析,两样本率的比较用χ2检验,计量资料用t检验,相关性研究采用Pearson相关分析,P<0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 TGF- β1 mRNA定位的检测

原位杂交结果显示TGF- β1 mRNA定位分布于大量肿瘤细胞的胞质(图 1),阳性细胞胞质呈棕黄色颗粒。

2.2 CD31在口腔鳞癌中的表达

CD31染色定位于口腔鳞癌组织中的微血管内皮细胞,阳性细胞呈棕褐色染色。癌组织内见大量微血管不均匀分布,形态不规则,部分血管无明显管腔,呈条索状或出芽状(图 2)。

2.3 TGF- β1 mRNA表达率

TGF- β1 mRNA在口腔鳞癌和正常口腔黏膜中的表达阳性率分别为66.67%(32/48)和10.00%(1/10)(P<0.01,表 1)。

2.4 TGF- β1 mRNA表达和各项临床病理学指标的关系

原位杂交显示,TGF- β1 mRNA在口腔鳞癌组织中的表达率浸润肌层或骨组织者明显高于浸润至黏膜下层者(P<0.05),淋巴结转移组明显高于淋巴结未转移组(P<0.01);而不同年龄、性别和病理分级间TGF- β1 mRNA的表达差异无统计学意义(P>0.05,表 2)。

2.5 口腔鳞癌中TGF- β1 mRNA的表达与MVD的关系

口腔鳞癌中TGF- β1 mRNA表达阳性组MVD值显著高于阴性对照组(t=3.007, P<0.01),相关性分析表明TGF- β1 mRNA表达与肿瘤MVD值呈正相关关系(r=0.678, P<0.01,表 3)。

3 讨 论

转化生长因子- β1(TGF- β1)是一种多功能的生长因子,对于细胞外基质的合成和贮存、调节细胞生长和分化,以及免疫反应等方面发挥着重要的作用。近年研究发现在肿瘤的晚期阶段, TGF- β1发挥着肿瘤促进因子的作用,通过刺激血管生成、免疫抑制及合成细胞外基质而提供适宜于肿瘤生长、浸润及转移的微环境[3]。

浸润生长和远处转移目前仍是恶性肿瘤致死的主要原因和治疗的难点,Gorsch[4]研究发现乳腺癌组织中TGF- β1表达水平越高,癌细胞浸润和转移的能力越强,癌症相关的死亡率越高。对结肠癌、肝癌、胃癌、肺癌和前列腺癌的体外和体内研究也得到了类似的结果[5]。Tian[6]研究发现阻断TGF- β1信号传导通路能够减少肿瘤的转移,提示TGF- β1可能参与了恶性肿瘤的浸润和转移。本研究中TGF- β1 mRNA在口腔鳞癌组织中的表达率明显高于正常口腔黏膜组织,而且口腔鳞癌组织中TGF- β1 mRNA表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移有关,说明TGF- β1可能参与了口腔鳞癌的浸润和转移过程,这与蔡传宝等[7]报道一致。对TGF- β1 mRNA与口腔鳞癌临床病理学特征间关系的研究发现TGF- β1 mRNA的表达在不同年龄、性别及病理分级中的表达相似。

在影响肿瘤浸润和转移的诸多因素中,多种因子参与的肿瘤血管生成(angiogenesis)是重要的因素之一[8]。TGF- β1作为一类功能复杂的细胞因子,广泛参与哺乳动物的各种病理生理过程,近年来研究发现其具有直接和间接地促血管生成作用。Xiong等[9]对96 例结直肠癌的研究发现,TGF- β1阳性组中VEGF 阳性率及肿瘤微血管密度均较高。Tuxhorn等[10]通过动物实验发现,使用TGF- β1抑制剂可使肿瘤重量和微血管密度明显减少。TGF- β1对内皮细胞表面代表其增殖活性的CD105 也具有上调作用[11]。TGF- β1一方面通过诱导金属蛋白酶表达,抑制金属蛋白酶组织抑制剂的产生,从而形成富含蛋白酶的微环境以利于内皮细胞的迁移,产生直接促血管生成作用;另一方面TGF- β1还能诱导VEGF的表达间接刺激血管形成。本实验中TGF- β1 mRNA表达阳性的口腔鳞癌组织中MVD值明显高于表达阴性组,并且TGF- β1的表达与口腔鳞癌MVD值呈正相关关系,表明TGF- β1 mRNA表达与口腔鳞癌的血管生成有关。

TGF- β1 mRNA一方面通过增加血管生成促进肿瘤的浸润和转移,另一方面还通过增加肿瘤细胞与胞外基质相互作用以及抑制免疫系统等途径促进肿瘤细胞浸润和转移[12]。Kao等[13]采用表达TTGF- β的逆转录病毒载体转染结肠癌细胞系CT26, 结果与空载体组相比, 转染TGF- β载体组小鼠生存率明显降低,显示其产生的TGF- β1可显著抑制树突细胞(DC)的抗肿瘤免疫作用, 成为肿瘤细胞逃逸免疫系统监视的重要原因之一。

综上所述,TGF- β1 mRNA在口腔鳞癌中的表达明显上调并且与肿瘤微血管密度密切相关,表明TGF- β1 mRNA可能通过促肿瘤血管生成和免疫抑制作用等多种途径促进了口腔鳞癌的浸润和转移。随着研究的进一步深入,TGF- β1有望成为抗血管生成治疗的新靶点。

摘要：目的:探讨口腔鳞癌中转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)mRNA的表达及其与临床病理学特征和肿瘤血管生成的关系。方法:应用组织原位杂交和免疫组化检测48例口腔鳞癌组织和10例正常口腔黏膜组织中TGF-β1 mRNA表达,并计数微血管密度(MVD),用SPSS 13.0软件包中的t检验及χ2检验进行统计学分析。结果:TGF-β1mRNA定位于肿瘤细胞胞质,在口腔鳞癌中的表达明显高于正常口腔黏膜组织(P<0.01);TGF-β1 mRNA的表达与口腔鳞癌的浸润深度、淋巴结转移密切相关(P<0.01),而与患者的年龄、性别及病理分级无关;TGF-β1 mRNA的表达与MVD值呈正相关(P<0.01)。结论:TGF-β1 mRNA的高表达可能在口腔鳞癌的浸润和淋巴结转移过程中起重要作用,并与肿瘤血管生成有关。

关键词：口腔鳞状细胞癌,TGF-β1,免疫组化,原位杂交,血管生成

参考文献

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血管生成因子 篇5

人G补缀FHA域血管生成因子1(angiogenic factor with G and FHA domains 1,AGGF1)基因是2004 年Tian等在对1 例染色体发生t(5;11)(q13.3;p15.1)平衡位点先天性静脉畸形骨肥大综合征患者进行精细的分子遗传学研究时,在染色体异位染色点克隆的一个新基因[3]。该基因在血管内皮细胞高度表达,所编码的蛋白在体外表现出强烈的血管生成能力,故被初步定性为一个新的血管生成因子。持续的肿瘤血管生成是宫颈癌的主要标志和特征之一,与宫颈癌的生长、侵袭、转移及复发密切相关[4],但是该分子是否影响宫颈癌患者术后生存尚未见相关报道。本研究的目的是探讨AGGF1 在宫颈癌的表达及其与宫颈癌术后患者预后的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2005 年6 月-2010 年8 月本院经病理确诊的60 例宫颈癌患者为研究对象,均符合宫颈癌诊断标准[4]。入选标准:宫颈活检或者阴道镜下活检病理确诊为宫颈癌,临床分期标准[国际妇产科协会(Federation International of Gynecology and Obstetrics,FIGO)] 为Ⅰb2和Ⅱa期。入选患者年龄27~69岁,平均(44.28±7.63)岁,中位年龄40 岁;FIGO分期Ⅰb2期39 例,Ⅱa期21 例;病理类型:鳞癌49 例,腺癌7 例,腺鳞癌4 例。每例患者有癌组织及癌旁组织标本,分别装入冻存管中,置于液氮中保存。所有患者有完整详细的临床资料。

1.2 免疫组织化学法染色

将收集的60 例宫颈癌组织及癌旁组织标本进行石蜡包埋。每例组织蜡块4μm连续切片,低温烤干后置入-20℃冰箱保存。采用辣根- 过氧化酶连接(streptavidin-perosidase,SP)二步法对60 例宫颈癌组织及癌旁组织进行免疫组织化学法检测,免疫荧光染色采用烟酸己可碱(上海恒远生物科技有限公司)和异硫氰酸荧光素(南京探求生物技术有限公司)混合染色,抗-AGGF1 一抗购自美国Santa Cruz公司。

1.3 结果判断

采用双盲法阅片,细胞中出现明显的绿色荧光为阳性细胞,着色点位于细胞核。细胞染色强度评分:0 分无染色,1 分弱染色,2 分中染色,3 分强染色。肿瘤细胞阳性率评分:1 分0~9%,2 分10%~25%,3 分26%~50%,4 分51%~100%。将染色强度评分和阳性细胞率评分的乘积作为该切片的评分值。设定评分0~4 分为阴性,>4 分为阳性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0 统计软件进行数据分析,计数资料以率表示,对AGGF1 在宫颈癌组织及癌旁组织的表达进行t检验。AGGF1 在宫颈癌组织中的表达与临床各病理指标的相关性用 χ2检验,用Kaplanmeier生存曲线和Cox比例风险回归模型进行生存分析,P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AGGF1 在宫颈癌组织及癌旁组织中的表达

60 例宫颈癌组织中33 例AGGF1 表达阳性,占55.0%。对宫颈癌组织及癌旁组织的免疫组织化学法检测结果进行t检验,分析发现AGGF1 在癌组织中的表达高于癌旁组织(P =0.035)。见图1、2。

2.2 AGGF1 表达与宫颈癌患者临床病理参数的相关性

AGGF1 表达与肿瘤大小、临床分期及血清癌抗原125(cancer antigen 125,CA125)相关。与患者年龄、淋巴结转移无关。见表1。

A:AGGF1在正常宫颈组织中表达;B:AGGF1在低级别鳞状上皮内病变的宫颈组织中表达;C:AGGF1在高级别鳞状上皮内病变的宫颈组织中表达;D:AGGF1在宫颈癌组织中表达

2.3 AGGF1 表达与患者预后的相关性

Kaplan-meier生存曲线显示,AGGF1 阳性患者术后生存期比AGGF1 阴性者短(P =0.004)(见图3)。单因素Cox比例风险回归模型分析发现,肿瘤大小、血清CA125、临床分期和AGGF1 表达为宫颈癌患者预后相关因素。应用多因素Cox比例风险回归分析对临床病理参数进行校正后,AGGF1 表达可作为宫颈癌患者术后生存的独立预测指标(见表2)。

3 讨论

持续性血管生成是原发性宫颈癌的主要特征之一,宫颈癌细胞的生长、侵袭及转移依赖于宫颈癌内血管的生成。肿瘤血管生成的主要原因和过程非常复杂,其中肿瘤细胞过量表达血管生成因子并以旁分泌的形势作用于内皮细胞是一条直接途径[5]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,AGGF1)基因被克隆后发现,VEGF可由肿瘤细胞表达和分泌,从而诱发肿瘤血管生成[6,7]。之后全球掀起肿瘤血管生成因子的研究热潮。

2004 年Tian等发现AGGF1 基因以来,AGGF1在心血管系统的生理功能进一步被揭示。Chen等[8]利用模式生物斑马鱼对AGGF1 在血管形成中的功能进行研究,发现AGGF1 在斑马鱼中可调控血管的形成和静脉的分化;Lu等[9]尝试利用AGGF1 基因对小鼠后肢缺血模型进行血管生成治疗,发现其能较好地改善缺血部位的血流供应;Hu等[10]发现AGGF1 可抑制血管炎症反应,改善血管内皮功能;Lei等[11]发现AGGF1 可监控斑马鱼血液细胞形成。本研究表明,AGGF1 能够促进血管的生成,并改善局部缺血功能,而这恰好为肿瘤的进一步生长、侵袭和转移提供条件,因此笔者可以大胆的猜测AGGF1 在促进宫颈癌的生长、转移和侵袭的过程中起重要作用。目前,本研究发现AGGF1 在宫颈癌组织的表达比癌旁组织高,与预期结果相符合。与此同时,本研究还发现AGGF1 表达高的宫颈癌患者预后较差。

综上所述,AGGF1 蛋白在宫颈癌组织中表达比癌旁组织高,并且AGGF1 可以作为一个独立指标评估和预测宫颈癌患者术后生存期。AGGF1 是潜在的抑制宫颈癌血管生成的分子靶点,能够为宫颈癌治疗提供新途径。

摘要：目的 探索人G补缀FHA域血管生成因子1(AGGF1)在宫颈癌中的表达及与宫颈癌患者预后的相关性。方法 对60例宫颈癌组织及癌旁组织进行AGGF1免疫组织化学法检测,并对其表达及与患者预后的相关性进行分析。结果 AGGF1在宫颈癌组织中的表达比癌旁组织高(P<0.05),Kaplan-meier曲线分析发现,AGGF1表达高的患者生存较差(P=0.004)。Cox回归模型分析发现,AGGF1可以作为独立指标预测宫颈癌患者术后生存。结论 宫颈癌患者AGGF1高表达预示预后较差,并且其可以作为一个独立因素来预测宫颈癌患者术后生存。

关键词：AGGF1,免疫组织化学法,宫颈癌,预后

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血管生成因子 篇6

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择2003- 05- 01至2006- 08- 31在南京医科大学附属第二医院东院妇产科住院行手术治疗的宫颈癌患者43例, 术前均无化疗、放疗及其他治疗史, 所有患者均无合并其他炎症疾病。选择同期在该院因CIN行宫颈锥切术的32例和因子宫肌瘤行子宫切除、术后经病理检查学证实为正常宫颈的43例作为对照。所有病例标本均经组织病理学检查确诊。

1.2 主要试剂

HIF- 1α鼠抗人单克隆抗体工作液、VEGF兔抗人单克隆抗体工作液、PV- 6000 (二步法) 免疫组化检测试剂、DAB显色试剂盒、CD34鼠抗人单克隆抗体工作液均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 实验方法

所有宫颈组织经石蜡包埋后备用。蜡块以4 μm连续切片, 采用PV- 6000二步法和免疫组化法, 分别作HIF- 1α、VEGF、CD34免疫组化染色和PBS空白对照染色。染色步骤按试剂盒说明书进行。

1.4 结果判定

HIF- 1α阳性表达部位主要在胞核, VEGF阳性表达部位主要在胞浆, 呈棕黄色颗粒状。阳性和阴性根据细胞染色强度和阳性细胞占总细胞数的百分比两者积分之和来判断。染色强度积分为:不染色, 0分;轻度染色, l分;中度染色, 2分;强染色, 3分。阳性细胞率积分为:10%～50%, 2分;51%～80%, 3分;>80%, 4分。然后将两种积分结合起来分为4级:无论染色强度如何, 细胞阳性率<10%为阴性;2～3分为弱阳性 (+) ;4～5分为中度阳性 (++) ;6～7分为强阳性 (+++) [5]。CD34主要定位于血管内皮细胞胞膜, 阳性者被染成棕色。参照Weidner等[6]的方法来进行微血管计数, 先在低倍镜下观察CD34染色阳性的血管, 确定血管密度最高处, 然后在200倍视野下选择4个不重复视野进行计数, 计算每例宫颈组织单位视野的平均血管数, 即MVD。

1.5 统计学分析

采用SPSS 10.0统计软件对HIF- 1α、VEGF的表达量进行t检验、 χ2检验、方差分析和Spearman等级相关分析。MVD结果用undefined表示。

2 结果

2.1 HIF- 1α、VEGF、MVD在各组中的表达

见表1。

注:括号内为百分率

2.2 HIF- 1α和VEGF表达的相关性

118例宫颈组织中, HIF- 1α和VEGF同时呈阳性表达的为28例, 同时呈阴性表达的为69例, HIF- 1α阳性表达而VEGF阴性表达的为10例, HIF- 1α阴性表达而VEGF阳性表达的为11例。经Spearman等级相关分析显示, HIF- 1α与VEGF在宫颈组织中的阳性表达程度呈正相关 (r=0.575, P<0.05) 。

2.2 HIF- 1α、VEGF表达和MVD值之间的相关性

HIF- 1α表达阳性的宫颈癌组织中, MVD值为56.6±5.3, HIF- 1α表达阴性的宫颈癌组织中, MVD值为43.9±4.4, 两者比较差异有显著性 (P<0.05) 。VEGF表达阳性的宫颈癌组织中, MVD值为57.6±4.7, VEGF表达阴性的宫颈癌组织中, MVD值为44.6±4.1, 两者比较差异也有显著性 (P<0.05) 。经相关分析显示, VEGF表达与MVD值也呈正相关 (r=0.625, P<0.05)

3 讨论

在肿瘤病理中, 细胞对缺氧的适应和血管生成是肿瘤发生发展的关键步骤。肿瘤的缺氧状态可诱导一系列促血管生成的多种细胞因子释放, 由此增进肿瘤的生长及转移。HIF- 1是缺氧条件下广泛存在于哺乳动物和人体内的一种异源二聚体转录因子, 参与哺乳动物细胞中缺氧诱导产生的特异应答, 在缺氧诱导的基因表达中起关键作用[7]。HIF- 1主要由HIF- 1α和HIF- 1β两个亚单位组成, HIF- 1α是唯一的氧调节亚单位, 决定HIF的活性[8], 其在肿瘤病理中的作用与地位[9]日益引起重视。血管生长在组织修复、炎症和恶性肿瘤这些生理与病理过程中起着至关重要的作用。VEGF是目前已知的重要的血管生成促进因子。研究表明, 缺氧微环境可诱导HIF- 1α表达, 从而调控VEGF的表达, 促进肿瘤新生血管形成, 由此增进肿瘤的生长及转移[10]。本实验结果显示, HIF- 1α、VEGF在正常宫颈组织、CIN和宫颈癌组织中的阳性表达率依次升高, 说明二者参与了宫颈癌的发生发展。MVD是衡量血管生成的定量指标。对多种人类肿瘤的研究显示, 采用对血管内皮细胞抗原的免疫组织化学技术染色进行微血管的定量测定 (即MVD) , 能准确反映肿瘤血管生成的情况。本研究结果显示, MVD在正常宫颈组织、CIN和宫颈癌组织中的表达也逐步升高, 说明血管形成与肿瘤的发生、进展密切相关。所以, 除临床分期、病理分级、淋巴转移这3个公认的预后因素外, 还可将肿瘤组织中MVD值作为一个重要的参考指标。本研究通过检测宫颈癌组织中HIF- 1α及VEGF表达阳性和表达阴性的MVD值, 发现它们无论是阳性表达还是阴性表达其MVD均存在显著差异, 而且HIF- 1α和VEGF表达呈正相关, 说明HIF- 1α可能通过诱导VEGF表达来促进宫颈癌血管形成, 进而促进宫颈癌的生长, 推测HIF- 1α、VEGF可能与宫颈癌的发生、发展相关。因此, HIF- 1α可作为宫颈癌早期检测新指标, 并以其为靶点进行治疗, 为宫颈癌治疗提供新的思路。

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血管生成因子 篇7

关键词：持续血液净化,外伤,脓毒症,炎症因子

脓毒症是严重外伤常见并发症类型之一,其病情进展迅速,如不及时控制可导致全身炎症反应综合征、多器官功能障碍(multiple organs dysfunction syndrome,MODS),严重威胁患者生命安全;流行病学报道显示,腹部外伤继发脓毒症患者死亡率高达35%~40%[1]。而免疫功能失调与异常炎症反应在脓毒症患者MODS发生发展过程中的关键作用已被广泛认可[2,3]。如何有效控制脓毒症患者炎症反应水平,改善预后已成为医学界关注的热点之一。本次研究选取外伤继发性脓毒症90例,分别采用常规对症支持和在此基础上加用持续血液净化疗法,比较两组患者临床疗效,28 d内死亡率,治疗前后A-PACHE II评分和炎症因子水平,探讨持续血液净化疗法治疗外伤继发性脓毒症临床效果及对高迁移率族蛋白1(high mobility group protein-1,HMG-1)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和促血管生长素2(angiopoietin-2,Ang-2)的影响。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取我院2011年7月-2014年5月收治外伤继发性脓毒症90例,采用随机数字表法分为对照组和试验组,每组各45例;对照组患者中男性31例,女性14例,年龄32~71岁,平均(54.80±7.15)岁;试验组患者中男性28例,女性17例,年龄34~72岁,平均(54.93±7.19)岁。两组患者一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.1.1 纳入标准

①经CT检查及腹腔穿刺确诊为闭合性腹部外伤[4];②符合美国胸科医师协会与危重病医学会委员会标准脓毒症诊断标准[5];③研究方案经医院伦理委员会批准;④患者家属签署知情同意书,自愿加入研究。

1.1.2 排除标准

①自身免疫性疾病;②恶性肿瘤;③血液系统疾病。

1.2 治疗方法

对照组患者采用常规对症支持治疗,包括早期液体复苏,乌司他丁静脉滴注、血糖控制及糖皮质激素应用等;试验组患者则在对照组治疗基础上加用持续血液净化疗法,血液净化机器为瑞典金宝公司Prisma CRRT机,透析膜滤过分子量为50 kD,置换液剂量7~8 L/h,9~10 h/次,1次/d,直至机体血流动力学指标恢复正常。

1.3 观察指标

①记录患者28 d内死亡例数,计算死亡率;②病情预后评估采用APACHE(急性生理学及慢性健康状况评分系统)II评分;③炎症因子水平检测指标包括HMG-1、TNF-α及Ang-2;其中HMG-1和TNF-α检测采用酶联免疫吸附法,而Ang-2检测采用免疫电发光法。

1.4 疗效评价标准

①治愈,发热、寒战、心率呼吸加速及尿量减少等临床症状消失,白细胞计数分类、血清C反应蛋白及降钙素原等实验室检查指标恢复正常,且创伤部位愈合;②好转,临床症状消失,但创伤部位尚未愈合;③无效,未达到上述标准。总有效率=[(治愈例数+好转例数)/总例数]×100%[6]。

1.5 统计学处理

本次研究数据录入分析软件分别采用Epidata3.09和SPSS19.0;其中计量资料采用t检验,以均数±标准差(±s)表示;计数资料采用χ2检验,以百分比(%)表示;P<0.05判定为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者临床疗效比较

试验组患者临床疗效显著优于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);见表1。

2.2 两组患者28 d内死亡率比较

对照组和试验组患者28 d内死亡率分别为31.11%(14/45)和17.78%(8/45);试验组患者28 d内死亡率显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 两组患者治疗前后APACHE II评分比较

两组患者治疗后APACHEII评分显著低于治疗前,且试验组患者治疗后APACHEII评分低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);见表2。

注:1)与对照组比较,P<0.05;2)与治疗前比较,P<0.05

2.4 两组患者治疗前后炎症因子水平比较

两组患者治疗后HMG-1、TNF-α及Ang-2等炎症因子水平显著低于治疗前,且试验组患者治疗后各项指标水平低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);见表3。

注:1)与对照组比较,P<0.05;2)与治疗前比较,P<0.05

3 讨论

持续血液净化疗法能够有效清除致炎细胞因子,降低炎症介质水平,从而阻断全身炎症瀑布反应;而其对于机体抗炎细胞因子水平降低作用亦有助于保持机体对内毒素血症和菌血症免疫活性[7,8]。同时持续血液净化还可等渗清除溶质,减少细胞外液容量变化,从而有效维持循环系统稳定性[9]。近年来持续血液净化认识已从单纯炎性介质被动清除,转变为主动调节机体免疫系统功能。

本次研究结果中试验组患者临床疗效和28 d内死亡率均显著优于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),提示持续血液净化疗法治疗外伤继发性脓毒症在改善临床近远期疗效方面具有优势;试验组患者治疗后APACHEII评分显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),说明持续血液净化有助于改善外伤继发性脓毒症患者预后;APACHEⅡ评分是目前公认内科危重症疾病病情及预后评估主要指标,已有研究显示,APACHE分值与病死率之间呈正相关关系,即分值越高,病死率亦越高;其病死率预测正确率可达85%~90%[10]。试验组患者治疗后HMG-1、TNF-α及Ang-2等炎症因子水平显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),则证实通过持续血液净化可有效降低外伤继发性脓毒症患者机体炎症因子水平,调节免疫系统功能;HMG-1是含量最丰富HMG蛋白,每10~15个核小体即可含有1个HMG-1分子,内含219个氨基酸残基,分子质量约为30 k D;其广泛分布于心脑肝肾及淋巴结组织中,并主要定位于胞核。因分子量小于50 k D,HMG-1可经血液净化治疗中对流或吸附机制清除。已有研究显示HMG-1可反映脓毒症晚期炎性反应水平,具有刺激巨噬细胞和单核细胞游离至细胞外,活化细胞核内DNA结合蛋白等促炎作用;而这一作用机制已被证实与TNF-α释放关系密切,即TNF-α作为上游因子调节HMG-2水平[11,12]。TNF-α是一种主要由LPS、IFN-γ、M-CSF及GM-CSF等刺激单核巨噬细胞而分泌的炎性因子;其内含157个氨基酸残基,分子量约为17 k D;因分子量小于50 k D,血液净化治疗中对流或吸附机制均可有效清除TNF-α。TNF-α在机体内可发挥免疫调节、炎症反应刺激等生物学活性,属于炎症早期关键和诱发炎症因子;动物实验显示,TNF-α可在脓毒症发生发展过程中发挥炎性细胞诱导和促进其他细胞因子合成和释放作用[13,14]。Ang-2由496个氨基酸残基组成,分子量为68 k D;其主要分布于卵巢、子宫和胎盘,与Ang-1同源性约为60%。因分子量大于50 k D,Ang-2主要经血液净化治疗中对流机制清除。国外研究显示,脓毒症患者体内Ang-2水平显著升高,与预后具有一定相关性[15]。连续性血液净化能够有效降低早晚期炎性介质水平,多环节拮抗机体级联炎症反应,并保证内环境相对稳定性,这可能是其改善外伤继发性脓毒症患者近远期疗效的主要机制。