神经诱导（共7篇）
神经诱导 篇1
帕金森病是一种常见的慢性进行性神经系统退行性疾病, 主要影响55岁以上的老年人群[1], 严重影响患者的生活质量。其主要的病理变化为黑质多巴胺能神经元的丢失和路易小体 (Lewy body) 沉积。它的确切病因仍未明确, 目前的治疗主要是改善帕金森病人的运动症状。但典型的PD只有当黑质致密部超过50%的多巴胺神经递质退化时, 才会出现运动症状[2]。最近的研究假设PD的发病机制可能涉及到多个起因, 而不仅是一个因素[3]。经典的PD动物模型为神经毒素模型, 主要针对多巴胺信号, 导致选择性黑质多巴胺神经元变性, 模拟PD大部分的病理和表型特征, 治疗目标为恢复有效的多巴胺功能而缓解症状。小鼠是一种小哺乳类动物, 具有基底神经节结构与功能, 类似于人类大脑的同源结构。该文主要介绍常用的PD小鼠模型的特异性和局限性, 使PD研究者根据实验的具体目的选择合适的PD动物模型。
1 6-羟基多巴 (6-hydroxydopamine, 6-OHDA) 模型
1968年Ungerstedt应用6-OHDA首次成功的诱导出PD动物模型, 6-OHDA与儿茶酚胺的化学结构相近, 在细胞外通过细胞表达被DA和/或去甲肾上腺素转运体所识别, 转运至DA神经元聚集在线粒体内, 通过抑制线粒体复合酶I和IV阻断电子传递链, 增加氧化应激, 导致多巴胺神经元的变性。是否会导致大量多巴胺纹状体通路病变及纹状体DA的显著下降, 取决于6-OHDA的注射剂量[4]。它不能通过血脑屏障 (the blood brain barrier, BBB) , 需利用立体定位仪定位注射入动物脑黑质致密部 (Substantia Nigra Pars Compacta, SNpc) 或前脑内侧束 (the medial forebrain bundle, MFB) 或纹状体。SNpc或MFB定点注射12 h后即出现约90%的多巴胺细胞丢失, 称为“急性完全损毁”模型, 注射后需给予相关的支持护理, 否则易死于不能取食和渴感缺乏等并发症[5]。纹状体定点注射使黑质多巴胺神经元进行性丢失, 比SNpc或MFB定点注射病变过程缓慢而温和, 更符合PD的进行性发病过程[6]。
6-OHDA模型的优势为仅诱导一侧大脑半球的神经变性, 致对侧身体的行为学症状, 可更好的评估其运动障碍及药物治疗效果。其缺点是小鼠死亡率较高, 且没有路易小体的沉积, 不能模拟PD的发病机制, 因此被看作是一个人工的急性黑质纹状体损害模型。
2 MPTP (1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine) 模型
MPTP在1980s因导致人类PD而被认知, 很快被用来诱导PD动物模型。它为高亲脂性化合物, 能有效的透过BBB, 主要被小胶质细胞识别, 被单胺氧化酶氧化成MPDP+, 随后自氧化成毒素MPP+。在细胞外通过多巴胺转运蛋白 (DAT) 被DA神经元摄取, MPP+阻断神经元线粒体复合酶I的活性, 大幅度增加氧化应激的水平。MPP+可在12~72 h之内导致纹状体多巴胺水平下降, 并逐渐导致SNps多巴胺神经元的死亡。MPTP主要采用腹腔内注射或皮下注射的全身给药方式, 可建立大剂量一次注射的急性PD模型和小剂量长期注射的慢性PD模型。一般首选慢性或亚急性模型, 因急性模型死亡率较高, 且症状主要由纹状体DA水平和酪氨酸羟化酶下降所致, 可自发的恢复至正常, 行为学持续时间较短。而小剂量MPTP诱导的慢性模型, 2周后开始出现运动迟缓症状, 并可持续至6个月, 其行为学表现更加明显和稳定, 有时可在细胞内形成α-突触核蛋白的包含物[7]。
MPTP模型是最常用的PD模型, MPTP模型不仅能复制PD的行为学症状, 且准确的模拟黑质纹状体系统的退行性变。另外MPTP模型可影响肠道DA神经系统致结肠蠕动障碍, 消化功能障碍是PD病人早期的主要症状。最后MPTP模型对于研究PD线粒体功能障碍的实验也较价值。但MPTP急性模型具有比较高的死亡率和可变, 其急性退行性变也不能模拟PD病因的复杂性和多变性。
3 鱼藤酮模型
流行病学证据表明暴露于杀虫剂可增加PD的患病风险, 故使用农药诱导PD动物模型引起大家关注。最引起关注的是鱼藤酮, 它是一种天然的杀虫剂, 可通过静脉、皮下、腹腔注射或口服等方式给药。它是一种高亲脂性化合物, 可通过血脑屏障进入脑内, 抑制线粒体复合酶I的活性, 降低谷胱甘肽的水平, 产生大量的活性氧, 并可间接抑制泛素系统[8]。鱼藤酮对小鼠多巴胺系统相当温和, 一般SNpc多巴胺细胞丢失不超过45%[9], 低于出现人类PD症状的阈值, 但鱼藤酮小鼠模型可出现行为学症状。Hoglinger[10]认为这不仅是多巴胺系统退行性变的原因, 与鱼藤酮影响纹状体5-TH神经元、c AMP调节的磷蛋白和蓝斑也有关系。鱼藤酮模型最大的缺点是其全身性毒性作用, 主要影响心血管系统。其主要的优势为黑质纹状体通路及肠道神经元均出现路易小体[11], 故鱼藤酮模型可以成为研究PD早期阶段周围神经系统病理的模型。
4 神经炎症模型
炎症最近成为PD发病机制的重要因素, 当前使用的所有神经毒素均可诱导黒质纹状体束均出现神经炎症反应。为了模拟这方面的PD模型, 可以选择注射脂多 (lipopolysaccharide, LPS) 。它是一种内毒素, 可全身或定点注射给药, 通过小胶质细胞活化和细胞毒性分子释放, 诱导黑质纹状体通路急性损害和类帕金森病症状。Hunter等人[12]将LPS注入小鼠纹状体, 诱导黒质纹状体通路进行性退变, 4周后注入SNps 41%的细胞丢失, 而纹状体DA水平降低42%。LPS模型适用于PD炎症机制的相关实验研究, 但它缺乏基底神经节之外的症状和急性自然的诱导变性。
5 结语
神经毒素PD模型是经典的动物模型, 然而他们仅出现局限的生化反应而无明显的PD病理学改变, 且其作用是短暂的, 通常仅用于测试药物的治疗效果。因此模拟出一个具有所有病理和表型特征的动物模型, 是一个有待解决的问题。随着PD“基因时代”的来临, 基因模型更贴切的复制PD的发病过程, 虽然基因模型未证实是否复制PD的大部分的主要特征, 但其为研究PD的病因及验证PD修饰治疗方法的研究者提供了补充性的选择。
摘要：帕金森病 (Parkinson's disease, PD) 是一种常见的神经系统退行性疾病, 其主要的病理改变为黑质多巴胺能神经元的进行性丢失、纹状体多巴胺的耗竭和残留的神经元胞浆中路易小体的形成, 但其确切病因仍未明确。目前对帕金森病病因和病理生理机制的认知, 主要来源于对PD动物模型的深入研究。为进一步研究PD, 该文对目前常用的神经毒素诱导的PD动物模型进行概述, 为相关研究者选择合适的动物模型提供一定依据。
关键词：帕金森病,动物模型,6-OHDA,MPTP,鱼藤酮,脂多糖
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神经诱导 篇2
关键词：神经干细胞,胶质瘤细胞,细胞培养,细胞迁移
自从神经干细胞成功分离,为中枢神经系统疾病治疗上存在的诸多问题的解决提供了可行办法。但是,如何使移植神经干细胞准确有效的迁入其所需部位并分化是近年神经科学工作者所关注的一个热点。本实验通过研究胶质瘤细胞在体外对神经干细胞的迁移诱导作用,为将来神经干细胞的临床应用奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料
SD大鼠由南通医学院实验动物中心提供,C6细胞株购自中科院上海细胞所,5-BrdU购自NEOMARKERS公司,Mouse Anti-Nestin IgG1购自CHEMICON公司,Mouse Anti-BrdU IgG1为NEOMARKERS公司产品。
1.2 方法
1.2.1 神经干细胞培养及传代
选用1～2d的SD大鼠,碘伏消毒后,在超净台下解剖暴露两侧大脑半球及小脑,取少许两侧大脑皮层组织,大小约1mm3,放入DMEM F12培养基洗涤两遍,尽量将组织剪碎;将皮层组织转移至10mL玻璃离心管并加入6～8mL DMEM/F12培养液,用毛细吸管将皮层组织机械分离成单细胞悬液,筛网过滤,离心(500r/min)5min,弃上清液并用bFGF2、B27、D MEM/F12培养基定容,细胞记数。按25cm2培养瓶中接种1×106个/4mL进行接种。将培养瓶放入37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养,5～7d原代神经细胞球形成。3～4d更换培养液。
将原代神经球吹打制成单细胞悬液,接种至含Brdu(浓度为5μmol/L)的bFGF2、B27、DMEM/F12培养液中培养5～7d即可形成次代神经球。换液同前。
1.2.2 Nestin和Brdu免疫荧光检测
Nestin免疫荧光检测:(1)贴壁:将培养的原代神经细胞球吸出,接种至置于24孔培养板内的盖玻片(多聚赖氨酸包被),放入37℃、5%CO2培养箱培养2h,使神经细胞球贴壁。(2)固定:吸去培养液加入4%多聚甲醛少许,室温下固定30min,去除固定液,PBS洗涤3次,每次10min。(3)封闭:用含10%羊血清、0.3%Triton-100的0.01mol/L PBS液在37℃条件下孵育封闭10min。(4)检测:加一抗(小鼠抗Nestin IgG1按1∶500倍稀释),放入4℃冰箱过夜,吸去一抗,洗涤同前。再加入二抗(FITC标记的羊抗小鼠IgG,按1∶150倍稀释),避光,在37℃水浴箱内孵育30min,吸去二抗,洗涤同前。(5)观察记录:在激发光波长为490nm,滤色光波长为520nm的共聚焦显微镜下观察照相(图1)。
Brdu免疫荧光检测:(1)贴壁;(2)固定;(3)封闭。方法同Nestin检测。(4)检测:一抗为小鼠抗Brdu IgG1(按1∶1000倍稀释),二抗为FITC标记的羊抗小鼠IgG(按1∶200倍稀释),余操作同前。(5)观察记录(图2)。
1.2.3 胶质瘤细胞与神经干细胞联合培养
将C6胶质瘤细胞、神经干细胞分别接种在置于6孔培养板内的半圆盖玻片上(多聚赖氨酸已包被),用无血清培养基培养2～4h使细胞贴壁,将胶质瘤细胞所贴壁的盖玻片与神经干细胞贴壁的盖玻片一起放在24孔培养板培养,并设空白对照,观察神经干细胞的生长及其形态学变化(图3)。
2 结果
2.1 Nestin和Brdu免疫荧光检测
Nestin-FITC,Common Focus(20×)
图片左侧为:C6胶质瘤细胞,图片右侧为:神经干细胞球
Nestin即巢蛋白,是一种仅存于神经上皮干细胞的中间丝成分,可作为神经干细胞的标志物。我们通过免疫荧光检测,发现神经球内的几乎所有细胞均呈Nestin阳性。从而证明我们培养的细胞球是神经干细胞球。
5-BrdU免疫荧光检测:5-BrdU即5-溴-2脱氧尿苷,它是胸腺嘧啶核苷的替代品。在细胞分裂的DNA合成前期,可以作为底物结合到新合成的DNA中,从而可验证神经干细胞的增殖能力。我们将用含5-BrdU的培养液培养形成的次代神经细胞球进行抗-BrdU免疫荧光检测显示,绝大多数细胞呈BrdU阳性。
2.2 C6细胞与神经干细胞联合培养
C6细胞和神经干细胞联合培养,可观察到神经干细胞分化,长出细胞突起,神经细胞球周围的细胞突起的密度及长度在各个方向上有明显的差异,在靠近胶质瘤细胞的一侧,突起的密度及长度均大于在其他方向上的突起,并且可见部分干细胞向胶质瘤细胞方向移动了。
3 讨论
3.1 神经干细胞培养及鉴定
自1992年Reynolds等[1]首先报道自成年小鼠纹状体分离培养出能在体外不断增殖,具有多种分化潜能的神经干细胞以来,对神经干细胞的研究便成为热点。后来的研究又在海马齿状回、脊髓、隔区、纹状体的实质及人的大脑内均成功分离出神经干细胞[2,3,4]。近年,分离、培养干细胞的技术日臻成熟。从实验用神经干细胞获取的角度看,从胎脑的纹状体区和海马齿状回容易获得,但对动物和取材技术要求较高。用成熟大鼠取材对培养技术和培养基要求又较高,不易存活。我们从新生大鼠大脑皮层分离培养出了具有分裂增殖能力的神经干细胞,在体外培养条件下形成典型的神经细胞球。Nestin免疫荧光染色为Nestin阳性,并通过5-BrdU免疫荧光染色证实这些细胞具有分裂增殖能力。说明新生大鼠皮层可培养出神经干细胞。我们的体会是从新生大鼠皮层分离培养神经干细胞有实验动物容易获得、取材简单、一次可获得大量干细胞和干细胞易成活的优点。
BrdU-FITC,Common Focus(20×)
3.2 胶质瘤细胞和神经干细胞共培养
Qu等[5]将神经干细胞注入2岁大鼠的侧脑室,发现神经干细胞在鼠脑内出现对称性迁移并分化成神经元和胶质细胞;Corbin等[6,7]研究发现,神经元有两种不同的迁移方式,即放射状迁移和正切迁移。这些研究提示,在成年人脑内可能有特定的诱导神经干细胞迁移的机制和信号物质。Kim等[8]的研究初步证明了这一点,他们发现端脑的GABA类联络神经元和小脑的谷氨酸类神经元分泌至细胞外基质的一种名为Reelin的糖蛋白,在神经干细胞的迁移中起重要作用。更有趣的是,Karen等[9]发现将神经干细胞移植至有移植胶质瘤生长的鼠脑内,神经干细胞很快充满肿瘤,并沿着浸润的肿瘤细胞而分布,即使将神经干细胞接种在肿瘤的远隔部位,甚至把神经干细胞接种在对侧大脑半球和侧脑室,它们也可穿过正常脑组织移行入胶质瘤。这说明胶质瘤的生长环境中或胶质瘤细胞本身存在着引导神经干细胞迁移的信号物质。假设胶质瘤细胞产生这种信号物质,那么在体外培养的胶质瘤细胞也应该有这种作用,如果我们能证实这种作用,即说明胶质瘤细胞中存在引导神经干细胞迁移的物质。于是,我们首先设计了限定区域共培养的方法在体外培养条件下观察神经干细胞的生长及其形态学变化。在实验中,我们从形态学方面观察到与胶质瘤细胞共培养的神经干细胞出现迁移和分化现象,具体作用机制还有待进一步研究。但该研究已初步说明在体外培养条件下胶质瘤细胞具有诱导神经干细胞迁移作用。从而为进一步研究胶质瘤细胞诱导神经干细胞迁移的机制,并为神经干细胞应用于临床,提高脑及脊髓损伤、胶质瘤和中枢神经系统退行性疾病的治疗效果奠定了一定的基础。
参考文献
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神经诱导 篇3
沉默信息调节因子1 (silent information regulator 1, SIRT1) 是哺乳动物中第一个被发现的去乙酰化酶Sirtuin蛋白家族成员, 作为一种NAD+依赖的脱乙酰基酶, 它与组蛋白乙酰基酶共同维持细胞核的乙酰化平衡。SIRT1以组蛋白和多种非组蛋白作为底物, 通过其去乙酰化作用调节基因转录、染色体稳定性和靶蛋白活性, 进而参与能量代谢、细胞周期、细胞衰老及肿瘤发生发展等生理病理过程的调节。近年来, 有关SIRT1的神经保护作用受到越来越广泛的关注。为进一步验证SIRT1可能具有的广泛的神经保护作用, 本研究拟采用NMDA诱导的兴奋性神经毒细胞模型, 应用 (cell counting Kit-8) CCK-8分析、乳酸脱氢酶 (LDH) 检测、Western-blot等方法, 明确SIRTI高表达在NMDA诱导的兴奋性神经毒中的保护作用。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞, 购自上海中国科学院细胞库;胎牛血清购自Gibco公司;NMDA试剂购自sigma公司;CCK-8购自Dojindo;Lipofectamine 2000 转染试剂、Opti-MEM 无血清培养基购自Invitrogen公司;MEM、F12培养基, Commassie改良增强型蛋白质定量试剂盒购自武汉博士德生物工程公司;质粒提取试剂盒购自全式金生物有限公司;兔抗人SIRT1抗体购自Abcam公司;β-actin山羊抗兔二抗购自中杉金桥;Super ECL Plus超敏发光液购自普利莱基因技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
SH-SY5Y培养基为MEM、F12, 含有10%胎牛血清, 100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素。将细胞以1×105的细胞浓度接种于孔板或培养瓶中, 培养于37℃, 5% CO2条件下, 每3天以1∶2传代一次。
1.2.2 NMDA毒性诱导
采用NMDA (500 μmol/L) 和甘氨酸 (10 μmol/L) 共孵育2 h, 更换培养基继续培养10 h, 再进行后续的CCK-8、LDH测定以及蛋白提取。
1.2.3 质粒转染
按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒后, 利用脂质体介导的方法将其转入SH-SY5Y细胞中。细胞培养24 h后进行转染, 质粒和lipo2000以1∶2.5混合后, 加入无血清无双抗培养基中, 培养6 h后更换为全培养基, 继续培养24h～36 h, 转染效率达到最高。
1.2.4 CCK-8的测定
将培养在96孔板中的细胞在转染24 h后, 加入NMDA进行毒性诱导, 继续培养12 h, 然后每孔加入CCK-8 10 μL, 37 ℃避光培养2 h, 上酶标仪测定, 检测波长450 nm, 参比波长650 nm。
1.2.5 乳酸脱氢酶释放检测
将培养在六孔板中的细胞转染24 h后 , 加入NMDA进行毒性诱导, 继续培养12 h, 收集细胞培养液进行LDH活性检测。
1.2.6 Western blot检测与分析
利用Commassie法测定蛋白浓度。用10%分离胶、5%浓缩胶进行SDS-PAGE电泳, 将蛋白转移到PVDF膜后, 用0.3%明胶中室温封闭1 h, 加入一抗SIRT1 (1∶5 000) 、β-actin (1∶3 000) 4 ℃孵育过夜, 洗膜后加入二抗 (1∶3 000) 室温孵育1.5 h。洗膜后加入ECL超敏发光液, 曝光拍照, 用分子生物学图像分析系统进行定量。β-actin条带作为内参。
1.3 统计学处理
应用SPSS13.0软件分析。数据以均数±标准差
2 结 果
2.1 SIRT1蛋白水平的改变
Western blot结果显示, 与正常组相比, SIRT1过表达组中SIRT1含量上调, 增加1.15倍 (P<0.05) ;空质粒组、lipo2000组未影响SIRT1的表达水平 (P>0.05) 。详见图1。
注:与对照组相比, **P<0.01。
2.2 SIRT1高表达对NMDA引起的细胞活力下降的作用
将构建的SIRT1表达载体转入SH-SY5Y细胞中24 h后, 加入NMDA (500 μmol/L) 作用2 h, 继续孵育12 h后采用CCK-8检测细胞活力。结果显示, 而SIRT1高表达可有效抑制NMDA引起的细胞活力下降, 使其活力恢复60.95% (P<0.05) ;与正常组相比, lipo2000、SIRT1组对细胞活力无统计学意义 (P>0.05) 。详见图2。
注:与对照组相比, **P<0.01;与NMDA组相比, ##P<0.01。
2.3 SIRT1高表达对NMDA引起的LDH释放的作用
在LDH实验中发现, 与对照组相比, NMDA组的LDH水平增高了59.45% (P<0.05) ;SIRT1高表达使NMDA诱导释放的LDH减少24.26% (P<0.05) ;lipo2000、SIRT1组对LDH的释放无统计学意义 (P>0.05) 。详见图3。
注:与对照组相比, **P<0.01;与NMDA组相比, ##P<0.01。
3 讨 论
谷氨酸作为中枢神经系统一种重要的神经递质, 当在突出间隙中过度积聚时, 可以激活突出后膜NMDA受体, 使胞外Ca2+内流, 激活多种蛋白酶, 过度产生自由基, 这些因素共同作用, 引起神经元损伤甚至死亡, 产生兴奋性神经毒效应[3]。
研究发现, 热量限制 (calorie restriction, CR) 可以延长酵母及啮齿动物寿命, 推迟哺乳动物年龄相关的疾病如癌症、动脉粥样硬化及糖尿病的发生, 可能正是通过增加去乙酰化酶Sirtuin活性而起作用。这类蛋白修饰酶最初是在酵母中发现, 被称为沉默信息调节因子2 (silent information regulator 2, Sir2) 。随后, 人们在哺乳动物体内也发现了具有广泛去乙酰化作用的Sir2编码蛋白。在哺乳动物基因组中, 目前证实存在7种Sir2同系物 (SIRTs 1-7) , 其中SIRT1是氨基酸序列最接近Sir2的同系物。SIRT1可能通过其去乙酰化酶活性参与调节物质代谢, 如抑制糖酵解、维持血糖稳定、防止脂肪变性等。最新研究表明, SIRT1高表达后通过其去乙酰化作用, 激活不同信号通路可防止心肌肥大, 血栓形成以及血管平滑肌的肥大。
在多种神经损伤模型, 如脑缺血性损伤模型、AD大鼠模型、HD小鼠模型、肌萎缩性侧索硬化症 (ALS) 和脊髓和延髓肌萎缩症 (SBMA) 模型, 通过上调SIRT1增加其去乙酰化酶活性, 发挥神经保护作用。在 p25转基因鼠, SIRT1过表达可以显著对抗神经退行性病;在猴的阿尔茨海默病 (Alzheimer’s disease, AD) 动物模型中, 高表达SIRT1能减少脑内的β淀粉样蛋白 (amyloid-β, Aβ) , 且脑内Aβ含量与同一区域的SIRT1含量呈负相关[4]。随后离体、在体PD模型中发现, 过表达SIRT1可促进α-synuclein蛋白降解, 减缓神经变性[5]。Parker和他的同事们已在线虫中证明, 过表达SIRT1可以抑制HTT突变引起的神经元死亡[6];在转基因小鼠HD模型中, 将SIRT1过表达可以使小鼠的运动协调能力得到显著改善, 并减轻外周神经及纹状体神经元的损伤[7,8]。将SIRT1基因转染至原代神经元, 发现过表达SIRT1可以拮抗由SOD1突变引起的神经毒性作用。SIRT1高表达在多种疾病损伤模型中可发挥神经保护作用。本实验中利用NMDA诱导的兴奋性神经毒模型, 观察SIRT1高表达在NMDA诱导的细胞损伤中的作用。谷氨酸作为中枢神经系统一种重要的神经递质, 当在突出间隙中过度积聚时, 可以激活突出后膜NMDA受体, 使胞外Ca2+内流, 激活多种蛋白酶, 过度产生自由基, 这些因素共同作用, 引起神经元损伤甚至死亡, 产生兴奋性神经毒效应。在实验中, 利用脂质体lipo2000介导的方法将质粒转入细胞中, 加入NMDA诱导损伤, 采用CCK-8、LDH检测发现, SIRT1高表达可以拮抗NMDA神经毒性损伤, 表现为细胞活力增加, LDH释放减少。
而上述保护效应由SIRT1对底物P53、FOXOs、Ku70、PGC-1α、TAFI68、P300、PCA等的去乙酰化作用介导的[9,10]。相应实验观察显示, SIRT1可以通过使P53去乙酰化, 从而负性调节其活性, 使细胞免于凋亡, 继续分裂生长;SIRT1通过使凋亡激活蛋白FOXOs去乙酰化而抑制其转录, 使神经元免于凋亡[11];SIRT1可以使NF-κB亚基p65的赖氨酸310位点去乙酰化而降低其活性, 防止细胞损伤;SIRT1通过使HSF1 (heat shock factor 1, HSF1) 去乙酰化, 促进HSF1与Hsp70启动子结合, 激活Hsp70, 减少细胞凋亡[12]。
本实验表明, 在NMDA引起的神经毒过程中, SIRT1作用可能受到抑制, 介导神经损伤, SIRT1高表达证实了可以拮抗NMDA引起的细胞损伤作用, 发挥神经保护作用。但是, SIRT1具体的神经保护机制尚未明确, 需要进一步研究证实。
摘要：目的 探讨沉默信息调节因子1 (SIRT1) 高表达对NMDA诱导的兴奋性神经毒中的保护作用。方法 培养SH-SY5Y细胞, 通过脂质体介导的方法将构建的SIRT1表达载体转入到细胞中, 给予NMDA (500μmol/L, 2h) 建立兴奋性神经毒模型;Western Blot检测SIRT1的表达;CCK-8、乳酸脱氢酶 (LDH) 检测细胞活力。结果 NMDA可以引起细胞活力下降, SIRT1高表达可以拮抗NMDA引起的毒性损伤作用。结论 SIRT1高表达能够在NMDA诱导的兴奋性神经毒中发挥保护作用。
神经诱导 篇4
1 材料与方法
1.1 实验动物
新生1 d～2 d的Wistar大鼠 (由山西医科大学实验动物管理中心提供) 。
1.2 主要试剂
细胞培养 OA (Okadaic acid) 、 多聚赖氨酸、阿糖胞苷、胰酶为Sigma公司;茶多酚:由浙江大学茶叶研究所提供, 其中多酚类化合物含量大于96%; Calcein-AM试剂为Sigma公司;CCK-8试剂为Dojindo公司。
1.3 实验方法
共分6组, 对照组、OA组、OA加不同浓度TP组 (TP浓度为5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL和20 μg/mL) 。
1.4 皮层神经元的培养
选用新生1 d～2 d的Wistar大鼠, 分离出大脑皮层组织, 采用机械与酶消化方法, 形成单细胞悬液;细胞浓度调整为1×106/mL, 培养12 d后再加OA和TP。
1.5 Calcein-AM测定
最适合作为荧光探针去染活细胞。在激光共聚焦显微镜 (Olympus, FV1000) 下观察细胞, 激发和发射波长分别为490 nm和515 nm。
1.6 Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 测定
在96孔板中培养皮层神经元, 每孔加入10 μL的CCK-8液, 培养1 h～4 h。在酶标仪上测定, 检测波长450 nm, 参比波长600 nm～650 nm。
1.7 统计学处理
所有数据均经SPSS15.0处理, 测定结果以均数±标准差
2 结 果
2.1 原代培养皮层神经元的观察
原代细胞呈贴壁生长, 24 h后细胞完全贴壁, 形成椭圆形的芽胞状, 有突起, 细胞周围有明显的光晕, 细胞折光性好, 活性强。培养至12 d细胞生长良好, 胞浆透明, 突起发育好。
2.2 OA诱导皮层神经元毒性作用的观察
在倒置显微镜下可观察到神经元在OA作用后形态发生改变, 胞体折光性下降, 突起回缩, 甚至断裂, 溶解成碎片。
2.3 茶多酚拮抗冈田酸诱导皮层神经元毒性作用的观察。
2.3.1 CCK-8活力检测
加入OA后, 细胞活力明显下降与对照组活力比较 (P<0.05) 。采用5 μg/mL和10 μg/mL TP预处理后不能抑制OA引起的细胞活力的降低。而用15 μg/mL、20 μg/mL TP可以发挥拮抗OA诱导的神经毒作用 (P<0.05) 。详见表1。
2.3.2 Calcein-AM染色分析
OA作用后Calcein-AM染色的阳性细胞明显减少, 即活细胞的数量明显降低。预先应用5 μg/mL和10 μg/mL TP阳性细胞数量无明显变化, 无保护作用, 而15 μg/mL 的TP保护作用明显增强, 表现为Calcein-AM阳性染色的细胞数明显增加。20 μg/mL TP的保护作用更加明显。
3 讨 论
AD又称为老年痴呆。目前有关AD的发病机制众说纷纭, 但越来越多的研究证明, 神经细胞内以过度磷酸化的tau蛋白为核心形成的NFTs在AD发病中发挥重要作用。OA是具有特殊构造的聚醚化合物 (C44H66O13, Mr802) 。OA被广泛用于AD模型的研究。
服茶多酚3个月后对AD高危人群认知功能减退具有改善作用[7]。在培养的海马神经元中加入Aβ可引起海马神经元的损伤, 但如果将EGCG (茶多酚的主要成分) 和Aβ一起培养则可显著减轻这种损伤[8]。然而, 茶多酚对OA诱导tau蛋白磷酸化所致皮层神经元毒性的作用未见报道。本实验前期显示, 不同浓度的OA (5nM 、10 nM、 20 nM) 与皮层神经元共培养24 h可引起皮层神经元损伤, 并呈现一定的剂量依赖性。其中以OA 10 nM作用最为明显 [9]。在10 nM的OA作用前, 提前24 h给予不同剂量的TP来观察TP对OA诱导皮层神经元的毒性作用的影响。本研究发现低于10 μg/mL的TP不能拮抗OA诱导皮层神经元的毒性, 而当浓度达到15 μg/mL以上才能拮抗OA的毒性作用。
TP发挥神经保护作用的主要机制是抗氧化作用。许多氧化产物和氧应激介质在AD 病理组织中被发现[8,10,11], 如丙二醛、羟基化合物、SOD 等, 在有关的尸检研究中发现, AD组织中所有的细胞大分子 (蛋白质、脂类、DNA) 均有氧化形成。故氧应激损伤可能是AD 发生和发展的重要因素之一, 出现在老年痴呆症患者神经元病理变化的极早期, 在易感神经元中就有氧化损伤出现[12], 说明氧化损伤是导致疾病的一个早期因素。很多氧化应激标志物在神经缠结还未形成之前就已经可以检测到[13]。另有研究显示, 用窑当归制成注射液为模型大鼠腹腔注射, 用盐酸丁咔地尔 (BHCl) 腹腔注射作阳性对照, 观察窑当归对OA致AD大鼠海马和皮质tau蛋白、SOD、GSH-PX、MDA含量变化。结果显示, 含Se (抗氧化剂) 量7.45 μg/mL的窑当归对OA诱导的AD大鼠脑组织, 有明显降低tau蛋白表达、减少丙二醛 (MDA) 生成的作用[4] 。说明OA诱导皮层神经元, tau蛋白过磷酸化, 同时伴有过氧化反应。这提示早期的抗氧化措施对延缓老年痴呆症发生可能会有一定作用。
茶多酚是抗氧化剂, 茶多酚的抗氧化作用是否对AD起作用呢?以往的动物实验已证明, GTP对脑缺血和Aβ等神经毒素诱致海马神经细胞损伤具有保护作用, 可提高神经细胞的存活率[14,15], 其作用与降低MDA、活性氧 (ROS) 水平和Caspase活性, 提高抗氧化能力和抑制脂质过氧化等作用有关[16]。降低脑片的过氧化水平的同时tau蛋白磷酸化程度也显著降低, 用褪黑素预处理能显著降低花萼海绵诱癌素 (CA) 引起的脑片过氧化反应, 而且tau蛋白磷酸化程度也显著降低。这不仅说明清除自由基可降低tau蛋白磷酸化程度, 而且进一步证实自由基损伤参与了神经细胞tau蛋白过度磷酸化的病理过程, 推测神经细胞中tau蛋白的过度磷酸化可能是氧化应激的下游事件[16]。
本研究显示, 茶多酚在一定浓度可有效地拮抗OA引起的细胞毒作用, 发挥神经保护作用。OA诱导皮层神经元tau蛋白的过磷酸化, 茶多酚可能通过抗氧化作用抑制tau蛋白的磷酸化, 拮抗OA引起神经元损伤。提示茶多酚对防治神经退行性疾病的神经损伤有较好的应用前景。
摘要：目的 探讨茶多酚 (TP) 拮抗冈田酸 (OA) 诱导的皮层神经元神经损伤的作用及机制。方法 冈田酸作用于原代培养皮层神经元后, 加入不同浓度的茶多酚, 采用细胞毒性检测技术, CCK-8检测、Calcein-AM染色, 观察茶多酚对冈田酸诱导的皮层神经元损伤的细胞活力的影响。结果 TP能够拮抗OA冈田酸诱导的皮层神经元损伤, 与对照组比较, TP可以使OA诱导的皮层神经元的活力升高 (P<0.05) , 活细胞的数目增多。结论 茶多酚在一定浓度可有效拮抗OA引起的皮层神经元的损伤, 发挥神经保护作用。
神经诱导 篇5
神经干细胞的发现与应用为某些中枢神经系统疾病的治疗带来了新的曙光[1],但治疗的关键问题是要诱导神经干细胞定向分化为所需的神经元。因此,探求神经干细胞定向分化的最佳微环境成为研究的热点。本实验通过体外培养SVZa神经干细胞,然后分为对照组、BMP2组、ACM组、BMP2+ACM组分别予以诱导分化,研究SVZa神经干细胞在BMP2和ACM作用下分化为GABA能神经元的情况,希望为SVZa神经干细胞的定向分化研究提供一些实验资料。
1 材料和方法
1.1 材料
SPF级孕16 d Wistar大鼠及新生2 d的KM小鼠由第三军医大学实验动物中心提供。培养基及细胞因子:DMEM/F12(Hyclone)、BMP-2和bFGF(Peprotech)、B27(Gibco)、兔抗鼠GAD67(武汉博士德)、兔抗鼠GFAP多克隆抗体、山羊抗兔免疫组化SP检测试剂盒(SP-9001)、DAB显色剂及FITC标记山羊抗兔IgG(北京中杉)。
1.2 方法
1.2.1 SVZa神经干细胞的分离培养及鉴定
取SPF级孕16 d Wistar大鼠,经腹腔麻醉、备皮及消毒后,取出胎鼠。再次消毒后,固定于冰台,剪开头皮和软骨并剥离出整个鼠脑,清洗后在解剖显微镜下切取室管膜前下区脑组织。然后将切取的脑组织移入预置有2 m L无血清培养基的离心管内,用吸管轻轻吹打成单细胞悬液,调整细胞浓度后转移到75 m L培养瓶内,每瓶约1×106个活细胞,加入DMEM/F12(含20 u L/m L的B27和20 ng/mL的bFGF)无血清培养基5～7 m L,于37℃、5%二氧化碳、95%湿度孵箱内进行原代培养。此后根据细胞生长情况,一般每4、5 d传代1次。待细胞增殖形成悬浮球状克隆团后,免疫荧光染色法检测悬浮细胞球的nestin表达阳性。再用10%胎牛血清诱导分化后,分别检测NF、GFAP、CNP表达阳性,以验证其多分化潜能。
1.2.2 星形胶质细胞的纯化培养及ACM的制备
参照严稽文等[2]的方法,取新生2 d的KM小鼠大脑皮质进行原代培养,经差速黏附分离后按1×105个/cm2接种至用多聚赖氨酸包被过的培养瓶中。传代时,将培养瓶置摇床,振荡分离。传代后细胞按0.5×105个/cm2密度接种在培养瓶(培养板)中继续培养。传至第4代时进行细胞爬片,常规免疫组化染色鉴定。实验组的前期实验发现,在不停传代培养过程中,第3代的星形胶质分泌神经生长因子(NGF)、脑源性生长因子(BDNF)等的能力最强,传代培养后的第3～7天,NGF和BDNF的浓度较高。因此,本实验采用培养至第3代第5天的ACM,于收集前2天换入无血清DMEM培养基,收集的无血清ACM经离心后转入无菌玻璃瓶中,-20℃冻存待用。
1.2.3 免疫组化法镜下观察GAD67+细胞分化
取第3代纯化的SVZa神经干细胞,以5×104/m L密度接种于预先用1%多聚赖氨酸处理过的24孔培养板中,每孔1 m L,培养液为新鲜的含10%胎牛血清的DMEM/F12合成培养基,在此基础上分为对照组、BMP2组(加入10 ng/mL BMP2)、ACM组(培养液中含20%的ACM,80%的完全培养基[2])、BMP2+ACM组(在ACM组基础上加10ng/mL BMP2)分别诱导SVZa神经干细胞分化,每组设3个孔,第3、4天半量换液(换液时浓度同上),分化培养7 d后行常规GAD67免疫组化SP法DAB染色,在显微镜下观察分化情况。
1.2.4 流式细胞仪检测GAD67+细胞的比例
取第3代纯化的SVZa神经干细胞单细胞悬液,调整细胞浓度为1×105/m L接种于预先用1%多聚赖氨酸处理过的6孔培养板中,干预及分组情况同免疫组化法,每孔2 m L培养液。每个组设3孔,对照组共设6孔,其中3孔作为流式细胞仪检测的空白对照组。分化培养3d后行GAD67免疫荧光染色,用流式细胞仪检测阳性细胞数,每组3个标本,每个标本检测10 000个细胞,得到阳性细胞在总细胞中的所占比例。阳性率计算:阳性率=阳性细胞/(阳性细胞+阴性细胞)-对照组中的非特异结合率。
1.3 统计学分析
数据以表示,用SPSS 10.0软件进行统计,采用单因素方差分析,P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 SVZa神经干细胞的培养及鉴定
在无血清培养基中可见细胞呈球状克隆团样增殖,见图1,nestin表达阳性,见图2。再用10%胎牛血清诱导分化后,免疫荧光检测NF、GFAP、CNP表达阳性,说明所培养细胞不但能自我更新而且具有多分化潜能,属于神经干细胞。
2.2 免疫组化镜下观察
分化7d后免疫组化DAB染色可以发现,对照组中仅见少量的散在分布的GAD67+细胞,而实验组中GAD67+细胞数较对照组明显增加,尤其是BMP2+ACM组中GAD67+细胞数增加最明显,胞体呈卵圆形,有较长突起,细胞突起相互连接呈网状,见图3。
2.3 流式细胞仪检测分化率
SVZa神经干细胞分化为GAD67+细胞的比例为对照组(9.38±0.73)%,BMP2组(13.90±0.57)%,ACM组(16.85±0.59)%,BMP2+ACM组(20.45±0.94)%。各实验组的GAD67+细胞比例均明显高于对照组,其中BMP2+ACM组分化比例最高,单因素方差分析,P<0.05。
3 讨论
SVZa神经干细胞在体内背-腹信号控制下,不断沿着一条局限化的迁移通道-吻侧迁移流(rostral migratory stream,RMS)向嗅球(olfactory bulb,OB)迁移,最后在嗅球分化为具有OB表型特征的中间神经元,包括多巴胺能神经元和GABA能神经元。而SVZa神经干细胞除自我更新和多分化潜能外,还具有不同于其他神经干细胞的特点:可长距离定向迁移分向[3],故笔者选择SVZa神经干细胞作为研究GABA能神经元产生的细胞模型。
BMP2是转化生长因子-β(TGF-β)超家族成员,对中枢神经系统的发育有着重要的作用。研究表明在E16d大鼠BMP2的免疫荧光染色显示,BMP2表达于从室管膜层(ventricular zone,VZ)到皮层的所有区域,这种表达方式同BMPR IA和BMPR IB的转录相吻合[4,5]。并且原位杂交显示,BMPR IA和BMPR IB广泛地在发育中的神经系统表达。这说明BMP2与神经干细胞的分化密切相关。MEHLER等[6]报道BMP2为1～10 ng/mL时促进祖细胞向神经元和星形胶质细胞分化,而在100 ng/mL时促进细胞凋亡。
神经干细胞在体内外的分化不仅受到自身基因的调控,而且更多地受到外来信号的影响,特别与其所处的微环境是密切相关的。星形胶质细胞是中枢神经系统内数量最多的一种胶质细胞,在结构和功能上是局部微环境理想的传感器和调控器。SONG等[7]发现星形胶质细胞可分泌神经生长因子(NGF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、脑源性神经营养因子(BDNF)等多种细胞因子,可以调控神经干细胞的分化,刺激神经元的产生。ACM作为星形胶质细胞体外培养时的细胞外液,其内含有丰富的可溶性生物活性物质,其促分化作用是单一神经营养因子所无法比拟的。NAKAYAMA[8]报道ACM中的可溶性因子是神经发育不可缺少的。
以往对GABA能神经元的研究多集中于海马来源的神经干细胞,而对于SVZa来源的神经干细胞分化为GABA能神经元报道较少。本研究结果显示BMP2和ACM均可促使SVZa神经干细胞向GABA能神经元分化,而且BMP2+ACM作用更显著(P<0.05),可获得正协同作用。其原因可能是:(1)两者促进神经干细胞向神经元分化的机制不同,存在互补作用。BMP2主要是与受体结合后激活Smad信号途径才能发挥生物学效应[9],而ACM中如GDNF主要是通过与GFR(1作用后促进GABA能神经元分化[10]。(2)有研究发现BMP2的诱导在作用初期较明显[11],而GDNF的作用时间窗较宽[10]。(3)JORDAN等[12]认为BMPs对神经元的作用是间接通过星形胶质细胞而产生,因此BMP2可能还有通过改变星形胶质细胞所分泌到细胞外液中的活性物质而达到调控GABA能神经元分化的作用。本研究为SVZa神经干细胞体外定向分化为GABA能神经元提供了基础研究资料。但BMP2与ACM促进神经干细胞向神经元分化的具体机制仍未完全阐明,有待进一步深入研究。
摘要：目的研究骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP2)及星形胶质细胞条件培养液(astrocyte-conditioned medium,ACM)在室管膜前下区(anterior subventricular zone,SVZa)神经干细胞分化为γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid,GABA)能神经元中的作用。方法体外培养SVZa神经干细胞,分为对照组、BMP2组、ACM组、BMP2+ACM组分别予以诱导分化,通过免疫组化和流式细胞技术分别检测各组SVZa神经干细胞分化后GAD67+细胞的比例。结果各实验组的GAD67+细胞的比例均明显高于对照组,其中BMP2+ACM组尤其显著,差异有显著性(P<0.05)。结论BMP2及ACM可以促进SVZa神经干细胞向GABA能神经元分化,而且BMP2与ACM有正协同作用。
关键词：神经干细胞,细胞分化,GABA能神经元
参考文献
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神经诱导 篇6
1 材料与方法
1.1 切割海马伞
取220-250g SD大鼠(南通大学实验动物中心提供)6只,腹腔注射复合麻醉剂Chlorpent 0.2ml/100克。麻醉后固定于立体定位仪,分离颅骨外骨膜,记录前囟A(矢状轴)、L(冠状轴)、V(垂直轴)坐标,参照Paxinos图谱确定双侧海马伞的切割范围。具体方法详见陈蓉报道[1]。
1.2 Native-PAGE及电洗脱
分别取6只正常及切割海马伞后14天大鼠的海马组织制成匀浆,按照郭尧君方法进行不连续的自然凝胶电泳。根据染色结果切取未染色部分含有83KD蛋白的条带,将其分别切碎后分别放入处理过的透析袋中,加入少量电洗脱缓冲液,然后把透析袋放入普通的核酸电泳槽中,并在电泳槽中加入适量电洗脱缓冲液,在稳压60V条件下进行低温(4℃)电泳2～3小时后,反向电泳5分钟。最后直接用消毒过的移液器吸头把透析袋中液体转入另一处理过的透析袋中。将盛有蛋白提取液的透析袋两端用专门的透析夹夹紧,放入灭菌双蒸水中在4℃环境下透析2～3小时,不断更换双蒸水以尽可能除净液体中的盐分。将透析袋放入20%PEG(分子量20 000)中4℃环境下浓缩30分钟。蛋白定量后将各组蛋白质浓度稀释调整为300μg/ml后分装于消毒过的Eppendorf管中,置于4℃冰箱中备用。
1.3 鼠胚神经干细胞的分离、克隆、检测及扩增
取E17 SD大鼠的前脑组织,按金国华等[3]和谭雪锋等[4]报道的方法,进行神经干细胞的分离、克隆、Nestin免疫荧光检测、BrdU标记和免疫荧光检测及传代和扩增。
1.4 分组及分化培养液:
(1)空白对照组:单纯DMEM/F12无血清培养基;
(2)56KD组:含10μg/ml 56KD蛋白的DMEM/F12无血清培养基;
(3)65KD组:含10μg/ml 65 KD蛋白的DMEM/F12无血清培养基;
(4)83KD组:含10μg/ml 83 KD蛋白的DMEM/F12无血清培养基;
(5)56KD+65KD组:含10μg/ml 56KD和10μg/ml65 KD蛋白的DMEM/F12无血清培养基;
(6)56KD+83KD组:含10μg/ml 56KD和10μg/ml83 KD蛋白的DMEM/F12无血清培养基;
(7)65KD+83KD组:含10μg/ml 65KD和10μg/ml83 KD蛋白的DMEM/F12无血清培养基;
(8)56KD+65KD+83KD组:分别含10μg/ml 56KD、10μg/ml65 KD和10μg/ml 83KD蛋白的DMEM/F12无血清培养基;
1.5 神经干细胞球的接种培养和观察:
将圆盖玻片高温高压消毒后放入4块24孔培养板各孔中,将浓度为0.1mg/ml的多聚赖氨酸涂布于圆盖玻片上,室温下干燥20分钟,用消毒双蒸水冲洗一遍后,置于37℃恒温箱中烘干备用。
4块培养板共计96孔,分成8组,每板每组3孔,每组共12孔,分别加入与上述分组相应的分化培养液1.5ml。将从单克隆后扩增所得到的来源于同一细胞的神经干细胞克隆球吸入10ml玻璃离心管中,用毛细吸管轻轻吹打后加盖垂直静置10分钟,待细胞球完全下沉至管底后,吸去上清液,再混匀克隆球,台盼蓝计数后将适量混匀的细胞球液体种植于上述2块培养板的45个孔中,使每孔接种的细胞克隆球数约为5个左右。将培养板放入饱和湿度、37℃、5%CO2培养箱中培养。每天在倒置显微镜下观察细胞分化情况。培养液每4天半量换液一次。
1.6 MAP-2免疫荧光检测
培养12d后,进行神经元特异性标记物MAP-2免疫荧光检测。吸去培养液,加人100%甲醇1ml,-20℃固定7min。吸去甲醇,每孔再加人含4%多聚甲醛的0.1%mol/L PBS (pH7.2) 1ml,固定20 min。吸去多聚甲醛,每孔加人含10%山羊血清的0.01mol/L PBS (pH7.2)200μl封闭30min。吸去封闭液,每孔加人1:100稀释的鼠抗MAP-2单克隆抗体(Chemicon公司)200μl,室温下轻轻振摇lh后置4℃冰箱中72h。然后吸去MAP-2抗体,每孔再加人1:100稀释的结合有异硫氰酸荧光素(fluoresecein isothiacyanate,FITC)的山羊抗小鼠IgG抗体(sigma公司)200μl,室温下轻轻振摇2h后吸去荧光抗体,最后用甘油缓冲液封片。在激发光波长为495nm,吸收光波长为520nm的荧光显微镜下观察MAP-2阳性的神经元。免疫荧光阴性对照除用0.01mol/L PBS替代MAP-2抗体外,其余步骤同上,结果为阴性。
1.7 MAP-2阳性神经元图象处理和统计学分析
将MAP-2免疫荧光检测时各组摄取的荧光激发情况下的照片导入图像处理系统,应用捷达801系列形态学分析系统软件计数每一个视野内的MAP-2阳性神经元数,同时通过该图像处理系统得到每一张照片中MAP-2阳性神经元的胞体面积和细胞(包括突起)周长。用STATA7.0统计软件对8组的MAP-2阳性神经元数目、平均胞体面积和细胞周长进行方差分析和组间比较。
2 结果
2.1 倒置显微镜下观察结果
接种4小时后,除对照组外7个实验组中神经干细胞球的边缘均长出毛刺样突起。接种后1天8组均见有细胞从球的边缘爬出,但含83KD蛋白的4组可见细胞已经发出突起,其中以56KD+65KD+83KD组细胞的突起最长,56KD+83KD组稍次之,而65KD组和空白对照组最差。起初3～6天内除空白对照组和65KD组细胞生长较慢外,其余6组均有细胞不断自球的边缘向外迁移,突起生长迅速,突起的长度无明显差异。接种9天后,可见很多细胞已从神经球内向外迁移,整个盖玻片上均已布满细胞。向外迁移和分化的细胞已可从形态上区分胶质样细胞和神经元样细胞。其中胶质样细胞迁出较近,大多靠近神经球,胞体较大扁平,呈毯片状平铺于盖玻片上,立体感不强,细胞有较多宽而扁平的突起,有的突起由胞体直接延续而来,难以和胞体区分。而神经元样细胞迁出较远胞体饱满,呈圆形或椭圆形,周围有很强的光晕,立体感强,从胞体发出的突起细长,以双突起为多。空白对照组中几乎未见神经元样细胞(图1)65KD组偶尔可见1～2个神经元样细胞,但突起较短(图2);56KD+65KD+83KD组和56KD+83KD组可见大量光晕很强的神经元样细胞,胞体较大,突起较多较长,且相互交织成网状(图3,4)。其它4组神经元样细胞较多,但胞体较小,突起较少较短,组间镜下观察不出明显差异(图5～8),接种后12天,倒置显微镜下所见和9天时所见无明显区别。
2.2 MAP-2阳性神经元图象处理和统计分析结果
诱导分化后8组的MAP-2阳性神经元数量、胞体面积和细胞周长的数据详见表。方差分析显示8组之间3项指标的F值分别为902.08、64.83和1660.96,P值均为0.0000,表明8组之间这3项指标均有显著性差异。两两比较结果显示:56KD+65KD+83KD组与56KD+83KD组之间没有显著性差异,但它们与其它各组之间均有显著性差异;65KD+83KD组、83KD组、56KD+65KD组和56KD组4组之间无显著性差异,但它们与65KD组和对照组之间均有显著性差异;65KD组和对照组之间无显著性差异。
3 讨论
从发育中和成年哺乳动物脑内分离出的神经干细胞,在体外可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。但研究发现大部分神经干细胞分化成了胶质细胞,仅少数神经干细胞分化为神经元[5]。这不是人们所希望的结果。因此,目前在神经干细胞分化研究中急需解决的问题有二:首先是如何控制神经干细胞向神经元分化而少向胶质细胞分化;其次是如何使神经干细胞分化为特定表型的神经元,如多巴胺能神经元、胆碱能神经元和GABA能神经元等。
神经干细胞的分化受多种因素的影响:①细胞因子的影响:成纤维细胞生长因子(FGF)特别是bFGF在神经干细胞的分化过程中的影响。体外实验已证明bFGF能够直接刺激神经干细胞的增殖与分化。Kuhn等[6]将bFGF注入成鼠的侧脑室内引起了室下区神经元前体细胞数量增加,以及从室下区迁移到嗅球的神经元数量增加。Kilpatrick等[7]发现在血清存在时,高浓度bFGF刺激的克隆只产生较少的神经元,低剂量bFGF时(0.1ng/ml)则产生较多的神经元。Kuhn[6]等还发现EGF能诱导室管膜下区产生星形胶质细胞。白血病抑制因子(LIF)对神经干细胞的分化也有一定的作用。Galli等[8]研究发现在人胚间脑神经干细胞的分化调节中,LIF可促进神经干细胞的分化;在睫状神经营养因子的协同作用下,可使神经干细胞分化为成熟神经元的数量增加2倍。②细胞的自身基因调控机制在神经干细胞的分化过程中也起着一定的作用。神经干细胞和祖细胞可以产生信号调控其自身的分化。有证据表明神经干细胞发育的多样性可能与干细胞表达多种多样的转录因子有关,不同的转录因子的表达导致不同谱系的分化[9]。③中枢神经系统局部微环境对神经干细胞分化的影响。Nishino等[10]的研究发现,移植到去多巴胺神经支配纹状体内的神经干细胞存活和分化为TH阳性神经元的数量要明显地比正常侧纹状体中的为多。从而推测物质对神经干细胞的存活和分化为TH阳性神经元有着促进作用。根据这一推测,Hida等[11,12]利用去多巴胺神经支配的纹状体和正常纹状体提取液在体外培养多巴胺能神经元和PC12细胞,发现加有去多巴胺神经支配的纹状体提取液培养的细胞数量和突起长度明显比用正常侧纹状体提取液培养的细胞要多和长。庆宏等[13]采用梯度离心法获取不同分子量的纹状体提取液,用这种提取液培养中脑黑质神经元,发现纹状体中10～30KD分子量的提取物有支持中脑黑质神经元生存和增强其活性的作用。Nakajima等[14]通过分子生物学方法证实,在去多巴胺神经支配的纹状体内bFGF和GDNF水平增高。bFGF能促进神经干细胞分裂增殖,GDNF可以促进多巴胺能神经元存活和生长。这一结果进一步解释了上述Nishino等[10]将神经干细胞移植到去多巴胺神经支配的纹状体中发现的结果。
我们通过切割海马伞阻断隔区的胆碱能神经元向海马的投射,导致海马中乙酸胆碱递质浓度的降低。由于机体的代偿作用,病变海马可能表达某种物质促进神经干细胞的存活,这种物质还可能诱导神经干细胞向胆碱能神经元分化,以弥补本身乙酰胆碱递质的不足。
海马中56KD蛋白能够诱导神经干细胞向神经元分化。本研究第一部分结果发现海马中83KD蛋白也有诱导神经干细胞向神经元分化的作用。为进一步研究海马中83KD蛋白在诱导神经干细胞向神经元分化方面是否与56KD蛋白具有协同作用、以及与65KD蛋白的关系,本实验将切割海马伞后14天海马与正常海马组织匀浆自然凝胶电泳比较后,将低分子量区所出现的56KD、65KD和83KD 3条差异条带进行电洗脱。收集后,以不同的组合加入鼠胚神经干细胞分化培养液中,观察上述3种差异蛋白对神经干细胞分化为神经元和AChE阳性神经元是否具有明显的促进作用和协同作用。结果显示,海马中83KD蛋白与56KD蛋白在诱导神经干细胞向神经元分化方面具有协同作用。65KD蛋白没有明显的诱导神经干细胞向神经元分化的作用,在含56KD、83KD两种差异蛋白培养液中加入和不加65KD蛋白的组间并没有明显的差异,说明65KD蛋白没有协同诱导神经干细胞向神经元分化的作用。
神经诱导 篇7
1 材料与方法
1.1 实验动物
Wistar大鼠、新生24h内的Wistar乳鼠。
1.2 主要实验仪器
二氧化碳培养箱、XSZ-D型倒置生物显微镜、梯度PCR仪、紫外分光光度仪、台式高速低温离心机、凝胶成像分析系统、单垂直板电泳槽、半干式转移电泳仪、紫外可见分光光度计。
1.3 主要化学试剂
DMEM/F12干粉培养基、无血清培养添加剂B27、D-Hank’s平衡盐溶液、Nestin、氯化钴、DEPC、BIOZOL、DNA Marker DL2、两步法RT-PCR试剂盒、EDTA等。
1.4 实验方法
1.4.1 神经干细胞的分离、培养、传代
神经干细胞培养7～9d后, 离心、收集、分离神经球, 以每毫升5×105个神经干细胞的密度分瓶、传代, 2～3d换半量培养液继续培养。
1.4.2 神经干细胞的鉴定
取部分神经干细胞, 接种于预先涂布多聚赖氨酸盖玻片的六孔培养板中, 加入含EGF及b-FGF的DMEM/F12的条件培养基, 24h后再行Nestin免疫组化染色鉴定。
1.4.3 氯化钴模拟缺氧、及缺氧-复氧模型的制备
将实验组分两组 (缺氧组4h、8h、12h、16h;缺氧-复氧组4h、8h、12h、16h) , 用CoCl2处理神经干细胞造成模拟缺氧模型。
1.4.4 细胞总RNA 的提取
经过裂解细胞、液相分离、沉淀RNA、RNA洗盐、重新溶解RNA、测纯度和定量, 去除混杂的DNA。1.5%琼脂糖凝胶电泳, 在紫外分析仪下观察电泳结果, 观察RNA条带的亮度和完整性。
1.4.5 引物的设计及合成
根据实验需要设计HIF-1α的上游引物为 5’-ATGTGGACAGCGATATGGTCA-3’ 下游引物为5’-AGGTTAAGGCTCCTTGGATGA-3’GAPDH的上游引物为5’-CCACAGTCCATGCCATCACT-3’下游引物为5’-GCCTGCTTCACCACCTTC-3’。扩增长度各为499bp及268bp。
1.4.6 逆转录反应
在PCR仪上进行变性、退火反应。离心使RNA引物沉积于试管底部, 配制反转录反应液后, 在PCR仪上进行反转录反应。
1.4.7 PCR 产物的鉴定、半定量的分析
反转录反应结束后, 取5μL反应液进行电泳实验, 确认PCR 反应产物。将扩增的HIF-1α、GAPDH产物一起行电泳、显色, 同时与DNAMarkers对照, 确定电泳条带。用凝胶成像分析系统摄像并分析电泳条带的平均灰度值, 计算基因表达量。
1.5 统计学处理
应用SPSS13.0统计, 计量资料以均数±标准差表示。
2 结果
2.1 神经干细胞的培养及鉴定
显微镜观察原代单神经干细胞在12h内聚集;到第3天聚集成球形;到第4天可见大量悬浮的神经细胞球, 细胞球呈半透明状, 表面较光滑, 单个细胞呈圆形, 细胞饱满, 细胞与细胞边界清晰, 细胞内部可见粒状结构。将细胞集落离心、吹打分散, 并以1×106个/mL的密度放置在培养皿中, 将培养皿置放到培养箱中培养, 6～7d传代一次, 传代后的神经干细胞球数量明显增多, 细胞内颗粒样物质更为致密, 杂质更少, Nestin表达明显增加。
2.2 缺氧NSCs 形态观察
实验分为缺氧组、复氧组分别培养4h、8h、12h、16h。缺氧4h及8h神经干细胞形态无明显变化。缺氧12h后, 神经干细胞肿胀明显, 折光性差, 并可见细胞碎屑。缺氧16h后, 神经干细胞死亡明显增多。复氧4h、8h、12h随着时间的增加, 神经干细胞肿胀明显, 死亡增多。复氧16h神经干细胞形态与复氧12h组无明显差别。
2.3 缺氧对神经干细胞增殖的影响
缺氧4h时神经干细胞神经球数目较常氧组有少量增加。缺氧8h时神经干细胞神经球数明显增加, 神经球致密, 是常氧组神经数的2倍。缺氧8h后随着时间的增加神经球减少。复氧8h内随着时间的延长, 神经球数减少。12h、16h神经球数无明显差别, 数目稳定。
2.4 缺氧及复氧对HIF-1αmRNA表达的影响
在缺氧及复氧组中, HIF-1αmRNA在分子量为499bp处出现不同程度的DNA条带。在缺氧8h时HIF-1αmRNA表达增多, 8h后随着时间的增加HIF-1αmRNA的表达逐渐减少。复氧组中HIF-1αmRNA随着时间的增加表达反而较少。 (见表1) 。
*P<0.01 VS对照组;#P>0.05 VS 对照组。
3 讨论
神经干细胞是具有自我更新和多分化潜能的细胞。氧是生命存在的必要条件, 经研究表明氧浓度的变化可影响细胞的功能状态。缺氧常可引起神经细胞的损伤[1], 缺氧后再复氧更进一步加重细胞的损伤。氯化钴缺氧模型的机制是钴可替代亚铁螯合于血红蛋白中, 从而损伤细胞对氧的感受[2]。经查询国内外大量资料表明10%的氧浓度能促进神经干细胞增殖更为明显。超过10%氧浓度的重度低氧抑制细胞增殖, 并随时间的增加加重细胞的损伤, 导致细胞的坏死。HIF-1α是细胞低氧反应中最重要的调控因子之一, 在低氧的条件下HIF-1α对NSCs的增殖与凋亡有什么样的作用, 国内外研究的不多。缺氧可以引起细胞损伤, 复氧可以使细胞损伤加重, 复氧加重细胞损伤的机制仍不十分清楚。HIF-lα和HIF-1β共同组成HIF-1, 其中HIF-lα亚单位对氧浓度调节细胞功能有专一性, 决定了HIF-1的主要活性。它受细胞氧浓度的变化调节细胞功能的机制是复杂的, 涉及到遗传物质的表达;生物蛋白的稳定性;细胞核的定位;以及缺氧、复氧后转录功能的增强;HIF-1β是芳香烃受体转位因子ARNT, 能与多种蛋白形成二聚体, 结合成DN[3～5]。HIF-1可调控基因的表达, 参与糖酵解途径基因表达, 调控血红素氧合酶、葡萄糖转运蛋白、腺苷酸激酶、和酪氨酸羟化酶等基因的表达[6]。研究HIF-1αmRNA的表达以及对细胞损伤有什么联系, 有利于弄清神经细胞在缺氧以及缺氧后再复氧中HIF-1因子所能发挥的作用。本实验表明, 使用氯化钴缺氧模型, 缺氧4h后洗涤去除CoCl2形成复氧。实验结果显示缺氧组神经球数目在4h时有少量增加, 8h神经球数目比常氧组增多2倍, 8h后神经球数目减少并有细胞坏死。说明低氧在一定时间内能促进NSCs数目的增加。复氧后随着时间的增加神经球数略有减少, 12h后神经球数目恒定。PCR检测神经干细胞的HIF-1αmRNA表达水平, 显示在缺氧及复氧组中, HIF-1αmRNA在分子量为499bp处出现不同程度的DNA条带。在缺氧8h时HIF-1αmRNA表达增多, 8h后随着时间的增加HIF-1αmRNA的表达逐渐减少。复氧组中HIF-1αmRNA随着时间的增加表达反而较少。实验结果显示: (1) 中等程度的低氧条件更有利于NSCs的增殖; (2) 低氧在一定时间内可增加神经干细胞内HIF-lα的表达, 实验结果显示8h HIF-lα的表达达到高峰; (3) HIF-1参与了低氧引起的神经干细胞的增殖。
参考文献
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