促血管生成因子（精选7篇）
促血管生成因子 篇1
摘要：目的 探讨持续血液净化疗法治疗外伤继发性脓毒症临床效果及高迁移率族蛋白1(HMG-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和促血管生成素2(Ang-2)的影响。方法 选取外伤继发性脓毒症90例,以随机数字表法分为对照组(45例)和试验组(45例);其中对照组患者采用常规对症支持治疗,试验组患者则在对照组治疗基础上加用持续血液净化疗法;比较两组患者临床疗效,28 d内死亡率,治疗前后APACHE II评分和HMG-1、TNF-α及Ang-2等炎症因子水平。结果 试验组患者临床疗效显著优于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);试验组患者28 d内死亡率显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);两组患者治疗后APACHEII评分和炎症因子水平显著低于治疗前,且试验组患者治疗后各项指标水平低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 持续血液净化疗法治疗外伤继发性脓毒症可有效缓解临床症状,降低病死率和炎症因子水平,对于改善预后具有重要意义。
关键词：持续血液净化,外伤,脓毒症,炎症因子
脓毒症是严重外伤常见并发症类型之一,其病情进展迅速,如不及时控制可导致全身炎症反应综合征、多器官功能障碍(multiple organs dysfunction syndrome,MODS),严重威胁患者生命安全;流行病学报道显示,腹部外伤继发脓毒症患者死亡率高达35%~40%[1]。而免疫功能失调与异常炎症反应在脓毒症患者MODS发生发展过程中的关键作用已被广泛认可[2,3]。如何有效控制脓毒症患者炎症反应水平,改善预后已成为医学界关注的热点之一。本次研究选取外伤继发性脓毒症90例,分别采用常规对症支持和在此基础上加用持续血液净化疗法,比较两组患者临床疗效,28 d内死亡率,治疗前后A-PACHE II评分和炎症因子水平,探讨持续血液净化疗法治疗外伤继发性脓毒症临床效果及对高迁移率族蛋白1(high mobility group protein-1,HMG-1)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和促血管生长素2(angiopoietin-2,Ang-2)的影响。
1 资料与方法
1.1 临床资料
选取我院2011年7月-2014年5月收治外伤继发性脓毒症90例,采用随机数字表法分为对照组和试验组,每组各45例;对照组患者中男性31例,女性14例,年龄32~71岁,平均(54.80±7.15)岁;试验组患者中男性28例,女性17例,年龄34~72岁,平均(54.93±7.19)岁。两组患者一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。
1.1.1 纳入标准
①经CT检查及腹腔穿刺确诊为闭合性腹部外伤[4];②符合美国胸科医师协会与危重病医学会委员会标准脓毒症诊断标准[5];③研究方案经医院伦理委员会批准;④患者家属签署知情同意书,自愿加入研究。
1.1.2 排除标准
①自身免疫性疾病;②恶性肿瘤;③血液系统疾病。
1.2 治疗方法
对照组患者采用常规对症支持治疗,包括早期液体复苏,乌司他丁静脉滴注、血糖控制及糖皮质激素应用等;试验组患者则在对照组治疗基础上加用持续血液净化疗法,血液净化机器为瑞典金宝公司Prisma CRRT机,透析膜滤过分子量为50 kD,置换液剂量7~8 L/h,9~10 h/次,1次/d,直至机体血流动力学指标恢复正常。
1.3 观察指标
①记录患者28 d内死亡例数,计算死亡率;②病情预后评估采用APACHE(急性生理学及慢性健康状况评分系统)II评分;③炎症因子水平检测指标包括HMG-1、TNF-α及Ang-2;其中HMG-1和TNF-α检测采用酶联免疫吸附法,而Ang-2检测采用免疫电发光法。
1.4 疗效评价标准
①治愈,发热、寒战、心率呼吸加速及尿量减少等临床症状消失,白细胞计数分类、血清C反应蛋白及降钙素原等实验室检查指标恢复正常,且创伤部位愈合;②好转,临床症状消失,但创伤部位尚未愈合;③无效,未达到上述标准。总有效率=[(治愈例数+好转例数)/总例数]×100%[6]。
1.5 统计学处理
本次研究数据录入分析软件分别采用Epidata3.09和SPSS19.0;其中计量资料采用t检验,以均数±标准差(±s)表示;计数资料采用χ2检验,以百分比(%)表示;P<0.05判定为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组患者临床疗效比较
试验组患者临床疗效显著优于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);见表1。
2.2 两组患者28 d内死亡率比较
对照组和试验组患者28 d内死亡率分别为31.11%(14/45)和17.78%(8/45);试验组患者28 d内死亡率显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。
2.3 两组患者治疗前后APACHE II评分比较
两组患者治疗后APACHEII评分显著低于治疗前,且试验组患者治疗后APACHEII评分低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);见表2。
注:1)与对照组比较,P<0.05;2)与治疗前比较,P<0.05
2.4 两组患者治疗前后炎症因子水平比较
两组患者治疗后HMG-1、TNF-α及Ang-2等炎症因子水平显著低于治疗前,且试验组患者治疗后各项指标水平低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);见表3。
注:1)与对照组比较,P<0.05;2)与治疗前比较,P<0.05
3 讨论
持续血液净化疗法能够有效清除致炎细胞因子,降低炎症介质水平,从而阻断全身炎症瀑布反应;而其对于机体抗炎细胞因子水平降低作用亦有助于保持机体对内毒素血症和菌血症免疫活性[7,8]。同时持续血液净化还可等渗清除溶质,减少细胞外液容量变化,从而有效维持循环系统稳定性[9]。近年来持续血液净化认识已从单纯炎性介质被动清除,转变为主动调节机体免疫系统功能。
本次研究结果中试验组患者临床疗效和28 d内死亡率均显著优于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),提示持续血液净化疗法治疗外伤继发性脓毒症在改善临床近远期疗效方面具有优势;试验组患者治疗后APACHEII评分显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),说明持续血液净化有助于改善外伤继发性脓毒症患者预后;APACHEⅡ评分是目前公认内科危重症疾病病情及预后评估主要指标,已有研究显示,APACHE分值与病死率之间呈正相关关系,即分值越高,病死率亦越高;其病死率预测正确率可达85%~90%[10]。试验组患者治疗后HMG-1、TNF-α及Ang-2等炎症因子水平显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),则证实通过持续血液净化可有效降低外伤继发性脓毒症患者机体炎症因子水平,调节免疫系统功能;HMG-1是含量最丰富HMG蛋白,每10~15个核小体即可含有1个HMG-1分子,内含219个氨基酸残基,分子质量约为30 k D;其广泛分布于心脑肝肾及淋巴结组织中,并主要定位于胞核。因分子量小于50 k D,HMG-1可经血液净化治疗中对流或吸附机制清除。已有研究显示HMG-1可反映脓毒症晚期炎性反应水平,具有刺激巨噬细胞和单核细胞游离至细胞外,活化细胞核内DNA结合蛋白等促炎作用;而这一作用机制已被证实与TNF-α释放关系密切,即TNF-α作为上游因子调节HMG-2水平[11,12]。TNF-α是一种主要由LPS、IFN-γ、M-CSF及GM-CSF等刺激单核巨噬细胞而分泌的炎性因子;其内含157个氨基酸残基,分子量约为17 k D;因分子量小于50 k D,血液净化治疗中对流或吸附机制均可有效清除TNF-α。TNF-α在机体内可发挥免疫调节、炎症反应刺激等生物学活性,属于炎症早期关键和诱发炎症因子;动物实验显示,TNF-α可在脓毒症发生发展过程中发挥炎性细胞诱导和促进其他细胞因子合成和释放作用[13,14]。Ang-2由496个氨基酸残基组成,分子量为68 k D;其主要分布于卵巢、子宫和胎盘,与Ang-1同源性约为60%。因分子量大于50 k D,Ang-2主要经血液净化治疗中对流机制清除。国外研究显示,脓毒症患者体内Ang-2水平显著升高,与预后具有一定相关性[15]。连续性血液净化能够有效降低早晚期炎性介质水平,多环节拮抗机体级联炎症反应,并保证内环境相对稳定性,这可能是其改善外伤继发性脓毒症患者近远期疗效的主要机制。
综上所述,持续血液净化疗法治疗外伤继发性脓毒症可有效缓解临床症状,降低病死率和炎症因子水平,对于改善预后具有重要意义。
促血管生成因子 篇2
1 VEGF和VEGFR家族
血管内皮生长因子 (VEGF) 是一种具有肝素结合活性的高度糖基化的碱性蛋白, 是由两个分子量为23KD的亚基组成的二聚体。人VEGF基因由8个外显子和7个内含子交替构成, 定位于染色体6p21.3上。其家庭成员还包括:胎盘生长因子 (placental growth factor, PLGF) 、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D。
VEGF通过与自身受体结合, 诱发一系列信号转导机制, 发挥生物学效应, VEGF受体VEGFR为酪氨酸激酶受体, 其信号转导与酪氨酸激酶的级联反应有关。目前发现的主要受体有VEGFR-1 (Flt-1) 、VEGFR-2 (KDR) 、VEGFR-3 (Flt-4) 3种。VEGF使血管细胞分裂、增殖、通透性增加主要通过KDR介导;Flt-1的表达与胚胎早期血管形成和伤口愈合有关;Flt-4仅与VEGF-C、D结合, 与淋巴侵袭和淋巴结转移有关。VEGFR家族还包括神经纤维网蛋白-1 (Neuropilin-1, np-1) 和神经纤维网蛋白-2 (np-2) [3]。
2 NSCLC的VEGF表达的临床意义
新生的肿瘤血管是肿瘤增殖的基本条件, 也是癌细胞浸润和血行转移的第一路径。VEGF的靶细胞是血管内皮细胞通过与之特异性结合增强血管通透性, 刺激血管内皮细胞增殖, 促进血管内物质的渗出, 抑制内皮细胞凋亡, 激活蛋白酶致使细胞外基质降解, 利于新生细胞生长及延伸, 为内皮细胞迁移和肿瘤细胞的转移提供形态学基础[4]。VEGF在肿瘤发展过程中全程表达[2], 其在肺癌组织中表达水平与原发肿瘤大小、癌细胞分化程度、淋巴结和远处转移状态、治疗反应、预后等有密切关系, 但与患者性别、年龄及肿瘤分期没有明显相关性[5]。
3 VEGF在NSCLC治疗中的研究
抗肿瘤新生血管的靶点是血管内皮细胞, 其基因相对稳定, 不易突变, 不易出现耐药株, 所以目前针对VEGF的靶向药物受到重视, 目前开发并进入临床研究的药物主要有以下几种。
3.1 VEGF单克隆抗体
目前应用于肺癌临床的贝伐单抗是一种重组人源化单克隆lgG抗体, 半衰期17～21d, 分子量149KD。贝伐单抗主要是通过与VEGF竞争性结合, 阻止、减弱VEGF与KDR的结合, 从而抑制内皮细胞增殖, 减少新生血管形成。同时, 贝伐单抗可使肿瘤及周围组织的血管分布正常化, 降低肿瘤组织间质压, 利于化疗药物的传递。临床试验证明, 化疗方案联合贝伐单抗治疗对晚期NSCLC患者的治疗反应率、存活期、无疾病进展生存期 (PFS) 均有明显增加。美国东部肿瘤协作组的Ⅲ期临床试验 (ECOG4599) 表明, 环磷酰胺+顺铂方案 (CP) +贝伐单抗方案较CP方案, 中位生存期延长2.3个月, PFS延长25%[6]。GP+贝伐单抗方案的Ⅲ期临床试验 (AVAIL) 显示贝伐单抗联合治疗晚期NSCLC提高了缓解率、延长pfs[7]贝伐单抗最严重的不良反应是肺部致命性大出血, 还引起血栓形成、蛋白尿、心脏毒性等毒副反应。以铂类药物为基础的化疗方案联合贝伐单抗可用于晚期非鳞状NSCLC患者的一线治疗;CP+贝伐单抗方案可作为不可切除、局部进展、复发或转移性的非鳞状的NSCLC患者的初始化疗方案[8]。贝伐单抗的推荐用药剂量为5～15mg/kg, 每3周给药1次。
3.2 VEGF抑制因子
血管内皮抑制素 (Endosta-tin, ES) 是目前被认为作用最强、效果最好、最广谱的肿瘤生成抑制剂。现用于临床的为重组人内皮抑素 (Endostar) , 商品名恩度 (rh-endostain, YH-16) 。ES通过特异性作用于新生血管的内皮细胞, 抑制细胞迁移, 诱导其凋亡, 阻碍VEGF诱导的新生内皮细胞管状结构的形成并破坏已经存在的结构, 抑制KDR酪氨酸磷酸化和细胞外信号调节激酶的活性并下调KDR的表达, 多靶点抑制血管生成。恩度联合去甲长春花碱+顺铂方案 (NP) 治疗晚期NSCLC的Ⅲ期临床研究结果:NP+YH-16方案与NP方案比较, 有效率增加15.9%、中位肿瘤进展时间延长2.7个月、临床获益率提高9.3%。恩度不增加化疗的毒副反应, 但可能会增加患者心律失常发生的几率, 使用时需严密监测[9]。作为NSCLC的一线用药, 恩度可以联合以铂类为基础的所有化疗方案, 临床常规使用剂量为7.5mg/㎡, 连用14d, 休息7d。
3.3 VEGF Trap
VEGF Trap (aflibercept) 是一种可溶性重组蛋白。VEGF Trap与VEGF-A的所有亚型具有高度亲和力, 这种亲和力是抗VEGF单克隆抗体亲和力的100～1 000倍。除VEGF-A外, VEGF Trap还可以与PIGF和VEGF-B结合。VEGF Trap通过结合和钝化血液循环的VEGF, 在血液中形成一种稳定的复合物而发挥作用。VEGF Trap治疗晚期NSCLC的Ⅰ、Ⅱ期临床试验显示其耐受良好, 严重不良反应少[10]。与化疗药物合用的Ⅲ期临床试验正在进行中。
3.4 酪氨酸激酶抑制剂
目前被美国FDA批准临床应用的酪氨酸激酶抑制剂有索拉非尼 (Sorafenib) 、舒尼替尼 (Sunitinib) 。索拉非尼为多靶点激酶抑制剂, 主要靶点为Raf、Kit、Fit-3、KDR、Flt-4和PDGFR-β。临床试验结果表明, 索拉非尼单药对晚期NSCLC患者有益, 但联合化疗不改善患者生存[11]。舒尼替尼是靶向于VEGFR-1、2、3、c-Kit, Ⅱ期临床试验证明作为二线药物治疗非小细胞肺癌具有较好疗效[12], Ⅲ期临床试验正在进行中。
4 展望
化疗在NSCLC的治疗中已经进入一个“平台靶分子治疗为肿瘤的治疗提供的一个全新的思路, 临床研究也确定了贝伐单抗联合化疗作为一线治疗的地位, 但在具体的临床使用中还存在问题, 如怎样增加靶向药物的特异性和针对性, 提高靶向药物的疗效;治疗方案如何选择能够真正实现患者治疗的个体化。目前三代化疗药+铂类仍为一线方案对治疗模式的变更需要进一步的研究
促血管生成因子 篇3
1 肿瘤血管生成的生理基础
1971年Folkman提出“肿瘤的生长及扩散依赖血管生成”这一概念,认为肿瘤的生长可分为无血管期及血管期。当瘤体<1 mm3,肿瘤聚集体可通过组织间弥散作用获得营养、氧气并转移代谢废物;而当体积>1 mm3,瘤体便无法仅依靠弥散作用获得维持生长所需的物质,维持局部微环境稳态,此时血管新生就显得尤为重要,若无新生血管向瘤体内长入,肿瘤便无法继续增长,甚至发生沉默或退化[1]。
通常对哺乳动物而言,除雌性生理周期外,血管系统在健康成年动物体内呈静止状态,而仅在外伤、肿瘤等特殊病理条件下,血管新生才被激活。基于这一规律,Hanahan等[2]提出“血管生成开关(angiogenic switch)”假说,认为血管新生过程受到血管生成诱导因子与抑制因子的“开关”调控,只有当诱导因子上调或抑制因子下调时,这一“开关”被激活,肿瘤血管新生才得以进行。
2 促血管生成相关因子
血管生成过程受多种促血管生长因子的调控,包括血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,b FGF)、血管生成素(angiopoietin,ANGPT)、环氧化酶(cyclooxygenase,COX)、血小板源性生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、survivin蛋白等。本文就相对重要的因子进行概述。
2.1 VEGF
VEGF是一类对内皮细胞具有高度特异性作用,在胚胎形成及人体正常生长发育过程中影响血管生成的重要因子,为心血管系统的正常构建奠定了基础[3]。通常在脉管系统形成后,VEGF在正常组织内低表达,而在实性肿瘤及部分造血源性肿瘤中过表达,且对于口腔鳞癌、乳腺癌、结肠癌、食管癌等恶性肿瘤,VEGF是评价其预后的重要指标[4]。其主要功能包括:(1)促进血管内皮及淋巴管内皮细胞的增殖;(2)调节血管通透性;(3)舒张血管;(4)对神经细胞、肺上皮细胞、心肌细胞等的营养作用[3]。
现阶段研究认为,VEGF与口腔鳞癌进展及转移关系密切。Kukreja等[5]发现,口腔鳞癌癌巢及瘤内上皮均可见VEGF表达,且表达水平与肿瘤病理分期呈正相关,同时癌组织中微血管密度(microvessel density,MVD)较正常组织及癌前病变显著升高。Sales等[6]发现,原发灶及癌周组织内VEGF-A及其m RNA表达显著高于正常组织,同时其在癌周组织中的表达明显高于原发灶,病变组织内VEGF-A表达水平与病变大小及淋巴结转移程度呈正相关,认为VEGF-A与口腔鳞癌转移相关,癌周组织参与了VEGF-A的生成。
2.2 ANGPT
ANGPT属于分泌型低聚糖蛋白,包含Ang-1、Ang-2、Ang-3、Ang-4四种亚型,其中以Ang-2与肿瘤血管生成关系最为密切。Ang-2由血管内皮细胞产生,作为酪氨酸激酶受体-2(tyrosine kinase receptor-2,Tie-2)部分激动剂,过表达的Ang-2可与Ang-1竞争结合Tie-2,抑制由Ang-1诱导的PI3K、Akt、Grb2等信号通路,降低血管基底膜的稳定性,抑制血管内皮细胞及管周细胞的相互作用及血管的自我修复作用[7],为口腔鳞癌血管新生创造条件。
Li等[8,9]发现,癌组织内MVD较正常及癌周组织明显升高,而血管成熟度明显降低,MVD及血管成熟度与Ang-2表达水平显著相关,认为Ang-2与口腔鳞癌内血管生成及成熟关系密切;并进一步发现,过表达的Ang-2可诱导TCA8113舌癌细胞产生波形蛋白并抑制黏钙素的表达,提高肿瘤细胞的迁移及局部浸润能力,同时Ang-2可诱导肿瘤细胞表达VEGF,促进瘤体内血管生成。梁博[10]发现,鳞癌组织内MVD显著高于正常组织,且Ang-2及其m RNA表达明显增高,Ang-2表达水平与MVD呈正相关,认为Ang-2是口腔鳞癌的血管生成的影响因子。
2.3 b FGF
b FGF在机体的创伤修复及血管生成中具有重要作用[11]。作为成纤维细胞生长因子成员之一,其几乎在所有细胞皆有表达,经与内皮细胞表面的酪氨酸激酶FGF受体-1/2(tyrosine kinase FGF receptor-1/2,TK-FGFR-1/2)、肝素硫酸蛋白多糖等结合后,可促进内皮细胞的增殖及迁移,诱导内皮细胞在基底膜上的改组并形成管腔样结构[12],同时可激活VEGF/VEGFR系统,协同促进肿瘤及胚胎的血管生成[11]。
大量研究表明,b FGF与口腔鳞癌转移关系密切。He[13]发现,口腔鳞癌内b FGF含量显著高于正常组织,其表达水平与瘤体内MVD呈正相关,与患者的年龄、病理分期、淋巴结转移程度关系密切。Hase等[14]发现,约67%的口腔鳞癌病例中,b FGF/FGFR1可见明显表达,其表达强度与肿瘤局部侵袭及淋巴结转移率呈正相关,认为b FGF/FGFR1的表达水平与口腔鳞癌浸润转移有关,是口腔鳞癌预后评估的依据。
2.4 MMPs
MMPs是一类Zn2+依赖的蛋白水解酶家族,根据作用底物的不同,MMPs可分为六类:胶原酶(collagenases)、基质溶解酶(matrilysins)、明胶酶(gelatinases)、膜基质金属蛋白酶(membrane-type MMPs)、间质溶解素(stromelysin)及其他基质金属蛋白酶。其作用主要包括:肿瘤细胞通过自分泌及释放VEGF等因子刺激内皮细胞产生MMPs,MMPs选择性作用于细胞外基质及血管基底膜,提高血管的通透性,协助肿瘤细胞迁移及扩散;同时为内皮细胞经血管间隙向血管外的出芽迁移,形成新生血管网提供条件[15]。
研究表明,MMP-2、MMP-9与口腔鳞癌血管生成关系密切[15]。Andishehtadbir等[16]发现,MMP-9在口腔鳞癌组织内高表达,且表达率与瘤内MVD呈正相关,认为MMP-9可促进口腔鳞癌血管生成。张壮等[17]发现,口腔鳞癌中MMP-2表达量与MVD呈正相关,且MMP-2、MVD与肿瘤大小及淋巴结转移程度呈正相关,认为MMPs可通过影响肿瘤血管生成促进肿瘤的发展及转移。Mishev等[18]发现,在口腔鳞癌进展的各阶段,瘤内MMP-2及MMP-9表达水平相对稳定,而MMP-7、MMP-13随肿瘤进展表达逐步下调,且其在癌组织的侵袭前沿及高度恶性区亦可见明显下调,认为MMPs表达水平可以帮助明确口腔鳞癌发展进程,并为预后评估提供依据。
2.5 COX
COX即前列腺素内过氧化物合成酶,是前列腺素合成过程中的重要限速酶,其作用在于将花生四烯酸代谢成为各种前列腺素产物,参与机体病理及生理过程。环氧化酶存在两种同功酶:COX-1及COX-2,其中COX-1作为结构酶,通常被认为仅参与调节机体正常的生理过程[19];COX-2作为诱导酶,主要表达于炎症、损伤及肿瘤组织,可影响局部微血管的生成,与口腔鳞癌的发生、发展及转移存在密切联系[20]。
Santoro等[20]发现,在口腔鳞癌组织中,COX-2的平均表达率呈高表达趋势,且与瘤内MVD呈正相关,认为癌细胞可高表达COX-2,促进瘤体内微血管生成及肿瘤细胞的局部浸润。Byatnal等[21]发现,口腔癌组织内均可见COX-2表达,且表达水平与淋巴结转移率、病变组织病理分期呈正相关,认为COX-2可作为评估肿瘤进展程度及患者预后的生物指标。
3 血管生成抑制因子
血管生成抑制因子与促血管生成因子的平衡是血管系统稳定的关键因素,目前发现的血管生成抑制因子包括血管抑素(angiostatin,AS)、内皮抑素(endo statin,ES)、白细胞介素、血小板反应素等,其中以AS、ES最为重要。
3.1 AS
AS是一种具有抗肿瘤潜力的血管生成抑制因子,在正常生理状态下并不表达,仅在肿瘤等疾病过程中,其可由MMPs及尿激酶降解血浆纤维蛋白溶酶(plasminogen,Pgn)形成,是一种可溶性的内肽片段[22]。作为Pgn的降解产物,AS包含Pgn的前四个Kringle片段,其中Kringle1-3可抑制内皮细胞的增殖,Kringle-4可抑制内皮细胞的迁移,因此AS的生物活性被认为是由多个Kringle片段联合作用的结果[23]。目前AS与口腔鳞癌之间的研究报道甚少。刘志刚[24]将AS注射至皮下舌癌TCA811后发现,瘤体内细胞凋亡指数和MVD、VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2蛋白及m RNA表达量明显下调,并在一定浓度范围内呈现剂量依赖性。认为AS可通过抑制VEGF/VEGFR系统抑制舌癌血管生成。
3.2 ES
ES是第一个被发现具有血管生成调控作用的细胞外基质蛋白,是胶原蛋白ⅩⅧ经MMPs等水解作用所形成的C-末端非胶原区的氨基酸片段。其通过抑制b FGF、VEGF-R2/KDR/Flk-1、整合素-α5β1等信号通路,抑制MMP-2/9/13等MMPs的活性,进而抑制内皮细胞的迁移;同时ES可通过下调细胞周期蛋白D1、细胞凋亡抑制基因、细胞周期调控基因、黏附斑激酶等基因的表达,抑制内皮细胞的增殖[25,26]。
研究表明,ES可影响口腔鳞癌组织中血管生成,并一定程度抑制肿瘤的局部侵袭。李刚等[27]发现,口腔鳞癌组织中ES表达率较正常组织高,且癌组织中ES阳性组的MVD低于阴性组。Alahuhta等[28]通过转染舌癌HSC-3细胞,使其过表达ES,发现ES可以抑制HSC-3细胞在3D胶原纤维模型中的局部侵袭。Hebert等[29]发现,口腔鳞癌细胞经ES处理后,VEGF及胶原蛋白ⅩⅧ表达下调,同时ES可抑制癌细胞的迁移,抑制强度与ES浓度呈正相关,认为ES具有一定的抗肿瘤侵袭潜能。
4 小结
肿瘤放化疗在临床治疗口腔鳞癌的过程中获得了不可否定的疗效,在缩小原发灶的基础上为术后局部组织缺损修复提供了有效的支持,并为患者预后奠定了良好的基础。但肿瘤的放化疗具有明显的非特异性,毒副作用明显,在杀伤肿瘤细胞的同时,对正常的组织、器官造成不同程度的损伤,部分患者在治疗过程中常出现严重的骨髓抑制、胃肠道刺激等不良反应,常常使综合序列治疗无法达到预期的效果。抗肿瘤血管生成作为一种新兴的治疗方法,具有较强的特异性,可在肿瘤发生早期破坏肿瘤微环境稳态,阻碍肿瘤的正常生长,同时在一定程度上限制肿瘤向癌周正常组织的侵袭及全身远处转移,为口腔鳞癌的综合序列治疗拓宽了思路,有望成为口腔鳞癌靶向治疗的重要途径。
摘要：肿瘤的发展及转移与血管生成关系密切,当肿瘤生长至一定程度,在多种因子的调节作用下,瘤体通过血管新生从宿主获取生长所需的营养及氧气,转运代谢产物,同时新生血管在一定程度上为肿瘤细胞的转移及扩散创造了条件。近年来,随着肿瘤与血管生成之间研究的不断深入,以抗血管生成为靶点的口腔鳞癌综合序列治疗日益引起重视。本文就影响血管生成的相关因子在口腔鳞癌中的研究现状进行综述。
促血管生成因子 篇4
1 材料与方法
1.1 材料
清洁级Wistar雄性大鼠110只,体重220～270克,由中国医科大学实验动物部提供。rhEPO为沈阳三生制药股份公司生产。原位末端标记检测(TUNEL)试剂盒,兔抗鼠NGF、BDNF多克隆抗体,SABC试剂盒及DAB显色试剂盒(博士德);鼠脑立体定位仪(日本)。
1.2 方法
1.2.1 分组
110只大鼠随机分成四组:正常组(5只)、假手术组、ICH对照组、rhEPO治疗组,后3组分为6h、12h、24h、48h、72h、120h、168h 7个亚组,每组5只。
1.2.2 ICH模型制备:
参照Xue[1]的方法制备大鼠ICH模型。大鼠称重后给予10%水合氯醛腹腔注射麻醉(300mg/kg),随后脑立体定位仪上固定,沿头皮正中切开长约10mm纵切口,钝性分离暴露前囟,微型手钻于定位处钻直径0.5mm小孔,用微量注射仪取大鼠自体不凝血50ul,注入大鼠尾状核,以20ul/min速度注入。术后留针5min,缓慢退针,缝合切口。假手术组除不注血外,其余步骤同上。术后5min治疗组給予rhEPO(3000UI/Kg,用生理盐水稀释成0.5mL)腹腔注射。模型组及假手术组术后相应时间给予生理盐水0.5mL腹腔注射。正常组大鼠不予手术及给药。
1.3 统计学处理
采用统计软件SPSS13.0处理数据,所有结果用均数±标准差undefined表示,两样本比较用t检验,多样本比较用LSD-t检验,P<0.05为显著性差异。
2 结果
2.1 各组大鼠TUNEL阳性细胞数的比较,见表1。
2.2 各组大鼠NGF阳性细胞表达的比较,见表2。
2.3 各组大鼠BDNF阳性细胞表达的比较,见表3。
3 讨论
本实验结果显示,和模型组相比EPO的使用可大大减少48～168 h TUNE阳性细胞数,改善脑出血大鼠的神经功能缺损症状(P<0.05)。治疗作用主要表现在48 h后,而6 h、24h大鼠的神经功能缺损症状无明显改善(P>0.05)。TUNEL染色阳性凋亡细胞在ICH后6h出现,24h后逐渐增多,72h达高峰,之后下降,但168h仍高于假手术组,提示细胞凋亡存在于出血灶周围脑组织损伤的过程,并可引起ICH后的神经元脱失。TUNEL染色显示,出血侧脑组织中的凋亡细胞大部分为神经元,少部分是星形胶质细胞及血管内皮,并特异性分布于血肿内部及周边区域,表明在出血性脑损伤中神经元比胶质细胞更易受损,内皮细胞凋亡可能是导致血脑屏障破坏及血管源性脑水肿的原因之一,与国外相关报道基本一致[2]。给与rhEPO治疗的ICH大鼠与ICH对照组比较,血肿周围的凋亡细胞数明显减少,提示rhEPO对出血后的脑损伤有抑制凋亡,减轻脑损害的作用。
本实验对NGF和BDNF表达的研究显示,假手术组NGF少量表达,BDNF很少表达。ICH对照组NGF和BDNF的表达均明显高于假手术组,在72h达高峰,说明脑出血发生后,凋亡系统被启动。本实验rhEPO治疗组大鼠NGF和BDNF的表达明显高于ICH对照组,提示rhEPO能明显提高抗凋亡作用,阻止凋亡程序的启动及进程,使结果向有利与神经细胞存活的方向转化,减轻脑损害。
本研究结果表明促红细胞生成素对脑出血后神经元损伤有保护作用,其作用可能通过提高NGF、BDNF的表达或合成,消除自由基,抑制凋亡,从而发挥脑保护作用。
摘要：目的 研究促红细胞生成素(EPO)对脑出血后神经功能缺损、细胞凋亡及神经生长因子表达的影响。方法用立体定向技术,将自体不凝血注入大鼠尾状核区制备脑出血模型。110只Wistar雄性大鼠,随机分成四组:正常组、假手术组、ICH对照组、rhEPO治疗组。应用免疫组化及原位细胞凋亡检测脑出血灶周组织NGF、BDNF表达及凋亡细胞。统计学方法采用t检验和LSD-t检验。结果与对照组比较,rhEPO治疗后48～168 h大鼠神经行为学评分明显减少(P<0.05)。ICH对照组及rhEPO治疗组术后6h血肿周围皮质TUNEL、NGF、BDNF阳性细胞明显增加,72h达到高峰,120h下降,各时间点与假手术组比较差异有显著性(P<0.01)。rhEPO治疗组TUNEL阳性细胞数明显少于同时点ICH对照组(P<0.01),但NGF、BDNF阳性细胞数明显增加(P<0.01)。结论凋亡机制参与脑出血后继发性损伤过程,EPO能促进神经元BDNF、NGF的表达,对脑出血后神经损伤起保护作用。
关键词：促红细胞生成素,神经生长因子(NGF),脑源性神经营养因子(BDNF),脑出血,凋亡,TUNEL,神经保护,损伤
参考文献
[1] Zhou XM ,Marc R,Del Bigio.Intracerebral injection of autologous whole blood in rat:time course of inflammation and cell death[J].Neuroscience Letters,2000,283(3):230-232.
促血管生成因子 篇5
1 材料与方法
1.1 材料
健康雌性未孕ICR小鼠, 健康雄性ICR小鼠, 鼠龄8~9周, 体重为 (28±2.5) g, 由四川简阳动物实验中心提供。
1.2 实验方法
1.2.1 动物模型的建立
小鼠同种异体垂体宫腔内移植法: (1) 腹腔麻醉:选择3%戊巴比妥钠作为腹腔麻醉用药, 根据体重计算, 30~35 mg/kg。抽取适量麻醉药给予8周龄雌鼠腹腔内注射。 (2) 分离雌鼠子宫:8周龄雌鼠, 分层切开皮肤层及皮下肌层, 在膀胱下找到子宫分叉处。 (3) 取出雄鼠垂体:8~9周龄ICR雄鼠, 处死后开颅取出垂体, 混合少许生理盐水后, 置于部分垂体生理盐水悬浊液约0.5~1 m L于自制套管针头内备用。 (4) 垂体注射入宫腔内:针头穿刺进入雌鼠右侧子宫内后, 利用套管针内芯将垂体生理盐水悬浊液缓慢推入宫腔, 针头及内芯同时退出, 将子宫放回腹腔, 腹腔内滴入庆大霉素溶液0.25 m L (1万U) 预防感染, 关腹。
1.2.2 实验药物制备
蒲灵化瘀止痛方是导师临床验方, 全方由蒲黄、五灵脂、制乳香、制没药、姜黄、延胡索、三七粉、花蕊石、水蛭、土鳖虫组成。该方由四川省中医院制剂室制成中药浸膏, 储存于4℃冰箱保存。实验前将中药浸膏用蒸馏水配成浓度为3.0 g/m L相当于1.2 g原生药材/20 g体重 (28倍于人体常用剂量, 按小鼠与人体体表面积折算) 。
1.2.3 实验分组
(1) 正常组:未施行手术, 常规饲养3个月。 (2) 模型组:6只, 同种异体垂体移植术后饲养3个月。 (3) A组:6只, 蒲灵化瘀止痛方组 (28倍于人体常用剂量, 按照体表面积换算) , 将中药浸膏用蒸馏水配成浓度为3.0 g/m L相当于1.2 g原生药材/20 g体重 (28倍于人体常用剂量) , 每天一次灌胃浸膏稀释后水溶液0.4 m L/20 g体重。灌胃3个月后处死。 (4) B组 (丹莪妇康煎膏组) :中药对照组6只, 成人每日用量0.5 g/kg体重, 昆明滇虹药业有限公司生产, 用蒸馏水配成浓度为0.35 mg/m L的水溶液 (相当于0.14 g/20 g体重) 国药准字Z20025253。灌胃3个月后处死。 (5) C组 (孕三烯酮组) :西药对照组6只, 孕三烯酮胶囊, 北京紫竹药业有限公司, 药准字H19980020用蒸馏水配成浓度为0.02 mg/m L的水溶液。每周2次灌胃孕三烯酮水溶液0.4 m L/20 g体重 (相当于8×103 mg/20 g体重) 。灌胃3个月后处死。
1.2.4 标本采集与处理方法
于末次给药后24 h, 颈椎脱臼处死小鼠, 立即剖腹取出右侧子宫标本置于10%中性福尔马林液中固定保存;48 h后取出, 经常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片 (片厚4μm) 、采用免疫组化SP法染色:用PBS液 (0.01 mol/L p H 7.4) 冲洗3次, 5 min/次;3%H2O2室温孵育10 min, 以消除内源性过氧化物酶的活性, 室温下孵育10 min;蒸馏水冲洗, PBS浸泡5 min;10%的正常山羊血清 (PBS稀释) 封闭, 室温孵育10 min。倾去血清, 勿洗, 滴加1:100比例稀释的一抗, 37℃孵育1 h;PBS冲洗, 冲洗3次, 5 min/次;滴加第二代生物素标记二抗工作液, 37℃孵育30 min;PBS冲洗, 冲洗3次, 5 min/次;滴加第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液, 37℃孵育30 min;PBS冲洗, 冲洗3次, 5 min/次;DAB显色剂显色;自来水充分冲洗, 苏木精复染, 封片。
1.3 观察指标
运用免疫组化技术观察各组AM小鼠在位及异位子宫内膜血管生成相关因子 (VEGF、CD31、MMP-2) 的变化。
1.4 结果判定
取模实验小鼠右侧子宫纵切面及横切面切片, 一个标本的同一切片显微镜下可同时观察异位内膜及在位内膜。在光学显微镜下分组观察, 在40倍视野下分别找到在位内膜及异位内膜部位, 转换为100倍视野, 观察子宫内膜层腺细胞及间质细胞侵入子宫肌层内的情况及浸润深度。采用Mias图形分析系统, 在200倍视野下分别选择异位及在位内膜组织的被覆上皮中含阳性物质 (即棕黄色颗粒物质) 最多的5个区域浏览, 先测量被覆上皮面积, 再测量相应面积中阳性物质的积分光密度, 以此表示观察指标的表达情况。
1.5 统计学处理
采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行处理, 计量资料以 (±s) 表示, 比较采用单因素方差分析, 组间比较用LSD、S-N-K分析和Tamhane’s T2检验, 以P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组在位子宫内膜CD31、MMP-2、VEGF的比较
与正常组比较, 模型组在位内膜CD31表达显著下降 (P<0.05) 。经过治疗后, A、B、C组CD31表达均有上调趋势 (P<0.05) 。与模型组比较, A组CD31表达上调显著 (P<0.05) , A组显著优于B、C两组, 差异均有统计学意义 (P<0.05) 。与正常组比较, 模型组在位内膜MMP-2、VEGF, 显著升高 (P=0.019) 。与模型组比较, 经治疗后各组MMP-2表达均下调 (A组:P=0.041;B组:P=0.091;C组:P=0.029) , VEGF表达均显著下降 (P<0.05) , A、B、C组之间比较无差异, 见表1。
2.2 各组异位子宫内膜CD31、MMP-2、VEGF的比较
与模型组比较, A、B、C组经治疗后异位内膜CD31表达显著下降 (A组:P=0.018;B组:P=0.031;C组:P=0.004) , A、B、C组之间比较差异无统计学意义 (P>0.05) 。与模型组比较, 治疗后A、B、C组异位内膜MMP-2均显著下降 (A组:P=0.002;B组:P<0.05;C组:P<0.05) , 且C组显著低于B组 (P=0.042) 及A组 (P=0.001) , 见表2。
*与正常组比较, P<0.05;△与模型组比较, P<0.05;#与A组比较, P<0.05
*与模型组比较, P<0.05;△与C组比较, P<0.05
3 讨论
实验结果表明, 模型组在位内膜CD31显著下降, 局部处于缺血缺氧的状态, 可能为AM发生的首要触发机制, 缺氧可以通过HIF-1通路等诱导血管增殖, 并可能是诱发促血管因子上调的最强因素之一[6]。而异位内膜CD31及VEGF表达显著增高, 异位内膜血管的增殖, 为异位病灶的发生发展提供了必要的条件[7]。经3种方法治疗后, 在位内膜CD31的表达均上升, 蒲灵化瘀止痛方组上升显著, 优于其他治疗组。活血化瘀类中药治疗对血管生成的多靶点作用的研究表明, 活血化瘀中药能够直接改善血液流变性、降低血黏度、抗凝、抑制血小板活性、促纤溶、抗血栓、消除微循环障碍, 可以改善血液高凝状态, 改善局部缺血缺氧状态[8];同时, 通过修复血管内皮细胞损伤, 抑制其增殖, 可能有效改善组织缺血缺氧的“血瘀”状态, 而消除新生血管生成的条件, 通过下调促血管生成因子、诱导内皮细胞凋亡、调节雌激素受体敏感性等多靶点作用, 在血管形成前期阻断病变进一步发展[9,10,11,12]。本实验中, 蒲灵化瘀止痛方组通过改善局部的缺血缺氧状态, 显著上调在位CD31水平, 下调在位及异位VEGF的异常增高, 下调在位及异位MMP-2的异常表达, 与现有的研究结果相似[13,14]。在下调血管生成关因子表达方面, 中西药治疗组无显著差异。
促血管生成因子 篇6
关键词：缺血耐受,血管内皮生长因子,血管生成素-1,缺血预处理
实验表明, 短暂性脑缺血预处理 (ischemia preconditioning, IP) 能够诱导产生内源性神经保护作用, 从而减轻其后发生的更为严重的缺血性脑损伤的程度, 该现象又称“脑缺血耐受”[1]。目前诸多研究探讨了脑缺血耐受的发生机制以及诱发神经保护的最佳时间窗, 但迄今尚无定论。研究发现, 在缺血性脑损伤过程中血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor, VEGF) 和血管生成素-1 (angiopoietin-1, Ang-1) 起着重要作用。脑缺血后, VEGF和Ang-1能够促进血管内皮细胞增殖和迁移, 从而参与血管形成;而且, 二者在神经发生和神经保护等方面也发挥重要作用[2]。本实验中, 我们首先建立大鼠脑缺血耐受模型, 然后动态检测IP后再灌注不同时间窗内缺血侧大脑皮层和纹状体VEGF及Ang-1的蛋白表达水平, 探讨二者在内源性脑保护中的作用, 为进一步阐明脑缺血耐受的发生机制提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及试剂
随机选择99只成年健康雄性Wistar大鼠, 体质量250～300g, 清洁级。实验前大鼠适应环境1周, 自由进饮食, 室温控制在 (22±2) ℃, 室内相对湿度65%, 每天光照时间为12 h。兔抗大鼠VEGF多克隆抗体和Ang-1多克隆抗体、即用型SABC试剂盒、DAB显色试剂盒等实验材料均购自武汉博士德生物工程有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 动物分组及预缺血及再缺血模型的制备
将实验大鼠随机分成三组, 即缺血预处理 (IP) 组 (45只) , 非缺血预处理 (NIP) 组 (45只) , 假手术对照组 (9只) 。采用由ZeaLonga[3]改良的大脑中动脉 (MCA) 二次线栓法建立动物模型, 具体步骤如下:经左侧颈外-颈内动脉插线 (18.5±2) mm完全阻断MCA, 10 min后将线栓退出至颈外动脉, 并埋于皮下, 完成脑缺血预处理。根据再次给予大脑中动脉闭塞 (MCAO) 的时间, IP组又分为5个亚组 (每个亚组9只) , 即在IP后1, 3, 7, 14, 21 d用线栓法再次MCAO, 于本次缺血2 h后将线栓抽出至颈外动脉, 造成第2次缺血再灌注, 于再灌注22 h后将大鼠处死。NIP组也分为5个亚组 (每个亚组9只) , 但以假手术代替IP, 即第1次手术仅仅暴露颈总动脉及分叉处, 不插线阻断MCA。按前述不同时间点, 于假手术后实施MCAO2h, 再灌注22 h后将大鼠处死。假手术对照组, 两次均为假手术, 与以上两组的1d亚组同时间处死。模型制作成功的标准:大鼠清醒后出现右前肢不能伸展、爬行时向右侧转圈。
注:与NIP组比较, *P<0.01;与IP组14, 21d亚组相比, #P<0.05
1.2.2 脑梗死体积的测量
在每亚组中随机选取4只大鼠, 快速处死取脑。距额极2mm向后连续等距切片, 间距2mm, 共取5个冠状脑片, 37℃水浴, 避光, 置于体积分数0.01TTC磷酸缓冲溶液中染色30min。蒸馏水冲洗, 应用40g/L多聚甲醛固定脑片。逐层拍照, 正常脑组织染为红色, 梗死组织为白色。应用Adobe PhotoShop CS计算脑梗死面积, 脑梗死体积=各层脑梗死面积之和×层间隔。
1.2.3 VEGF和Ang-1蛋白表达的检测
将每组其余5只实验大鼠灌注固定, 断头取脑。取前囟后3～6mm间冠状脑组织, 常规石蜡包埋, 按片厚5μm进行切片。采用SABC免疫组织化学染色法检测大鼠缺血侧大脑皮层和纹状体VEGF和Ang-1蛋白的表达。DAB显色, 光镜下观察, 发现胞浆出现棕色颗粒则为阳性着色。先在低倍镜下选择视野, 分别于皮质区和纹状体区取4个象限, 然后在高倍镜下计数阳性细胞[4]。
1.3 统计学方法
应用SPSS l0.0软件包进行统计分析。计量资料采用均值±标准差表示。采用t检验和方差分析分别进行组间比较和组内比较。
2 结果
2.1 各组脑梗死体积的变化
假手术对照组脑组织无缺血灶, 呈均匀红染。NIP组与IP组均见白色缺血灶, 主要位于缺血侧的额顶颞叶大脑皮质, 在纹状体及海马部位亦见有缺血灶。NIP组之各亚组间比较, 脑梗死体积差异无显著性;IP组1, 3, 7 d亚组脑梗死体积较14, 21 d亚组明显减小 (P<0.05) , 其中3 d亚组变化最明显。组间比较显示, IP组1, 3, 7 d亚组梗死体积较NIP组之相应亚组明显减小 (P<0.01) 。详见表1。
2.2 各组VEGF和Ang-1蛋白表达水平的比较
假手术对照组未见VEGF阳性表达。NIP组与IP组VEGF蛋白阳性表达细胞较多, 胞浆棕黄色, 着色明显, 主要分布于缺血灶及周围的神经元、神经胶质细胞以及微血管内皮细胞, IP组之1, 3, 7 d亚组中VEGF蛋白表达水平明显高于NIP组之相应亚组 (P<0.05) , 其中以IP组3 d亚组变化最明显。详见表2。
注:与NIP组比较, *P<0.05;与IP 14 d亚组相比, #P<0.05;与IP21 d亚组相比, △P<0.05
各组均发现Ang-1蛋白阳性表达的细胞, 阳性细胞内出现棕黄色颗粒。位于缺血侧大脑皮质和纹状体区的神经元、神经胶质细胞以及内皮细胞。各组之间的比较显示, IP组之7 d亚组Ang-1蛋白表达水平明显高于NIP组之相应亚组 (P<0.05) 。详见表2。
3 讨论
3.1 IP诱导产生脑缺血耐受的时间窗
本实验显示, 大鼠脑缺血再灌注后出现不同程度的神经功能障碍, 缺血脑组织的神经细胞数量减少, 有些神经细胞呈现核固缩和破碎现象。而IP后, 梗死灶中心区明显减小, 脑水肿程度减轻, 周围区结构完整的神经细胞显著增多。IP组之1, 3, 7 d亚组脑梗死体积较NIP组之相应亚组明显减小, 提示IP诱发产生“脑缺血耐受”。
脑缺血耐受的发生机制无明确定论。以往研究表明, 可能涉及细胞防御机制的激活、兴奋性和抑制性神经递质动态平衡的改变、以及细胞因子的参与等[5]。而且, 不同时间窗内IP发挥神经保护作用的机制存有差异。IP的效果与其持续的时间密切相关, IP时间过短不足以诱导产生脑缺血耐受, 时间过长则可能导致神经损伤, IP只有持续“适当的时间”, 尚能刺激机体发挥最大限度的神经保护作用[6]。本研究中, IP诱导产生神经保护的最佳时间为IP后3 d, 持续1～7 d。
3.2 IP对大鼠VEGF蛋白表达的影响
研究表明, VEGF是一种特异性血管内皮细胞有丝分裂原, 为增加血管通透性的最强烈的物质之一。VEGF能够选择性作用于内皮细胞膜上的酪氨酸受体, 即血管内皮生长因子受体1 (VEGFR1) 和血管内皮生长因子受体2 (VEGFR2) , 诱发血管内皮细胞增殖、迁移、细胞间的相互作用以及管腔的形成, 从而促进机体血管新生。机体中的VEGF的表达受到诸多因素的调控, 有研究显示缺血和缺氧是VEGF表达增加的最主要的诱导因素[7]。Mu等[8]研究显示, 在脑缺血半暗带区域, “缺氧”激活了低氧诱导因子1α的表达, 后者不仅诱导了VEGF过量表达, 同时还刺激组织表达VEGF受体。VEGF与其受体结合后, 促使新生血管的生成, 改善局部的血液供应, 减轻缺血性脑损伤。另外, 在脑缺血的急性期, VEGF对神经细胞、雪旺细胞及星形胶质细胞等还发挥着直接的神经营养和神经保护作用, 并通过抑制神经细胞凋亡而保护神经元, 从而促进神经功能恢复[9]。
本实验显示, NIP组与IP组大鼠缺血侧脑组织均见较多的VEGF蛋白表达阳性细胞。VEGF蛋白在IP后1d即出现升高, 阳性表达的高峰期为IP后3 d, 持续时间为7 d。同时, IP组1, 3, 7 d亚组VEGF蛋白表达水平明显高于NIP组之相应亚组。VEGF蛋白表达水平的这些变化趋势与脑缺血耐受产生的时间是基本一致的, 提示VEGF可能参与了脑缺血耐受的发生机制。
3.3 IP对大鼠Ang-1蛋白表达的影响
Ang-1作为血管内皮细胞特异性受体酪氨酸激酶Tie-2的配体, 对血管内皮细胞能产生强力的趋化作用, 能够诱导内皮细胞出芽、迁移, 并形成管状结构;同时还能诱导释放纤溶酶, 抑制基质金属蛋白酶组织抑制剂-2的分泌, 从而提高二者的比例, 最终导致细胞外基质降解, 为细胞迁移创造条件。实验表明, 脑缺血发生后, Ang-1能够促进缺血脑组织周围侧支循环的形成, 加强内皮细胞间的紧密连结, 维持血脑屏障的完整性, 明显改善缺血脑组织的血流灌注;并能直接抑制神经细胞的凋亡, 保护缺血半暗带的神经细胞, 促进神经功能的恢复[10]。
本研究中, Ang-1在各组均有所表达。其中, 仅IP组之7d亚组的Ang-1蛋白表达明显高于NIP组之相应亚组。然而, 脑缺血耐受在IP后1d即开始出现, 其产生的高峰期在IP后3d, 持续至7d。上述结果提示, 在脑缺血耐受早期阶段Ang-1的表达并未呈现明显升高, 故Ang-1可能主要作用于脑缺血耐受的后期阶段。
综上所述, IP可诱导大鼠产生脑缺血耐受, VEGF在脑缺血耐受产生的时间窗内发挥重要作用, 而Ang-1则可能作用于脑缺血耐受的后期阶段。本研究对阐明脑缺血耐受的机制具有重要价值。
参考文献
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[9]Vezzani A.VEGF as a target for neuroprotection[J].Epilepsy Curr, 2008, 8 (5) :135.
促血管生成因子 篇7
1 材料及方法
1.1 研究对象
131例组织标本全部取自兰州大学第一医院胸外科2000~2008年资料完整的住院手术患者, 患者均经病理证实为非小细胞肺癌, 年龄40~73岁, 男94例, 女37例。所有患者术前均未接受化疗、放疗或针对肿瘤的治疗, 均在全麻下行非小细胞肺癌切除术。131例非小细胞肺癌中高分化癌39例, 中分化癌75例, 低分化癌17例, 全部病例按照国际抗癌联盟 (UICC) 1997年分期标准进行分期, 浸润深度:Ti 6例, T110例, T244例, T358例, T413例;淋巴分期:N044例, N187例;远处转移:M0101例, M130例;临床分型:0期1例, Ⅰ期7例, Ⅱa期13例, Ⅱb期51例, Ⅲ期44例, Ⅳ期15例。正常对照组织全部取自手术时切除的、距瘤体约10 cm、均经病理证实为正常的肺组织。
1.2 标本处理
所有标本均经100 mol/L甲醛液固定, 常规石蜡包埋, 制备成4μm厚的连续切片5张, 1张行苏木精-伊红染色, 其余切片贴附于经防脱处理的载玻片上, 60℃干燥72 h后, 用于不同的免疫组织化学染色。
1.3 实验方法
1.3.1 苏木精-伊红染色
切片进行常规苏木精-伊红染色。
1.3.2 免疫组织化学染色方法
本实验采用S-P染色法检测HPs、BFGF和CD34在各标本上的表达。S-P试剂盒, 购自福州迈新生物技术开发公司。将切片进行免疫组织化学标记, 3%双氧水室温浸泡5 min, 蒸馏水洗, PBS浸泡5 min。5%~10%正常羊血清, 室温孵育10 min, 倾去血清后加入适当稀释的一抗HPs (鼠单抗, 554R16, ABCAM) 、BFGF (兔单抗, Santa cruz) 或CD34 (MAB-0034) , 37℃孵育60 min, PBS浸泡5 min, 共3次。滴加生物素标记的二抗37℃孵育15 min, PBS浸泡5 min, 共3次。滴加辣根酶标记的链霉卵白素37℃孵育15 min, PBS浸泡3 min, 共3次。DAB显色, 水洗后, 苏木精复染, 分色, 返蓝, 脱水, 透明封固。以PBS代替第一抗体为阴性对照。
1.3.3 观察指标
(1) HPs阳性判定标准:HPs、选染色均匀的区域, 显微镜下随机选择10个高倍视野计数, 阳性细胞数<10%为阴性, ≥10%为阳性。切片中癌组织阳性染色弱, 阳性范围<50%癌组织面积者判定为 (+) ;染色弱, 阳性范围>50%判定为 (++) ;染色强, 阳性范围<50%判定为 (+++) ;染色强, 阳性范围>50%判定为 (++++) 。并将染色强度 (+) ~ (++) 划分为低表达, (+++) ~ (++++) 划分为高表达[8]。
(2) BFGF阳性判定标准:对BFGF标记切片, 采用Eastham等[9]的方法。即切片中癌组织阳性染色弱, 阳性范围<癌组织面积50%者判定为 (+) ;染色弱, 阳性范围>50%判定为 (++) ;染色强, 阳性范围<50%判正为 (+++) ;染色强, 阳性范围>50%判定为 (++++) 。并将染色强度 (+) ~ (++) 划分为低表达, (+++) ~ (++++) 划分为高表达[8]。以肿瘤细胞胞质内出现棕黄色颗粒为阳性判定标准。
(3) CD34阳性判定标准:在低倍视野下选取肿瘤微血管数量 (CD34阳性) 最丰富区域, 在200倍视野范围计5个视野的微血管数目, 取平均值作为肿瘤微血管密度 (MVD) ;以血管内皮细胞胞质内出现棕黄色颗粒为阳性判定标准。
1.4 统计学分析
应用统计软件SPSS 13.0分析资料, 计数资料采用χ2检验、方差分析, 计量资料采用t检验, 应用Log-Rank检验比较不同组别患者的生存时间。
2 结果
2.1 非小细胞肺癌及正常肺组织中HPs、BFGF、MVD的表达
131例非小细胞肺癌组织中, HPs阳性105例 (80.2%) , BFGF阳性99例 (75.6%) 。20例正常肺组织中未见HPs阳性表达, 6例BFGF阳性表达。非小细胞肺癌组织中HPs和BFGF的表达阳性率显著高于正常肺组织 (P<0.01) 。非小细胞肺癌中MVD计数为 (30.59±13.38) 个, 显著高于正常肺组织的MVD计数 (13.82±4.16) 个 (见表1) 。
2.2 HPs、BFGF和MVD的表达与非小细胞肺癌分化程度的关系 (见表2)
HPs在高、中、低分化非小细胞肺癌中阳性率分别为:66.7%、84.0%、94.1% (P<0.05) ;BFGF在高、中、低分化非小细胞肺癌中阳性率分别为:74.4%、78.7%、64.7% (P>0.05) ;MVD在高、中、低分化非小细胞肺癌中分别为:33.13±7.93、31.92±5.29、32.52±6.17 (P>0.05) 。本研究提示HPs基因过度表达随恶性度增加而升高, 从而证实HPs有使细胞恶性转化的能力。而BFGF、MVD在非小细胞肺癌中的表达与非小细胞肺癌分化程度无关。
2.3 HPs、BFGF和MVD的表达与非小细胞肺癌临床分期的关系 (见表2)
HPs在0+Ⅰ+Ⅱ期、Ⅲ+Ⅳ期中阳性率分别为:73.6%、88.1% (P<0.05) 。BFGF在0+Ⅰ+Ⅱ期、Ⅲ+Ⅳ期中阳性率分别为:68.1%、84.7% (P<0.05) 。MVD在0+Ⅰ+Ⅱ期、Ⅲ+Ⅳ期中分别为:35.95±5.19、43.19±7.15 (P>0.05) 。由此说明, HPs、BFGF在非小细胞肺癌中的表达与临床分期显著相关 (P<0.05) , 非小细胞肺癌组织中MVD与临床分期无相关性 (P>0.05) 。
2.4 HPs、BFGF和MVD的表达与非小细胞肺癌淋巴结转移M分期的关系 (见表2)
表2显示, HPs、BFGF在非小细胞肺癌中的表达与非小细胞肺癌淋巴结转移M分期情况呈显著相关性, 非小细胞肺癌组织中MVD与非小细胞肺癌淋巴结转移情况无显著相关性。
2.5 HPs与BFGF在非小细胞肺癌中的关系
HPs在本组非小细胞肺癌中的表达与BFGF的表达有显著性差异 (r=0.553, P=0.000) , 同时, HPs与BFGF在本组非小细胞肺癌中的表达与MVD有显著性差异 (P=0.000) 。
2.6 不同HPs表达水平对非小细胞肺癌患者生存时间的影响 (见表3、图1)
根据HPs的表达水平将131例患者分成3组, 采用KaPlan-meier方法描绘3组的生存曲线, 用Log-Rank检验比较3组生存时间, 3组之间有极显著性差异 (P<0.001) 。
2.7 采用Cox风险比例模型预测影响非小细胞肺癌预后的因素 (见表4)
注:*P<0.05
采用Cox风险比例模型, 拟对131例非小细胞肺癌患者临床病理因素及癌组织中HPs、BFGF、MVD的表达强度进行预后多因素分析。由表4可知HPs的表达程度、远处转移及非小细胞肺癌淋巴结转移是非小细胞肺癌术后影响患者生存时间的危害性因素。
3 讨论
人类乙酰肝素酶基因位于第4条染色体上, 有12个外显子, 11个内含子, 编码区总跨度为39 113个核苷酸, 编码区上游2.3 kb区包含一启动子。结构完整的人类乙酰肝素酶CDNA是一个由543个氨基酸残基切除后, 形成一个同上C端386个氨基酸残基组成的活性很强的成熟蛋白, 分子量约为50 kDa;并且这种前体酶的水解激活是所有参与ECM蛋白降解及细胞浸润酶类的共同特征。同一种族的不同组织细胞间, 如人的胎盘、血小板、转移的肿瘤细胞等也表达同一种乙酰肝素酶。癌症的转移是癌细胞从癌组织中突破胞外基质的限制, 转移扩散到别的器官并继续增殖所造成的。癌症成为致命的疾病, 不仅在于癌细胞的生长失去控制, 更在于其转移能力。在转移过程中, 细胞粘附、细胞运动、ECM的降解及血管生成是肿瘤转移的决定性因素, 在本研究中乙酰肝素酶及碱性成纤维细胞生长因子在非小细胞肺癌组织中的表达与肿瘤的浸润及转移密切相关 (P<0.001) 。同时, 与微血管密度在非小细胞肺癌组织中的表达密切相关, 本实验结果及相关资料表明乙酰肝素酶及碱性成纤维细胞生长因子的表达与肿瘤细胞转移潜能密切相关。
非小细胞肺癌中普遍存在BFGF的高表达, 并且和较差的预后[2]、肿瘤进展[3]、血管新生[4]、淋巴浸润和转移[5]相关。这些高表达的BFGF是否由EIF4e所驱动, 对于研究非小细胞肺癌血管新生、浸润和转移的详细机制, 进而提供新的治疗靶点具有重要意义。本研究通过在131例不同分化非小细胞肺癌标本中对HPs、BFGF的表达水平检测, 发现HPs和BFGF蛋白在非小细胞肺癌中表达阳性率显著高于正常肺组织。高表达的HPs和BFGF与非小细胞肺癌中肿瘤浸润、淋巴转移、远处转移和较高的临床分期呈正相关。我们还检测了HPs与BFGF在非小细胞肺癌中不同区域的表达, 分析2者之间的相关性。结果表明, 2者之间的相关系数为0.533, 提示2者之间密切相关, 且成正相关, 即HPs的高表达会导致BFGF的表达水平增高。这说明在非小细胞肺癌中, HPs的表达和BFGF具有相似的趋势, 2者可能存在某些调节关系。
在许多肿瘤中, HPs和BFGF的表达具有高度相关性。Yang SX等[10]应用组织芯片分析了多种肿瘤来源的组织, 发现HPs和BFGF在黑色素瘤、乳腺癌、结肠癌、非小细胞肺癌、淋巴瘤、前列腺癌和卵巢癌等中都具有相关性[10]。BFGF在非小细胞肺癌中是一个重要的预后因子, 而HPs的研究相对较少。Salehi等[11]发现HPs在非小细胞肺癌组织中的表达显著高于正常肺组织, 并且与进展期非小细胞肺癌密切相关。我们的研究证实了这些发现, 同时还首次发现非小细胞肺癌中HPs和BFGF的表达具有高度相关性。
HPs和BFGF高度相关, 而BFGF能促进血管新生、导致肿瘤微血管密度增加。我们接着比较了HPs表达和MVD的表达趋势, 发现在浸润深度、淋巴转移、远处转移和临床分期方面, 2者的表达趋势高度一致。这说明HPs表达能促进血管新生、增加肿瘤微血管密度, 这很可能是通过增加BFGF表达介导的。
我们还发现, HPs基因蛋白在高分化、中分化、低分化的表达率是递增的 (66.7%、84.0%、94.1%) , 提示HPs基因过度表达随肿瘤恶性程度增加而升高, 从而证实HPs有使细胞恶性转化的能力。而BFGF和MVD在不同分化状态的非小细胞肺癌标本中的表达无显著性差异。这表明HPs在不同分化程度非小细胞肺癌的差异表达和肿瘤细胞增殖、致瘤性等特征相关, 这可能与促进生长因子的蛋白翻译有关。我们的研究也证实了其他作者在非小细胞肺癌中的发现:HPs高表达于低分化非小细胞肺癌组织[12]。
我们分析了非小细胞肺癌患者的生存时间, 发现HPs表达水平与生存时间显著相关, HPs表达越高, 生存时间越短。多因素分析显示:HPs的表达程度、远处转移及非小细胞肺癌淋巴结转移是非小细胞肺癌术后影响生存时间的危害性因素。而BFGF和MVD对生存影响相对较小。
我们的研究不仅揭示非小细胞肺癌高表达BFGF和HPs存在相关, 还证实HPs是一个比BFGF更好的、用于预测患者生存的预后因子。这将为研究非小细胞肺癌新的治疗方法提供重要信息, 针对HPs的反义核酸在动物体内可以有效抑制肿瘤生长且毒性很小[13]。因而, 非小细胞肺癌中, 靶向HPs的治疗值得进一步研究。
我们的研究表明:HPs、BFGF协同表达对非小细胞肺癌血管生成、浸润和转移起到关键性的作用。HPs的过度表达与非小细胞肺癌的致瘤性和生存时间密切相关, 且能作为非小细胞肺癌恶性程度的一个分子标志和治疗靶标。