诱导作用（共12篇）
诱导作用 篇1
在教学中, 我们常常会发现这种现象:越是低年级学生, 发言的积极性越高。小学课堂上, 一个问题提下去, 几十双手举起来, 回答起来也声音洪亮, 积极雀跃;随着年龄的增长, 举手的人渐渐少了, 到了技工教育阶段甚至就没人举手了, 即使回答, 声音也是低低的, 课堂气氛沉闷不堪。难道学生的思维能力随着年龄的增长、知识的增多反而降低了?
当然不是, 这种现象实际上是学生年龄心理差异的一种表现。作为老师, 应当考虑到学生这种变化着的心理特点, 设计难易适度并能激发学生兴趣和思考的问题, 启发诱导他们积极有效的思维, 让这些“思维着的精神开出地球上最美的花朵”, 而不应一味形式地要求他们当堂发言。
例如《林教头风雪山神庙》, 我在对课文作了疏通后, 没有详细讲述林冲的悲剧性格, 而是提了一个看似和课文没多大关系的问题:“林冲为什么没有被大火烧死?”学生的积极性一下子就被调动起来。大家各抒己见, 畅所欲言, 从各种角度谈了自己的看法:有的学生从林冲性格谈起, 认为他做事小心谨慎, 例如他“盖火炭”、“摸火种”, 认为草料场没有着火的可能了才放心离开草料场, 从而躲过此劫;有的学生认为是那场纷纷扬扬的大雪救了林冲的命, 如果没有雪, 就没有草屋的被崩坏, 林冲身上的寒冷, 以及林冲的去沽酒, 路遇山神庙。没有雪, 就没有草厅被压倒, 林冲无处容身, 只得借宿山神庙, 从而躲过此险;也有的学生认为这是天意, 就像书上说的这是“天理昭然, 佑护善人义士”, 认为是林冲命不该绝;有的学生认为这是作者的巧妙安排, 若烧死林冲就没有后面的故事安排;有的学生则认为大火不是天灾而是人祸, 是有人想置林冲于死地, 邪恶战胜不了正义, 所以林冲没有被大火烧死……最后, 经过学生热烈的讨论以及我的归纳总结, 学生理解了林冲性格的特点, 也懂得了文章在结构安排上前后呼应的好处, 更看到了作者思想上的局限性, 可谓一举多得。
这一教学实践证明, 让学生结合课文思考问题远比教师辛辛苦苦地分析课文更能培养学生独立思考问题的能力;教师旁敲侧击指出思考的突破口, 就能较好地启发学生开动脑筋解决问题。其实, 到了中学教育阶段, 学生课外阅读面拓宽了, 他们的“成人感”变得特别强, 他们开始关注人生、事业以及社会问题, 并希望参与评论, 希望能发表自己独到的见解, 以期一鸣惊人。虽说课堂气氛不够活跃, 但似乎人人都蕴蓄着一种力量, 智慧的火花随时会因一导火索而迸发出来。因此, 作为老师要创造条件让学生能联系生活实际, 多层次, 多角度进行思维, 而这就需要老师根据教学目的、教学内容及学生实际, 进行设疑。
所以, 老师在课堂上的启发诱导, 对学生正确理解一篇课文的作用是至关重要的。在教学中, 还要鼓励学生不“唯书”、“唯上”, 积极质疑、发言, 对教材作出自己的分析、鉴赏、评价, 用各种形式表达、交流自己的所思所感, 最终通过老师的点评, 接受思想道德、情感审美等方面的陶冶, 同时扩大视野、增长知识, 这样才符合当代中学生发展个性的要求, 也能满足他们参与、发表的欲望和引人注意、获得成功的要求, 就能极大地提高他们学习语文的积极性和自觉性, 使他们的个性得到充分的发挥。
赵俊, 江苏镇江技师学院教师。
诱导作用 篇2
JIP-测定(JIP-test)是以生物膜能量流动为基础建立的分析方法.利用该方法可以获得有关光系统Ⅱ的`大量信息.文章介绍了快速叶绿素荧光诱导动力学曲线的定义、数据分析方法及相关参数的意义,并举例说明如何利用该方法分析不同环境条件对光合机构主要是PSⅡ的供体侧、受体侧及PSⅡ反应中心的影响.
作 者：李鹏民 高辉远 Reto J.Strasser LI Peng-Min GAO Hui-Yuan Reto J.Strasser 作者单位：李鹏民,高辉远,LI Peng-Min,GAO Hui-Yuan(山东农业大学植物科学系,泰安,271018)
Reto J.Strasser,Reto J.Strasser(Bioenergetics Laboratory,University of Geneva,Jussy-Geneva,CH-1254,Switzerland)
诱导作用 篇3
关键词：诺丽果汁；H2O2；PC12细胞；细胞坏死；乳酸脱氢酶
中图分类号： TS275.5文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）02-0317-03
收稿日期：2015-03-24
基金项目：中国热带农业科学院海口实验站科研启动项目（编号：HKZKY140204）；农业部财政项目“热带野生果树种子资源收集、利用和评价”。
作者简介：谭琳（1974—），女，博士，副研究员，研究方向为食品分子营养。E-mail：tanlin7402@126.com。
通信作者：马蔚红，研究员，主要从事热带作物种质资源收集与评价研究，E-mail：zjwhma@163.com；郑学勤，研究员，主要从事热带作物遗传育种研究。E-mail：zhengxxxqin@126.com。氧化应激是由活性氧自由基和活性氮自由基产生和清除失衡引起的应激损伤状态[1]，在中枢神经系统退行性疾病中起着重要作用[2-3]。近年来，越来越多的研究显示植物多酚具有强抗氧化性，且在防治氧化损伤神经退行性疾病有着重要的作用[4-5]。诺丽（Morinda citrifolia），又称诺尼、海巴戟，属茜草科巴戟天属植物，主要分布在南太平洋诸岛屿以及中国的海南岛、西沙群岛和台湾岛等地[6]。早在2 000多年前，南太平洋岛屿的波利尼西亚人就发现诺丽果实具有天然的健康和医学功效，经常将诺丽果压成汁液，作为日常饮品和用于治疗癌症、糖尿病、高血压等多种疾病[7]。现代医学也表明诺丽具有抗氧化、抗癌、降糖等多种生物学活性[8-10]，但是关于其神经保护方面的功能鲜见报道。前期研究表明诺丽果汁中多酚含量高达1.934 mg/mL，且对DPPH 自由基、ABTS 自由基、羟自由基、过氧化氢等均具有很好的清除活性[11]。本研究利用H2O2诱导类神经细胞系PC12细胞产生氧化损伤模型，检测诺丽果汁对PC12细胞的保护作用，旨在为新型诺丽果汁保健产品的开发奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1细胞PC12高分化细胞（大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株）购于中国学科院典型培养物保藏委员会昆明细胞库。
1.1.2诺丽果汁诺丽果由郑学勤研究员采自海南陆侨集团三亚种植基地，将采来的新鲜诺丽果实去皮和去籽，果肉用医用纱布包裹，挤压，得到诺丽果汁，果汁再用一次性0.22 μm 滤膜（milipore）进行过滤除菌，备用。
1.1.3药品和试剂RMPI1640培养液购自北京索莱宝公司；无支原体胎牛血清为杭州四季清生物工程材料有限公司产品；Trypsin为 Amersco 公司产品；DMSO、LDH 脱氢酶试剂盒购自Promega公司；MTT、Hoechst33342/PI细胞凋亡测定试剂盒上海美吉生物医药科技有限公司。
1.1.4主要儀器超净工作台（苏净安泰VS-840K-U，苏州），二氧化碳培养箱（Thermo/Forma3111，美国），倒置荧光显微镜（Zeiss/Axiovert 40CFL，德国），全自动酶标仪（Thermo Multiskan FC，美国）；细胞培养瓶，细胞培养板（康宁）。
1.2方法
1.2.1细胞培养PC12细胞培养用含10%胎牛血清 RMPI 1640 培养液，37 ℃、5% CO2条件下培养，每2 d传代1次。待细胞增长至80%融合时，用0.25%胰酶消化细胞，调整细胞密度至1 × 105 个/mL 后传代或接种于细胞培养板进行各项指标测定。
1.2.2细胞形态检测取对数生长期的PC12细胞接种于96孔培养板中，每孔100 μL。培养24 h后吸弃培养液。试验分为对照组、损伤组、预防组，每组设3个复孔。对照组细胞按常规方法培养，预防组用终体积分数分别为1%、2.5%、5%的诺丽果汁培养24 h后，吸弃培养液，PBS冲洗1～2次，加入H2O2终浓度为0.3 mmol/L的培养液，培养4 h，损伤组用不含诺丽果汁的培养液培养，其余处理方法与预防组细胞相同，荧光倒置显微镜检查细胞形态。
1.2.3MTT检测诺丽果汁对氧化应激损伤PC12 细胞活力的影响按照“1. 2 .2”节进行试验分组、给药处理及培养，然后用MTT法测定细胞活力，向各孔加入5 g/L的MTT后继续培养4 h，小心吸弃所有培养液，每孔加入150 μL二甲基亚砜（DMSO） 振荡10 min。在酶标仪上以560 nm 波长测定各孔吸光度D。按相对活力=（D处理-D空白）/（D正常平均-D空白） × 100%公式计算细胞相对活力。
1.2.4细胞凋亡和细胞坏死检测根据Hoechst33342/PI试剂盒说明书进行细胞凋亡和细胞坏死检测。先配制好染色缓冲液，然后对各处理组进行离心收集悬浮细胞，用PBS洗涤细胞2次。取适量离心收集好的细胞用0.5～1 mL 染色缓冲液将细胞重悬，使其浓度大约为1 ×106 个/mL。加入5 μL Hoechst 33342染色液。 轻轻混匀后室温避光孵育10～15 min。用PBS洗涤细胞1次，用0.5～1 mL染色缓冲液将细胞重悬，加入5 μ LPI染色液，轻轻混匀后室温避光孵育10～15 min，再用PBS洗涤细胞1次，加PBS稀释至适当浓度后荧光显微镜检测结果。Hoechst33342-DNA的最大激发波长为350 nm，最大发射波长为460 nm，PI的最大激发和最大发射波长分别为488、615 nm。
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1.2.5LDH檢测诺丽果汁对PC12 细胞的保护作用细胞凋亡或坏死而造成的细胞膜结构的破坏时，细胞内的LDH会释放到培养基中，而活细胞则不会，所以培养上清中LDH的活性可以反映细胞的死亡或损伤程度。各组细胞经相应处理后，吸取细胞培养上清，按照试剂盒说明书操作检测LDH含量。
1.2.6数据处理与统计分析采用SAS 9.0统计分析软件分析试验数据，处理组之间差异显著性分析采用邓肯氏（Duncans）多重比较法，以P<0.05为差异显著。
2结果
2.1诺丽果汁对PC12细胞形态的影响
本研究发现，对照组细胞呈长梭形或多角形镶嵌状排列，细胞边界清晰，大小均匀，细胞丰满，无重叠生长现象（图1-A）。而H2O2损伤组细胞出现收缩、变圆、体积变小，细胞间隙增宽，大部分细胞破碎、脱落，但细胞轮廓尚较清晰（图1-B）。用不同剂量诺丽果汁预处理后均有不同程度的保护作用，细胞形态好于损伤组（图1），其中10%诺丽果汁预处理组细胞形态与对照组接近（图1-E）。
2.2诺丽果汁对H2O2氧化损伤PC12细胞存活率的影响
不同质量浓度诺丽果汁均可减小H2O2对细胞的增殖抑制作用，细胞存活率从120%增加到166%，与H2O2损伤组比，差异极显著（P<0.01）（图2）。此结果表明，在一定浓度范围内，诺丽果汁不仅有保护细胞免受损伤的作用，而且还有促进细胞增殖的作用。
2.3诺丽果汁对H2O2氧化损伤PC12细胞坏死的影响
Hoechst33342是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，与DNA结合，凋亡细胞有膜通透性改变，主要摄取Hoechst染料，凋亡细胞中的凝聚染色质会比正常细胞中的染色质染色更深、更加明亮，表现为强蓝色荧光。坏死细胞由于有很强的PI嗜染性并可覆盖Hoechest染色，故呈强红色荧光。本研究发现，对照组有少数 PI染色阳性细胞（橘黄色），300 μmol/L H2O2处理组PI染色阳性细胞显著增加，而经诺丽果汁预处理后PI阳性细胞完全没有，但有少量凋亡细胞（亮蓝色）（图3）。以上结果表明，诺丽果汁可显著地减少H2O2诱导的细胞坏死。
2.4诺丽果汁对H2O2氧化损伤PC12细胞LDH漏出率的影响
研究发现对照组中的LDH含量较低，而模型组中的LDH含量极显著高于对照组。经诺丽果汁保护后，LDH含量下降，并随诺丽果汁浓度的增加而显著降低（（图4）。结果表明，诺丽果汁有效降低H2O2对PC12细胞的氧化损伤，且在1%～5%的浓度范围内其保护效果与诺丽果汁浓度呈正相关。
3结论与讨论
本研究用H2O2造成PC12神经细胞氧化损伤模型，通过荧光显微镜观察细胞形态，MTT测定细胞存活率、乳酸脱氢酶（LDH）活力检测法，Ho/PI染色检测细胞凋亡探讨诺丽果汁对过氧化氢所致PC12细胞氧化损伤的影响，发现1%～5%体积分数诺丽果汁均能不同程度地保护细胞形态，增加细胞的生存率，抑制过氧化氢诱导的PC12细胞坏死，减少损伤后LDH的生成，表明1%～5%体积分数诺丽果汁对过氧化氢诱导的PC12细胞损伤有保护作用，这将为诺丽果用于开发神经保护方面的保健品奠定了理论依据。
自1983年Mosmann创立了MTT比色法以来，由于其经济、灵敏、无放射性污染等特点，使之成为细胞生物学及相关研究领域一种常用的细胞活性检测方法[12]。本研究采用MTT 比色法分析了1%～5%范围内诺丽果汁对过氧化氢诱导PC12损伤存活率的影响，发现其不仅有保护细胞免受损伤的作用，而且还有促进细胞增殖的作用，但有研究显示，10%诺丽果汁能降低Hela细胞（宫颈癌细胞）22.3%的生存率，具有抗癌作用[13]，这表明不同浓度范围的诺丽果汁对细胞的增殖作用不同。
虽然本研究首次报道了1%～5%体积分数诺丽果汁具有神经保护作用，但是在更大浓度的范围内，诺丽果汁对过氧化氢诱导的PC12细胞损伤是否还存在保护作用尚不得而
知。此外，1%～5%体积分数诺丽果汁产生的保护作用机制尚不清楚。因此，今后将在更广的浓度范围内研究诺丽果汁对PC12细胞的保护作用，并探究其作用机制。
参考文献：
[1]付艳玲.氧化应激与阿尔茨海默病以及抗氧化治疗研究进展[J]. 国际神经病学神经外科学杂志，2010，37（4）：336-340.
[2]Dubinina E E，Schedrina L V，Neznanov N G，et al. Oxidative stress and its effect on cells functional activity of Alzheimers disease[J]. Biomeditsinskaia Khimiia，2015，61（1）：57-69.
[3]Joshi Y B，Praticò D. The 5-lipoxygenase pathway：oxidative and inflammatory contributions to the Alzheimers disease phenotype[J]. Frontiers in Cellular Neuroscience，2014，8（8）：436.
[4]Pasinetti G M，Wang J，Ho L，et al. Roles of resveratrol and other rape-derived polyphenols in Alzheimers disease prevention and treatment[J]. Biochimica et Biophysica Acta，2014（14）：00312-00313.
[5]Malar D S，Devi K P. Dietary polyphenols for treatment of Alzheimers disease-future research and development[J]. Current Pharmaceutical Biotechnology，2014，15（4）：330-342.
nlc202309030834
[6]李法营，蓝增全，刘昌芬，等. 诺丽研究进展（一）——国内外研究进展[J]. 安徽农业科学，2009，37（32）：15819-15821.
[7]许国平，张春妮.诺丽作用机制的研究进展[J]. 医学研究生学报，2007，20（9）：974-977.
[8]Lin Y L，Chou C H，Yang D J，et al. Hypolipidemic and antioxidative effects of noni （Morinda citrifolia L.） juice on high-fat/cholesterol-dietary hamsters[J]. Plant Foods for Human Nutrition，2012，67（3）：294-302.
[9]Kma L. Roles of plant extracts and constituents in cervical acncer therapy[J]. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention，2013，14（6）：3429-3436.
[10]Lee S Y，Park S L，Hwang J T，et al. Antidiabetic effect of Morinda citrifolia （Noni） fermented by cheonggukjang in KK-A（y） diabetic mice[J]. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine，2012，2012：163280.
[11]李奕星，袁德保，郑晓燕，等. 诺丽果汁的抗氧化性研究[J]. 热带作物学报，2013，34（8）：1531-1534.
[12]熊建文，肖 化，张镇西.MTT法和CCK-8法检测细胞活性之测试条件比较[J]. 激光生物学报，2007，16（5）：559-562.
[13]Gupta R K，Banerjee A，Pathak S，et al. Induction of mitochondrial-mediated apoptosis by Morinda citrifolia （Noni） in human cervical cancer cells[J]. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention，2013，14（1）：237-242.張福生，何成芳，朱鸿杰. 基于腐烂指数的草莓采后货架期预测模型[J]. 江苏农业科学，2016，44（2）：320-323.
诱导作用 篇4
The prevalence of obesity is increasing rapidly worldwide.Along with the increase in obesity,a parallel increase in the prevalence of metabolic complications has occurred,such as diabetes,and dyslipidemia[1].Insulin resistance plays central role in the clustering of these disease.Searching for novel and safe drugs against metabolic abnormal disease continues to be the major focus in drug discovery.
Several studies have shown beneficial effects of berberine on diabetes,hyperlipidemia and obesity[2].A series of reports showed that berberine may stimulate glucose uptake[3],inhibit adipocyte differentiation[4],stimulate insulin secretion[5],enhance insulin sensitivity,and increase insulin receptor expression[6].However,the mechanisms remain largely uncertain,and data on the effect of BBR on deep adipose tissues,liver lipid and endoplasmic reticulum(ER)stress are very limited,especially from in vivo studies[7].Recent research suggested that ER stress plays an important role in the onset of the state of obesity,insulin resistance and T2DM[8].The ER and related signaling networks are emerging as a potential site for the intersection of inflammation and metabolic disease[9].It is not clear how for berberine to ameliorate insulin resistance and improves insulin sensitivity and whether there is a crosstalk between inflammation and endoplasmic reticulum(ER).
In vivo animal models such as high-fat diet-induced obesity(DIO)mouse and rats have been developed and used extensively in the investigation of metabolic diseases[10].Therefore,the aim of the present study was to examine the metabolic effects and related mechanisms of BBR in a DIO rat model.The effects of BBR on the plasma concentration of glucose and lipids,inflammatory cytokines and liver biomarkers of endoplasmic reticulum(ER)stress were also investigated.
1 Materials and method
1.1 Animal experiments
Sprague-Dawley rats were obtained from Shanghai BK Experimental Animal Center.Animals were kept in an environmentally controlled breeding room(temperature:(20±2)℃,humidity:(60±5)%,12-h dark/light cycle).All rats had free access to food and water.After 1 week of acclimation with free access to regular rodent chow and water,obesity was induced by high fat diet.Diets induced obesity(DIO)rats were treated with a total dose of BBR of 75,150 or 300mg/kg everyday,respectively(n=12).Vehicle group was treated with physiological saline solution(n=12).Pioglitazone at 10 mg/kg was treated as positive control(n=12).Rat weight and food intake were recorded every 3 days with the day of treatment with berberine or control as day 0.At 7,14,21 days,fasting plasma parameters were tested.Blood samples were taken by tail.When sacrificed on days 21,rats liver,kidney,spleen and epididymal fat tissues were dissected and weighed.The liver tissues from the vehicle-treated controls or the berberine-treated DIO mice were frozen in liquid nitrogen immediately and stored at80℃.All experimental animals were overseen and approved by the Animal Care and Use Committee before and during experiments.
1.2 RNA preparation and Quantitative real-time PCR analysis
Total RNA was prepared with TRIzol(Invitrogen)according to the protocol recommended by the manufacturers.RNA was dissolved in pure water and quantified at 260/280 nm,and sample integrity was checked by 1.5%agarose gel electrophoresis.Realtime reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR)analysis was used to measure mRNA expression of genes TNF-a,IL-6,CHOP and eIF in the control ofβ-actin.mRNA expression of genes was quantified by the one step SYBR PrimeScriptTM RT-PCR kit according to the manufacturer's instructions(Takara).The primer sequences used for the real-time PCR analyses are available in table 1.
1.3 Measurement of triglycerides,free fatty acids,LDL and cholesterol
Blood sample from each rat was collected and serum was separated by centrifugation for the measurement of level of glucose,triglyceride and total cholesterol.Serum glucose concentrations were analyzed using Glucose(HK)Assay Kit(Sigma-Aldrich).Serum triglyceride concentrations were analyzed using Serum Triglyceride Determination Kit(SigmaAldrich).Serum cholesterol concentrations were analyzed using Amplex(R)Red Cholesterol Assay Kit(Invitrogen).All experimental assays were done according to the manufacturer's instructions.
Note:Data are presented as means±SEM(in mmol/L).1)P<0.05 or 2)P<0.01 compared to vehicle
1.4 Statistical analysis
Data were assessed by SPSS 11.5 software.Results are expressed as mean±standard deviation(SD).The One-Way ANOVA Post-Hoc Multiple Comparisons LSD and t-test were used for statistical comparison between groups and within group.A difference was considered significant at P<0.05.
2 Results
2.1 Berberi ne reduced weight gain,deep adipose tissues
There is not significant change in cumulative food or water intake over 3 weeks.On day 21,the body weight of Berberine group declined slightly.Compared with vehicle group,the decreased rate was0.1%,0.7%,2.3%in 75,150 and 300 mg/kg separately[(479.1±7.3),(484.8±11.3),(473.9±11.4)vs.(486.3±11.1)g].While the body weight of Pioglitazone increased 1.8%[(492.0±11.6)vs.(486.3±11.1)g].Vis-ceral fat was dissected and weighed after the rats were sacrificed.The results showed that deep adipose tissues of 300 mg/kg berberine group were lower than vehicle group[(15.51±2.55)g vs.(18.66±1.66)g,P=0.03].
Note:1)P<0.05,2)P<0.01 compared to vehicle
2.2 Effects of Berberine on blood glucose and serum insulin levels
Berberine showed hypoglycemic effects in DIO rats.Fasting blood glucose levels were measured after rats were fasted for 6 hours on days 7 and 14(during treatment),day 21(last day of treatment).From day14,pioglitazone(10 mg/kg)significantly decreased fasting blood glucose of diabetic rats(Fig.1).Compared with vehicle group,berberine(300 mg/kg)and pioglitazone(10 mg/kg)both decreased fasting blood glucose of diabetic rats on day 21.Unlike pioglitazone group,berberine had no effect on the raised diabetic serum insulin levels.
2.3 Effect of BBR on plasma lipids and free fatty acids
Berberine showed dose dependent effect on fasting total cholesterol(TG),triglycerides(TC)and free fatty acids(FFAs).After 21 days of treatment,the levels of TG,TC and FFAs decreased in the high dose berberine group(P=0.05,P=0.04,P=0.05).Pioglitazone also significantly decreased TG,TC and FFAs levels(P=0.03,P=0.01,P=0.02).(Table 1).
Note:A:real-time PCR analysis of genes involved in inflammation(A),endoplasmic reticulum stress(B)from the liver of DIO rats treated with vehicle or BBR.Each value indicates the amount of m RNA relative to that in the vehicle-treated mice.Actin was used as the invariant control.Data are means±standard deviation SD(n=10).1)P<0.05 or 2)P<0.01 compared to vehicle
2.4 BBR regulated the expression ofgenes in-volved in inflammatory and ER stress in the liver of DIO rats
Inflammation-related genes TNF-a,IL-6 and endoplasmic reticulum stress-related genes CHOP,and eIF,significantly decreased in the berberine group(Fig.2).
3 Discussion
Diabetic-dysli pidemic rats induced by high-fat and high-cholesterol diets are easily obtained.It is steady animal models for simulating clinically obesity individuals complicated with dyslipidemia and also for screening drugs with hypoglycemic effects.In the present study,the effects of BBR on metabolic diseases were assessed using a DIO rat model.We observed that berberine(300 mg/kg)had hypoglycemic effect and hypolipidemic effect.The effect of BBR on insulin secretion were investigated,as well as food intake and body weight,parameters relating to liver insulin signal,ER stress and inflammation were assessed.All results showed berberine significantly improved the metabolic control induced by diets.
BBR has been shown to have hypoglycemic and insulin-sensitizing activity both in animal model[11]and in type 2 diabetes mellitus patients[12,13].Previous research has identified BBR as a drug candidate for hyperlipidemia,which is also characteristic of subjects with insulin resistance and T2DM.Pitoglitozone was selected for evaluating hypoglycemic and hypolipidemic activity.It was associated with better blood glucose and lipid control in type 2 diabetic patients.Decrease in body weight and deep adipose tissues demonstrated after 3 weeks of treatment in the high dose berberine group in our research.BBR administration into DIO mice reduced body weight without a significant effect on food intake,which is consistent with previous reports[14].Thus,unlike TZDs,which may lead to weight gain,BBR may be more suitable for insulin-resistant T2DM patients with obesity.
The results showed hypoglycemic effects of BBR at week 3.Despite studies supporting the insulinotropic capabilities of BBR[15],our study did not show any insulinotropic effect in accordance with a recent study in rats.The effect of BBR on insulin secretion is controversial.The reason for these discrepancies is unclear and may be due to the different experimental conditions and research models used.The insignificant effect of BBR on the aforementioned parameters suggest that BBR improves glucose control through other mechanisms,such as reduction of FFA and inflammation response,leading to improved insulin sensitivity and also may be related to reduction of ER stress.
Several studies have demonstrated that FFAs are inversely related to pancreaticβ-cell response to glucose,and elevated blood FFAs contribute to the development of insulin resistance and T2DM.We found in DIO rats that BBR supplementation appeared to decrease plasma FFA levels as well as lipid deposition in the liver.The similar phenomena was observed when impaired glucose tolerance rats were given with berberine,and a recent in vitro study showed that BBR can reverse FFA-induced insulin resistance in adipocytes[16].The general idea is that as consequence of both hepatic and peripheral insulin resistance,the hepato-cellular accumulation of triglycerides,initially leads to an altered metabolism of glucose and free fatty acids in the liver.Hence,the improved ability of BBR to control blood glucose might be related to its FFA and lipid lowering effects.
Low-grade chronic inflammation is one of the major characteristics of obesity and obesity-related metabolic disorders such as diabetes mellitus[17].Neutralization of overexpressed TNF-αin obese fa/fa rats caused a significant increase in the peripheral uptake of glucose in response to insulin.These results indicate a role for TNF-αin obesity and particularly in the insulin resistance and diabetes that often accompany obesity.It is reported that in insulin-resistant states of obesity and T2DM,the plasma concentration of TNF-αis increased.In the previous study,researchers have shown that berberine has both antiadipogenic and anti-inflammatory effects on 3T3-L1adipocytes[18].We observed that berberine treatment at the doses of 300 mg/kg/d tended to reduce levels of the inflammatory biomarkers TNF-αin the liver,which plays essential roles in metabolism,biosynthesis,excretion,secretion and detoxication.Therefore,it is likely that BBR could improve metabolic diseases probably through its anti-inflammatory property as well[19].ER stress has been recognized in various models of liver injury and human liver diseases[20].Livers and hepatocytes from rats on a high saturated fat diet were characterized by increased CHOP protein.Moreover,an in vitro model of hepatocytes(HepG2)shows that triglycerides induce the expression of endogenous ER stress markers,including peIF2alpha and CHOP.ER stress,in turn,leads to the suppression of insulin receptor signaling,and therefore insulin resistance.In the present study,we found for the first time that the mRNA of ER stress gene expression profile,such as CHOP and EIF was reduced after berberine treatment.ER stress are associated with metabolic derangements,especially with insulin resistance[21].In this aspect,it is interesting to note that BBR reduced inflammatory gene expression in liver of obese animals[22].Inflammation and ER stress are linked at many levels:both are short-term adaptive systems necessary for the function and survival of the organism and both are detrimental when chronically engaged.Both of ER stress and inflammation responses will influence on insulin resistance.
诱导作用 篇5
设α为任意锐角。
诱导公式一：终边相同的角的同一三角函数的值相等
sin(2kπ+α)=sinα(k∈Z)，cos(2kπ+α)=cosα(k∈Z)，tan(2kπ+α)=tanα(k∈Z)，cot(2kπ+α)=cotα(k∈Z)
诱导公式二：π+α的三角函数值与α的三角函数值之间的关系
sin(π+α)=-sinα，cos(π+α)=-cosα，tan(π+α)=tanα，cot(π+α)=cotα
诱导公式三：任意角α与-α的`三角函数值之间的关系
sin(-α)=-sinα，cos(-α)=cosα，tan(-α)=-tanα，cot(-α)=-cotα
诱导公式四：π-α与α的三角函数值之间的关系
sin(π-α)=sinα，cos(π-α)=-cosα，tan(π-α)=-tanα，cot(π-α)=-cotα
诱导公式五：2π-α与α的三角函数值之间的关系
sin(2π-α)=-sinα，cos(2π-α)=cosα，tan(2π-α)=-tanα，cot(2π-α)=-cotα
诱导公式六：π/2±α及3π/2±α与α的三角函数值之间的关系
sin(π/2+α)=cosα，cos(π/2+α)=-sinα，tan(π/2+α)=-cotα，cot(π/2+α)=-tanα，sin(π/2-α)=cosα，cos(π/2-α)=sinα，tan(π/2-α)=cotα，cot(π/2-α)=tanα，sin(3π/2+α)=-cosα，cos(3π/2+α)=sinα，tan(3π/2+α)=-cotα，cot(3π/2+α)=-tanα，sin(3π/2-α)=-cosα，cos(3π/2-α)=-sinα，tan(3π/2-α)=cotα，cot(3π/2-α)=tanα
三角函数诱导公式推导过程
万能公式可以用三角函数诱导公式来推导：
诱导作用 篇6
doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2014.04.008
Study on the Balanced Regulation of Juanbi Granule on Th17/Treg Cells in Mice with Collagen-induced Arthritis
LIU Wei-chao，LI Ling-yu，WAN Chun-ping，LI Zhao-fu，ZHENG Xi，QI Yan，WU Jing-jin，PENG Jiang-yun
【ABSTRACT】 Objective：To study the balanced regulation of Juanbi Granule on Th17/Treg cells in mice with collagen-induced arthritis in order to explore its mechanism in the treatment of rheumatoid arthritis.Methods：The arthritis models were induced by the bovine type II collagen.20 DBA/1 mice were divided equally into the CIA group and the Juanbi granule group according to the clinical score.The arthritis clinical score method was used to observe the seriousness of the onset of arthritis in CIA mice；the flow cytometry was used to detect the subpopulation of the splenic lymphocytes （CD4，CD8，B220），and the Th17，Th1 cytokines and the expression of Treg cells in CD4+T cells.Results：Juanbi Granule could significantly reduce the clinical score of CIA mice with collagen-induced arthritis，but had no significant effect on the subpopulation of the splenic lymphocytes （CD4，CD8，B220）.Meanwhile，it down regulated the expression level of IL-17A in the CD4+T cells of CIA mice，promoting the expression of Treg cells in a certain extent.Conclusion：Regulating the balance of the Th17 cells and Treg cells and down-regulating the expression of the proinflammatory cytokine IL-17A may be one of its mechanisms in the treatment of rheumatoid arthritis.
【Keywords】 arthritis，rheumatoid；arthritis，collagen-induced；Juanbi Granule；Th17 cell；regulatory
T cells；mice
蠲痹颗粒是中医学家吴佩衡学术继承人、云南省名老中医吴生元教授基于扶阳理论总结出的治疗类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）的效方，主要由附片、川芎、赤芍、桂枝、麻黄、薏苡仁、五加皮等组成，具有温经散寒、祛风除湿、通络止痛之功，主治寒湿痹阻之RA。最新研究表明，Treg、Th17细胞功能和分化过程具有共同之处却又相互对抗，其平衡失调影响着RA发生与转归[1-2]。
1 实验材料
5 参考文献
[1]Littman DR，Rudensky AY.Th17 and regulatory T cells in mediating and restraining inflammation[J].Cell，2010，140（6）：845–858.
[2]Bettelli E，Carrier Y，Gao W.Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells[J].Nature，2006，441（7090）：235-238.
[3]万春平，彭江云，李兆福，等.蠲痹颗粒对胶原诱导性小鼠关节炎的抑制作用及机制研究[J].中药材，2013，36（9）：1505-1507.
[4]周茹，杨以阜，左建平.II型胶原诱导的小鼠关节炎动物模型的建立及影响因素[J].中国药理学通报，2006，22（12）：1532-1535.
[5]King C，Tangye SG， Mackay CR.T follicular helper （TFH）cells in normal and dysregulated immune responses[J].Annu Rev Immunol，2008，26：741-766.
收稿日期：2014-02-21；修回日期：2014-03-17
诱导作用 篇7
1 材料与方法
1.1 试药
肝胆清片 (江苏黄河药业股份有限公司) ;联苯双酯片 (上海信谊天平药业有限公司) 。实验前用灭菌蒸馏水溶解配成所需浓度。
1.2 动物
清洁级Balb/c小鼠, 雄性, 6~7周龄, 购自上海斯莱克动物实验公司。
1.3 试剂
Con A为Sigma产品;MDA、SOD、ALT、AST、TNF-α、考马斯亮蓝试剂盒均购自上海生工。
1.4 模型制备及给药方法
雄性Balb/c小鼠60只随机分成肝胆清高、中、低剂量组、联苯双酯组、空白对照组、模型组, 每组10只。空白对照组及模型组给予生理盐水, 联苯双酯组给予200 mg/kg联苯双酯, 肝胆清高、中、低剂量分别为12、6、3 g/kg, 灌胃, 每天给药1次, 连续10 d。末次给药4 h后, 正常组尾部生理盐水, 静注, 其余组尾部Con A 20 mg/kg, 静注。禁食不禁水, 8 h后摘眼球取血, 离心取血清;取上述各个实验组小鼠肝脏, 液氮中保存[1,2]。
1.5 血清AST、ALT及TNF-α测定
实验中通过眼球取得的全血离心, 取上清, 按照AST、ALT及TNF-α试剂盒进行测定。
1.6 肝匀浆MDA、SOD的测定
准确称取1.4中液氮保存的小鼠肝脏, 加入9倍预冷的生理盐水, 匀浆, 离心后去上清液, 按MDA、SOD试剂盒说明书进行测试上述两项数据。同时测定小鼠肝脏的蛋白质含量 (考马斯亮蓝法) 。
1.7 统计学处理
将上述数值用SPSS 18.0软件进行统计学分析, 计量资料采用 (±s) 表示, 采用t检验, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肝胆清片对肝损伤小鼠 (Con A诱导) 血清ALT和AST的影响
表1显示, Con A诱导的肝损伤小鼠血清ALT、AST与空白对照组比较有显著的升高 (P<0.01) , 表明模型成功;给予肝胆清后, 血清AST、ALT明显下降, 尤其是高剂量组降低血清AST、ALT的作用与联苯双酯组相当 (P>0.05) 。但低剂量组与联苯双酯组比较差异有统计学意义 (P<0.01) 。
U/L
*与模型组比较, P<0.01;#与空白对照组比较, P<0.01
2.2 肝胆清片对肝损伤小鼠 (Con A诱导) 血清TNF-α的影响
表2显示, Con A诱导肝损伤小鼠血清TNF-α与空白对照组比较有显著的升高 (P<0.01) , 表明模型成功;给予肝胆清后, 血清TNF-α明显下降, 尤其是高剂量组。但低剂量组降低血清TNF-α较低。
μg/L
*与模型组比较, P<0.05;**与模型组比较, P<0.01;#与空白对照组比较, P<0.01
2.3 肝胆清片对肝损伤小鼠 (Con A诱导) 肝匀浆MDA和SOD的影响
表3显示, Con A诱导肝损伤小鼠肝匀浆与空白对照组比较SOD显著降低, MDA明显上升 (P<0.01) , 表明模型成功;给予肝胆清片10 g/kg后, 肝匀浆SOD明显升高, MDA明显降低 (P<0.01) , 但中、低剂量组对Con A诱导肝损伤小鼠肝匀浆MDA、SOD的影响较小。
*与模型组比较, P<0.05;**与模型组比较, P<0.01;#与空白对照组比较, P<0.05;##与空白对照组比较, P<0.01
3 讨论
Con A诱导的小鼠免疫性肝损伤模型, 被认为更适合研究人类病毒性肝炎及自身免疫性肝病的发病机制和抗肝损伤药物的筛选评价, 故自身免疫性肝病的动物模型一般采用Con A诱导的小鼠免疫性肝损伤模型[2]。目前广泛运用作为肝损伤的检测指标的有血清ALT、AST、TNF-α与肝匀浆MDA、SOD等[3,4,5,6,7,8]。在之前的研究中就有人用它们作为肝损伤的检测指标, 比如谢灵璞等[9,10,11,12]在肝损伤的保护作用中采用的肝损伤的检测指标中都都采用了上述指标。本文亦采用常用的检测标准血清ALT、AST、TNF-α及肝匀浆SOD、MDA作为评价指标从而考察肝胆清片对免疫性肝损伤的保护作用。由于肝胆清片的处方组中含有猪鬃草、金钱草、龙胆、大黄、黄连、延胡索、鸡内金、赭石、吴茱萸, 其中金钱草具有利水通淋、除湿退黄、解毒消肿的功效, 能够清肝胆湿热, 退黄疸。龙胆具有清热燥湿、泻肝火的功效, 能够清肝胆邪热, 还可以用于治疗肝胆实热所致的胁痛、头痛、口苦、耳赤、耳聋、阴肿阴痒诸证。而本研究结果表明, 肝胆清片高剂量组能显著降低血清ALT、AST, 明显提高肝匀浆SOD, 降低肝匀浆MDA (P<0.01) 。实验结果表明:肝胆清片对肝细胞起到一定的保护作用, 这也为肝胆清片在临床中应用进一步提供相关的病理学依据。
摘要：目的:观察肝胆清片对肝损伤小鼠 (ConA诱导) 的保护作用。方法:通过测定血清丙氨酸转氨酶 (ALT) 、谷草转氨酶 (AST) 以及肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 、肝匀浆超氧化物歧化酶 (SOD) 、丙二醛 (MDA) 等数值, 研究肝胆清片对小鼠肝脏的保护作用。结果:肝胆清片高剂量组能够明显降低肝损伤小鼠模型 (ConA诱导) 的血清ALT、AST、TNF-α、肝匀浆MDA, 提高肝匀浆SOD (P<0.01) 。结论:肝胆清片对ConA诱导肝损伤小鼠具有一定的保护作用。
诱导作用 篇8
关键词：神经干细胞,胶质瘤细胞,细胞培养,细胞迁移
自从神经干细胞成功分离,为中枢神经系统疾病治疗上存在的诸多问题的解决提供了可行办法。但是,如何使移植神经干细胞准确有效的迁入其所需部位并分化是近年神经科学工作者所关注的一个热点。本实验通过研究胶质瘤细胞在体外对神经干细胞的迁移诱导作用,为将来神经干细胞的临床应用奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料
SD大鼠由南通医学院实验动物中心提供,C6细胞株购自中科院上海细胞所,5-BrdU购自NEOMARKERS公司,Mouse Anti-Nestin IgG1购自CHEMICON公司,Mouse Anti-BrdU IgG1为NEOMARKERS公司产品。
1.2 方法
1.2.1 神经干细胞培养及传代
选用1～2d的SD大鼠,碘伏消毒后,在超净台下解剖暴露两侧大脑半球及小脑,取少许两侧大脑皮层组织,大小约1mm3,放入DMEM F12培养基洗涤两遍,尽量将组织剪碎;将皮层组织转移至10mL玻璃离心管并加入6～8mL DMEM/F12培养液,用毛细吸管将皮层组织机械分离成单细胞悬液,筛网过滤,离心(500r/min)5min,弃上清液并用bFGF2、B27、D MEM/F12培养基定容,细胞记数。按25cm2培养瓶中接种1×106个/4mL进行接种。将培养瓶放入37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养,5～7d原代神经细胞球形成。3～4d更换培养液。
将原代神经球吹打制成单细胞悬液,接种至含Brdu(浓度为5μmol/L)的bFGF2、B27、DMEM/F12培养液中培养5～7d即可形成次代神经球。换液同前。
1.2.2 Nestin和Brdu免疫荧光检测
Nestin免疫荧光检测:(1)贴壁:将培养的原代神经细胞球吸出,接种至置于24孔培养板内的盖玻片(多聚赖氨酸包被),放入37℃、5%CO2培养箱培养2h,使神经细胞球贴壁。(2)固定:吸去培养液加入4%多聚甲醛少许,室温下固定30min,去除固定液,PBS洗涤3次,每次10min。(3)封闭:用含10%羊血清、0.3%Triton-100的0.01mol/L PBS液在37℃条件下孵育封闭10min。(4)检测:加一抗(小鼠抗Nestin IgG1按1∶500倍稀释),放入4℃冰箱过夜,吸去一抗,洗涤同前。再加入二抗(FITC标记的羊抗小鼠IgG,按1∶150倍稀释),避光,在37℃水浴箱内孵育30min,吸去二抗,洗涤同前。(5)观察记录:在激发光波长为490nm,滤色光波长为520nm的共聚焦显微镜下观察照相(图1)。
Brdu免疫荧光检测:(1)贴壁;(2)固定;(3)封闭。方法同Nestin检测。(4)检测:一抗为小鼠抗Brdu IgG1(按1∶1000倍稀释),二抗为FITC标记的羊抗小鼠IgG(按1∶200倍稀释),余操作同前。(5)观察记录(图2)。
1.2.3 胶质瘤细胞与神经干细胞联合培养
将C6胶质瘤细胞、神经干细胞分别接种在置于6孔培养板内的半圆盖玻片上(多聚赖氨酸已包被),用无血清培养基培养2～4h使细胞贴壁,将胶质瘤细胞所贴壁的盖玻片与神经干细胞贴壁的盖玻片一起放在24孔培养板培养,并设空白对照,观察神经干细胞的生长及其形态学变化(图3)。
2 结果
2.1 Nestin和Brdu免疫荧光检测
Nestin-FITC,Common Focus(20×)
图片左侧为:C6胶质瘤细胞,图片右侧为:神经干细胞球
Nestin即巢蛋白,是一种仅存于神经上皮干细胞的中间丝成分,可作为神经干细胞的标志物。我们通过免疫荧光检测,发现神经球内的几乎所有细胞均呈Nestin阳性。从而证明我们培养的细胞球是神经干细胞球。
5-BrdU免疫荧光检测:5-BrdU即5-溴-2脱氧尿苷,它是胸腺嘧啶核苷的替代品。在细胞分裂的DNA合成前期,可以作为底物结合到新合成的DNA中,从而可验证神经干细胞的增殖能力。我们将用含5-BrdU的培养液培养形成的次代神经细胞球进行抗-BrdU免疫荧光检测显示,绝大多数细胞呈BrdU阳性。
2.2 C6细胞与神经干细胞联合培养
C6细胞和神经干细胞联合培养,可观察到神经干细胞分化,长出细胞突起,神经细胞球周围的细胞突起的密度及长度在各个方向上有明显的差异,在靠近胶质瘤细胞的一侧,突起的密度及长度均大于在其他方向上的突起,并且可见部分干细胞向胶质瘤细胞方向移动了。
3 讨论
3.1 神经干细胞培养及鉴定
自1992年Reynolds等[1]首先报道自成年小鼠纹状体分离培养出能在体外不断增殖,具有多种分化潜能的神经干细胞以来,对神经干细胞的研究便成为热点。后来的研究又在海马齿状回、脊髓、隔区、纹状体的实质及人的大脑内均成功分离出神经干细胞[2,3,4]。近年,分离、培养干细胞的技术日臻成熟。从实验用神经干细胞获取的角度看,从胎脑的纹状体区和海马齿状回容易获得,但对动物和取材技术要求较高。用成熟大鼠取材对培养技术和培养基要求又较高,不易存活。我们从新生大鼠大脑皮层分离培养出了具有分裂增殖能力的神经干细胞,在体外培养条件下形成典型的神经细胞球。Nestin免疫荧光染色为Nestin阳性,并通过5-BrdU免疫荧光染色证实这些细胞具有分裂增殖能力。说明新生大鼠皮层可培养出神经干细胞。我们的体会是从新生大鼠皮层分离培养神经干细胞有实验动物容易获得、取材简单、一次可获得大量干细胞和干细胞易成活的优点。
BrdU-FITC,Common Focus(20×)
3.2 胶质瘤细胞和神经干细胞共培养
Qu等[5]将神经干细胞注入2岁大鼠的侧脑室,发现神经干细胞在鼠脑内出现对称性迁移并分化成神经元和胶质细胞;Corbin等[6,7]研究发现,神经元有两种不同的迁移方式,即放射状迁移和正切迁移。这些研究提示,在成年人脑内可能有特定的诱导神经干细胞迁移的机制和信号物质。Kim等[8]的研究初步证明了这一点,他们发现端脑的GABA类联络神经元和小脑的谷氨酸类神经元分泌至细胞外基质的一种名为Reelin的糖蛋白,在神经干细胞的迁移中起重要作用。更有趣的是,Karen等[9]发现将神经干细胞移植至有移植胶质瘤生长的鼠脑内,神经干细胞很快充满肿瘤,并沿着浸润的肿瘤细胞而分布,即使将神经干细胞接种在肿瘤的远隔部位,甚至把神经干细胞接种在对侧大脑半球和侧脑室,它们也可穿过正常脑组织移行入胶质瘤。这说明胶质瘤的生长环境中或胶质瘤细胞本身存在着引导神经干细胞迁移的信号物质。假设胶质瘤细胞产生这种信号物质,那么在体外培养的胶质瘤细胞也应该有这种作用,如果我们能证实这种作用,即说明胶质瘤细胞中存在引导神经干细胞迁移的物质。于是,我们首先设计了限定区域共培养的方法在体外培养条件下观察神经干细胞的生长及其形态学变化。在实验中,我们从形态学方面观察到与胶质瘤细胞共培养的神经干细胞出现迁移和分化现象,具体作用机制还有待进一步研究。但该研究已初步说明在体外培养条件下胶质瘤细胞具有诱导神经干细胞迁移作用。从而为进一步研究胶质瘤细胞诱导神经干细胞迁移的机制,并为神经干细胞应用于临床,提高脑及脊髓损伤、胶质瘤和中枢神经系统退行性疾病的治疗效果奠定了一定的基础。
参考文献
[1]Reynolds BA,Weiss S.Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system[J].Science,1992,255(5052):1707-1709.
[2]Temple S,Alvarez-Buylla A.Stem cells in the adult mammalian central nervous system[J].Curr Opin Neurobiol,1999,9(1):135-141.
[3]Doetsch F,Alvarez-Buylla A.Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain[J].Proc Natl Acad Sci USA,1996,93(25):14895-14900.
[4]Eriksson PS,Perfilieva E,Bjork-Eriksson T,et al.Neurogenesis in the adult human hippocampus[J].Nat Med,1998,4(11):1313-1317.
[5]Qu T,Brannen CL,Kim HM,et al.Human neural stem cells improve cognitive function of aged brain[J].Neuro Report,2001,12(6):1127-1132.
[6]Corbin JG,Nery S,Fishell G.Telencephalic cells take a tangent:non-radial migration in the mammalian forebrain[J].Nat Neurosci,2001,4(Suppl):1177-1182.
[7]Marin O,Rubensiein JL.A long,remarkable journey:tangential migration in the telencephalon[J].Nat Rev Neurosci,2001,2(11):780-790.
[8]Kim HM,Qu T,Kriho V,et al.Reelin function in neural stem cell biology[J].Neurobiology,2002,99(6):4020-4025.
诱导作用 篇9
1 对象与方法
1.1 对象
大鼠血管内皮细胞(RAOEC,ATCC);DMEM高糖培养基、胎牛血清(美国Gibco公司);PCMV6-SERP1-t GFP质粒、PCMV6-empty质粒(美国ori GENE公司);荧光倒置显微镜(德国Zeiss公司)、一抗GLP-1R(美国Novus公司)、一抗serp1(美国Abcam公司)、一抗β-actin(美国Cell Signaling公司);Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司);Opti-MEM(美国GIBCO公司);BCA蛋白测定试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司)。
1.2 内皮细胞转染及药物处理
将处于最佳生长期的内皮细胞接种于6孔板中,用未添加抗生素的含10%FBS高糖DMEM培养基于37℃、5%CO2孵箱中培养。在6孔板上标记空质粒组;空质粒+过氧化氢组;serp1质粒组、serp1质粒+过氧化氢组,以便后续转染及药物处理等实验操作。待细胞达到80%左右,开始转染。先在Nanodrop 2000分光光度仪上测定PCMV6-SERP1-t GFP质粒和PCMV6-empty质粒的浓度,配制每孔所需的转染试剂量;于一个EP管内加入250μL Opti-MEM后再加入2μg PCMV6-empty或PCMV6-SERP1-t GFP质粒,混匀,室温静置5 min;另一EP管内加入250μL OptiMEM后再加入5μL Lipofectamine 2000;两EP管1∶1混匀,室温孵育30 min,在孵育期间,将待转染的6孔板换液后,将混合液按6孔板上的标记分别相应待转染的孔板内。转染4 h后吸掉原培养液,换新鲜的完全培养基,放于5%CO2培养箱中继续培养。转染时间达24 h后,按6孔板上事先做好的标记分别加入400μmol/L或100μmol/L的过氧化氢。24 h后将不同浓度过氧化氢处理的血管内皮细胞分别用PI/Hochest双染色法和细胞划痕实验检测其凋亡和增殖情况。每次实验至少重复3次。
1.3 细胞凋亡检测
PI/Hochest双染色是用来检测细胞凋亡的一种方法,PI将晚期凋亡的细胞染色成红色,Hochest将正常细胞核染成均匀蓝色。本研究将荧光显微镜下红光与蓝光个数的比值记为内皮细胞的凋亡率进行观察。将上述浓度为400μmol/L的过氧化氢处理的一组细胞吸弃上清后用PBS清洗细胞1次后,在每孔细胞中加入1 m L PBS;再在每孔中加入1 mg/m L的Hochest20μL和50 mg/m L的PI染色液1μL,置于脱色摇床避光摇匀后,荧光显微镜下观察并拍照,观察细胞凋亡情况,记录红光、蓝光个数并将其比值记作细胞凋亡率。每次实验至少重复3次。
1.4 细胞划痕实验
先用marker笔在6孔板背后,用直尺比着,均匀地划横线,每隔0.5~1 cm一道,横穿过孔,每孔穿过5条线。用上述转染方法转染24 h后,用浓度为100μmol/L的过氧化氢处理相应孔板中的细胞后,用枪头比着直尺,尽量垂至于背后的横线划3条痕,枪头垂直,不同孔之间使用同一只枪头。PBS洗细胞3次,去除划下的细胞,每组中均加入新鲜完全血清培养基。放入37℃5%CO2培养箱,培养;按0 h及24 h时间点取样,拍照;统计方法:使用Image J软件打开图片后,随机划取6~8条水平线,计算细胞间距离的均值,将0 h与24 h细胞间距的差值与0 h细胞间距的比值判定细胞增殖的修复率。每次实验至少重复3次。
1.5 GLP-1R表达
采用Western blot法。对上述浓度为100μmol/L过氧化氢处理的空质粒+过氧化氢组和serp1质粒+过氧化氢组两组蛋白提取后,用BCA试剂盒测定蛋白含量后,各取30μg蛋白进行电泳,转膜,5%脱脂牛奶封闭1 h,根据目的蛋白分子量的不同切取不同分子量的条带,一抗4℃孵育过夜:β-actin、serp1、GLP-1R;次日回收一抗,TBST洗膜10 min×3次;相应二抗室温孵育1.5 h,TBST洗膜10 min×3次。加入ECL发光剂,化学发光成像系统自动提取结果,应用Image J软件测定条带灰度值,以目标条带与内参条带灰度的比值作为上述各蛋白的相对表达量。
1.6 统计学方法
采用Graph Pad Prism 5统计学软件进行数据分析,计量资料数据用均数±标准差(±s)表示,两组间比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 内皮细胞凋亡率的比较
按上述方法转染及药物处理24 h后,空质粒组和空质粒+过氧化氢组血管内皮细胞的凋亡率分别为(3.54±0.78)%和(35.89±5.26)%,差异有统计学意义(P<0.05),提示400μmol/L的过氧化氢引起内皮细胞凋亡作用明显。serp1质粒组与serp1质粒+过氧化氢组血管内皮细胞凋亡率分别为(3.13±0.98)%和(12.32±1.26)%,与空质粒+过氧化氢组比较,serp1质粒+过氧化氢组血管内皮细胞凋亡率显著下降,差异有统计学意义(P<0.05),提示serp1过表达能缓解过氧化氢诱发内皮细胞凋亡。见图1。
两组比较,*P<0.05
2.2 内皮细胞增殖修复率的比较
按上述方法转染及药物处理24 h后,空质粒组和空质粒+过氧化氢组血管内皮细胞的增殖修复率分别为(69.08±7.78)%和(30.86±5.26)%,差异有统计学意义(P<0.05),提示100μmol/L的过氧化氢对内皮细胞增殖修复抑制作用明显。serp1质粒组与serp1质粒+过氧化氢组血管内皮细胞的增殖修复率分别为(73.58±5.19)%和(55.75±3.13)%,与空质粒+过氧化氢组比较,serp1质粒+过氧化氢组血管内皮细胞增值修复率显著增加,差异有统计学意义(P<0.05),提示serp1过表达能提高内皮细胞在氧化应激下的增殖活性。见图2。
两组比较,*P<0.05
2.3 Serp1转染与GLP-1R表达量的变化
氧化应激条件下,在通过serp1质粒转染对血管内皮细胞进行serp1的过表达时,可在蛋白水平上检测到GLP-1R的表达量显著增加,差异有统计学意义(P<0.05),提示serp1可促进氧化应激状态下GLP-1R的表达。见表1。
注:与空质粒+过氧化氢组比较,*P<0.05
3 讨论
随着内质网应激与心血管系统疾病的关系日益明确,制订能够有效降低心血管事件的方案成为迫切需要共同攻克的难题。通过文献复习总结出,作为UPR的重要伴侣蛋白之一,serp1通过参与蛋白转录后修饰,来缓解炎性反应,最终达到维持细胞的活性的目的[10]。而这一过程中所涉及的机制,主要与serp1通过参与胞内及胞膜蛋白的糖基化来缓解内质网应激过多未折叠蛋白应激压力而抑制了疾病的进一步发展的功能有关[11,12,13,14]。通过课题组前期研究,我们已经通过免疫共沉淀及免疫荧光实验证实,在Hep G2肝癌细胞内,serp1和GLP-1受体可在细胞膜上结合,且serp1可以通过促进GLP-1受体糖基化而影响其功能。受到启发,本研究在内皮细胞上通过蛋白质免疫印迹实验证明亦有这两种蛋白的表达,且在体外应激环境下,本研究发现过表达serp1可增加GLP-1受体的表达。这种现象发生的机制可能与氧化应激条件下,对serp1的过表达可使血管内皮细胞活性增加,从而间接改善了GLP-1受体的表达有关;肖元元等[15]也发现与氧化应激的发生关系密切的肝细胞脂肪变也可导致GLP-1R表达量降低;除了通过间接影响GLP-1R的表达,serp1还可以通过参与GLP-1R转录后的糖基化修饰而介导GLP-1R下游对微循环的改善有重大意义的相关信号通路的传导:GLP-1R的激活已被证明可减少凋亡因子的产生而起到维持细胞活性的作用,其表达减少与许多疾病的发生密切相关;另外,在内皮细胞上与其配体结合后,GLP-1R介导的信号通路可通过激活e NOS,而产生使血管扩张的NO,这对降低心血管事件的发生意义重大[16,17,18]。目前,GLP-1受体激动剂已广泛应用于临床,来治疗肥胖及2型糖尿病等慢性疾病,但其受体激动剂因胃肠道、神经系统反应等副作用因素在血管并发症的防治方面靶向性不够,具有一定临床应用的局限性。本研究已经通过内皮细胞凋亡和增殖修复实验证实,增加胞内serp1表达可改善应激状态下细胞活性及胞膜上GLP-1R表达;由于serp1与GLP-1R的结合主要发生在细胞膜上,外源药物性(胞外)serp1的加入能否对氧化应激下内皮细胞凋亡率、GLP-1R表达量及其与之配体结合后下游信号通路的传导产生影响,从国家倡导的“转化医学”的新理念出发,后续实验将继续对此假设进行探索、验证,这将对内皮细胞GLP-1R表达下调的心血管疾病高危人群防治靶向药物开发具有重要指导意义。
摘要：目的 探讨内质网应激相关蛋白1(serp1)对体外过氧化氢诱导大鼠血管内皮细胞凋亡的保护作用。方法 体外培养的大鼠血管内皮细胞均匀种于6孔板内,分为空质粒组、空质粒+过氧化氢组、serp1质粒组、serp1质粒+过氧化氢组。根据不同的实验目的各组加入不同浓度的过氧化氢。用PI/hochest荧光染色法对400μmol/L过氧化氢组进行细胞凋亡的检测;采用细胞划痕实验检测100μmol/L过氧化氢组进行伤口修复情况;采用Western blot法观察serp1过表达对GLP-1R表达的影响。结果 serp1质粒+过氧化氢组内皮细胞凋亡率明显低于空质粒+过氧化氢组,而修复率却明显高于转染空质粒过氧化氢组,差异均有统计学意义(P<0.05);serp1质粒+过氧化氢组GLP-1R表达明显高于空质粒+过氧化氢组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 serp1过表达可抑制过氧化氢引起的血管内皮细胞凋亡,并促进氧化应激状态下血管内皮细胞的增值修复,其作用机制可能与serp1促进氧化应激状态下血管内皮细胞的GLP-1受体表达有关。
诱导作用 篇10
1 材料与方法
1.1 主要材料与试剂
人肝癌HepG2细胞株(武汉凯泰新生物技术有限公司馈赠)、RPMI1640培养液由干粉(美国Gibco公司)按说明配制并加10%新生胎牛血清(杭州四季青公司)和青链霉素混合液(碧云天公司),胰蛋白酶(美国Amresco公司)、钼酸氨(天津化学试剂厂,纯度99.0%)、AnnexinV-FITC/PI凋亡试剂盒(南京凯基公司)、碘化丙啶(PI)和RNA酶试剂(Sigma公司)。
1.2 主要仪器与设备
超净工作台(BCM21000型,苏州净化设备有限公司)、CO2恒温培养箱(SWJ2300TVBB,美国Quene公司)、倒置显微镜(OLYMPUS2CK40,日本OLYM-PUS公司)、酶标仪(STATFAX22100型,广州市倍威仪器有限公司)、流式细胞仪(BDLSRⅡ,美国BD公司,)。
1.3 方法
1.3.1 药物制备
钼酸氨以生理盐水溶解配成1000 mg/L的溶液,滤菌后置4℃冰箱保存,临用前用培养基稀释成所需浓度。
1.3.2 细胞培养
人肝癌HepG2培养于含10%胎牛血清、青霉素和链霉素各1×105U/L的RPMI1640培养基中,在5%CO2、37℃的培养箱中换液传代培养,至稳定生长。
1.3.3 CCK-8法测定细胞抑制率
收集处于对数生长期的HepG2细胞,制成4×104/L单细胞悬液,以4×103细胞/孔接种到96孔板(每孔接种100μL),细胞贴壁后,吸去培养孔中的液体,分别加入含有不同终浓度钼酸氨(0.101、0.202、0.404、0.606 mol/L)的培养液200μL,继续分别培养24、48、72 h,同时设空白调零组(不加细胞仅加入等量培养液),以及阴性对照组(加细胞同时加入等量培养液),每组设6个复孔。在上述药物作用不同的时间点,各孔加入CCK-8 10μL,继续培养3 h,在酶标仪上以490 nm的波长测定吸光度(OD)值。结果判定:细胞生长抑制率=(对照孔平均OD值-实验孔平均OD值)/(对照孔平均OD值-空白孔OD值)×100%。
1.3.4 流式细胞仪检测细胞周期
取对数生长期的HepG2细胞,用胰酶消化后按每孔4.0×105个细胞接种于6孔板2 m L,24 h后换液,分别加入含有不同终浓度钼酸氨(0.101、0.202、0.404 mol/L)的培养液4 m L,继续分别培养24、48、72 h,同时设阴性对照组(加细胞和等量不含钼酸氨的培养液)。在上述药物作用不同的时间点收集细胞,PBS洗涤1次,-20℃预冷的70%乙醇固定3～4 h,PBS洗1次后各管加入600μL PI和RNA酶混合液,避光染色30min,流式细胞仪检测细胞周期,Modfit LT-Unititle软件分析数据。
1.3.5 流式细胞仪检测细胞凋亡
细胞培养、接种、分组及作用时间同细胞周期测定,不同的时间点收集细胞,预冷PBS洗涤2次,用90μL Annexin V Binding Buffer重悬细胞,加入Annexin V-FITC和PI溶液各5μL,室温避光孵育15 min,加入200μL Annexin V Binding Buffer,于1 h内流式检测,BD-FACSDiva软件分析数据。
1.4 统计学处理
应用SPSS 11.5统计软件进行Friedman检验,以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 钼酸铵作用后Hep G2细胞形态学变化
不同浓度的钼酸铵作用于HepG2细胞24、48、72 h后,倒置显微镜下观察,对照组细胞贴壁生长状态佳,细胞轮廓清楚,呈梭形,随着培养时间的延长,细胞数量明显增加,而0.101 mol/L组细胞,随培养时间的延长细胞变化不明显:0.202 mol/L组细胞,1～2 d变化不明显,培养3～4 d,可见贴壁细胞中部分为圆形,有少量细胞漂浮在培养液中,细胞数目与对照组相比明显少:0.404、0.606 mol/L组细胞培养2d,细胞出现明显变化,细胞贴壁状况不良,圆形细胞及细胞碎片较多,有较多细胞漂浮在培养液中,贴壁细胞密度下降,培养3～4 d,上述变化更加明显。
2.2 钼酸铵对Hep G2细胞增殖的影响
CCK-8法检测结果显示随着药物浓度增大和作用时间延长,钼酸氨对HepG2细胞增殖抑制存在着明显的剂量-效应关系和时间-效应关系(P<0.05)即剂量越大、药物作用时间越长,则对HepG2细胞的抑制率越高,见表1和图1。
注:Friedman检验不同浓度、不同时间抑制率的χ2,P值分别为
2.3 钼酸铵对Hep G2细胞周期分布的影响
流式细胞仪检测细胞周期结果显示不同浓度钼酸铵对HepG2细胞作用24、48、72 h后,与对照组相比,细胞周期中各期细胞发生改变,即G0/G1期细胞及细胞凋亡率上升,S期和G2/M期细胞下降,差异性有显著(P<0.05),且与钼酸铵浓度和作用时间具有剂量依赖性和时间依赖性。见表2和图2-4。
注:Friedman检验χ2=9,P=0.029
2.4 钼酸铵对Hep G2细胞凋亡的影响
不同浓度钼酸铵对HepG2细胞作用24、48、72h后,流式细胞仪检测细胞凋亡,与对照组相比,随着钼酸铵浓度的增加和作用时间延长,活细胞数百分比(Q3)逐渐减少,凋亡细胞数百分比(Q4+Q2)逐渐增加,且呈剂量依赖和时间依赖关系,差异有统计学意义(P<0.01),见表3和图5-7。
注:Friedman检验χ2=19.2,P=0.000
3 讨论
钼是人体14种必需的微量元素之一。其生理功能主要是通过各种钼酶的活性来实现。钼是醛氧化酶、黄嘌呤氧化酶、硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶等的重要组分。钼酶存在于所有生物体内,参与蛋白质、含硫氨基酸和核酸的代谢[4]。
十多近年来,随着人们对钼的认识的逐步深入及国内外大量的流行病学调查研究和试验研究[5,6,7,8]的进展,进而发现钼除了作为人体必需微量元素发挥多种生理功能外,还对肿瘤的发生、发展具有预防和抑制作用,其抗癌机理可能有:(1)钼是抗氧化剂,有阻断过氧化物生成的作用,从而防止氧化损伤。(2)钼是硝酸还原酶的组份,此酶防止硝酸盐及亚硝酸盐与二级胺生成亚硝酸胺化合物;(3)钼对肝P450酶和去甲基化酶的活性有影响,小浓度可促进亚硝胺代谢并减少肝脏DNA化合物的生成;大浓度钼可减慢亚硝胺的代谢;(4)钼有封闭类固醇类激素受体的作用,像黄体酮受体,雄性激素受体,钼也是体内转失活雌激素进入活性体的抑制剂,因为乳腺是雌激素调节的靶器官,雌激素是促进乳腺正常和异常生长的因素,钼使乳腺雌性激素受体失活减弱激素致癌过程的促进作用[9]。
该实验结果表明:(1)钼酸铵在体外能明显抑制人肝癌细胞HepG2的生长和诱导细胞凋亡,并呈一定的量效和时效关系,不同浓度钼酸铵对HepG2细胞的增殖抑制率和细胞凋亡率随着药物浓度的增加和时间的延长而升高,明显高于对照组(P<0.0l)。(2)钼酸铵对HepG2细胞周期各时相有一定影响,随着钼酸铵浓度的增加和作用时间的延长,G0/G1期细胞显著增多,S期和G2/M期细胞减少,并出现凋亡峰。说明钼酸铵可以诱导肿瘤细胞出现G1期→S期阻滞和细胞凋亡,使许多肿瘤细胞不能进行DNA合成,从而起到抑瘤作用。抑瘤药物对细胞周期的影响可以通过阻滞G1期→S期阻止DNA复制或阻滞S期→M期抑制细胞分裂而抑制肿瘤细胞的生长。G1期是细胞DNA复制前期,是合成细胞生长所需要的多种蛋白质、RNA等重要物质的关键时期;S期完成DNA合成,DNA含量在此期增加一倍,此两期皆是药物等因素作用的靶点,抑制细胞周期G1期或S期,从而抑制肿瘤细胞增殖[10]。该研究说明在钼酸铵的作用下,HepG2肿瘤细胞的DNA合成复制受到抑制,导致细胞增殖分裂减慢并部分凋亡。
综上所述,钼酸铵能抑制人肝癌细胞的体外增殖,其机制可能与阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡有关,其作用的具体分子机制尚需进一步探讨。
参考文献
[1]YAN XM,HONG M,ZHANG H,et al.Progress in studies oftrace element selenium and organoselenium compounds as phar-maceticals[J].Guang Dong Wei Liang Yuan Su Ke Xue,2003,10(9):1-10.Chinese
[2]PENG XE,YANG XH,SHI XS,et al.Study on geographiccharacteristics of esophageal cancer in fujian province[J].Chin.j.Prey Chron Non-commun Dis,2003,11(5):212-213.Chinese
[3]JIA RB.New progress research on molybdenum elements andgastric cancer[J].China Molybdenum Industry,2000,24(1):46-49.Chinese
[4]HU XH.Essential trace element molybdenum of human body andhuman health[J].Mondern Preventive Medicine,2001,28(3):353-355.Chinese
[5]DENG Y,LU XM,PANG XL.The anticancer and antitumouractivity of the molybdenum-containing complex[J].Chemistry,2005,7:522-527.Chinese
[6]JOHNS PG,KAY S.A novel agent for the treatment of solidtumors[J].Anticancer Drugs,2001,12(8):639-646.
[7]MITSUI S,OGATA A,YANAGIE H,et al.Antitumour activityof polyoxomolybdate,[NH3Pri]6[Mo7O24].3H2O,against humangastric cancer model[J].Biomed Pharmacother,2006,60:353-358.
[8]OGATA A,MITSUI S,YANAGIE H,et al.A novel anti-tumouragent,polyoxomolybdate induces apoptotic cell death in AsPC-1human pancreatic cancer cells[J].Biomed Pharmacother,2005,59:240-244.
[9]ZHANG AH,ZHANG Q.Cobalt,molybdenum mutagenesis resis-tance and anti-cancer effect[J].Studies of Trace Elements andHealth,1994,11(4):55-56.Chinese
激趣、诱导、创新 篇11
爱因斯坦曾经说过，兴趣是最好的老师。针对学生每逢作文课，常常感到无话可说，只能东拼西凑，说一些空话、套话甚至编一些材料的现状，我认为应该对学生以激趣、诱导、创新为前提，通过我多年的教学经验，在作文教学中做了以下几方面尝试，收效较好。
一、 观察生活，培养写作兴趣，简单概括为“激趣”
有人说，学生见识少，生活单调，没啥可写，这是一种片面的看法。其实，学生的生活很丰富，他们从小生活在大自然的怀抱里，对丰富多彩的自然风光、四季景物，以及千姿百态的动植物世界都特别熟悉，这为学生提供了取之不尽、用之不竭的素材。
在作文教学中，要把学生的视野引到广阔的生活中去，使学生认识生活，感受生活，学生拿起笔来就会有言可叙，有感可发、有情可抒。如在指导学生“观察一种植物”这篇作文时，我把学生带到室外去观察各种植物，让学生通过亲自看、触、闻多种感官参与观察，使其对植物产生了兴趣，然后把兴趣引导到作文上，其效果比在教室里讲，在黑板上看植物挂图，念范文，依葫芦画瓢的作文教学方法好得多，学生感到有话可说，有内容可写，他们热爱生活的兴趣和写作兴趣都得到了发展。
二、 寓教于游戏之中，以说促写，培养写作兴趣
说和写是一对孪生姐妹，说是用嘴“写”，写是用笔“说”，说和写是有机联系、相辅相成的，所以说的作用是极其重要的。在作文教学中，以说促写不失为一种较成功的办法。
1. 课前三分钟口语训练
为了激发学生写作兴趣，我注重每天的训练。即每节课的前三分钟让学生走上讲台“说”，每日一人或几人，轮流上台，说自己想说的爱说的话题。据教育学、心理学的研究表明，现阶段学生普遍反映出求新、求奇、求美、求乐的心理特点，他们最爱说也最想说的话题，归纳起来主要表现为以下几个方面：看来的，听来的新奇事；讲故事；家庭、亲人、好友，特别是崇拜的偶像；爱畅想自己的未来，学生爱说什么，想说什么，就让他说什么，因为只有这样才能激发起说的兴趣。一轮后，把每人说的写成书面文字，装订成册，成为班上的“材料库”。实践证明，这种方法确实能调动学生的积极性和主动性，收到很好的效果。
2. 重视口头作文
由于学生作文中思路较混乱，重点不突出，中心欠明确的现象常常出现，在讲评作文时，教师把带有这类现象的作文在班上读后，学生们几乎都能看出毛病所在，可如果篇篇都由教师批改才能解决问题，那学生不是太被动了吗：于是应考虑让学生说作文，即每次议题确定后，先让学生认真思考，首先确定中心，中心确定后考虑如何开头、结尾、安排材料等，考虑好后同桌互相說，学生在说的时候会发现自己思路的一些缺点，没有什么问题了，在学写作文。
3.还可以组织故事会，激发学生说的兴趣，也可以对周围新近发生的事，让学生讨论，各抒己见，既培养了说的能力，有促进了写
当然，学生要“说”好，还需要教师多指导。尤其是对于学生来说，说的能力并不强，表现为不知道“说什么”和“怎么说”。教师可以示范，让学生模仿。要明确提出说的要求，如说一件事要把时间、地点、人物，事件的起因经过及结果这些要素交代清楚；说一个人要把她的长相、穿着、语言、动作等在具体活动中的表现讲明白、讲具体，是学生说的有法则、有规矩。学生说了，要及时评价，要充分的肯定，保护其积极性。当然，说好不等于写好，但说好为写好做了极好的准备和铺垫，奠定了坚实的基础，因为说好不仅为写好提供了物，而且提供了序。这就要求教师要积极诱导。
三、 写好日记，在日常生活中积累写作素材，培养写作习惯
学生生活经验少，认识水平低，词汇贫乏，概括能力不强，写作技能也尚未入门，因此教师要引导他们写最熟悉的事物，写自己的真情实感，可以写得零星一点，不求全，难度低，学生易学易写，因而容易引起兴趣，不会把作文当作是一件“苦差事”，易产生跃跃欲试不吐不快的心理。所以我们每周都给学生上二节作文课，这样不仅增加了学生练笔密度，还满足了学生一吐为快的心理需要。
培养习惯，树立恒心，告诉学生应每天规定时间写日记，不管做什么，都要有坚强的意志，初写日记，内容可短些、浅些，养成习惯后，再在日记的质量上下功夫。日久天长，学生练笔多了，写作水平自然就提高了。
四、 修改作文多样化，展示学生好作品，诱导写作乐趣
在学生写完作文稿之后，让他们自己按照本次作文的训练要求，认真对照检查，这样学生能发现一些自己作文中字、词、句方面较为明显的错误，这叫“自改”。“自改”完后同桌“互改”，在“互改”时对他们提出的要求是：用波浪线划出写得较好的词句；修改作文中的错字、别字、病句、错漏的标点；适当给改的作文插进一二个成语。经过互改后让学生把改好的文稿誊抄在作文本上交给教师批改。“互改”是同学们最愿意做的一项练习，他们常常是注意力很集中地给对方修改，俨然一位小老师，在“互改”中学生受益不小。他们既能在“互改”时扬长避短，又能学习别人的长处。教师在批改学生作文时注意挖掘了学生作文中的“闪光点”，只要文中有一点可取之处，都给予热情肯定，为的是增强学生的自信心；每次习作都从中挑选三篇在班上的优秀小作品学习园地里发表，让他们充分享受成功的喜悦，从而提高他们的作文兴趣。
五、 展开想象的翅膀，自己编故事，培养创新精神
创新是一个民族的灵魂，是国家兴旺发达的不竭动力。因此教师一定要注重培养学生的创新意识。学生富于想象，而且善于创新，教师处让学生看图作文外，还可设想一个故事开头给学生，让他们自编故事，引发其写作兴趣。如设想了《小猴子和老山羊》的故事开头：“小猴子和老山羊是好朋友，老山羊总愿意帮助别人，而小猴子屁股上的毛被火星烧着了”。故事会怎样发展，结果怎样，让学生展开想象，自己编写，学生的兴致极高，他们把故事编得各式各样，有理、有情、有趣，读了引人发笑。这样，学生怀着极大的兴趣认真写作，怎么能不充分发挥自己的创新才能呢？
诱导作用 篇12
关键词：脂多糖,炎症,T614,艾拉莫德
细菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)又称细菌内毒素,是革兰氏阴性菌细胞壁外膜层的主要成分。LPS在细菌生长繁殖、死亡破裂或裂解后释放。它具有多种生物活性,通过诱导机体产生非特异性免疫,释放出前炎症细胞因子,如TNF-α、IL-1、IL-6及前列腺素等,参与机体的免疫炎症反应;一旦进入敏感动物体内可造成宿主各主系统、器官损伤[1]。
T614是日本富山制药公司原研产品,其成药艾拉莫德于2011年8月获国家食品药品监督管理局(SFDA)批准开发生产,是一种新型缓解病情用抗风湿药物(DMARD),可缓解慢性关节炎和自身免疫性疾病的关节损伤和免疫异常,抑制炎性细胞因子和免疫球蛋白的产生[2]。在慢性关节炎和自身免疫性疾病的动物模型中,艾拉莫德改善关节炎症损伤的作用中包含了对免疫紊乱的改善,如抑制炎性细胞因子的产生、调节B细胞、T细胞和巨噬细胞的功能等免疫调节作用等。
国内外尚无报道考察T614对LPS所致动物炎性损伤的影响,作者依据文献报道[3—5]采用小鼠LPS炎性损伤模型对T614的炎性保护作用进行评价,以期为T614在动物相关疾病中的应用提供数据支持。
1材料与方法
1.1试验动物分组及给药
SPF级ICR小鼠70只,雌性,体重22~24 g,购于上海斯莱科实验动物有限责任公司,动物合格证编号:2007000552029。于实验动物房(屏障环境)标准鼠笼中饲养,自由摄食、饮水。待检疫期结束后,剔除体重过大或过小的动物,将剩余小鼠随机分为6组,每组10只。各试验组分别为空白对照组、模型对照组、阳性药对照组(强的松,5 mg/kg)和T614低剂量组(10 mg/kg)、中剂量组(30 mg/kg)和高剂量组(90 mg/kg)。空白对照组和模型对照组给予溶剂(0.5%羧甲基纤维素),阳性药经研磨后用纯水混悬给药,T614低中高剂量组均混悬于0.5%羧甲基纤维素,各组均为灌胃给药,连续给药7 d,给药体积为0.1 m L/10 g。首次给药1 h后开始造模,空白对照组动物腹腔注射给予0.9%生理盐水溶液,0.1 m L/20 g,其余各组动物腹腔注射给予LPS 5 mg/kg(0.1 m L/20 g)。各组动物分别于给药前(Day1)、给药后24 h(Day2)和Day3、Day4、Day5和Day7称量动物体重,于末次给药后24 h眼眶采血(用于血液生化和血液学指标检测),之后将动物脱颈处死,取心、肝、脾、肺、肾和肠系膜淋巴结(不称重)称重记录后分别固定在中性福尔马林中。
1.2药品与试剂
T614:由海南先声药业有限公司馈赠,纯度>98%;强的松(醋酸泼尼松片,Lot#1211173):购于浙江仙琚制药股份有限公司;LPS(Lot#92M4006),购于Sigma-Aldrich公司;丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定试剂盒(Lot#0612141)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)测定试剂盒(Lot#0812131)、碱性磷酸酶(ALP)测定试剂盒(Lot#0612091)、尿素(BUN)测定试剂盒(Lot#0712121)、肌酐(CREA)测定试剂盒(Lot#1112251)、尿酸(UA)测定试剂盒(Lot#0612121),购于四川迈克生物科技股份有限公司;CELLPACK(20 L)稀释液(Lot#G3035)、RET-SEARCHⅡ(RED-700A)全自动网红(Lot#ZA2053)、SULFOLYSER(SLS-210A)血红蛋白溶血素(Lot#A1016),购于日本Sysmex公司。
1.3试验方法
1.3.1脏器系数
小鼠脱颈处死后取心、肝、脾、肺、肾脏,在生理盐水中清洗后用滤纸吸干水分,在分析天平上称重,计算脏器指数。脏器指数=100×脏器重量/体重。
1.3.2 HE染色
将小鼠心、肝、脾、肺、肾和肠系膜淋巴结取材后放置脱水机中进行梯度乙醇脱水、二甲苯透明,之后进行石蜡包埋、切片(3μm),60℃烘片6 h。将载玻片置于二甲苯、梯度乙醇复水后转移至苏木精染液中染色,1%盐酸乙醇分化、流水返蓝、0.5%伊红水溶液复染,梯度乙醇和二甲苯脱水后用中性树胶封固,置于蔡司显微镜下镜检。
1.3.3血液生化指标检测
动物处死前禁食12 h,Day8眼眶采集动物血液,37℃水浴15 min促进血液凝固,3 000 r/min×10 min后,吸取血清,以日立7020型血生化分析仪检测ALT、AST、ALP、BUN、CREA和UA等各项生化指标。
1.3.4血液学指标检测
Day8眼眶采集动物血液,存放于加入EDTA-K2的EP管中,轻轻混匀以防止血液凝固,通过Sysmex XT—2000iv型血液学分析仪检测白血细胞计数(WBC)、红细胞计数(RBC)、血小板计数(PLT)、网织红细胞计数(RET)、平均红细胞血红蛋白含量(MCH)和平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)等各项血液学指标。
1.4统计学分析
采用SPSS16.0统计学软件进行单因素方差分析,计量数据用“均值±标准偏差”(mean±sd)表示,比较各组数据差异。
2结果与分析
2.1动物临床症状
空白对照组动物临床症状正常,其余各组动物造模后可见自发活动减少、蜷曲、竖毛、精神萎靡不振、稀粪、尿道口周围出现黄色玷污,喜簇拥成团。从造模后第72 h(Day4)起,除模型组和T614低剂量组恢复较慢外,其余各组小鼠临床症状均有明显好转。
2.2动物死亡率
模型对照组和T614低剂量组小鼠死亡率最高,均为30%;T614中剂量组小鼠死亡率为10%;空白对照组、T614高剂量组和阳性药组无动物死亡。
2.3动物体重变化
表1可见空白对照组小鼠平均体重增长率为7.9%,模型对照组动物平均体重在试验终点时未能恢复至造模前水平(增长率为-3.4%),其余各组动物体重均有不同程度增长,T614中剂量组和阳性药组动物体重增长率最高,均为3.4%。
2.4动物血液生化指标变化
由表2可见LPS造模后,与空白对照组相比,模型组动物ALT、AST、ALP、BUN、CREA和UA均显著升高。T614中高剂量组及阳性药组与模型组相比上述血液生化指标均明显改善,其中阳性药组与空白对照组水平相当。
注:与空白组比较,##P<0.01;与模型组比较*P<0.05,**P<0.01。
注:与空白组比较,##P<0.01;与模型组比较**P<0.01。
注:与空白组比较,##P<0.01;与模型组比较*P<0.05,**P<0.01。
2.5动物血液学指标变化
由表3可见LPS造模后,与空白对照组动物相比,模型组动物白细胞计数(WBC)和网织红细胞计数(RET)显著升高,红细胞计数(RBC)和血小板计数(PLT)显著降低,平均红细胞血红蛋白含量(MCH)和平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)未见明显变化。T614中高剂量组及阳性药组与模型组相比WBC、RET、RBC和PLT均明显改善,与空白对照组水平相当。
2.6动物脏器系数变化
由表4可见LPS造模后,与空白对照组相比,模型组动物肺、肝、脾和肾脏脏器系数显著升高。T614中高剂量组及阳性药组与模型组相比肺、肝和肾脏脏器系数均明显改善,与空白对照组水平相当。与模型组相比,阳性药组动物脾脏脏器系数有明显改善(部分恢复),而T614低、中、高剂量组动物脾脏脏器系数未见明显改善。各组动物心脏脏器系数未见异常变化。
2.7 HE染色结果
心脏:各组动物心肌纤维排列整齐有序,横纹清晰,未发现变性、坏死、增生肥大、纤维化等病理学变化。
肺脏:空白对照组动物肺泡壁完整,毛细血管轻度充血,腔内无脱落细胞,支气管结构完整,间质无水肿、炎性细胞及纤维化。模型组和各给药组动物小鼠出现不同程度地炎性细胞浸润和肺泡间隔增厚,但T614中高剂量组和阳性药组程度较轻。
肝脏:各受试组动物肝小叶结构完整,细胞排列整齐呈放射状。但部分动物肝细胞出现大小不均的坏死灶,模型组、T614低剂量组、中剂量组、高剂量组和阳性药组发生率分别为6/7、6/7、4/9、4/10、2/10。模型组和T614低剂量组动物肝脏除了有局灶性坏死外,还出现炎性细胞弥散性浸润,枯否氏细胞明显增生。
肾脏:空白对照组、T614中高剂量组和阳性药组肾小球结构正常,肾小管上皮细胞完整,管腔无扩张及脱落细胞,间质无水肿、炎性细胞,未见细胞增生及纤维化。模型组和T614低剂量组出现程度不等的炎性改变和肾小球系膜细胞增生,肾小球及间质区血管充血明显,肾小管上皮细胞有浊肿样变性。
脾脏:空白对照组白髓和红髓结构正常,白髓可见大小不一的脾小体及动脉周围淋巴鞘,淋巴细胞未见减少,红髓的脾索相互连接成网,脾血窦内充满红细胞。模型组和各给药组动物脾脏红白髓结构界限不清,脾小体增大、数量增多,阳性药组动物脾脏病理改变程度较轻。
淋巴结:空白对照组、T614中高剂量组和阳性药组动物皮质浅层可见大小不一的淋巴小结及弥散淋巴细胞,髓质可见明显的髓索和髓窦,未见淋巴细胞减少。模型组和低剂量组组动物淋巴结内淋巴细胞增生、体积变大,生发中心明显。
3讨论与小结
LPS是革兰氏阴性菌细胞壁外膜层的主要成分,它具有多种生物活性,通过诱导机体产生非特异性免疫,释放出前炎症细胞因子,如TNF-α、IL-1、IL-6及前列腺素等,参与机体的免疫炎症反应,一旦进入敏感动物体内,可造成宿主各主系统和器官损伤,表现为发热、心动过速、低血压、休克、多器官功能衰竭甚至死亡。另外,当发生革兰氏阴性杆菌败血症时,细菌在血中大量繁殖,死亡解体的细菌可释放大量内毒素,造成内毒素血症。当对败血症病畜进行抗菌治疗时,使用抗生素反而造成细菌大量死亡崩解,进而释放大量的内毒素,造成更为严重的内毒素血症[1]。有文献报道[6],奶牛缺乏粗料或者采食高精料日粮以满足产奶的营养需要时会发生瘤胃代谢紊乱。瘤胃代谢紊乱可使瘤胃中异常代谢产物LPS显著增加,并通过肠道大量转运入血,引起机体系统免疫反应,使进入乳腺的营养素减少,且进入乳腺中的LPS可损害乳腺上皮细胞,并抑制乳脂肪合成相关酶的活性。同时动物有生殖道感染、子宫内膜炎、肠道炎症性疾病、应激反应等都能使血液的内毒素水平显著升高,增加胚胎的死亡率[7—10]。也有文献报道[11],在妊娠早期接触LPS也可引起胚胎吸收、死胎和自发性流产等不良后果。
T614为抗炎镇痛药,其原研单位为日本富山公司,其分子结构为具有色原酮架构的小分子化合物,适应症为类风湿性关节炎,作用机理为慢作用药物(DMARD),对IL-1、IL-6、IL-8、TNFa、Ig M、Ig G、PGE2、COX-2等多种炎症相关因子都有抑制作用。其最重要的特点是,在慢性关节炎和自身免疫性疾病的动物模型中,改善关节炎症损伤的作用中包含了对免疫紊乱的改善,如抑制炎性细胞因子的产生,调节B细胞、T细胞和巨噬细胞的功能等免疫调节作用。国内外尚无报道考察T614对LPS所致动物炎性损伤的影响。
为考察T614对LPS所致动物炎性损伤的影响,作者采用小鼠腹腔注射LPS 5 mg/kg建立系统性炎症和多器官损伤模型。试验结果显示,模型组动物死亡率为30%,试验终点时体重未恢复至造模前水平,增长率为-3.4%;模型组动物血液生化指标ALT、AST、ALP、BUN、CREA和UA较空白对照组均显著升高,脏器系数和组织病理学检查显示动物肺脏、肝脏和肾脏出现增生和炎性改变,脾脏和肠系膜淋巴结出现淋巴细胞增生,动物WBC较空白对照组显著增加,综合结果显示小鼠腹腔注射LPS5 mg/kg可产生显著的系统性炎症和多器官损伤,同时RBC、PLT降低和RET的升高提示LPS对小鼠造血系统产生影响。与模型组相比,阳性药强的松组和T614中高剂量组动物死亡率、临床症状、脏器系数及组织病理学结果(注:T614各给药组动物未表现出对LPS所致脾脏增生的抑制作用)均显著改善,同时血液生化指标(ALT、AST、ALP、BUN、CREA和UA)显著降低(均P<0.01),血液学指标(WBC、RBC、PLT和RET)均与空白对照组动物水平相当。研究结果表明T614对LPS诱导的小鼠系统性炎症和多器官损伤具有明显的保护作用,其保护作用的机理可能与其广泛的抗炎活性相关,该试验为T614在动物相关疾病中的应用提供了数据积累和支持。
参考文献
[1] 赵延涛.LPS致流产作用及保胎中药的调控效应研究.保定:河北农业大学,2011Zhao Y T.Studies on LPS-induced abortion and modulation effects of anti-abortive herbal medicine.Baoding:Agricultural University of Hebei,2011
[2] Tanaka K,Shimotori T,Makino S,et al.Pharmacological studies of the new antiinflammatory agent 3-formylamino-7-methylsulfonylamino-6 -phenoxy-4H-1-benzopyran-4-one.1st communication:antiinflammatory,analgesic and other related properties.Arzneimittelforschung,1992;42(7):935—944
[3] Izui S,Lambert P H,FourniéG J,et al.Features of systemic lupus erythematosus in mice injected with bacterial lipopolysaccharides:identificantion of circulating DNA and renal localization of DNA-antiDNA complexes.J Exp Med,1977;145(5):1115—1130
[4] 张建勇,钟家熙,戴馨仪,等.苓丹片、青蒿琥酯对SLE小鼠T淋巴细胞亚群的影响.中药药理与临床,1998;14(6):27—29Zhang J Y,Zhong J X,Dai X Y,et al.The effect of Qindan tablets and artesunate on T lymphocyte subsets of SLE model mouse.Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica,1998;14(6):27—29
[5]李悦.腺病毒介导载脂蛋白A-I在LPS诱导的小鼠系统性炎症和组织损伤中的保护作用.上海:复旦大学,2008Li Y.Human ApoA-I overexpression diminishes LPS-induced systemic inflammation and multiple organ damage in mice.Shanghai:Fudan University,2008
[6] 刘建新.动物营养研究进展(2012年版).北京:中国农业科学技术出版社,2012:151—159Liu J X.Advances in the Study on the Nutrition of Animal(2012 edition).Beijing:China Agricultural Science and Technology Publishing Company,2012:151—159
[7] Romero R,Espinoza J,Mazor M.Can endometrial infection/inflammation explain implantation failure,spontaneous abortion,and preterm birth after in vitro fertilization?Fertil Steril,2004;82(4):799—804
[8]吴秀群,王立志.热应激对奶牛血液中内毒素含量和抗氧化指标的影响.四川畜牧兽医,2011;1:22—23Wu X Q,Wang L Z.The effect of heat stress on the endotoxin content and redox in the serum of dairy cattle.Sichuan Animal&Veterinary Sciences,2011;1:22—23
[9] Foley G L,Schlafer D H,Elsasser T H,et al.Endotoxemia in pregnant cows:Comparisons of maternal and fetal effects utilizing the chronically catheterized fetus.Theriogenology,1993;39(3):739 —762
[10] Giri S N,Emau P,Cullor J S,et al.Effects of endotoxin infusion on circulating levels of eicosanoids,progesterone,cortisol,glucose and lactic acid,and abortion in pregnant cows.Vet Microbiol,1990;21(3):211—231