病毒诱导（精选6篇）
病毒诱导 篇1
人类呼吸道病毒性感染的常见病原体有流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、鼻病毒和冠状病毒等。具有传染性强、传播迅速、极易流行等特点。目前治疗流感的主要药物是奥司他韦(达菲),因其价格、耐药性、一定的毒副作用及储备量不足等问题,很难应对大面积出现的流行性感冒(流感)。因此,发挥中医药优势,研究有效防治流感的中药复方具有重要意义。疏风宣肺解毒汤主要由桑叶、菊花、杏仁、桔梗、连翘、生地、柴胡、沙参、甘草组成(保密方),以清热解毒、宣肺解表立法。该方经临床观察,对流感以及各种病毒引起的急性呼吸道炎症均有一定疗效。本研究试图通过观察疏风宣肺解毒汤对甲1型流感病毒感染的犬肾传代(Madin-Darby canine kidney,MDCK)细胞凋亡的影响,来探讨其抗流感病毒的分子生物学机制,为临床应用提供依据。
1 材料与方法
1.1 药物和制剂
疏风宣肺解毒汤药材购自太原市同仁堂药店,常规方法煎煮、浓缩、干燥,用细胞维持液稀释配制成1 g/ml浓度的药液。奥司他韦(Oseltamivir)购自太原市万民大药房,上海三维制药有限公司生产,批号:H20065414,规格:75 mg/粒,制备成浓度为25 mg/ml的混悬液。复方药液和对照药物混悬液均离心取上清,过滤除菌后置4℃冰箱保存备用。
1.2 病毒株和细胞
甲1型流感病毒鼠肺适应株(甲1/PR/8/1934)由中国疾病预防控制中心提供,经9日龄鸡胚尿囊腔接种培养传代,微量血凝试验滴定病毒效价,血凝效价测定1∶640的病毒株为试验用毒株,-80℃冰箱保存。犬肾传代细胞购自北京病毒科学研究所。
1.3 试剂和设备
DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、乙二胺四乙酸(EDTA)等购自北京百和营科技发展有限责任公司,Annexin v-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司,流式细胞仪为美国BD FACSCalibur。
1.4 药物对MDCK细胞的毒性测定
在96孔细胞培养板,将1 g/ml的疏风宣肺解毒液和25 mg/ml的奥司他韦药液连续倍比稀释为8个浓度后分别加入到长成良好的MDCK单层细胞中,每孔100 μl,每个浓度4孔,同时设细胞维持液对照组,置37℃、5%CO2培养箱中培养,每天用倒置显微镜观察细胞病变情况,3天后用MTT法于酶标仪测定492 nm波长处的OD值,计算药物最大无毒限量。其中最大无毒浓度:疏风宣肺解毒汤为62.5 mg/ml,奥司他韦为1.56 mg/ml。
1.5 病毒半数感染量测定
将病毒培养液做10倍系列稀释从10-1至10-10。消化MDCK,调整细胞密度至1×105个/ml,接种于96孔细胞培养板,将各稀释度的病毒液接种于长成后的MDCK单层细胞中,每一稀释度4个复孔,每孔100 μl,同时设阴性对照,每孔加细胞维持液100 μl,置37℃、5%CO2培养箱中孵育2 小时,弃去含病毒维持液,更换正常细胞培养液,继续培养,连续培养3天,观察细胞病变,用Reed-Muench法求出细胞半数感染量(TCID50)。甲1型流感病毒(血凝滴度为1∶640)的TCID50为:10-4.5。
1.6 药物对甲1型流感病毒感染的MDCK细胞凋亡影响的检测
试验分6组进行,病毒对照组(细胞+病毒液+细胞维持液)、正常细胞对照组(细胞+细胞维持液+细胞维持液)、疏风宣肺解毒汤治疗组(细胞+病毒液+疏风宣肺解毒汤药液)、疏风宣肺解毒汤对照组(细胞+细胞维持液+疏风宣肺解毒汤药液)、奥司他韦治疗组(细胞+病毒液+奥司他韦药液)、奥司他韦对照组(细胞+细胞维持液+奥司他韦药液)。将长成单层的细胞瓶用PBS冲洗3次,分别接种上述各组不同的液体入细胞瓶内,含药组均加入相应的最大无毒限量药液,37℃、5%CO2条件下孵育,观察细胞,细胞产生病变时分别收集各组细胞测试。
将培养的MDCK细胞用PBS洗3次后进行试验,各组于37℃、5% CO2条件下培养24 小时后收集上清液,悬浮细胞离心(2000 rpm离心5分钟)收集,贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化收集(胰酶消化时间不易过长,否则容易引起假阳性);用PBS洗涤细胞二次(2000 rpm离心5分钟)收集1×105~5×105细胞;加入500 μl的Binding Buffer悬浮细胞;加入5 μl AnnexinV-FITC混匀后,加入5 μl 碘化丙啶(ProPidiumIodide,PI),混匀;室温、避光、反应5~15分钟;在1小时内流式细胞仪的观察和检测,共计算10 000个细胞,每标本测试4次。同时计算药物对病毒诱导MDCK细胞凋亡的抑制率(inhibition ratio,IR)。
附:
流式细胞仪分析条件:激发波长Ex=488 nm;发射波长Em=530 nm。AnnexinV-FITC的绿色荧光通过FITC通道(FL1)检测;PI红色荧光通过PI通道(FL3)检测。荧光补偿调节:使用未经凋亡诱导处理的正常细胞,作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。
1.7 统计学分析
用SPSS 17.0统计软件进行分析,所有计量资料用均数±标准差
2 结果
各组细胞用双染后,根据AnnexinV与正常及凋亡细胞膜上的磷脂酰丝氨酸(PS)结合情况不同及碘化丙啶(PI)与不同细胞DNA结合情况的不同,用流式细胞仪检测24小时的凋亡百分率,每组重复测试4次,每次均设有阴性对照组,结果表明,病毒对照组、各药物对照组和治疗组的凋亡率显著高于正常细胞对照组(P<0.01);疏风宣肺解毒汤治疗组和奥司他韦治疗组的凋亡率显著低于病毒对照组(P<0.01)。而高于其药物对照组(P<0.01)。疏风宣肺解毒汤可抑制流感病毒诱导的细胞凋亡,抑制率为67.07%,与奥司他韦治疗组相近(76.36%)。见表1。
注:与正常细胞对照组比较,aP<0.01;与病毒对照组比较, bP<0.01;与相应药物对照组比较,cP<0.01;“-”表示无此项。
3 讨论
流行性感冒是流感病毒引起的一种发病率高、流行广泛、传播迅速的急性呼吸道传染病,主要侵犯呼吸道黏膜气管、支气管、细支气管和肺泡表面的上皮细胞,使细胞出现空泡、皱缩、纤毛丢失、细胞核圆缩和破碎,最后细胞凋亡、坏死脱落,引起感冒临床症状。流感病毒分为甲、乙、丙3 型。目前人群中流行的主要为甲型流感病毒。Tak-Zawa等[1]于1993年发现,体外培养的犬肾传代细胞(MDCK)感染人甲型流感病毒后,细胞出现染色体浓缩、凝聚,凋亡小体形成等一系列凋亡变化,从而首次提出流感病毒可诱导体外培养细胞发生凋亡。随后,又有研究表明流感病毒能诱导鸡体内细胞、小鼠气管、支气管上皮细胞、肺泡及淋巴细胞凋亡的发生[2,3]。随着更深入全面的研究,Hinshaw等[4]用人凋亡阻滞剂Bcl-2基因转染MDCK细胞后,发现转染细胞不会出现凋亡,进一步证明了诱导凋亡是流感病毒引起细胞死亡的机制之一。
本研究结果表明:甲1型流感病毒感染MDCK细胞后,MDCK细胞凋亡率显著高于正常细胞(P<0.01),说明流感病毒可诱导体外培养细胞发生凋亡,与上述文献报道相同。
本研究也表明疏风宣肺解毒汤治疗组和奥司他韦治疗组的凋亡率显著低于病毒对照组(P<0.01),说明疏风宣肺解毒汤可抑制甲1型流感病毒感染引起的MDCK细胞凋亡,阻滞流感病毒在体外细胞内增殖,其对甲1型流感病毒感染诱导的细胞凋亡抑制率为67.07%,与奥司他韦(76.36%)接近,足见疏风宣肺解毒汤对甲1型流感有良好的防治作用,为临床应用疏风宣肺解毒汤治疗甲1型流感提供了分子生物学实验依据;但同时疏风宣肺解毒汤的凋亡率又高于其药物对照组(P<0.01),提示疏风宣肺解毒汤本身也可以引起细胞的凋亡,相应机制有待进一步研究。
中医药防治疫病有几千年的历史和丰富的临床经验,其临床疗效肯定、毒副作用小、价廉已被世界所公认。疏风宣肺解毒汤以清热解毒、宣肺解表立法,经临床验证,其清热解毒、透邪解表的功效确切,其抗流感病毒作用应该是抑制流感病毒诱导细胞凋亡、阻滞病毒在宿主细胞内增殖,进而干扰病毒在体内大量复制。但其自身引起宿主细胞凋亡及抑制甲1型流感病毒感染引起的MDCK细胞凋亡是否与调控细胞凋亡途径、影响凋亡信号传导、调控凋亡相关基因表达、调控细胞因子等有关以及有何关联,这些详细机理都有待深入探讨。
摘要：目的 探讨疏风宣肺解毒汤对甲1型流感病毒感染的犬肾传代细胞凋亡的影响。方法 将犬肾传代细胞分为六组:正常细胞对照组、病毒对照组、疏风宣肺解毒汤治疗组、疏风宣肺解毒汤对照组、奥司他韦治疗组、奥司他韦对照组,含药组均加入相应的最大无毒限量药液,Annexin V和PI双染用流式细胞仪(flow cytometry,FCM)测定细胞凋亡的百分率。结果 疏风宣肺解毒汤治疗组和奥司他韦治疗组的凋亡率显著低于病毒对照组(P<0.01),而高于其药物对照组(P<0.01);疏风宣肺解毒汤对甲1流感病毒诱导的细胞凋亡的抑制率(IR)为67.07%,奥司他韦为76.36%。结论 疏风宣肺解毒汤可抵抗甲1型流感病毒诱导的细胞凋亡,作用与奥司他韦相近。
关键词：疏风宣肺解毒汤,流感病毒,犬肾传代细胞,细胞凋亡
参考文献
[1]Takieuusa T,Matsukawa S,Higuchi Y,et al.Induction of pro-grammed cell death(apoptosis)by influenza virus infection in tis-sue culture ce11s[J].J Gen Virol,1993,74(Pt 11):2347.
[2]Mori I,Komatsu T,Takeuchi K,et a1.In vivo induction of apopto-sis byinfluenza virus[J].J Gen Viral,1995,76(11):2869-2873.
[3]Toshihiro I,Kobayashi Y,Morita T,et a1.Virulent influenza A vi-ruses induCe apoptosis in chickens[J].Virus Research,2002,84(1-2):27-35.
[4]Hinshaw VS,Olsen CW,Dybdahl-Sissoko N,et a1.Apoptosis:amechanism of cell killing by influenza A and B viruses[J].J Vi-ral,1994,68(6):3667-3673.
病毒诱导 篇2
由于艾滋病病毒感染人体后会在细胞内形成一个潜伏病毒库, 在中断治疗后能迅速释放病毒, 导致继续感染。因此, 临床上治疗艾滋病的药物只能抑制病毒的生长, 而不能彻底清除艾滋病患者体内的病毒, 致使艾滋病无法得到治愈。这一难题长期困扰着世界各国从事艾滋病研究的科研人员, 也激发了科研人员破译艾滋病病毒的信心和决心。
由于艾滋病病毒囊膜蛋白是启动病毒感染的关键蛋白, 抑制囊膜糖蛋白的功能具有抗病毒的治疗作用, 而直接阻断其在细胞内的合成则能达到根除病毒感染的目的。
中国农业科学院哈尔滨兽医研究所基础免疫研究团队在首席科学家郑永辉研究员的带领下, 以抑制艾滋病囊膜蛋白功能为主要研究方向, 经过不懈努力终于取得重要研究进展。
研究人员在对艾滋病病毒囊膜糖蛋白天然降解通路做了深入细致的研究后, 筛选出一个能够抑制该降解通路的小分子化合物, 该化合物通过抑制I型α-甘露糖苷酶的活性有效阻断了病毒囊膜蛋白的降解。通过对I型α-甘露糖苷酶家族的进一步筛选, 最终发现其家族成员之一的ERMan I酶能够诱导艾滋病病毒囊膜糖蛋白降解, 并抑制艾滋病病毒的复制。ERMan I酶是糖蛋白在细胞内质网进行糖基化过程中所需要的一种酶, 该酶对确保蛋白质在内质网中正确折叠起着关键作用。该研究显示, 艾滋病病毒在感染人体细胞时会在内质网合成大量病毒囊膜糖蛋白, 并消耗大量细胞资源进行糖基化修饰和折叠, 诱发细胞抵抗机制, 导致ERMan I酶激活, 从而特异性地降解病毒囊膜糖蛋白, 达到清除病毒的目的。
病毒诱导 篇3
为了制备JSRV受体Hyal -2蛋白的抗血清和进一步研究JSRV与其受体的相互作用,本试验对JS- RV受体Hyal - 2原核表达条件进行优化,以期摸索出最佳的表达条件,现将结果报道如下。
1材料
pGEX - 4T - 1空载体质粒、含pGEX - 4T - 1 - Hyal - 2重组质粒的BL21( DE3) 重组菌( 重组质粒带有EcoRⅠ、NotⅠ限制性内切酶酶切位点) ,由内蒙古农业大学绵羊肺腺瘤病研究室保存; EcoRⅠ、NotⅠ限制性内切酶、DL - 10 000 Marker,均购自TaKaRa公司; 质粒少量提取试剂盒,购自TIANGEN试剂公司; SDS - PAGE配胶试剂盒、彩色预染蛋白分子质量标准,购自碧云天生物技术研究所; 鼠抗GST抗体、 HRP标记的羊抗鼠IgG抗体,购自北京博奥森生物技术有限公司。
2方法
2. 1菌液的活化及其鉴定
按照1∶100比例将含pGEX - 4T - 1 - Hyal - 2重组质粒的BL21( DE3) 重组菌添加到20 mL含氨苄西林( Amp) 的LB液体培养基中,37 ℃、200 r/min振荡培养过夜; 按照质粒少量提取试剂盒操作方法提取pGEX - 4T - 1 - Hyal - 2重组质粒,用EcoRⅠ、NotⅠ 限制性内切酶对重组质粒进行双酶切鉴定,对菌液测序鉴定。将pGEX -4T - 1空载体质粒转化至BL21 ( DE3) 大肠杆菌中得到含pGEX -4T -1空载体质粒的对照菌。
2. 2重组菌IPTG诱导浓度的优化
将过夜活化的重组菌按照1∶100的比例加到10 mL含Amp的LB液体培养基中,37 ℃ 、200 r / min振荡培养; 待其OD值达到0. 6 ~1. 0时,分别加入终浓度为0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. 0 mmol/L的IPTG; 37 ℃ 、200 r / min诱导4 h; 将诱导好的菌液以12 000 r / min离心5 min; 弃上清液,向菌体沉淀中加3 mL PBS悬浮沉淀,4 ℃ 、12 000 r / min离心5 min; 如此反复3次; 向漂洗好的菌体中加1 mL PBS置于冰上,超声破碎至清亮; 4 ℃、12 000 r/min离心10 min; 分离上清液和沉淀,分别加入蛋白上样缓冲液并煮沸5 min; 取10 μL制备好的样品用10% SDS - PAGE电泳检测,考马斯亮蓝R250染色液染色2 h; 脱色液脱色至条带清晰,扫描仪扫描,确定最佳的IPTG诱导浓度。
2. 3重组菌作用时间的优化
将过夜活化的重组菌按照1∶100的比例加到10 mL含Amp的LB液体培养基中,37 ℃ 、200 r / min振荡培养; 待其OD值达到0. 6 ~1. 0时,加入终浓度为0. 5 mmol/L的IPTG,在37 ℃、200 r/min条件下诱导表达; 于第2,4,6,8小时时分别取样,按照2. 2中的方法制样,最后用10% SDS - PAGE电泳检测以确定最佳的作用时间。
2. 4低温对目的蛋白产量的影响
将过夜活化的对照菌、重组菌按照1∶100的比例分别加到10 mL含Amp的LB液体培养基中,37 ℃、 200 r / min振荡培养; 待其OD值达到0. 6 ~ 1. 0时, 向对照菌、重组菌中分别加入终浓度为0. 5 mmol/L的IPTG,在15 ℃、150 r/min条件下诱导过夜; 按2. 2中的方法制样,最后用10% SDS - PAGE电泳检测以确定目的蛋白的表达量及其表达形式。
2. 5 Western - blot检测
将低温条件下诱导表达的产物经10% SDS - PAGE电泳后,应用湿转方法( 恒流350 mA、3 h) 转移至硝酸纤维素膜( NC膜) 上,5% 脱脂乳封闭过夜; 次日弃掉封闭液,以鼠抗GST抗体为一抗( 1∶5 000) 稀释,室温孵育1 h; PBST漂洗4次,每次8 min; 以HRP标记的羊抗鼠IgG抗体为二抗( 1∶4 000) 稀释, 室温孵育1 h; PBST漂洗4次,每次8 min; 显影液显影,多功能成像仪成像。
3结果与分析
3. 1重组质粒的鉴定结果
重组质粒经EcoRⅠ、NotⅠ双酶切后得到大小分别为4 900,1 431 bp的2条条带,分别与pGEX - 4T - 1空载体质粒和Hyal - 2基因片段大小相符,说明目的片段已正确插到pGEX - 4T - 1空载体质粒中,即为pGEX - 4T - 1 - Hyal - 2重组质粒,结果见图1。
3. 2不同浓度IPTG诱导对目的蛋白产量的影响
经10% SDS - PAGE电泳检测显示,重组菌经不同浓度IPTG诱导后均表达了目的蛋白,目的蛋白主要以包涵体形式在沉淀中表达,上清液表达量较少, 不同终浓度IPTG对表达量的影响较小,其中以0. 4 mmol / L的IPTG诱导时表达量最高,结果见图2。
3. 3不同作用时间对目的蛋白产量的影响
经10% SDS - PAGE电泳检测显示,重组菌经IPTG诱导后表达了目的蛋白,不同作用时间对重组菌表达目的蛋白有明显影响,其中作用2 h后蛋白表达量最高,结果见图3。
3. 4低温对重组菌表达目的蛋白的影响
在15 ℃、终浓度为0. 5 mmol/L的IPTG诱导条件下,对照菌表达大小为26 ku的GST标签蛋白,重组菌表达大小为80 ku的带GST标签的目的蛋白,重组菌表达的目的蛋白在此诱导条件下可溶性形式增加,包涵体所占的比例明显减少,结果见图4。
1.EcoRⅠ单酶切;2~3.EcoRⅠ、NotⅠ双酶切;M.DL-10 000 Marker。
1 ～ 2. 0. 2 mmol / L 的 IPTG 诱导结果; 3 ～ 4. 0. 4 mmol / L 的 IPTG 诱 导结果;5 ～6.0.6 mmol/L 的 IPTG 诱导结果;7 ～8.0.8 mmol/L 的 IPTG 诱导结果; 9. 1. 0 mmol / L 的 IPTG 诱导结果; M. 蛋白分子 质量标准。
1~2.2 h取样;3~4.4 h取样;5~6.6 h取样;7~8.8 h取样;M.蛋白分子质量标准。
3. 5 Western - blot检测结果
Western - blot检测结果显示: 硝酸纤维素膜上重组菌经诱导后在80 ku附近出现明显印迹,即带GST标签的GST - Hyal -2融合蛋白条带; 对照菌经诱导后在26 ku左右出现印迹,即GST标签蛋白条带。重组菌表达的GST - Hyal - 2目的蛋白包涵体形式所占比例较高,上清液中也有可溶性形式存在,但所占比例较少。对照菌表达的标签蛋白在低温时主要以可溶性形式在上清液中存在,结果见图5。
M.蛋白分子质量标准;1.对照菌诱导超声破碎后的上清液;2.对照菌诱导超声破碎后的沉淀;3.重组菌诱导超声破碎后的上清液;4.重组菌诱导超声破碎后的沉淀。
M.蛋白质分子量标准;1.对照菌诱导超声破碎后的上清液;2.对照菌诱导超声破碎后的沉淀;3.重组菌诱导超声破碎后的上清液;4.重组菌诱导超声破碎后的沉淀。
4讨论
原核表达受多种因素影响,对诱导条件进行优化是十分必要的,为了使GST - Hyal - 2目的蛋白大量、稳定、高效地表达,本试验分别对重组菌表达GST - Hyal - 2目的蛋白的IPTG诱导浓度、作用时间、温度进行优化,摸索出了重组菌的最佳表达条件。 结果发现,含pGEX -4T -1 - Hyal -2重组质粒的重组菌在37 ℃、终浓度为0. 4 mmol/L的IPTG诱导条件下目的蛋白的表达量最高,最佳的作用时间是2 h, 在37 ℃ 时,目的蛋白主要以包涵体形式存在,在15 ℃ 以下时,目的蛋白可溶性形式明显增加,说明温度对GST - Hyal -2目的蛋白的表达有明显影响。
原核表达系统以大肠杆菌表达系统最为常见,大肠杆菌系统由于其遗传学、生物化学和分子生物学已被人们充分了解而成为表达外源蛋白的首选表达系统,而且大肠杆菌表达系统具有成本低、表达量高、表达产物分离和纯化相对简单和周期短等优点[5]。本试验后期计划用表达出的Hyal - 2蛋白制备多克隆抗体,选用的是pGEX -4T -1空载体质粒,pGEX表达载体系列被广泛用于各种融合蛋白的表达[6],该载体在分子生物学的研究中被广泛应用,并且表达出的目的蛋白可利用谷胱甘肽亲和层析进行亲和、纯化,得到较纯的目的蛋白,还可以利用载体自带的凝血酶酶切位点把GST标签特异地切除,得到单一的目的蛋白。
本试验结果显示,在37 ℃时目的蛋白主要以包涵体形式存在,当温度降到15 ℃时目的蛋白的可溶性形式明显增加,主要原因是原核表达系统不能对表达出的蛋白进行修饰和进一步加工,当外源蛋白在大肠杆菌中过量表达时,常导致表达产物在细胞内大量蓄积,二硫键不能以正确的方式配对形成正确的空间结构,最后形成不溶性包涵体,对大多数蛋白来说在低温、低IPTG诱导浓度的条件下可以抑制包涵体的形成,使可溶性形式增加[7]。由于包涵体的复性操作复杂而且复性效率不高,所以包涵体的形成是蛋白表达的一个难题,后期的蛋白纯化步骤也十分繁琐。 任增亮等[8]研究发现,添加信号肽、分子伴侣及改变培养基营养条件有利于目的蛋白的高效表达。
病毒诱导 篇4
研究发现TRX参与机体多种生物学活性, 并与人类多种疾病有关, 如肿瘤、获得性免疫缺陷综合征、自身免疫性疾病、心脑等器官缺血再灌注损伤性疾病等[5]。由于TRX具有多种重要的生物学功能, 近年来已成为研究的热点。
有研究表明, TRX基因是非常有前途的用于基因治疗的候选基因, 应用重组TRX治疗的方法取得了令人鼓舞的结果, 但应用的重组蛋白质半衰期短, 需反复给药, 这可能会引起全身或其他部位的不良反应, 同时, 生产大量高质量的重组蛋白质花费巨大, 而采用转基因治疗的方法可能克服上述缺点。因此我们利用腺病毒载体感染效率高、宿主范围广及安全性较好等特点, 构建携带hTRX的腺病毒载体, 为hTRX在医学工程和基因治疗中的应用提供基础。
1 材料和方法
1.1 材料
E.coliJM 109和DL2000marker购自Takara (日本) ;限制性内切酶NotI和SalI酶, CeuI和PeuI酶, T4DNA Ligsae, 购自Promega (美国) ;小量质粒提取试剂盒, LambdaDNA/EcoRI+HindⅢMarker, 3购自哈尔滨宏博生物公司;pGEM-TEasy/TRX重组质粒由哈尔滨医科大学邹宁博士提供;PCR扩增引物P1、P2、P3和P4 (参考序列GeneBankJ04026) 序列分别为P1位于64～81 bp, 序列为5′-ATGGTG-CAGATCGAG-3′, P2位于455～473bp, 序列为:5′-GGCAACTGGTTACTTC-3′, P3序列为5′, -ATCGAGCT-CAGATG-GTGAAGCAGATCGAG-3′ (含SacI酶切位点) , P4序列为:5′-ATCGTCGACG-GCAACTGGTTAT-GTCTTC-3′ (含SalI酶切位点) 。
1.2 方法
1.2.1 pGEM-T Easy/TRX重组质粒的测序:
取PCR扩增鉴定的阳性克隆, 应用T7和SP6引物双向测定TRX序列, 由博亚生物公司完成。
1.2.2 含TRX基因的穿梭质粒构建:
将pGEM-T Easy/TRX (含NotI和SalI酶切位点) 和穿梭质粒pshuttle2分别用NotI和SalI 37℃双酶切后, 回收目的片段, 在4℃下用T4DNA连接酶连接过夜。连接产物转化大肠杆菌JM 109, 铺LB平板 (含50μg/mlAmp) , 培养过夜后挑取单个菌落, 转入LB培养液中培养过夜后提取质粒, 进行多聚酶链反应 (PCR) 扩增筛选阳性克隆后双酶切电泳鉴定。
1.2.3 重组腺病毒载体pAdCMV-TRX的构建:重组
质粒pshuttle2-TRX用CeuI和PeuI 37℃双酶切后, 回收带有CMV启动子的TRX基因小片段, 用T4DNA连接酶在4℃下连接E 1、E 3缺失的含有同样酶切位点的Adeno-X病毒DNA过夜, 连接产物转化大肠杆菌JM 109, 铺LB平板 (含50μg/mlAmp) , 培养过夜后挑取单个菌落, 转入LB培养液中培养过夜后提取质粒, 进行PCR扩增筛选阳性克隆后双酶切电泳鉴定。
2 结果
2.1 pGEM-TEasy/TRX重组质粒序列测定
将重组质粒pGEM-TEasy/TRX质粒在博亚公司进行序列测定, 结果与GeneBank序列J04026比较, 序列一致, 测定序列长度为503bp, 其中包括TRXcDNA全长315bp (ATG-TAA) (图1) 。
2.2 含TRX基因穿梭质粒的构建及鉴定
将穿梭质粒pshuttle2 (图2) 和重组质粒pGEM-T Easy/TRX分别经NotI和SalI双酶切后回收目的片段连接, 成功构建出重组质粒pshuttle2-TRX, 用引物P1和P2进行PCR扩增, 在1.2%TBE的琼脂糖凝胶上电泳, 可在415bp处见清晰条带 (图3) 。提质粒后用限制性内切酶NotI和SalI酶切鉴定, 在1.2%TBE的琼脂糖凝胶上电泳, NotI单酶切和双酶切获得两条带, SalI单酶切获得一条带 (图4) 。
M:LambdaDNA/EcoRI+HindⅢMarker, 3;质粒:pshuttle2穿梭质粒
0117-7:pshuttle2/TRXPCR (415bp) ;M:DL2000marker
N:NotI酶切;S:SalI酶切;D:双酶切;M 1:LambdaDNA/EcoRI+HindⅢmarker, ;M:marker
2.3 重组腺病毒pAdCMV-TRX的构建与鉴定
重组质粒pshuttle2-TRX和Adeno-X病毒分别经CeuI和PeuI双酶切后回收的目的片段, 连接产物转化大肠杆菌JM 109, 用引物P3和P4进行PCR扩增筛选阳性克隆后在1.2%TBE的琼脂糖凝胶上电泳, 在435bp处出现清晰条带 (图5) , PI-SceI和I-CeuI双酶切重组腺病毒pAdCMV-TRX在1.2%TBE的琼脂糖凝胶上电泳, 在23.1kb和2.0kb处可见清晰条带 (图6) 。成功构建出Tet-Off诱导的重组腺病毒pAdCMV-TRX。
P:pAdCMV-TRX质粒的PCR (435kb) ;M 1:LambdaDNA/EcoRI+HindⅢmarker, 3;M 2:DL2000marker
M 1:LambdaDNA/EcoRI+HindⅢmarker, 3;M 2:DL2000marker;Z:质粒 (32kb) ;D:双酶切 (PI-SceI和I-CeuI) ;S:单酶切
3 讨论
TRX一般都具有一个相同的有氧化还原活性的Cys-Gly-Pro-Cys的氨基酸序列。在其保守的活化区域内含有具备氧化还原活性的二硫巯基和二硫醇, 因此TRX在细胞内具有各种不同的功能[6]。如抗氧化作用、调节细胞生长、抑制凋亡、转录调节作用、辅助因子作用等。因此, TRX与人类许多疾病有关, 如病毒性心肌炎、肿瘤、心脑等器官缺血再灌注损伤性疾病[7]、获得性免疫缺陷综合征、自身免疫性疾病、类风湿性关节炎、神经系统疾病等[8]。为此, 我们进行TRX腺病毒基因重组, 为进一步研究TRX的功能提供平台。
本实验所用的重组质粒pGEM-TEasy/TRX, 在博亚公司进行序列测定, 其测序结果的正确性为下一步实验的顺利进行打下了基础。将TRXcDNA与穿梭质粒pshuttle2连接, 使重组质粒易于转入细胞进行克隆扩增。然后把TRXcDNA克隆至E 1、E 3缺失的Adeno-X病毒中正确构建重组腺病毒pAdCMV-TRX, 为以后TRX基因表达及其功能研究奠定基础。
人们从上世纪50年代开始认识腺病毒[9,10], 到80年代初已开始利用腺病毒重组子作为哺乳动物细胞表达载体。腺病毒DNA不整合到宿主染色体, 只在体外连接, 并在穿梭质粒和腺病毒载体上设计稀有的酶切位点, 避免反向连接及自身环化, 便可保证重组腺病毒载体正确构建。另外, 本实验采用新型腺病毒表达系统即Adeno-XTMTet-Off表达系统, 在腺病毒载体中存在受四环素调控的基因片段, 在四环素诱导下, Adeno-XTMTet-Off表达系统能精确地调控目的基因表达。这样即使是编码细胞毒素的基因或例如肿瘤抑制基因, 细胞因子或激素等这样的蛋白质, 都能被安全地整合在有传染性的腺病毒上然后传染给要表达和研究的靶细胞。通过PCR、双酶切手段鉴定显示我们成功构建了重组腺病毒pAdCMV-TRX, 为下一步将TRX基因克隆进真核细胞表达载体, 收集重组腺病毒pAdCMV-TRX蛋白表达产物, 采用心肌内多点注射或冠状动脉内注射使重组腺病毒载体介导的TRX基因转染心肌细胞保护急性柯萨奇B 3病毒性心肌炎, 观察是否有保护和治疗作用, 观察TRX是否抑制病毒在细胞内的复制, 是否抑制细胞凋亡等奠定了基础。为临床上应用TRX治疗之急。
由于福利院常住人口数量、调查时间等客观条件的限制, 本调查研究存在样本量偏小的局限性, 有待于相关大样本量的调查进一步验证。对社会福利院老年人这一高发病率的特殊弱势群体, 应建立相应的健康体检和健康教育机制, 通过多种途径加强高血压防治知识的普及, 给予积极的社会援助, 纠正不良的生活习惯, 从而提高其生活质量, 改善远期预后。
摘要：目的克隆人硫氧还蛋白 (hTRX) 基因, 并构建含有该目的基因的重组腺病毒载体。方法用内切酶从重组质粒pGEM-TEasy/TRX上切下全长TRX cDNA片段, 与穿梭质粒pshuttle2连接, 形成pshuttle2-TRX重组质粒, 再双酶切pshuttle2-TRX, 将带有CMV启动子的目的片段, 插入Tet-Off诱导的Adeno-X病毒DNA中, 用PCR、双酶切方法进行鉴定。结果对pGEM-T Easy/TRX重组质粒进行序列测定, 测定结果与Gene-Bank序列J04026基本一致, 其中包括TRX cDNA全长。该实验构建出含TRX的穿梭质粒pshuttle2-TRX, 并成功获得Tet-Off诱导的重组腺病毒载体pAdCMV-TRX。结论TRX基因的克隆及其重组腺病毒载体pAdCMV-TRX的成功构建, 为进一步研究TRX生物活性及发病与氧化损伤关系密切的疾病治疗提供新的手段, 如病毒性心肌炎、动脉硬化、心肌病、糖尿病、Alzheimer's病等。
关键词：硫氧还蛋白,腺病毒,基因重组
参考文献
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病毒诱导 篇5
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 材料
pcDNA3.1、阳离子脂质体 (lipofectamin peagant) , 购自Invitrogen公司;受体菌E.coli DH5α, 由东北农业大学生命科学与技术研究中心提供。鸡贫血病毒, 由东北农业大学生命科学与技术研究中心分离自哈尔滨郊区某鸡场, 命名为哈尔滨株;人肺癌细胞A549, 由北京第一医科大学惠赠。
1.1.2 试剂 Sma
Ⅰ、BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ、Sal Ⅰ、XbaⅠ, 购自New England BioLabs公司;dNTPs、其他限制性内切酶、T4 DNA连接酶, 购自宝生物工程 (大连) 有限公司;DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒, 购自上海华舜生物工程有限公司;Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒, 购自南京凯基生物科技发展有限公司。
1.2 方法
1.2.1 病毒DNA的分离
给1日龄SPF鸡接种鸡贫血病毒, 接种第7天取病鸡肝脏, 冷却后置于-20 ℃保存, 备用。
取因典型贫血病致死鸡的肝脏进行匀浆, 4 000 r/min离心并收集上清液, 加蛋白酶K和10%SDS至终浓度分别为300 μg/mL和0.5%, 37 ℃消化过夜。分别用酚、酚-氯仿、氯仿各抽提1次, 再用乙醇沉淀, 收集沉淀, 干燥后用TE溶解, 备用。
1.2.2 VP3基因克隆、测序
根据GenBank中报告的cDNA序列, 用Primer Premier 5.0引物设计软件设计出1对寡核苷酸引物 (由上海生工生物工程技术服务有限公司合成) :primer 1为5′–ATGAACGCTCTCCAAGAAG–3′, primer 2为5′–GCCATCTTACAGTCTTATACGC –3′。PCR反应程序:94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min, 55 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 mim, 30个循环;最后72 ℃延伸5 min 。反应结束后用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测结果, -20 ℃保存, 备用。
回收纯化PCR产物用T4 DNA聚合酶将其末端补平后, 与用Sma Ⅰ消化的pUC18连接, 将重组质粒转化感受态细胞DH5α, 挑取若干个单菌落分别进行质粒扩增、提取。重组质粒pUC-VP3经PCR鉴定目的片段应为366 bp, EcoRⅠ和BamH Ⅰ双酶切鉴定目的片段应为390 bp, Pst Ⅰ酶切鉴定目的片段应为320 bp。将初步鉴定为重组质粒的菌液用质粒抽提纯化试剂盒提取质粒DNA, 对阳性克隆菌液进行测序。
测序反应见CEQ8000操作流程。收集GenBank数据库中收录的鸡贫血病毒基因, 在NCBI中用BLAST将克隆的基因与GenBank数据库进行序列比较, 用Gene Runner软件 (3.0版) 对VP3 DNA序列和氨基酸组成进行排序和数据整理。
1.2.3 VP3真核表达载体的构建
将经测序后的pUC-VP3用BamH Ⅰ和Xba Ⅰ把目的片段切下, 同时用相同的两种酶处理真核表达载体pcDNA3.1, 胶回收双酶切产物并连接, 质粒经相应的酶切鉴定无误后进行测序确证读码框正确, 获得pcDNA-VP3真核表达体系。
1.2.4 细胞培养及基因转染人肺癌细胞A549
人肺癌细胞A549在含10%胎牛血清的DMEM培养基于37 ℃、5%CO2的条件下培养, 待细胞生长汇合达80%时用0.25%胰酶消化, 1∶3传代, 选取对数生长期细胞进行试验。LipofectamineTM2000介导的基因转染按说明书进行。
1.2.5 RT-PCR检测
待细胞融合度达70% ～80%时常规消化、收集细胞, 用异硫氢酸胍一步法提取培养细胞中的总RNA, 在MLV逆转录酶的作用下以Oligo-dT为引物合成cDNA, 然后扩增特异的片段。同时以未转染细胞为空白对照和空质粒转染的细胞为阴性对照。
1.2.6 流式细胞术检测转染后基因诱导凋亡的细胞
收集转染前、转染后各时段的人肺癌细胞A549, 胰酶消化后制备成单细胞悬液 (用PBS调整细胞浓度至1×106个/mL) , 具体操作程序按Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒进行。
1.2.7 MTT法检测不同处理组A549细胞增殖情况
取空白对照组、阴性对照组、试验组不同时段 (12, 24, 48, 72 h) 细胞, 用MTT法检测细胞生长抑制率, 每组均设6个复孔。在酶联免疫检测仪上测定各孔的光吸收值OD490, 记录结果并绘制A549细胞增殖抑制曲线[4], 数据进行单因素方差分析, 以undefined表达结果, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 重组质粒pUC-VP3的鉴定结果 (见图1、图2)
1.PCR产物;2.DL-2 000 Marker。
1.EcoRⅠ/BamH Ⅰ双酶切产物;2.Pst Ⅰ酶切产物;3.λ-EcoT14。
图2中泳道1为pUC-VP3经EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ消化的产物;泳道2为经Pst Ⅰ消化的产物, 重组质粒出现约390 bp、320 bp的电泳条带, 与预期相符。
2.2 测序结果
随机挑选3个正向连接的阳性克隆, 所测得的序列完全相同, 该基因的开放读码框为366 bp, 编码121个氨基酸。有1个典型的核定位区, 氨基酸位置为111～121个 (RPRTARRRIRL) 。从氨基酸组成计算VP3等电点的理论值为10.02。在GenBank数据库中, 克隆的基因与CAV-1的VP3基因序列完全一致。
2.3 重组质粒pcDNA-VP3的酶切鉴定结果 (见图3)
1.DL-15 000 Marker;2.pcDNA-VP3;3.pcDNA-VP3经BamHⅠ /Xba Ⅰ双酶切的产物。
泳道3为pcDNA-VP3经BamH Ⅰ、Xba Ⅰ双酶切产物, 得到约400 bp的片段, 与预期相符。
2.4 RT-PCR检测结果 (见图4)
1.DL-2 000 Marker;2.空白对照;3.阴性对照;4.RT-PCR产物。
由图4可见, 泳道4为RT-PCR扩增产物, 得到长度约为400 bp的特异片段, 与预期相符, 非转染细胞和转染空质粒的细胞未出现阳性扩增。
2.5 流式细胞术检测结果 (见图5)
注:Ⅰ、Ⅲ.24 h、72 h阴性对照样本;Ⅱ、Ⅳ.转染后24 h、72 h试验组样本。
由图5 (左下象限FITC-/PI-显示为活细胞, 右下象限FITC+/PI-为早期凋亡细胞, 右上象限FITC+/PI+为非活细胞即坏死细胞和晚期凋亡细胞) 可以看出:24 小时时凋亡细胞由早期凋亡细胞组成;72小时时凋亡细胞由中晚期凋亡细胞细胞组成。试验组随着时间的推移凋亡细胞明显增多, 说明鸡贫血病毒VP3基因是以凋亡的方式诱导细胞死亡的。
2.6 MTT法检测结果 (见图6)
由图6可见:试验组细胞的增殖明显比阴性对照组和空白对照组细胞缓慢。A549细胞在12小时时细胞生长抑制率在各试验组间差异无统计学意义, 24, 48, 72 h的细胞生长抑制率分别为20.1%、40.7%、49.5%, 呈升高趋势, 提示VP3对A549细胞的生长具有抑制作用。
3 讨论
目前, 尚未见有关VP3基因促进肺癌细胞凋亡的研究。试验构建了pcDNA -VP3的真核表达载体, 并转入人肺癌A549细胞中, 证实VP3基因在体外对人肺癌细胞有明显的诱导凋亡作用, 抑制肺癌细胞增殖, 提示VP3有望成为一种有效的肿瘤抑制剂 (尤其是在肺癌治疗) 。
参考文献
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病毒诱导 篇6
1 材料和方法
1.1 主要试剂
鼠抗人IFN-γ单抗(mouse anti-human IFN-γm Ab,R&D公司),生物素化的鼠抗人IFN-γ单抗(anti-human IFN-γbiotinylated m Ab,R&D公司),链霉亲和素-碱性磷酸酶(streptavidin-alkaline phosphatase,R&D公司),硝基四唑氮蓝(nitroblue tetrazolium,NBT,R&D公司),5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸-4-甲苯胺盐(BCIP,R&D公司),淋巴细胞分离液(上海化学试剂厂),RPMI-1640(GIBCO公司)、胎牛血清(fetal calf serum,FCS,GIBCO公司),植物血凝素P(PHA-P,Sigma公司),96孔聚乙烯板(polyvinylidene diflu oride-backed plates,PVDF:MAIPS4510,Milloipore公司)。
1.2 HTNV NP C端合成多肽
参照人HTNV 76-118株NP序列(GeneBank accession No.P05133),由上海申友生物技术有限公司合成C端15个氨基酸长重叠9个氨基酸的多肽,纯度大于95%。合成多肽的序列和位置见附表。
1.3 外周血单个核细胞的分离
13例肾综合征出血热患者均为2007年12月～2008年10月本院收治的住院患者(经临床和流行性出血热特异性IgM和IgG抗体检测确诊)。恢复期时,抽取9 m L静脉血加1 m L肝素钠(500 u/mL)抗凝。采用Ficoll密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),计数,留2 m L PBMC悬液用于ELISPOT实验和T细胞增殖实验,其余3 m L冻存(15%DMSO,85%FCS)。
1.4 IFN-γELIs pot实验
参照文献[6]进行。简要步骤如下:每孔用100μL含0.5μg/m L的鼠抗人IFN-γ单克隆抗体包被96孔PVDF板,置4℃过夜。PBS洗板后,取10μL200μg/m L肽溶液添加至PVDF板的每孔中,每条肽作4个复孔。然后每孔添加100μL HFRS患者的PBMC悬液(含2×105细胞/m L)。阴性对照加10%FCS的RPMI 1640(R10)和PBMC悬液,阳性对照加R10、PBMC悬液和5μL PHA-P(1μg/μL)。将培养板置37℃5%二氧化碳孵箱过夜(16～18 h)。PBS洗板后,每孔添加100μL含0.5μg/m L的生物素化的鼠抗人IFN-γ单克隆抗体,置室温孵育1h。PBS洗板,添加抗生蛋白链菌素-碱性磷酸酶(1∶2 000稀释)100μL于PVDF板的孔中,置室温孵育1 h。PBS洗板后,各取100μL NBT和BCIP于10 m L Tris缓冲液(pH9.5)中,混匀后,加100μL至PVDF板的孔中,室温避光显色15～20 min。自来水冲洗3次,以终止显色反应。晾干后,用ELIspot读数分析系统(德国,ELR03)统计蓝色斑点数。特异性斑点呈边缘模糊、规整的蓝色圆点。每一个斑点代表一个特异性分泌IFN-γ的T细胞。阴性对照的斑点数一般在0～3个,斑点数在3或3个以上者为阳性。特异性分泌IFN-γT细胞(SFC,spot forming cells)的数量=实验孔斑点数-阴性对照孔斑点数。T细胞频率通常用SFC/106 PBMCs为单位。
2 结果
2.1 ELIs pot实验结果
用IFN-γELIspot实验测试了13名HFRS患者对23条合成肽的T细胞反应,在5名患者(3、4、7、10和12号)检测到不同程度的肽特异性IFN-γ分泌。其余8名患者未检测到肽特异性T细胞应答。见图1。
2.2 肽特异性T细胞频率
3、10号患者对No.70肽反应较强,T细胞频率分别为51和55 SFC/106 PBMCs;4、7和12号患者对No.51肽反应较强,T细胞频率分别为90、65和95 SFC/106PBMCs。见图2。
注:实验中,输入细胞数为2×105 PBMC/m L。A、C、E为No.51肽分别诱导4、7、12号患者的T细胞反应;B、D为No.70肽分别诱导3、10号患者的T细胞反应;G为阴性对照。
3 讨论
在诱发免疫应答过程中,T细胞识别靶细胞表面抗原表位的同时,必须识别同一靶细胞所表达的MHC分子,否则免疫应答不会发生。与MHCⅠ类分子结合的多肽通常为8～10个氨基酸,一般为9个。而与MHCⅡ类分子结合的多肽通常为13～34个氨基酸。但在T细胞表位鉴定中,长度为12～20个氨基酸残基范围内的多肽均能满足初筛的需要[7,8],通常都选择15个氨基酸长的多肽进行表位筛选[5～7]。HV NP序列总的同源性为50%,但C端100个氨基酸更为保守,同源性可达85%左右,如汉滩和汉城病毒为82%。因此,鉴定C端T细胞表位有利于交叉反应性T细胞表位的研究。其次,NP被B细胞和T细胞识别的表位分布存在明显的差异。B细胞抗原表位主要位于NP N端[9,10],而T细胞抗原表位似乎主要位于NP C端[3,5]。本室既往研究表明[11],C端CTL反应较N端强,提示C端可能含有较多的T细胞表位。因此,笔者前期工作选择了NP 1/3的C端为研究对象,并合成了23条15个氨基酸长的短肽作为抗原,体外诱导HFRS患者的T细胞反应,以筛选该段可能的T细胞表位。
T细胞通过其表面的T细胞受体(TCR)对抗原和MHC进行双识别后,才能活化和启动免疫反应。IFN-γ主要由CD4+Th1和CD8+Th1细胞分泌,这些细胞统称为Th1样细胞。Th1应答主要是增强巨噬细胞和CTL的抗感染能力。随着酶免疫分析技术在医学和生物学领域的广泛应用,80年代中期建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和细胞因子(cytokine,CK)分泌细胞的固相酶联免疫斑点试验(enzyme-linked immunospot,ELIspot)。该技术是ELISA技术的延伸,通过检测CK来评价T淋巴细胞功能和特异性的新方法。它不仅具有检测活化(activated)或记忆(memory)T细胞的优点,而且在单细胞水平能检测CK的释放,并直接记数外周血中抗原特异性T细胞,尤其是CTL的频率。其次,敏感性高,足以检测到1/105个IFN-γ分泌细胞,并可同时分析大量标本。因此,灵敏、高通量和容易操作使ELIspot法适于监控和定量检测抗原特异性T细胞应答,被国内外学者广泛用于T细胞表位筛查和疫苗疗效监测等。本研究用该方法测试了13名HFRS恢复期患者对HTNV核蛋白23条多肽的T细胞反应。结果表明,5名患者有不同程度的多肽特异性T细胞应答。其中,3、10号患者对No.70肽反应较强,T细胞频率分别为51和55 SFC/106 PBMC。4、7、12号患者对No.51肽反应较强,T细胞频率分别为90、65、95 SFC/106PBMC。这种表位识别的差异提示抗病毒免疫应答的性质和组成不同,说明不同个体具有不同的表位特异性优势T细胞群,其原因可能是由于不同个体具有不同的HLA单倍型。有趣的是,VAN EPPS等(1999)[3]鉴定的受HLA-A1限制的aa421～429表位(ISNQEPLKL)刚好位于No.70肽(aa415～429:DVKVKEISNQEPLKL)内。笔者筛选的No.70肽,其表位最适大小及HLA限制性是否与上述相同,尚有待进一步证实。其余8名患者未检测到多肽特异性T细胞应答,原因可能是这些多肽特异性T细胞频率低于检测极限,也可能是在ELIspot实验中使用的15氨基酸肽的刺激不是最理想的。另一个很重要的原因是笔者仅合成了NP 1/3的C-端多肽,这8名患者体内NP多肽特异性T细胞反应可能不在此范围内。此外,由于表位肽受HLA限制,未检测到多肽特异性T细胞应答的8名患者可能没有与之相匹配的HLA型别。
本实验以恢复期的HFRS患者为研究对象,测定了PBMC中的T细胞频率。由于此期患者体内病毒已基本清除[4,12],激活的T细胞因凋亡而死,仅有一部分存活下来成为记忆性T细胞。因此,本研究测定的是记忆(memory)T细胞而非活化(primed)T细胞。事实上,T细胞应答的动力学研究也证实了这一点。病毒感染后CD8+T细胞迅速活化,6 h即可测出活化的T细胞,48 h后开始杀伤感染的细胞[13]。活化一般持续48～96 h后结束[14]。此外,本文报道的T细胞频率可与EBV、HIV等一些抗原表位特异性T细胞频率相比[15,16],这些病毒由于持续感染而定期再活化,通常都有很高的CTL频率。较高的抗原特异性记忆T细胞频率可能是人不会再次感染汉坦病毒(HV)的原因。动物实验已证实[1],鼠持续感染HV与病毒特异性CD8+T细胞缺乏有密切的关系。因此,本实验为进一步研究HFRS发病机理、疫苗研制及抗病毒免疫反应提供了重要资料。
摘要：目的测定汉滩病毒(HTNV)核蛋白(NP)C-端多肽诱导肾综合征出血热(HFRS)患者的特异性T淋巴细胞反应,为HFRS发病机制、疫苗研制及抗病毒免疫反应研究提供资料。方法采用Ficoll密度梯度离心法,分离HFRS恢复期患者外周血单个核细胞(PBMC),用IFN-γ酶联免疫斑点试验(ELIspot)测试13名患者对23条多肽的T淋巴细胞反应,筛选出反应较强的肽段。结果5名患者有不同程度的肽特异性T细胞反应。No.70肽可诱导3号和10号患者分泌IFN-γ,T细胞频率分别为51和55SFC/106PBMC,No.51肽可诱导4、7、12号患者分泌IFN-γ,T细胞频率分别为90、65、95SFC/106PBMC。结论No.51肽和No.70肽可诱导较强的T淋巴细胞反应,可能是NPC端的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位。