血管生成素样蛋白2（精选3篇）
血管生成素样蛋白2 篇1
卵巢上皮性癌(epithelial ovarian carcinoma,EOC)是妇科中常见的恶性肿瘤[1],因其发病隐匿,大多数的患者明确诊断时已属于癌症晚期,其病死率已位居女性生殖系统恶性肿瘤的首位。新生血管不仅仅为肿瘤细胞的增殖提供养分,同时是肿瘤细胞进一步侵袭的重要的途径,为肿瘤的生长及转移创造有利的条件[2]。近年来研究[3]表明,基质金属蛋白酶(matrix metalloproteins,MMPs)在肿瘤血管的生成中起重要作用。本研究采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(streptavidin-perosidase,SP)检测60例卵巢上皮性癌、16例良性卵巢肿瘤组织和10例正常卵巢组织中MMP-2及MMP-9的表达,探讨与局部血管生成的关系,为临床上深入地了解卵巢上皮性癌中肿瘤血管的生成提供临床参考。
1 资料与方法
1.1 临床资料
选取本院2007年2月~2010年9月诊治的60例EOC患者初次切除后的卵巢石蜡包埋组织标本,年龄33~67岁,平均年龄(47.5±13.3)岁;根据国际妇产科联盟(Intemational Federation of Gynecology and Obstetrics,FIGO)标准进行临床分期及病理组织学的分级,其中临床分期Ⅰ~Ⅱ期24例,Ⅲ~Ⅳ期36例;高分化~中分化程度35例,低分化程度25例;术后对60例EOC患者进行随访2~6年。并取同期因子宫良性疾病手术而切除卵巢的患者的石蜡包埋组织标本其中正常卵巢组织10例,患者年龄35~64岁,平均年龄(47.2±12.4)岁,术前未做任何的化疗及放疗;良性卵巢肿瘤组织16例,年龄34~68岁,平均年龄(48.9±15.1)岁。对数据进行分析比较。
1.2 方法
1.2.1 实验试剂
即用型鼠抗人MMP-2、MMP-9、CD34单克隆抗体及SP免疫组织化学超敏染色试剂盒和二氨基联苯氨(diaminobenzidin,DAB),均由美国Maxim公司生产,购于迈新生物技术有限公司。
1.2.2 方法
标本取材后采用5.0%的甲醛缓冲液固定,进行常规脱水和石蜡包埋,切取5.0μm石蜡切片,放置于54℃烘箱中。MMP-2、MMP-9和CD34表达情况的检测采用免疫组织化学SP法,按照MMP-2、MMP-9、CD34鼠抗人的单克隆抗体、SP免疫组化试剂盒和DBA显色液试剂盒中各自的说明进行操作,每组染色均以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。
1.2.3 观察标准
显微镜下观察细胞的染色情况,细胞浆或细胞核中出现黄色或棕黄色颗粒作为阳性判定的标准。按照5.0%以上细胞浆或细胞核呈棕黄色染色为表达阳性,<5.0%的细胞着色或细胞与背景一致不着色定位阴性(-),5.0%~30.0%的细胞阳性染色定为(+),30%~50.0%的细胞阳性染色定为(++),阳性细胞>50.0%定为强阳性(+++)。微血管密度(microvessel density,MVD)的计数:先在40倍镜下全面观察用免疫组织化学SP法进行CD34染色的切片,确定MVD的最高点;然后在200倍镜下记录5个视野内的微血管数,取其平均值作为该病例的MVD值。
1.3 统计学处理
采用SPSS11.5统计学软件对数据进行处理分析,各组MMP-2、MMP-9与临床病理特征的关系采用χ2检验,MVD与临床病理特征的关系采用t检验,MMP-2和MMP-9与MVD的相关性应用Spearman分析,检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 MVD在3种组织中的表达
CD34呈棕黄色细颗粒状,在卵巢肿瘤组织间质血管内皮细胞胞浆呈阳性表达,EOC、良性卵巢肿瘤和正常卵巢组织的MVD分别为(41.25±32.12)、(14.27±9.58)和(7.43±5.47),EOC组中的MVD与卵巢良性肿瘤组比较显著升高(P<0.05)。
2.2 MMP-2和MMP-9在3种组织中的表达
MMP-2和MMP-9免疫组织化学的阳性产物均呈棕黄色细颗粒状,主要定位于肿瘤细胞的胞浆和胞核。60例EOC中MMP-2和MMP-9的阳性率分别为67.45%和72.41%,显著高于卵巢良性肿瘤组及正常组(P<0.05)。
2.3 EOC中MMP-2和MMP-9的表达与临床病理特征的关系
EOC中MMP-2和MMP-9的表达与肿瘤大小无关(P>0.05),与细胞的分化程度、转移和肿瘤分期具有相关性(P<0.05),结果见附表。
2.4 卵巢上皮性癌中MMP-2、MMP-9与MVD表达的相关性分析
MMP-2和MMP-9的表达均与MVD表达呈正相关,相关系数为(r=0.254,r=0.246,P<0.05)
3 讨论
MMPs是蛋白水解酶中较为重要的一类。资料显示[4,5],肿瘤细胞除了能分泌MMPs外,还能分泌血管生成因子,如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),诱导内皮细胞产生MMPs。降解细胞外基质和基底膜[6,7],进一步促进肿瘤新生血管的生成。
据资料,MMP-9在EOC的表达与局部肿瘤血管生成的关系的报道较少,本文通过研究,将正常卵巢组织与卵巢上皮性癌组织进行对比分析,结果显示卵巢上皮性癌中MMP-9的阳性表达率显著升高(P<0.05),这与王喜梅[8]的报道相一致,从而证实了MMP-9在卵巢上皮性癌中过度表达,促进肿瘤血管的生成。MMP-2是分子量为72 kD的Ⅳ型胶原酶,主要的作用底物为4、5型胶原,主要由肿瘤细胞、成纤维细胞以及炎性细胞分泌,研究[9]表明,其在肿瘤介导的细胞外基质降解中发挥着重要的作用,基质膜和基质的降解对血管生成所必需的内皮细胞极为重要,MMP-2被认为是肿瘤血管生成关键因素之一。通过本次研究结果显示,MMP-2及MMP-9的表达率高的EOC患者,其肿瘤血管生成的能力越强[10],因此,卵巢上皮性癌中MMP-2和MMP-9表达的增强,可能与卵巢上皮性癌的发生发展具有相关性(r=0.254,r=0.246,P<0.05)。检测EOC中MMP-2及MMP-9的表达有助于进一步了解肿瘤血管的生成情况。
综上所述,MMP-2及MMP-9与EOC的血管生成显著相关,是EOC相关的一种癌蛋白,在EOC的发生和发展中发挥着重要的作用,对蛋白的表达有正向的调节作用,进而可以影响EOC血管的生成。
参考文献
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血管生成素样蛋白2 篇2
关键词：持续血液净化,外伤,脓毒症,炎症因子
脓毒症是严重外伤常见并发症类型之一,其病情进展迅速,如不及时控制可导致全身炎症反应综合征、多器官功能障碍(multiple organs dysfunction syndrome,MODS),严重威胁患者生命安全;流行病学报道显示,腹部外伤继发脓毒症患者死亡率高达35%~40%[1]。而免疫功能失调与异常炎症反应在脓毒症患者MODS发生发展过程中的关键作用已被广泛认可[2,3]。如何有效控制脓毒症患者炎症反应水平,改善预后已成为医学界关注的热点之一。本次研究选取外伤继发性脓毒症90例,分别采用常规对症支持和在此基础上加用持续血液净化疗法,比较两组患者临床疗效,28 d内死亡率,治疗前后A-PACHE II评分和炎症因子水平,探讨持续血液净化疗法治疗外伤继发性脓毒症临床效果及对高迁移率族蛋白1(high mobility group protein-1,HMG-1)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和促血管生长素2(angiopoietin-2,Ang-2)的影响。
1 资料与方法
1.1 临床资料
选取我院2011年7月-2014年5月收治外伤继发性脓毒症90例,采用随机数字表法分为对照组和试验组,每组各45例;对照组患者中男性31例,女性14例,年龄32~71岁,平均(54.80±7.15)岁;试验组患者中男性28例,女性17例,年龄34~72岁,平均(54.93±7.19)岁。两组患者一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。
1.1.1 纳入标准
①经CT检查及腹腔穿刺确诊为闭合性腹部外伤[4];②符合美国胸科医师协会与危重病医学会委员会标准脓毒症诊断标准[5];③研究方案经医院伦理委员会批准;④患者家属签署知情同意书,自愿加入研究。
1.1.2 排除标准
①自身免疫性疾病;②恶性肿瘤;③血液系统疾病。
1.2 治疗方法
对照组患者采用常规对症支持治疗,包括早期液体复苏,乌司他丁静脉滴注、血糖控制及糖皮质激素应用等;试验组患者则在对照组治疗基础上加用持续血液净化疗法,血液净化机器为瑞典金宝公司Prisma CRRT机,透析膜滤过分子量为50 kD,置换液剂量7~8 L/h,9~10 h/次,1次/d,直至机体血流动力学指标恢复正常。
1.3 观察指标
①记录患者28 d内死亡例数,计算死亡率;②病情预后评估采用APACHE(急性生理学及慢性健康状况评分系统)II评分;③炎症因子水平检测指标包括HMG-1、TNF-α及Ang-2;其中HMG-1和TNF-α检测采用酶联免疫吸附法,而Ang-2检测采用免疫电发光法。
1.4 疗效评价标准
①治愈,发热、寒战、心率呼吸加速及尿量减少等临床症状消失,白细胞计数分类、血清C反应蛋白及降钙素原等实验室检查指标恢复正常,且创伤部位愈合;②好转,临床症状消失,但创伤部位尚未愈合;③无效,未达到上述标准。总有效率=[(治愈例数+好转例数)/总例数]×100%[6]。
1.5 统计学处理
本次研究数据录入分析软件分别采用Epidata3.09和SPSS19.0;其中计量资料采用t检验,以均数±标准差(±s)表示;计数资料采用χ2检验,以百分比(%)表示;P<0.05判定为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组患者临床疗效比较
试验组患者临床疗效显著优于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);见表1。
2.2 两组患者28 d内死亡率比较
对照组和试验组患者28 d内死亡率分别为31.11%(14/45)和17.78%(8/45);试验组患者28 d内死亡率显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。
2.3 两组患者治疗前后APACHE II评分比较
两组患者治疗后APACHEII评分显著低于治疗前,且试验组患者治疗后APACHEII评分低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);见表2。
注:1)与对照组比较,P<0.05;2)与治疗前比较,P<0.05
2.4 两组患者治疗前后炎症因子水平比较
两组患者治疗后HMG-1、TNF-α及Ang-2等炎症因子水平显著低于治疗前,且试验组患者治疗后各项指标水平低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);见表3。
注:1)与对照组比较,P<0.05;2)与治疗前比较,P<0.05
3 讨论
持续血液净化疗法能够有效清除致炎细胞因子,降低炎症介质水平,从而阻断全身炎症瀑布反应;而其对于机体抗炎细胞因子水平降低作用亦有助于保持机体对内毒素血症和菌血症免疫活性[7,8]。同时持续血液净化还可等渗清除溶质,减少细胞外液容量变化,从而有效维持循环系统稳定性[9]。近年来持续血液净化认识已从单纯炎性介质被动清除,转变为主动调节机体免疫系统功能。
本次研究结果中试验组患者临床疗效和28 d内死亡率均显著优于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),提示持续血液净化疗法治疗外伤继发性脓毒症在改善临床近远期疗效方面具有优势;试验组患者治疗后APACHEII评分显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),说明持续血液净化有助于改善外伤继发性脓毒症患者预后;APACHEⅡ评分是目前公认内科危重症疾病病情及预后评估主要指标,已有研究显示,APACHE分值与病死率之间呈正相关关系,即分值越高,病死率亦越高;其病死率预测正确率可达85%~90%[10]。试验组患者治疗后HMG-1、TNF-α及Ang-2等炎症因子水平显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),则证实通过持续血液净化可有效降低外伤继发性脓毒症患者机体炎症因子水平,调节免疫系统功能;HMG-1是含量最丰富HMG蛋白,每10~15个核小体即可含有1个HMG-1分子,内含219个氨基酸残基,分子质量约为30 k D;其广泛分布于心脑肝肾及淋巴结组织中,并主要定位于胞核。因分子量小于50 k D,HMG-1可经血液净化治疗中对流或吸附机制清除。已有研究显示HMG-1可反映脓毒症晚期炎性反应水平,具有刺激巨噬细胞和单核细胞游离至细胞外,活化细胞核内DNA结合蛋白等促炎作用;而这一作用机制已被证实与TNF-α释放关系密切,即TNF-α作为上游因子调节HMG-2水平[11,12]。TNF-α是一种主要由LPS、IFN-γ、M-CSF及GM-CSF等刺激单核巨噬细胞而分泌的炎性因子;其内含157个氨基酸残基,分子量约为17 k D;因分子量小于50 k D,血液净化治疗中对流或吸附机制均可有效清除TNF-α。TNF-α在机体内可发挥免疫调节、炎症反应刺激等生物学活性,属于炎症早期关键和诱发炎症因子;动物实验显示,TNF-α可在脓毒症发生发展过程中发挥炎性细胞诱导和促进其他细胞因子合成和释放作用[13,14]。Ang-2由496个氨基酸残基组成,分子量为68 k D;其主要分布于卵巢、子宫和胎盘,与Ang-1同源性约为60%。因分子量大于50 k D,Ang-2主要经血液净化治疗中对流机制清除。国外研究显示,脓毒症患者体内Ang-2水平显著升高,与预后具有一定相关性[15]。连续性血液净化能够有效降低早晚期炎性介质水平,多环节拮抗机体级联炎症反应,并保证内环境相对稳定性,这可能是其改善外伤继发性脓毒症患者近远期疗效的主要机制。
血管生成素样蛋白2 篇3
1 材料和方法
1.1 材料:
选择雄性SD大鼠15只,清洁级,由中山大学实验动物中心提供。18～251饲养,正常进食及水。大鼠体质量200～250g,动物随机分为假手术组、模型组和实验组,每组5只。实验第七天处死大鼠,实验组取注射Ang-2部位及周围心室组织,假手术组和模型组取相应部位组织,迅速冷冻在液氮中做检测用。
1.2 方法:
动物模型构建:建立大鼠心肌梗死模型按照文献上的方法[1],将大鼠用水合氯醛腹腔注射麻醉。气管插管后接人工呼吸机辅助呼吸。在左胸第四肋骨～第五肋骨间做横切口,在肺动脉圆锥与左心耳交界稍下一处用无创缝线结扎左冠状动脉前降支,以结扎部位以下心肌变白,搏动减弱,心电图出现段弓背向上明显抬高为造模成功。在心肌变白边缘及结扎部位与心尖连线中点交汇处模型组注射50μl生理盐水,实验组注射100ng (50μL) Ang-2。假手术组的大鼠于开胸后不结扎冠状动脉,仅在相应部位用无创针空穿一次,关胸。开胸前后即时记录导联心电图。
1.3 心肌细胞的凋亡情况检测:
①原位末端脱氧核昔酸转移酶介导的生物素脱氧尿嗜Ni核昔酸原位缺口末端标记法,采用Roche公司检测试剂盒,按试剂盒说明书操作,镜下观测阳性标记的细胞数,即凋亡细胞数。②流式细胞仪Annexin V/P1双标检测法:取各鼠心肌组织50mg,机械破碎,加人D-Hank's液500μL,振荡器混匀,过35μm尼龙网,用D-Hank’s液调整细胞量至2x106,加人稀释的由异硫氰酸荧光素标记的Annexin V (购于Coulter公司)5μL和稀释的PI 5μL,冰孵育10 min,上机。AnnexinⅤ阳性细胞即凋亡细胞。
1.4 Bcl-xl和Caspase-3的mRNA表达
Trizol法提取总RNA进行RT-PCR检测。Bcl-xl和caspase-3mRNA引物由上海博亚生物技术公司合成,引物序列分别如下:bcl-xl:正链5'TTCGGGATGGAGTAAACTGG3';负链5'TGTCTGGTCACTTCCGACTG3';318 bp;Caspase-3:正链5'CAC GAGCAGAGT CAA AGG3'负链5'TTC AAC AAGCCA ACC AAG3',206 bp。RT反应体系:42℃90 min合成cDNA第1链,75℃15 min灭活逆转录酶。PCR反应体系热循环参数:变性94℃,30s;退火59℃,1 min;延伸72℃,1min;共30个循环,末次循环后72℃延伸7 min。PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统成像,用各条带的OPTDI(面积与平均光密度之乘积)与β-actin OPTDI的比值作为其相对表达量。
1.5 统计学分析:
计量资料用means±SD表示,采用SPSS11.0软件进行单因素方差分析比较,P<0.05表示两组差异有统计学意义。
2 结果
心肌细胞凋亡情况的原位缺口末端标记结果见图1:如图Ⅰ 所示,假手术组见少许标记的凋亡阳性细胞,模型组出现较多阳性标记细胞,实验组原位缺口末端标记法阳性细胞数最多,明显高于假手术组和模型组。各组之间比较差异有显著性意义。
A:假手术组,可见少量凋亡细胞;B:模型组,凋亡细胞明显比假手术组多;C:实验组,可见凋亡细胞最多。箭头所指为凋亡细胞。
心肌细胞凋亡情况的流式细胞仪Annexin V/PI双标检测结果见表1:如表1所示,假手术组细胞凋亡(Annexin V阳性细胞)数约为于5%,模型组凋亡细胞数目明显增加,约为12%,实验组凋亡细胞数目最多,约为18%。各组相比差异具有显著性。
n=5,与假手术组比较*P<0.01,与模型组比较##P<0.01。
心肌组织bcl-xl及Caspase-3 mRNA表达。各组心肌组织Bcl-x1和Caspase-3 mRNA的相对表达见图2。从图2可以看出Bcl-xl mRNA表达在假手术组最高,实验组表达最低,他们之间的比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。Caspase-3 mRNA的表达则正好与Bcl-xl mRNA表达相反,在假手术组最低,实验组表达最高,它们之间的比较差异有统计学意义(P<0.01)。
A:Ang-2对心肌组织Bcl-xl及Caspase-3 mRNA表达的影响;B:Bcl-x1及Caspase-3 mRNA表达半定量结果。n=5,与假手术组比较*P<0.01,与模型组比较#P<0.05,##P<0.01。
3 讨论
治疗性血管新生是近年来缺血性疾病治疗的研究热点,为急性心肌梗死的积极治疗提供了新思路。血管生成素(angiopoietin,Ang) 家族是近年来发现的一个既含受体激动剂又含受体抑制剂的促血管生成家族,他们在新生血管萌芽、形成过程中其重要作用[2]。然而,MaisonpieITe等[3]在Ang-2转基因的小鼠胚胎模型中发现,过表达Ang-2的小鼠胚胎的心血管缺陷表型比Ang-1及Tie-2受体敲除的小鼠更严重,特别是血管壁的不完整性及不连续性尤为明显,因此推测其机制可能与Ang-2直接促进内皮细胞凋亡等有关。我们以前的研究结果也显示通过小干扰RNA抑制内皮细胞Ang-2的表达可抑制H2O2诱导的细胞凋亡[4]。Ang-2参与了细胞凋亡和死亡的调节。Ang-2是否会诱导缺血部位心肌细胞凋亡呢?我们通过在心肌缺血部位直接注射Ang-2来对心肌细胞凋亡进行观察,结果发现Ang-2具有促进缺血部位心肌细胞凋亡作用,Ang-2干预组心肌细胞凋亡数明显多于假手术组和单纯缺血组。由此, 利用Ang-2诱导新生血管生成来改善心肌缺血,可能会因为Ang-2对心肌细胞的损伤作用而影响心功能,从而对患者不利。最近, Winston等[5]研究也发现联合血管内皮生长因子与Ang-2治疗心肌缺血,缺血部位血管生成增多,但心功能不能改善,甚至恶化。 这也支持我们的观点,其机制可能与Ang-2具有促进缺血部位心肌细胞凋亡作用有关。
大量的研究表明,细胞凋亡受基因调控,并发现了许多与细胞凋亡密切相关的调控基因,主要有Caspase家族、Bcl-2蛋白家族、 HSP、IEGs和p53基因等[6]。凋亡发生是一个复杂的由Caspase家族成员介导的蛋白酶级联反应过程。首先活化不同的Caspase起始因子,再由启始因子激活级联下游的Caspase效应分子,最终由效应分子特异地水解细胞中的一系列底物而导致细胞解体,并包裹形成凋亡小体。因此,Caspase家族是直接导致凋亡细胞解体的蛋白系统,在细胞凋亡的分子机制网络中居中心地位,其活化是细胞凋亡通路的中心环节。我们的研究结果表明Ang-2有诱导Caspase-3表达作用,Ang-2干预组Caspase-3mRNA表达明显高于假手术组和缺血模型组。此外,Bcl-2基因家族也与凋亡密切相关,在细胞凋亡的调节中,Bcl-xl是凋亡抑制基因,其表达增加可抑制细胞凋亡[7]。我们的研究结果也显示在Ang-2促进缺血部位心肌细胞凋亡作用中,Ang-2干预的实验组,Bcl-xl表达明显低于单纯的缺血组。因此,Ang-2促进缺血部位心肌细胞凋亡机制可能与其增加Caspase-3表达及抑制Bcl-xl基因表达有关。
总之,我们的研究结果表明单纯的Ang-2治疗心肌缺血,它可通过诱导心肌细胞凋亡而对心脏产生有害作用;其作用机制可能与促进Caspase-3表达及抑制Bcl-xl表达有关。要让Ang-2有效治疗缺血心肌病尚需进一步研究。
摘要：目的探讨血管紧张素对缺血部位心肌细胞凋亡的影响及可能机制。方法实验动物分假手术组、模型组和实验组。细胞凋亡情况采用原位缺口末端标记法及流式细胞仪Annexin V/PI双标检测法,检测心肌细胞凋亡情况,并通过TR-PCR法检测Bcl-xl和Caspase-3的mRNA表达。结果与假手术组比较模型组凋亡细胞增多,实验组凋亡的细胞数进一步增加。模型组Bcl-xl的mRNA表达下降,实验组下降更明显及模型组Caspase-3的mRNA表达增高,实验组表达最高。结论血管生成素2促进缺血心肌细胞凋亡,其机制可能与抑制Bcl-xl表达及促进Caspase-3表达有关。
关键词：血管生成素2,心肌细胞,凋亡
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