体外诱导耐药（共7篇）
体外诱导耐药 篇1
摘要：目的以58株金黄色葡萄球菌为例, 分析其耐药性分布, 指导临床抗生素的合理使用。通过体外诱导耐药, 初步探讨其耐药机制。方法 整群选取该院2013年3月—2014年3月临床分离得到的58株金黄色葡萄球菌, 进行药敏实验, 分析其耐药性分布。通过体外诱导法建立金黄色葡萄球菌的耐药模型, 初步探讨其耐药机制。结果 58株金黄色葡萄球菌中, 分离出32株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA) , 占金黄色葡萄球菌的55.2%。金黄色葡萄球菌主要分布在ICU病房、呼吸内科以及神经外科。主要感染标本为痰液和分泌物。所分离到的58株菌对万古霉素和利奈唑胺均敏感, 青霉素耐药率为98.3%。结论 金黄色葡萄球菌主要分布在门诊、ICU等科室, 且耐药菌株的数量已不容乐观, 应引起临床上的足够重视, 加强抗生素合理使用的管理以及对金黄色葡萄球菌感染的监测。
关键词：金黄色葡萄球菌,耐药性,体外诱导耐药
金黄色葡萄球菌 (staphylococcus aureus) 是近年来临床常见的主要致病菌, 属于革兰氏阳性菌。 金黄色葡萄球菌可引起皮肤软组织感染、重型肺炎、导管相关性感染、感染性心内膜炎以及血液感染等疾病, 且其极易形成生物膜 (BBF) [1], 加大了治疗难度。 半个多世纪前, 抗生素的发现开辟了医疗革命的新时代, 但随着抗生素的广泛使用, 甚至是滥用, 导致了耐药菌的产生, 且数量在逐年增加[2]。 为了进一步了解金黄色葡萄球菌的分布和耐药性, 该研究整群选取该院2013 年3 月—2014 年3 月临床分离得到的58 株金黄色葡萄球菌进行分析, 现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
1.1.1 菌株来源该院临床分离得到的58 株金黄色葡萄球菌, 质控菌株ATCC25923 购自卫生部临检中心。
选取的58 株金黄色葡萄球菌主要分布在门诊、ICU病房、呼吸内科和神经外科, 见表1。 感染标本主要来自痰液和分泌物, 见表2。
1.1.2 药敏纸片万古霉素、青霉素、利奈唑胺、环丙沙星、莫西沙星、苯唑西林、替加环素、四环素、红霉素、庆大霉素均由英国Oxiod公司生产。
1.1.3 培养基MH肉汤、MH琼脂培养基和甘露醇氯化钠琼脂培养基均由自北京三药科技开发公司生产。
1.2 方法
分离的菌株经过微生物自动分析系统VITEK鉴定;药物敏感性实验采用K-B (Kirby-Bauer) 纸片法进行测定。 采用含药甘露醇氯化钠琼脂平板对MRSA进行体外诱导, 具体方法采用药物浓度递增方式进行。
1.3 观察标准
参照CLSI标准, 抑菌圈直径20 mm以上为极敏感菌, 15~20 mm为高度敏感菌, 10~14 mm为中度敏感菌, 10 mm以下为低敏感菌, 无抑菌圈则不敏感。
2 结果
2.1 金黄色葡萄球菌的耐药情况分析
分离到的58 株菌中MRSA32 株、MSSA26 株, 所有58 株临床致病菌对万古霉素和利奈唑胺均敏感, 但青霉素耐药率为98.3%, 其余7 种抗菌药对MRSA的耐药率均高于MSSA (非耐甲氧西林金黄色葡萄球菌) , 见表3。
2.2 利奈唑胺体外诱导6 株MRSA耐药情况分析
6 株对临床常用抗生素强耐药的MRSA体外诱导耐药显示, 经20 次体外耐药诱导后, 1、3、4 号菌株的MIC升高2 倍, 2、5 号菌株的MIC升高4 倍。 6 号菌株的MIC升高8 倍。 说明抗生素的不合理使用, 会导致耐药菌株的产生, 增加治疗难度。
3 讨论
金黄色葡萄球菌在革兰氏阳性菌感染中居首位, 是院内感染和社区内感染的主要致病菌之一[3]。 该研究表明, 金黄色葡萄球菌尤其是MRSA引起的感染已经日益严重, 且有报道称MRSA具有多重耐药性[4]。 随着抗生素的使用, 细菌在繁殖过程中, 后天性地获得了更多的耐药基因, 从而对越来越多的抗生素产生了耐药性[5]。 金黄色葡萄球菌在各科室的分布受多种因素的影响, 例如医院环境、患者体质等, 但主要取决于细菌本身的致病性和患者本身的免疫力[9], 该文研究结果显示, 金黄色葡萄球菌在门诊和ICU检出率较高。 有报道显示, MRSA的爆发已发生在ICU[10]。 这可能是由于ICU病房重症患者相对集中, 且长期卧床等原因[11], 因此, 减少机械性操作的使用很有必要, 保持室内空气流通, 创面严格消毒, 减小感染几率。 金黄色葡萄球菌易形成生物膜 (bacterial biofilm, BBF) , BBF会加大细菌的致病性和耐药性, 给治疗增加了新的挑战[12]。 因此, 在治疗金葡菌感染, 尤其是MRSA感染时, 应合理选择抗生素。
该研究从58 株金黄色葡萄球菌中分离得到32 株MRSA, 检出率高达55.17%, 说明耐药菌株的数量已不容小觑, 且有不断增加的趋势, 需引起足够的重视, 这与文献报道基本一致。 治疗MRSA感染主要依赖糖肽类抗菌药, 万古霉素就是其代表药物[6,7]。 该研究选取的58 株金黄色葡萄球菌均对万古霉素敏感, 因此, 万古霉素仍是治疗MRSA的有效药。
此外, 该研究还用利奈唑胺对6 株MRSA进行了体外诱导耐药实验。 利奈唑胺是一种新型噁唑烷酮类药物, 口服利用度好, 药效与万古霉素相当甚至更高[8], 其体外诱导试验结果显示, 在经20 次体外诱导后, 所有被诱导的菌株其MIC均有所上升, 升高倍数2~8 倍不等, 说明即使利奈唑胺是一种新型的抗菌药物, 但其在临床上也需合理使用, 否则将导致耐药菌株的产生, 增加治疗难度。
综上所述, 金黄色葡萄球菌导致的感染已经遍布了门诊、ICU等科室, 且MRSA占了临床感染金葡菌的很大比例, 并呈现像各科室扩散的趋势, 应该引起临床的足够重视, 加强抗生素合理使用、开发新型抗生素以及增强对金黄色葡萄球菌感染的监测力度。
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体外诱导耐药 篇2
体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞样细胞方向分化
探讨成纤维生长因子-2(FGF-2)在体外定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)向肝细胞样细胞分化的作用及量化关系.体外分离培养大鼠BM-MSCs,将第3代BM-MSCs采用不同剂量的FGF-2诱导.诱导后,在显微镜下观察细胞形态学的改变;用免疫细胞化学法检测白蛋白和CK19的分泌;Shiff染色法检测糖原的分泌.诱导后BM-MSCs由梭形向多角形、卵圆形方向变化,白蛋白、CK19和糖原12 d即有阳性表达,以后随着诱导时间的.延长阳性率逐渐升高.20 ng/mL FGF-2诱导比10 ng/mL FGF-2诱导细胞白蛋白、CK19和糖原的表达量均多.20 ng/mL FGF-2具有较强的诱导BM-MSCs向肝细胞样细胞分化的能力.
作 者：胡晶 牟玲 罗恩杰 HU Jing MU Ling LU En-jie 作者单位：胡晶,罗恩杰,HU Jing,LU En-jie(中国医科大学,病原生物学教研室,辽宁,沈阳,110001)牟玲,MU Ling(沈阳市传染病医院,辽宁,沈阳,110006)
刊 名：微生物学杂志 ISTIC英文刊名：JOURNAL OF MICROBIOLOGY 年，卷(期)：2008 28(3) 分类号：Q254 关键词：骨髓间充质干细胞 成纤维生长因子-2 肝细胞样细胞皮肤干细胞体外培养与诱导分化 篇3
1 材料与方法
1.1 材料
标本来源:收集本院产科新生儿脐带标本25份,健康成人头发12份,及新鲜猪软骨10份。
上皮细胞培养液:参照文献[2]配制。在DMEM和F12(V∶V=3∶1)基础培养液中添加如下成分:15%胎牛血清、4 mmol/L谷氨酰胺、0.4μg/mL氢化可的松、5μg/m L转铁蛋白、1.8×10-4mmol/L腺嘌呤、2×10-11mmol/L三碘甲腺原氨酸、5μg/mL胰岛素、10 ng/mL表皮生长因子、100 u/mL青霉素和100μg/mL链霉素。以上试剂中,DMEM和F12培养基购自杭州吉诺生物科技有限公司,胎牛血清购自杭州四季青公司,其余试剂购自美国Sigma公司。
普通消化液:0.25%胰酶以1∶1的比例加入0.02%EDTA(美国Gibco公司);抗人角蛋白19(K19)单抗(美国Biovision公司);Hanks液(杭州吉诺生物科技有限公司);SP试剂盒及DAB试剂盒(北京奥森生物技术有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 制备干细胞悬液
(1)将取得的新生儿脐带纵向剪开,用三蒸水清洗除去血液及脐带中内容物,然后将皮肤组织剪碎,用含2 000 u/L青霉素、200 mg/L链霉素及2.5 mg/L两性霉素B的无钙镁离子PBS液反复冲洗3次;(2)将冲洗干净的皮片组织置于0.25%中性蛋白酶Ⅱ中消化20 min,再置于0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA中,37℃消化30 min,200目金属网过滤,收获细胞悬液,1 000 r/min离心5~10 min,再用无钙镁的Hanks液洗涤离心2次,进行细胞计数;(3)将消化洗涤后的细胞加入含有15%胎牛血清、4 mmol/L谷氨酰胺、0.4μg/mL氢化可的松、5μg/mL转铁蛋白、5μg/mL胰岛素、10 ng/mL表皮生长因子、1.8×10-4mmol/L腺嘌呤、100 u/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM和F12(V∶V=3∶1)培养基中,培养瓶底用Ⅳ型胶原包被,于37℃、5%二氧化碳孵育箱中孵育,次日吸出培养液及未贴壁细胞,再加入新鲜培养液,2、3 d换液1次,细胞长至70%~80%融合时进行诱导分化培养及离心涂片,免疫组化鉴定表皮干细胞。
1.2.2 表皮干细胞的鉴定
取第2代传代培养的表皮干细胞离心涂片烤干,免疫组织化学染色检测表皮干细胞的K19表达,PBS液代替1抗作为阴性对照。
1.2.3 体外诱导分化实验
根据细胞因子及激素等物质对干细胞有诱导分化的影响,将第2代传代培养的表皮干细胞从瓶底消化至单个细胞,离心收集后制成细胞悬液,分别用诱导液A液(10ng/mL M199培养液、15%胎牛血清、100 u/mL青霉素、100μg/mL链霉素、4μg/mL地塞米松、5 ng/mL表皮生长因子、10 ng/mL成纤维细胞生长因子)和B液(10 ng/mL M199培养液、10%胎牛血清、100 u/mL青霉素、100μg/mL链霉素、0.05 mg/mL维生素C)加入24孔培养皿内(孔内放置3、4根毛干组织或猪软骨2、3块)培养,24 h后换液,以后每2天换液1次,观察干细胞的分化情况。
2 结果
用Ⅳ型胶原黏附法分离得到约5%~10%的快贴附培养细胞,这些细胞被认为是皮肤干细胞[3],免疫组织化学K19阳性表达(图1),随着培养细胞传代数的增加,细胞体外培养增殖的速度会减慢,获得的干细胞数也会下降。原代细胞经2、3周培养会出现较明显的增殖和细胞克隆现象,并可进行传代或诱导分化培养,诱导分化培养2、3 d后发现干细胞向毛根及毛干聚集生长(图2、3),10~15 d细胞缓慢分化为毛干的毛皮质样结构,并同毛皮质融合成一体,部分干细胞围绕毛干形成隆突样物质,原细胞形态逐渐消失(图4)。在含猪软骨块的培养孔中,皮肤干细胞形态变异,形成异型样细胞,众多细胞围拢渐渐融合成片状,但未见聚集成鸟巢状集落(图5)。
A:新生儿皮肤干细胞(×100);B:免疫组织化学K19表达阳性(×100)
A:干细胞密集生长(×400);B:干细胞向毛发聚集生长(×100)
A、B:猪软骨组织诱导后细胞出现异形性改变(×400)
3 讨论
干细胞是一类具有自我更新的原始细胞,能产生至少一种以上高度分化的子代细胞,在细胞的生长和分化过程中起主导作用。表皮中角质形成细胞主要由3种细胞成分组成,包括表皮干细胞、短暂扩增细胞和有丝分裂后分化细胞[4],其中表皮干细胞是角质形成细胞中增殖能力最强的细胞,是潜在的多能干细胞,成为近年来干细胞研究重点之一。TU-DOR等[5]利用表皮干细胞具有快速黏附Ⅳ型胶原的特性将其分离出来,并发现基底细胞中有4%~10%的细胞具有快速黏附性,其中45%能增殖形成大克隆。这些多能干细胞能分化产生构建表皮、皮脂腺等细胞。关于毛囊干细胞与表皮干细胞是否同源是近来科学家们所关注的问题,过去一直认为毛囊和表皮各自有独特的干细胞,现在BLANPAIN等[6]指出:这两种结构中只有一种根本的表皮干细胞,它不仅具有形成皮肤的能力,也有形成毛发、皮脂腺的能力。METALLO等[7]也认为毛囊是角朊干细胞的主要来源,毛囊干细胞不仅能形成毛发,而且可形成表皮。OSHIMA等[8]指出,存在于小鼠触须毛囊外根鞘部上端的多能干细胞,能分化产生构建表皮、皮脂腺和毛囊等所需的各种类型的细胞。从胚胎发育角度,毛囊及汗腺均由外胚层分化来的表皮干细胞产生,所以有学者认为三者是一个共同的干细胞来源,提出表皮-毛囊-皮脂腺单位的概念。黄锦桃等[9]发现胚胎干细胞源性表皮干细胞在小鼠全层皮肤缺损创面可分化为表皮样、汗腺样、毛囊样和皮脂腺样结构。根据上述概念,笔者用成人毛发为诱导物使新生儿皮肤干细胞向毛发组织转变。在实验研究过程中观察到,最初几天新生儿ESCs会向毛干周边移动聚集,随后逐步分化成毛鞘样结构。本组的结果支持METALLO的观点。
本实验中用细胞生长因子及条件培养基,对所分离的干细胞用猪软骨作诱导物进行诱导分化,得到异型样细胞,提示所分离的干细胞具有多向分化潜能,并且可被诱导进行横向分化。试想如果能从成体皮肤、血液、新生儿脐带及脐带血中提取有效的成体或多能干细胞,在微环境的诱导下,在相关细胞及细胞外基质间的作用中调节干细胞增殖及定向分化,这将给皮肤组织工程带来新的治疗途径。总之,皮肤干细胞的研究和应用还处于早期阶段,很多分化机制和体外调控机制尚不明确,但皮肤干细胞对细胞疗法具有重要的意义。
摘要：目的 探讨新生儿皮肤干细胞(ESCs)的培养方法,并研究新生儿皮肤干细胞的增殖及诱导分化。方法 用两步酶消化法分离新生儿脐带获得角质形成细胞,采用Ⅳ型胶原快速黏附法筛选ESCs并培养。在含细胞因子的条件培养基中加入人头发组织或猪软骨组织作为诱导物,对增殖的ESCs进行体外诱导培养,观察ESCs的分化状况。结果 培养的新生儿ESCs有克隆状生长现象,角蛋白K19免疫组化染色阳性,培养初期细胞有向毛发的毛根和毛干为中心聚集生长现象,并逐步分化成类似毛皮质的结构。结论 新生儿ESCs在含毛发组织为诱导物的条件培养基中逐步分化成类似毛干皮质的组织结构,这为体外构建毛发组织工程奠定了一定的理论基础。
关键词：皮肤干细胞,体外克隆,诱导分化
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体外诱导耐药 篇4
关键词：胚胎干细胞(ESC),诱导性多能干细胞(i PS),原始生殖细胞,体外诱导,雄配子,雌配子
近年来人的不孕不育问题越来越突出,配子发生早期阶段数量减少甚至没有配子形成,或是产生异常配子,都会给治疗不育不孕症带来极大困难。随着科学的发展,对人体配子形成过程的了解逐渐加深,逐步实现了体外诱导人干细胞向生殖细胞的形成,为治疗不孕不育提供了理论与应用基础。
胚胎干细胞(ESC)是受精卵发育到囊胚阶段的细胞,是一种能够发育成所有组织器官的多能干细胞;诱导性多能干细胞(i PS)是一种能自我更新和具有多分化潜能的干细胞,是对成体细胞或胎儿细胞强制表达octamer-binding transcription factor 3/4(Oct3/4)、SRY(sex determining region Y)-box 2(Sox2)、v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog(c-myc)和Kruppel-like factor(klf4)等基因重编程形成的。ESC和i PS是一类能向多种细胞类型分化的多能干细胞,在特定体外培养条件下可诱导产生生殖细胞。配子的形成是一个非常复杂的过程,在体内包括连续的时间和空间过程。前期是向原始生殖细胞(PGC)发育,PGC迁移到生殖脊并形成性腺,最终通过减数分裂向配子体分化。
1 原始生殖细胞的获取和体外培养
ESC表达的特异性基因在自我更新和维持多能性方面发挥着重要作用,其中一些特异标记物与PGC相同,为了研究PGC分化为配子的关键因子,首先得将其与ESC区别开。PGC是ESC在一系列基因精确表达并逐渐向生殖细胞发育过程中形成的。人胚胎发育至第5~10周产生PGCs,对应小鼠产生于E10.5~E13.5。期间包含表观遗传重组和全DNA去甲基化,伴随着新细胞的形成及维持细胞的多能性。在体内,PGC经历二个发育阶段,第一阶段:在胚胎期外胚层内出现PGC,聚集在泌尿生殖脊外侧分化形成减数分裂前生殖细胞。此阶段细胞具有干细胞特性,一些特异标记物与ESC相似。第二阶段:减数分裂前生殖细胞启动减数分裂发育为成熟配子。在体外,ESC分化为具有PGC特异表达标记物的细胞。ESC-PGC和PGC-生殖细胞的转变可作为两个常见的阶段。这里具体描述决定各阶段最具代表性的分子决定因素。
A.T.Clark等人成功诱导人ESC细胞表达生殖细胞特异性基因DAZL后,对人的3个ES细胞系展开了研究,通过检测胚胎干细胞和生殖细胞特异性基因的表达发现,GDF3、NANOG和STELLAR在未分化的ES细胞中表达,但是不表达减数分裂前期的特异性标记基因(OCT4、NANOG、STELLA、GDF3、PUM2、DAZL、NANOS、VASA)和减数分裂后期的特异性标记基因(SCP1/3、MLH1、TEKT1、GDF9)。进一步研究发现,在诱导ESC形成类胚体(embryoid Body,EB)过程中,OCT4、STELLAR、NANOG和GDF3表达下调,而VASA、SCP1、SCP3、GDF9和TEKT1在类胚体产生3 d后开始表达[1]。
K.Kurimoto等[2]检测了在体外培养小鼠外胚层细胞产生PGC的过程中的全基因组转录动态,结果发现,产生PGC是一个高度有序的大量基因调控的过程,小鼠这个时期的细胞中有500个基因表达上调,330个基因表达下调。因此,可用特定的基因表达作为PGC的一种标记并与ESC区分开来,这些特异性标记基因涉及细胞的多能性、细胞迁移及生殖取向。PRDM1和BMP/SMAD(小鼠和人ESC转变为PGC的关键标记基因)等基因作为PGC的标记基因已被认可。研究表明,人ESC产生PGC的过程中PRDM1转录是必需的。保守基因DAZ(AZFc)基因家族包括DAZL和BOULE,人类约有15%的无精症患者缺失AZF区域。研究发现,敲除DAZL基因的小鼠不能产生生殖细胞。研究发现,在h ESC形成PGC的过程中DAZL基因启动表达,因此可用DAZL和VASV来标记PGC[3]。VASA基因缺陷会影响雄性生殖细胞的增殖和分化,过表达VASA可诱导h ESC分化为PGC[1],过表达BOULE或DAZ可加快PGC的增殖。此外,由ESC诱导分化而来的PGC表达STELLA[1,4],并且STELLA基因表达是决定m ESC向生殖细胞系分化的重要因素,已通过转基因小鼠得到验证。另一个相关标记基因是CXCR4,CXCR4与其配位体SDF1/CXCL12互作是PGC向原始性腺迁移所必需的。此外,由于ESC不表达CXCR4,可同PGC区分开来。通过调节细胞培养条件和基因的表达水平可大量培养PGC。2009年,N.Bucay等人利用相应的培养条件培养h ESC获得10~50个细胞的小克隆,其中有20%~30%的细胞表达CXCR4,且CXCR4+细胞在基因KIT、DAZL、PRDM1和VASA(PGC特异基因)的表达量上要远远高于CXCR4-细胞。Tilgner在培养h ESC时发现,表达SSEA1的细胞与PGC类似,也表达VASA、OCT4和STELLA等基因[4]。移植小鼠E6.25外胚层后,BMP4可诱导BLIMP1和PRDM14表达,与AP2γ共同诱导其产生PGC[5,6]。这些基因形成的网络可抑制体细胞基因表达,诱导PGC特异性基因(如Nanos3)表达[7,8]。2014年,在诱导h ESC分化为PGC的研究中,N.Irie等[9]发现了在人类中(而不在小鼠中)调控这一过程的一个主导基因Sox17。
2009年,T.S.Park等[10]通过体外培养h IPS获取PGC,筛选了培养7 d后的SSEA1+KIT+VASA+细胞群体,结果只有不到10%的细胞表达PGC特异性基因PRMD1、STELLA和DAZL。2011年,K.Hayashi等[11]成功将小鼠ES和i PS细胞转化为健康精子,并产生了健康的后代,首先将ES和i PS诱导为外胚层样细胞(epiblast-like cells,Epi LCs),再用BMP4、LIF、SCF、BMP8a和EGF将其诱导为原始生殖细胞样细胞(primordial germ cell-like cells,PG-CLCs),结果约有40%的细胞形成了PGCLCs。
2 ESC向雄性生殖细胞分化
睾丸是产生雄性生殖细胞的重要器官,参与生殖细胞的分裂和分化。参与精子发生的主要作用因子有BMP和RA,以及周围的支持细胞和间质细胞分泌因子等。一些旁分泌因子对于形成一个完整的精子也至关重要,主要是下丘脑-垂体轴分泌的激素:LH和FSH。科研人员进行了大量研究以实现体外精子发生,他们通过ESC获得了不同发育阶段的生殖细胞(精原细胞、精细胞、精子)。PGC作为生殖细胞的过渡阶段,最终发育形成精子和卵子[9]。
2004年,A.T.Clark等[1]研究发现,减数分裂阶段细胞表达特异性标记基因(SCP1/3、MLH1、TEKT1),h ESC一旦进入这个阶段,能自发分化形成雄性生殖细胞。2008年,F.D.West等[12]在研究h ESCs时发现,OCT3+/VASA+细胞群体可持续分化,并进入精原细胞阶段(表达PUM2、DAZ1/4和NANOS1)和减数分裂阶段(表达SCP3和MLH1)。也有研究人员利用各种因子(RA、BMP、睾丸提取物或黏连蛋白)诱导h ESC向雄性生殖细胞分化。2009年,N.Bucay等人利用层黏连蛋白-1培养CXCR4+PGC,获得的细胞表达FSH、AMH和LH受体,以及雄性生殖细胞特异性标记基因SOX9和ACR。
通过比较不同条件下培养的特定细胞(BMP4、RA或新生儿睾丸),结果发现,视黄酸似乎对细胞向生殖细胞诱导最有效。基于先人的研究,2009年,B.Aflatoonian等[13]利用RA成功诱导h ESC分化形成早期生殖细胞(DAZL、VASA),进入减数分裂(SCP3)和形成精细胞(TNP1、PRM1/2),成功产生了单倍体圆形精子细胞和长形精子;同时,他们还检测到细胞分泌的二氢睾酮(dihydrotestosterone,DHT)和雌二醇(estradiol,E2),这两种激素是精子发生过程中细胞合成的。此前,2004年,N.Geijsen等[14]利用RA诱导小鼠ESC衍生的胚状体SSEA1+OCT4+细胞得到了表达LHR、AMH和SRY基因以及顶体素的雄性生殖细胞,荧光原位杂交检测细胞染色体倍性为单倍体,并通过胞浆内单精子注射及囊胚二倍体检测精子的生殖发育能力。
有学者通过检测特定的基因来证明向雄性生殖细胞的分化,结果表明,RA结合睾酮能诱导小鼠ESC表达雄性生殖细胞特异性基因(ACT和PRM1),然而这些细胞在形态学上没有被证实为生殖细胞,而且也没有检测是否具有生殖能力。这显然没有足够的说服力。因此,研究人员通过向ICSI受精后的囊胚转入报告基因,用于研究ESC向雄性生殖细胞的诱导。2009年,K.Kee等人向h ESC中转入了VASA-GFP报告基因,然后过表达GFP+细胞的DAZ、DAZL和BOULE基因,结果表明,细胞表达减数分裂标记基因(SCP3、ACR),并最终获得了单倍体细胞和圆形精子。2003年,Y.Toyooka等[15]培养敲入VASA基因的小鼠ESC(IRES-GFP和IRES-LACZ),VASA+细胞与分泌BMP4细胞共培养可分化为PGC,将分化得到的PGC移植到小鼠睾丸中成功产生了成熟的精子。
多能干细胞分化为雄性配子是由一系列精确的分子过程决定的,尽管只在有限的研究中得到报道[13,14,16],然而人精子发生的分子机理还没有完全研究清楚,通过诱导获得的生殖细胞还没有在人体得到验证。令人振奋的是通过ICSI试验证实了,在小鼠上可以发育成胚胎[14,16]。应用于人上只是时间的问题。
3 ESC向雌性生殖细胞分化
在动物体中,卵子发生过程是不连续的。减数分裂开始于胎儿,出生前停止,青春期恢复并最终完成受精。配子在卵巢中形成,并且卵巢具有周期现象。卵子发生和卵泡发育之间具有密切联系,体现在卵巢中体细胞和生殖细胞之间的联系。卵泡发育首先依赖于局部因素(SCF、TGFβ、GDF9、AMH、雄激素等)使其变得敏感,之后主要依赖于LH和FSH[17]。
2007年,H.F.Chen等[18]以卵巢卵泡为基础培养h ESC,培养21 d后细胞表达STELLA和GDF9基因,虽然有蛋白SCP3表达,但是减数分裂其他相关基因表达量极低。2006年,I.Novak等[19]研究发现,m ESC可诱导分化为原始卵泡和初级卵母细胞,但是这些细胞不能进入减数分裂。2006年,O.LachamKaplan等[20]研究发现,由m ESC获得的卵母细胞样细胞与体内形成的卵母细胞基本相同,可检测到ZP3和FIGα表达,但没有发现透明带。2007年,T.Qing等[21]强调,体外诱导生殖细胞需要了解生殖细胞与体细胞之间的相互作用关系,如用颗粒细胞与m ESC来源的PGC共培养,虽然这些细胞表达GDF9、ZP1/3和SCP3,且有典型的卵母细胞形态,但没有透明带。2009年,B.Aflatoonian等[13]使用SSA1+h ESC细胞获得了卵母细胞样细胞和卵泡样结构,并检测了SCP3和GDF9蛋白的表达,但也没有发现卵母细胞样细胞的透明带。2012年,K.Hayashi等[22]在培养基里添加BMP4、LIF、SCF、BMP8a和EGF等因子,将小鼠雌性ESCs和i PSCs诱导形成PGCLCs后,与E12.5卵巢体细胞重组形成重组卵巢,体外培养2 d,将Prdm1+Dppa3+的重组卵巢移植到小鼠体内可产生成熟的卵母细胞,并可受精产生健康后代。
研究发现,OCT4在干细胞中表达,但在精子发生和卵子发生过程中会经历一个表达下调阶段,在卵母细胞减数分裂Ⅰ期后表达重新上调。2003年,K.Hubner等[23]对m ESC进行了有针对性地表达OCT4(gc OCT4-GFP),然后选择培养同时表达GFP和KIT的细胞种群,获得了表达雌性生殖细胞特异性标记基因GDF9和SCP3的细胞,这些卵细胞有透明带并表达ZP2和ZP3膜蛋白;他们还用孕马血清促性腺激素(PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(HCG)诱导激活卵母细胞可使其排出极体,揭示了这些细胞能完成第一次减数分裂,通过孤雌激活可发育到囊胚期。进一步研究发现,转染GDF9基因启动子的m ESC能形成卵母细胞的表型,获得的卵母细胞可孤雌发育形成2-细胞和4-细胞[24]。2009年,C.R.Nicholas等[25]通过向m ESC转入OCT4获得了卵母细胞样细胞,选取SSEA1-细胞群体并在含BMP4、KIT-ligand/SCF和RA因子的培养液中培养,结果发现,这些细胞开始减数分裂,但染色体定位SCP3仍然是局部的,这些细胞移植到小鼠肾包膜下能够形成原始卵泡和初级卵泡。
总之,在小鼠上ESC分化形成雌配子是可行的,并且已经得到了证实[22,23,24];但是人ESC体外诱导形成的卵母细胞的功能还没有得到充分证实。
4 结语与展望
ESC体外形成配子是一个复杂过程,迄今为止已经有一些科研团队获得了人成熟和具有功能的配子。尽管人体外产生配子的研究进展迅速,但基于伦理问题,体外产生的配子并未在人体上验证其产生后代的能力,而只能使用鼠作为模型来验证。然而,猪、猴等动物的生理配子发生更接近人类,在未来的研究中可以加快这方面的发展。
体外诱导耐药 篇5
关键词：铜绿假单胞菌,重组蛋白质类
绿脓杆菌是一种人类和动物的重要条件致病菌, 可以经创伤引起继发性感染[1]。绿脓杆菌具有易定植、易变异、多重耐药和耐药机制复杂等特征。由于细菌的生长离不开脂肪酸的合成, 因此, 抑制脂肪酸的生物合成将直接影响细菌生长和繁殖。在分子水平上, 脂肪酸生物合成 (fatty acid biosynthesis, FAS) 酶系可分为Ⅰ型和Ⅱ型两种类型, FAS-Ⅰ酶系集中分布于于哺乳动物。而FAS-Ⅱ酶系则在细菌中广泛分布的, FAS-Ⅱ酶系中的每一种酶活性均处于不同的蛋白质上, 每一个反应都是由一个单独的酶催化。基因敲除试验和特定靶标抑制剂的使用也证实了FAS-Ⅱ途径中的酶是细菌生存必不可少的[2]。在脂肪酸延长循环的四步反应中, 由烯酯酰-ACP还原酶催化的还原反应是最后一步反应, 也是整个循环反应的限速步骤, 因此烯酯酰-ACP还原酶是整个脂肪酸生物合成途径中最关键的一个酶, 也是作为FAS抑制剂的筛选是一种理想的靶标, 烯酯酰-ACP还原酶IV (FabV) 也是烯酯酰-ACP还原酶系中的一种酶。研究发现, 烯酯酰-ACP还原酶IV是一种NADH依赖型的单功能酶, 由于其分子量比较大, 在溶液中以单体形式存在, 并且其二级结构存在Rossmann折叠, 活性基序为Tyr- (Xaa) 8-Lys[3]。因此烯酯酰-ACP还原酶IV的结构、结合的辅酶, 和活性位点方面都存在较大特异性。本实验的研究主要就是针对绿脓杆菌烯酯酰-ACP还原酶IV阳性克隆转染、诱导、蛋白提纯表达, 从而优化重组蛋白诱导表达时间, 使绿脓杆菌烯酯酰-ACP还原酶IV重组蛋白的表达达到一个良好的水平。为建立以烯酯酰-ACP还原酶IV为靶标的新型抗生素筛选模型奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
Pseudomonas aeruginosa CMCC10104, 购买于上海复祥生物科技有限公司。质粒pET-28b (+) , 实验室保存。E.coli BL21 (DE3) , 实验室保存。各种限制性内切酶, 修饰酶购自大连宝生物公司, DNA/Hind III Marker、蛋白质Marker等购自Takara司。PCR纯化试剂盒, 切胶回收试剂盒, 质粒抽提试剂盒等主要购自AXYGEN公司。
1.2 烯酯酰-ACP还原酶IV重组转化子的制备
挑取Pseudomonas aeruginosa CMCC 10104单菌落, 过夜培养后离心、洗涤、去上清, 苯酚/氯仿/异戊醇抽提, DNA沉淀晾干后用溶解, 电泳检测总DNA符合预期目标。配制PCR反应体系进行PCR扩增, PCR扩增结束后取5μl于1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。鉴定PCR产物后使用胶回收试剂盒按照以下步骤来回收、纯化PCR产物。将纯化后的fabV基因以及质粒pET-28b (+) 通过内切酶Hind III和Nde I进行双酶切, 37℃恒温培养箱中酶切8h左右, 并进行琼脂糖凝胶电泳检测。酶切产物回收后酶连过夜。制备大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞, 将酶连产物转化感受态细胞, 制备重组工程菌。将菌种在含有卡那的培养基培养5～6h后抽提质粒, 将电泳初步检测正确的转化子再进行PCR和双酶切检测, 结果得到预期期待目标。
1.3 烯酯酰-ACP还原酶IV重组工程菌的诱导表达优化
1.3.1 诱导开始时间的优化
(1) 在以1%的接种量接入菌种后每隔一小时加入IPTG, 同时每隔1小时取样测定OD600值, 观察其生长。 (2) 取1ml培养液, 电泳分析重组蛋白的表达量。
1.3.2 诱导时间的优化
(1) 在500ml三角瓶中装入50ml LB培养基, 按1%的接种量接入活化菌种, 根据诱导开始时间的最优时间, 将菌液于37℃培养4h。取1ml菌液于1.5ml的离心管中作为未诱导对照, 低温保存。剩余带菌培养液中加入IPTG后继续培养, 每隔1小时测其OD600值, 并取1ml菌液分析蛋白的表达量。
2 结果
2.1 烯酯酰-ACP还原酶IV重组蛋白诱导表诱导开始时间的优化
分析可知, 如果较早开始诱导, 菌体合成蛋白的时间也提前, 而蛋白的产生会影响菌体的生长。因而, 培养0h和1h 就加入IPTG, 其生物量明显低于诱导开始晚的实验组;2h时, 菌体生长已临近对数生长期, 因此菌体正逐步进入快速生长阶段;3h时菌体生长处于对数生长前期, 如果3h作为诱导起始时间, 可以看到, 在诱导开始后2h内菌体依然可以进行快速生长, 之后达到平台期;而在培养4h时, 菌体生长已进
入对数生长中后期, 如果在这时开始诱导, 菌体在1h内就进入了平台期。因而最终菌体量在诱导起始时间在为2h、3h、4h 三者之间没有明显差异。由此可判定, 在菌体对数生长期开始诱导会得到较高的生物量。
对于重组蛋白的表达, 诱导开始时间也会带来不同的结果。如果从0h开始诱导, 那么达到蛋白最大表达量的时间就会提前;而0h、1h、2 h诱导的重组蛋白表达并没有明显差别。而蛋白最大表达量最晚的时间是在4h时诱导。由此可知, 在3h时重组蛋白表达量最大, 其次为2h;而由于0h时开始诱导其生物量低, 因而最终的蛋白表达量也低。所以对于重组蛋白表达来说, 要想得到最大的表达量, 还是在菌体生长的前期诱导为好。也就是说, 在菌体培养3h 时诱导是最佳诱导开始时间。
2.2 烯酯酰-ACP还原酶IV重组蛋白诱导表诱导时间的优化
重组工程菌的生长量是随着时间的增加而逐步增长, 菌体在最初的2h没有明显的增加, 而2h后菌体进入对数生长期, 7h后生物量达到最高点, 之后增长逐步趋于平稳。而重组蛋白的表达呈一个缓慢增长趋势, 在诱导6h后达到重组蛋白表达的最大量, 之后随着诱导时间的增加, 蛋白合成量逐步下降。因此从诱导时间对于工程菌和重组蛋白的影响综合分析可以看出, 在IPTG诱导后6h时, 是工程菌和重组蛋白表达均达到最大表达量的一个时间。
3 讨论
烯酯酰-ACP还原酶IV是2008年才从霍乱弧菌中发现的一类新型的烯酯酰-ACP还原酶, 是一种与FabI同源的新型ENR, 它可以单独存在于细菌FASⅡ, 也可以在绿脓杆菌中与FabI同时存在。它是绿脓杆菌脂肪酸生物合成代谢中的关键酶, 可作为药物筛选的新靶标。
实验结果表明, 绿脓杆菌烯酯酰-ACP还原酶IV能在外源宿主细胞内表达, 且为可溶性表达, 在重组工程菌诱导表达的起始时间与诱导时间达到一个最适时间点, 工程菌的生长量和蛋白的表达量均能达到一个最大值。在此基础上, 后续实验将过量表达的重组蛋白进行纯化, 并且测定酶活, 为建立抑制剂体外筛选模型奠定了基础。在此基础上定向筛选出几种特异的对假单胞菌脂肪酸合成有抑制作用的抗菌物质, 开发出抗菌谱广、物理化学性质稳定的现代抗菌药物。
参考文献
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[2]Campbell JW, Cronan JE Jr.Bacterial fatty acid biosynthesis:targets for antibacterial drug discovery[J].Ann Rev Microb, 2001, 55:305-332.
体外诱导耐药 篇6
1 材料与方法
1.1 大鼠肝卵圆细胞的分离
选用昆明医科大学动物实验中心繁育的近交系SPF级雄性SD大鼠, 体质量 (250±20) g, 实验动物饲养于昆明医科大学天然药物重点实验室的SPF级动物实验室, 单笼饲养, 喂食普通饲料, 引用高压蒸汽灭菌水, 饲养环境温度波动于22~25℃, 湿度为40%~80%。应用二乙酰氨基芴/部分肝切除法 (2AAF/PH) 建立大鼠HOC增殖模型, 肝切除术后7d采用改良二步酶消化法[3]分离HOC, 并对HOC进行体外培养。
1.2 HOC体外培养及诱导向胆管上皮细胞分化体系的建立
细胞培养所用的新生牛血清 (new born calf serum) , DMEM-F12培养基购于hyclone公司, 表皮生长因子 (endothelial growth factor, EGF) 、干细胞生长因子 (stem cell growth factor, SCF) 、白血病抑制因子 (leukemia inhibitory factor, LIF) 购于sino生物公司。原代分离的HOC 3 d内培养于含20%新生牛血清的DMEM-F12培养基中, 第4天更换为含20%新生牛血清、SCF 20 ng/m L、EGF 10 ng/m L、LIF 10ng/m L的DMEM-F12培养基, 细胞培养于37℃, 5%二氧化碳细胞培养箱。
1.3 细胞形态观察及细胞生长曲线的绘制
每3 d于倒置相差显微镜下观察实验组及对照组细胞形态及生长情况, 必要时更换培养基并传代。在细胞培养过程中, 对第1、3、5和7代细胞进行传代时取部分细胞悬液, 调整细胞浓度为1×104/m L, 按5×102/孔将细胞接种于96孔板, 每代细胞接种7个复孔, 待细胞贴壁后分别于第0、1、2、3、4、5和6天取出培养板, 以MTT法比色法检测吸光度, 绘制细胞生长曲线。
1.4 流式细胞检测CK-19及OV-6阳性细胞的表达
分别取所培养的细胞原代及第4、6代细胞进行流式细胞检测, 流式细胞检测所用的小鼠抗大鼠OV-6抗体、兔抗大鼠CK-19抗体、FITC标记的山羊抗小鼠抗体以及PE标记的山羊抗兔抗体均购于Santa Cruz公司。将生长良好并铺满瓶底的上述代次细胞以胰酶消化使贴壁细胞漂浮后终止消化, 细胞离心后以PBS缓冲液悬浮, 调整细胞数量为1×105/m L, 将同一代细胞悬液分别置于3个流式管, 设立阴性对照组、OV-6组及CK-19组。1 200 r/min离心8 min, 弃上清, OV-6组及CK-19组分别加入相应的一抗, 振荡混匀后避光孵育30 min, 加入PBS缓冲液1 m L, 振荡后1 200 r/min离心8 min, 弃上清, 加入相应的二抗振荡混匀, 避光孵育30 min后上机检测。
1.5 免疫荧光显微镜观察胆管上皮细胞细胞分化
将实验组第1、3、5、7代细胞接种于24孔板, 待细胞细胞铺满后吸去培养基, 加入4%多聚甲醛固定15 min, 37℃下PBS振荡洗涤3次, 每次5 min, 以1%Triton-X100溶液破膜30 min, 37℃下PBS振荡洗涤3次, 每次5 min, 按1∶100稀释一抗后加入孔板, 37℃避光孵育20 min, 放入4℃冰箱中避光过夜。次日吸去一抗工作液, 37℃下PBS振荡洗涤3次, 每次5 min, 按1∶100稀释荧光标记的山羊抗兔抗体, 37℃避光孵育30 min, PBS振荡洗涤3次, 每次5 min, 每孔加入200μL DMEM培养基封闭, 上机检测。
1.6 统计学分析
实验数据以SPSS18.0进行统计学处理, 组间及组内差异采用单因素方差分析及LSD法进行比较, 检验水准α=0.05, P<0.05差异有显著性。
2 结果
2.1 原代HOC形态特点
以2AAF/PH方法3建立大鼠HOC增殖模型后以改良二步酶消化法分离的HOC在光镜下呈卵圆形, 细胞体积较小, 核质比大, 可见有较多体积较大的非卵圆细胞 (图1A) , 随着培养过程的进行, 非卵圆细胞逐渐减少, 培养第4天, 加入含有细胞因子的培养基后, 细胞生长速度增快, 至第8天可见典型的集落形成 (图1B) , 细胞传代后可见大量细胞为梭形或类圆形, 有少量细胞表现为不规则形, 细胞体积仍较小 (图1C) 。细胞培养传代至第3代时, 可见大量细胞为不规则形, 细胞体积较大, 细胞质变薄, 部分细胞可见明显的细胞核 (图1D) 。
2.2 细胞生长曲线
诱导后的HOC生长速度增快, 根据MTT法测吸光度后绘制的生长曲线可见, 第3代细胞生长速度最快, 而第5代及第7代生长速度虽然较第3代细胞慢, 但仍保持了较好的增殖活性, 生长较第1代细胞更为良好。
A:原代培养的大鼠干卵圆细胞, 可见细胞大小不一, 非目的细胞较多 (×100) ;B:诱导后的大鼠肝卵圆细胞形成典型的集落, 部分细胞形态发生变化 (×100) ;C:第3代HOC细胞形态发生改变, 大部分呈梭形, 仍可见少量类圆形细胞 (×100) ;D:第7代HOC细胞形态呈现不规则形, 细胞较薄, 呈典型的上皮样细胞形态 (×100)
2.3 流式细胞结果
%
注:1) 与原代细胞相比, P<0.05, 差异有显著性;2) 与第4代细胞相比, P<0.05, 差异有显著性
附表和图3提示, 原代HOC中表达OV-6阳性的细胞比例较高, 约为 (94.30±1.40) %, 而原代细胞CK-19阳性细胞率仅为 (3.16±1.87) %, 而诱导后并传代的HOC, 第4代细胞CK-19阳性细胞比率为 (61.23±3.21) %, 而OV-6阳性细胞比率, 则下降至 (27.13±2.89) %, 与原代HOC相比, 差异有显著性 (P<0.05) 。而至第6代细胞, 此差异则更为明显。
A:原代HOC OV-6阴性对照流式细胞结果;B:原代HOC OV-6阳性细胞比率;C:诱导后的第4代HOC OV-6阳性细胞比率;D:原代HOC CK-19阴性对照流式细胞结果;E:原代HOC CK-19阳性细胞比率;F:诱导后的第4代HOC CK-19阳性细胞比率
2.4 免疫荧光显微镜结果
免疫荧光显微镜下, 第3代HOC中可见OV-6阳性细胞, 但表达强度不高, OV-6阳性细胞体积较小, 呈类圆形 (图4A) , 部分OV-6强阳性细胞可见突出的伪足样结构 (图4B) 。诱导后的第3代HOC CK-19广泛表达, 并可见部分细胞表达强阳性 (图4C) , 免疫荧光显微镜下可见CK-19阳性细胞体积较大, 细胞质较薄, 可见“伪足”样突起, 且可见诱导后的HOC并非平铺于孔板底部, 而是具有一定的立体空间结构 (图4D) 。
A:OV-6阳性细胞体积较小, 呈类圆形;B:部分OV-6强阳性细胞可见突出的伪足样结构;C:诱导后的第3代HOC CK-19广泛表达, 并可见部分细胞表达强阳性;D:免疫荧光显微镜下可见CK-19阳性细胞体积较大, 细胞质较薄, 可见“伪足”样突起
3 讨论
胆管上皮细胞在以往被认为是被覆于肝内外胆管的一类简单的上皮细胞, 其功能是维持胆道的结构完整以保持其输送胆汁进入肠道。而近几年来越来越多的研究证实, 胆管上皮细胞不仅仅是一类仅在结构上维持完整的细胞群, 而是在胆汁分泌、炎症发生及排斥反应等方面均起到重要作用的细胞群[4]。从组织起源来看, 肝内胆管由来源于肝芽突的肝前体细胞延门静脉分支形成, 而肝外胆管则由肝芽突及腹胰突之间的内胚层细胞形成[4]。目前, 对于胆管上皮细胞的组织来源及分化过程尚不完全明确, 但有研究认为, 胆道系统与肝脏及胰腺同样来源于胚胎发育过程中的内胚层前肠 (foregut) 。在肝外胆道中, 存在大量的胆管周围腺体 (peribiliary glands, PBGs) , 这些腺体中存在一类SOX17+/PDX1-的细胞亚群, 能够分化为肝外胆管上皮细胞[5]。而在肝内组织中, hering管中的肝卵圆细胞则被认为是肝内干细胞, 能够分化为成体肝细胞或胆管上皮细胞, 从而维持肝内的结构和功能完整。
目前对于肝卵圆细胞的表面及胞内分子标志, 尚无统一的认识, 目前的研究发现, HOC可表达c-kit、CD90和OV-6等表面标志[6]。因此, 有学者认为OV-6可标记大部分的卵圆细胞。而胆管上皮细胞则可表达SOX17、γ-GT和CK19等表面和胞内分子标志, 其中CK-19被认为是胆管上皮细胞的特异性标志。根据以上研究结果, 本研究选择了OV-6作为大鼠肝卵圆细胞的标志, CK-19作为诱导后胆管上皮细胞的标志, 自原代培养的细胞开始以流式细胞检测OV-6阳性肝卵圆细胞及CK-19阳性胆管上皮细胞的比例变化。
目前, 对于体外培养胆管上皮细胞的研究较少, 这不仅仅因为成体的胆管上皮细胞难以分离、纯化, 作为一种分化成熟的细胞, 成体胆管上皮细胞体外培养容易老化, 在培养过程中增殖能力有所减弱[7]。而对于通过肝卵圆细胞诱导获得胆管上皮细胞, 尚无统一有效地方法, 有研究采用丁酸钠作为诱导分化剂, 可诱导大鼠肝卵圆细胞分化为胆管上皮细胞, 但过高浓度的丁酸钠反而有可能抑制细胞生长[8]。
表皮生长因子 (epithelial growth factor, EGF) 是促有丝分裂因子, EGF通过与其膜受体EGFR结合, 起到促进细胞增殖的作用, 有研究使用EGF对实施2AAF/PH后的大鼠进行体内灌注EGF, 证实EGF能够促进胆小管细胞及其周围细胞的增殖, 并且能够促使HOC从汇管区向肝实质迁移[9]。此外, 干细胞生长因子 (stem cell growth factor, SCF) 是一种重要的造血刺激因子, 通过与细胞表面的c-kit结合, 是细胞活化并产生增殖。HOC表面可表达c-kit, 并且SCF可能在卵圆细胞的增殖活化过程中起到关键作用[10]。
对于大鼠肝卵圆细胞体外分化为胆管上皮细胞的研究, 目前还较少, 本实验通过EGF及SCF的协同作用, 成功诱导大鼠肝卵圆细胞分化为表达CK-19的胆管上皮细胞, 并且细胞形态发生了明显的改变, 符合上皮细胞形态特点, 并且免疫荧光证实CK-19在培养细胞中的表达。但对于诱导过程中的具体机制, 还需要进一步研究来阐明其作用途径及机制。
摘要：目的 通过对大鼠肝卵圆细胞进行体外培养, 建立诱导大鼠肝卵圆细胞分化为胆管上皮细胞的诱导体系。方法 通过2AAF/PH建立大鼠肝卵圆细胞活化模型, 使用二步酶消化法获得原代肝卵圆细胞, 应用20ng/mL干细胞生长因子及10 ng/mL表皮生长因子诱导肝卵圆细胞向胆管上皮细胞分化, 并应用流式细胞及免疫荧光观察细胞分化过程中OV-6及CK-19标志的表达变化。结果 原代肝卵圆细胞OV-6阳性细胞为 (94.30±1.40) %, CK-19阳性细胞为 (3.16±1.87) %, 诱导后第7代细胞OV-6阳性细胞为 (4.97±0.21) %, CK-19阳性细胞为 (96.17±1.21) %, 差异有显著性 (P<0.05) 。免疫荧光结果证实CK-19广泛表达。结论 成功诱导大鼠肝卵圆细胞分化为表达CK-19的胆管上皮细胞, 细胞形态符合上皮细胞形态特点, 表皮生长因子及干细胞生长因子可诱导肝卵圆细胞分化为胆管上皮细胞。
关键词：大鼠,肝卵圆细胞,胆管上皮细胞,细胞分化
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体外诱导耐药 篇7
关键词：扶正透邪方,含药血清,多重耐药铜绿假单胞菌,体外抑菌
“超级细菌”的出现,再次引发全球对耐药菌的恐慌,敲响了抗菌素时代的警钟。现代药理学研究表明中药抑菌成分较多,可作用于细菌的不同部位和繁殖的不同阶段,并对细菌的多个代谢环节发挥作用,故不易产生耐药性[1]。近年来的研究证实中医药在细菌耐药方面极具良好的应用前景,但也存在一些问题,如选择的中药大多以清热解毒类为主,缺乏对中药不同组分药效和机制的研究等[2]。有鉴于此,本研究以扶正透邪方(黄芪、当归、金银花、青蒿、虎杖)为对象,对全方提取物及其各组分和含药血清进行体外抑菌实验,具体如下。
1 材料与方法
1.1 药物
扶正透邪方提取物(2.0 g/ml)、提取物纯化组分(粗多糖、精多糖、皂苷、酚酸+香豆素、黄酮+蒽醌),由北京中医药大学中药学院中药研究室提供。(pH试纸检测各组分的pH值)
1.2 动物
SD大鼠30只,雌雄各半,清洁级,体重200~220 g,购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心,合格证号SCXK-(军)2007-004。正常光照条件下,食、水可自由摄取,室温控制在18~22℃。
1.3 菌株
多重耐药铜绿假单胞菌临床分离株1643号,由首都医科大学附属北京朝阳医院细菌室提供。
1.4 试剂与设备
M-H肉汤培养基,一次性无菌24孔板,加样器,立式自动电热压力蒸汽灭菌器(ATELL AMA440N),恒温培养箱(SAMYO SIM-F124),低温高速离心机(Kendro Labofuge 400R),微量天平(METTLER AE100),一次性针式滤器(PALL Corporation 0.2 μm Supor)。
1.5 扶正透邪方提取物和各纯化组分抑菌试验
在24孔板中加入M-H肉汤培养基1 ml,第一个孔再分别加入扶正透邪方提取物和经滤器过滤的各组分1 ml,采用二倍稀释法将各孔依次对倍稀释,最终每个反应体系均为1 ml,再将含液体培养基的菌液(5×107 CFU/ml)取10 μl加入各孔中,37℃,孵育18~24小时。观察各组浑浊情况,记录最小抑菌浓度(MIC值)。
1.6 用通法[3]制备含药血清
将SD大鼠随机分为空白组、扶正透邪方提取物1/2等效剂量组、等效剂量组、2倍等效剂量组、8倍等效剂量组(人体按70 kg算,则200 g大鼠的等效剂量为人的0.018倍,并根据等效剂量将扶正透邪方提取物分别稀释至所需要的浓度),每组6只,雌雄各半,空白组予蒸馏水灌胃,每日两次,每次4 ml,其余各组分别予相应浓度的扶正透邪方提取物灌胃,每日两次,每次4 ml,共5天,末次给药后1小时,将各组大鼠予10%水合氯醛溶液,按0.4 ml/100 g,腹腔注射麻醉后,腹主动脉采血,4℃离心,2 500 转/分,20分钟,无菌分离血清,将各组6只大鼠血清混合后,56~60℃水浴30分钟,进行灭活。
1.7 含药血清抑菌试验
在24孔板中分别依次加入0.8、0.4、0.3、0.2、0.1 ml的空白血清、1/2等效剂量含药血清、等效剂量含药血清、2倍等效剂量含药血清和8倍等效剂量含药血清,然后用M-H肉汤培养基将各孔补至1 ml,再将含液体培养基的菌液(5×107 CFU/ml)取10 μl加入各孔中,37℃,孵育18~24小时。观察各组浑浊情况。
1.8 菌种鉴定及药物敏感试验
分别将各组菌株转种至含有M-H琼脂培养基的培养皿上,37℃,孵育18~24小时。进行菌种鉴定并做药物敏感试验,由东直门医院细菌室进行。
2 结果
2.1 扶正透邪方提取物和各纯化组分抑菌试验结果
扶正透邪方提取物、皂苷具有较好的体外杀菌作用;粗多糖、精多糖、酚酸+香豆素、黄酮+蒽醌均无明显的体外抑菌作用。见表1。
注:“-”表示无抑菌作用。
2.2 含药血清抑菌效果
给予大鼠2倍和8倍等效剂量扶正透邪方提取物灌胃后采血分离的含药血清在血清含量占反应体系80%和40%时具有较好的体外抑菌作用,而给予大鼠1/2等效剂量和等效剂量扶正透邪方提取物灌胃后采血分离的含药血清在实验所选各含量下均无明显的体外抑菌作用。见表2。
注:“+”为浑浊、有菌落生长,程度依次增加,阳性对照为“++++”;“-”为澄清、无菌落生长。
2.3 转种后菌种鉴定与药物敏感试验结果
经东直门医院细菌室菌种鉴定,各组均为铜绿假单胞菌;药敏结果显示,扶正透邪方提取物、皂苷和含药血清菌液转种后的铜绿假单胞菌对头孢哌酮舒巴坦钠耐药性为中介,MIC值为32 μg/ml,对其他抗生素耐药。粗多糖、精多糖、酚酸+香豆素、黄酮+蒽醌和空白血清菌液转种后的铜绿假单胞菌与实验菌株的药敏结果一致,对抗生素的敏感性未发生变化。
3 讨论
众所周知,抗菌素对病原微生物具有强大的杀灭和抑制作用, 但它同时也是细菌耐药性日益增强的罪魁祸首。新型抗菌素的研发总是滞后于耐药菌的增加,也同样存在诱导出新的耐药菌株的可能。因此,针对日益严重的多重耐药铜绿假单胞菌感染和多重耐药性产生的复杂机制,目前现代医学尚缺乏有效的应对措施。
近年来的一些研究进一步表明中医药在耐药菌感染方面存在着巨大的潜力,如杨钧等[4]研究发现具有清热解毒通腑泄热功效的中药复方清热颗粒剂能通过降低血浆内毒素水平的作用,控制和调节某些炎性介质的产生,增强感染动物的非特异性免疫功能,从而提高机体自身清除内毒素能力与直接拮抗内毒素毒力的能力,全面调动机体的抗感染能力。肖洋等[5]研究结果表明五倍子提取液对铜绿假单胞菌R质粒具有较好的消除作用。杨秀捷等[6]认为耐药铜绿假单胞菌感染者的中医证候以虚实夹杂证及实证为主(共占97.26%),而其中虚实夹杂证以气虚痰阻证、阴虚热郁证为主,实证以痰热郁阻证、痰瘀互阻证为主。王禹等[7] 研究发现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)经五倍子、绿茶、防风、丹皮、黄芩、浙贝母含药血清处理后能够恢复对耐酶β-内酰胺类抗生素的敏感性。结合目前有关耐药菌的中医基础和临床研究,本课题组认为耐药菌感染属于院内感染,主要易感人群为免疫功能低下者如老年人、新生儿、使用免疫抑制剂患者等,这一群体中医体质辨为“正虚”“阴阳失衡”“气血不足”等,并且临床上细菌出现变异、耐药主要是通过抗菌素的筛选,在适宜的条件下大量繁殖而发病。这与中医伏邪致病正虚邪伏、伺机而作、待时而发的特点十分相似。因此,本实验中的扶正透邪方针对正虚邪伏这一耐药菌感染的中医病机,以扶正透邪为组方原则,在清热透邪的基础上重视益气养血。本实验运用“通法”[3] 制备含药血清,通过灭活消除血清中补体等的影响因素。经pH试纸检测各组分pH值除外物理杀菌、抑菌作用。结果表明扶正透邪方提取物、皂苷具有较好的体外杀菌作用;给予大鼠2倍等效剂量和8倍等效剂量扶正透邪方提取物灌胃后采血分离的含药血清具有较好的体外抑菌作用,为其治疗多重耐药菌感染提供实验依据。提取物的其余组分没有明显的体外抑菌作用证实并不是扶正透邪方提取的各个组分都有抑菌作用,但其余组分是否能够在体内发挥其整体调节作用以及是否可以提高方中具有抑菌作用组分的含量以达到更好的抑菌效果值得进一步研究。1/2等效剂量和等效剂量扶正透邪方提取物灌胃后得到的含药血清无体外抑菌作用表明中药也需要达到一定剂量才能发挥疗效,但并非给药剂量越大含药血清的抑菌作用越好。
值得注意的是,药敏结果显示扶正透邪方提取物组、皂苷组分和含药血清组转种后的铜绿假单胞菌对头孢哌酮舒巴坦钠耐药性为由耐药转为中介,MIC值为32 μg/ml,与王禹等研究结果相似,提示扶正透邪方提取物、皂苷组分和含药血清可能能够逆转耐药菌的耐药性,使其对原本耐药的抗菌素重新恢复敏感,从而解决细菌耐药这一棘手难题,但扶正透邪方、方中的皂苷组分和含药血清究竟通过何种机制逆转细菌耐药尚不明确,根据本实验的结果,仅对头孢哌酮舒巴坦钠的耐药性有改变,考虑干预纯化酶的可能性较大,但不除外皂苷组分和含药血清可能对耐药菌的耐药性存在多途径、多环节、多靶点的干预作用,可以进一步深入研究。同时,体外抑菌实验只是在一定程度上提示了药物具有抑菌作用,关键是体内实验进一步研究扶正透邪方的药效和作用机制,为临床应用提供更可靠的依据。
总之,中医药能够在整体观念、辨证施治的思维方法指导下,以扶正祛邪、调和阴阳为大法,处方用药或祛邪、或扶正、或扶正祛邪、或攻补兼施,不仅辨病辨证,更辨患病的人,不仅强调对抗病原菌,更注重保护机体脏器组织,从而达到“阴平阳秘”、“人菌并治”,为阻止多重耐药菌感染的传播流行、降低其发病率和病死率提供新的手段和措施,值得进一步挖掘。
参考文献
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