体外成熟培养（共3篇）
体外成熟培养 篇1
体外培养的成肌细胞是通过酶消化后从肌肉中分离出来的单核细胞, 具有肌肉形成能力, 进行移植后可以作为一种治疗遗传性肌病和基因转染载体的方法, 但到目前为止尚未取得满意的应用效果。Kuang 等[1]的研究结果显示根据干细胞表达标志分离出来的成肌细胞可以显著提高移植后细胞的存活率。 近些年的研究表明, 从表达分子标记的角度看, 肌肉中不同表型的细胞可以认为是处于静止、激活、增殖及分化等不同的肌肉形成阶段。Pax7特异性地表达在静止和新激活的肌肉卫星细胞中, 具有对干细胞库维持作用[2]。M-cadherin也经常被用来标记肌肉卫星细胞。然而, Wróbel 等[3]的研究提示这种分子参与肌肉卫星细胞的分化。CD34阳性细胞存在于肌肉间充质组织中, 在刚从肌肉中分离出来的细胞中, CD34+/45-肌上皮前体细胞仅表达c-met mRNA, 不表达其它成肌相关的标记分子, 然而3 d后MyoD、Myf-5、M-cadherin和 Pax-7等成肌分子在这种细胞上相继表达[4]。
研究者们经常利用细胞的差速贴壁能力来纯化体外培养的成肌细胞, 但是对其机制尚不明了。我们假设细胞的这种能力不仅与成熟程度有关, 同时也受到细胞物理性状的影响, 由此可以建立一种方法, 即根据某一物理性状来分离纯化具有干细胞特征的肌肉形成细胞。本研究通过2 个部分来验证这一假设。第一部分是将体外培养的成肌细胞按照差速贴壁方法进行传代, 分别在不同的时间点收集细胞。流式细胞仪检测所收集细胞的大小和所含颗粒等物理特征, 以及CD34、 Pax7 、M-cadherin等成肌细胞标记的表达;第二部分是采用多步Percoll密度梯度离心法分离直接从肌肉中获得的单核细胞, 流式细胞仪观察CD34、Pax7 及M-cadherin 阳性细胞的分布特征。
1 材料和方法
1.1 成肌细胞准备
1.1.1 成肌细胞体外培养与传代
常规分离制备7 d龄雄性SD大鼠后肢肌肉组织[5], 分别采用0.2%Ⅱ型胶原酶 (Worthington Biochemicals) 及0.25%胰蛋白酶 (Sigma) 消化, 100目滤网过滤, 离心后收集细胞, 接种在未包被多聚赖氨酸的培养瓶中使细胞预贴壁20 min, 2 次, 去除成纤维细胞。将未贴壁的细胞按照5×104接种在预先包被多聚赖氨酸的培养瓶中, 加入增殖培养基 (Dulbecco's modified Eagle's medium, 加入20%胎牛血清及浓度为100 U/ml的青链霉素, Gibco) 进行体外培养;或者随即进行Percoll密度梯度离心分离。
体外培养的成肌细胞生长到铺满培养瓶底80%左右后传代。在细胞第3 次传代时采用差速贴壁法进行, 分别在20 min、1、2、26 h收获贴壁细胞;并收获在2 h 和26 h未贴壁的细胞, 流式细胞仪检测每组细胞不同成肌分子的表达。
1.1.2 直接从肌肉中分离单核细胞
Percoll密度梯度离心方案采用的是Kästner 等[6]的修订方案, 如图1所示。将含有70%、55%、40%、35%、 25% 和15% Percoll (Amersham Biosciences) 的生理盐水溶液, 各2 ml, 依次置于15 ml 离心管中, 形成六步密度梯度离心体系, 从顶端缓慢加入从肌肉中直接分离出来的细胞混悬液, 室温下1 250 g水平离心20 min后, 分别在不同的密度界面间收集细胞, 如图 1, 包括15%～25%界面及 25%～35%界面, 35%～40%界面间的细胞层次不清, 所以与40%～55%界面间的细胞合并为35%～55%组, 生理盐水洗2 次去除Percoll 颗粒后进行流式细胞仪检测。
1.2 流式细胞仪检测
1.2.1 成肌细胞的分子标记表达
体外培养的第3 代成肌细胞经差速贴壁传代后获得的不同细胞亚群及Percoll密度梯度离心后分离的新鲜肌肉细胞的不同亚群, 按照1×106/ml密度悬于500 μl的PBS中, 分别加入CD34 (Santa Cruz 1∶50) 、Pax7 (R&D SYSTEM, Inc 1∶30) 、M-cadherin (Santa Cruz 1∶50) 一抗, 37 ℃下孵育30 min, PBS清洗2 次, 再加入FITC标记的荧光二抗 (Santa Cruz) , 室温下孵育30 min, PBS清洗2 次, 上流式细胞仪 (BD公司) 检测各组细胞相应的抗体表达, 设立荧光对照。
1.2.2 成肌细胞不同亚群的大小及颗粒分布特征
流式细胞仪可以依据光电系统记录的细胞散射光信号快速检测分析细胞的多物理特性, 即细胞的大小和内部结构。前向角散射 (FSC) 检测的是激光束照射方向与收集散射光信号的光电倍增管轴向方向的散射光信号, 与被测细胞的大小和面积有关。侧向角散射 (SSC) 收集与激光束正交90°方向的散射光信号, 与被测细胞的颗粒密度和内部结构有关。采用流式细胞仪检测差速贴壁的成肌细胞不同亚群在FSC和SSC一定阈值内的阳性细胞比率, 以此反映细胞相应的大小及颗粒分布, 如图 2所示。
a:显示的是1 h贴壁细胞的散点分布图;b, c:显示的随FSC和SSC变化细胞数量分布的柱形图, 各图中分别设立相应的计算阈值
1.3 统计分析
采用四格表卡方检验2 组阳性细胞率是否具有统计学意义, 以P<0.01为标准。
2 结 果
2.1 成肌细胞不同亚群的成肌分子标志表达
流式细胞仪检测差速贴壁传代的成肌细胞不同亚群的成肌分子标志表达结果见表 1。从表 1中可以看出, CD34 阳性细胞主要出现在2 h未贴壁细胞和26 h贴壁与未贴壁细胞中, 而Pax7 阳性细胞主要富集于2 h贴壁细胞中。除了26 h未贴壁细胞, 其余各组细胞中M-cadherin 阳性细胞率均有统计学意义。
(1) 与荧光对照组相比, P<0.01
2.2 成肌细胞不同贴壁亚群的大小及颗粒分布特征
流式细胞仪检测体外培养第3 代的成肌细胞差速贴壁法传代后不同亚群细胞FSC和SSC分布结果见表 2, 从表 2中可以看出快速贴壁细胞在阈值范围内FSC的阳性细胞少, SSC的阳性细胞多, 而贴壁较慢的细胞则反之;26 h后还未贴壁的细胞在阈值范围内FSC、SSC细胞分布更少;说明早期贴壁细胞小, 所含颗粒多, 稍晚贴壁细胞面积大, 所含颗粒少, 26 h后还未贴壁是更为幼稚的细胞。
2.3 不同密度单核细胞的成肌分子标记表达
流式细胞仪检测肌肉细胞不同密度亚群CD34、Pax7 和M-cadherin等的表达, 从未进行分离的总细胞组到35%～55%Percoll界面间细胞组, 结果见表 3。从表 3中可以看出, CD34 和Pax7 阳性细胞主要出现在15%～25% 和 25%～35%Percoll界面间, 而M-cadherin阳性细胞主要富集于25%～35%Percoll界面间, 35%～55% Percoll界面间细胞组中Pax7 、CD34和M-cadherin阳性细胞与对照组相比无统计学意义。
(1) 与荧光对照组相比, P<0.01
3 讨 论
很多研究旨在获得大量的具有干细胞特征的肌肉形成细胞, 在体外培养过程中差速贴壁法常用于肌肉形成细胞的分离纯化。Huard 的研究小组建立了一种以24 h为间隔的序列贴壁技术[7], 肌肉来源的细胞被分为早期贴壁细胞、晚期贴壁细胞和肌肉来源的干细胞。连续3 个24 h贴壁获得的细胞经流式细胞仪检测显示Sca-1 和CD34表达呈阴性, Desmin表达阴性, M-cadherin 的阳性细胞率介于40% 和80%之间; 4 个24 h后仍未贴壁细胞表现为Sca-1和CD34阳性, M-cadherin阴性, Desmin阳性细胞率低于30%。
Rouger 等[8]采用免疫细胞化学染色法检测M-cadherin、 Pax7 和 Desmin的表达来判断细胞的成肌进程, 结果显示早期贴壁细胞M-cadherin阳性细胞率高于晚期贴壁细胞, 而晚期贴壁细胞的Pax7 阳性细胞率明显高于早期贴壁细胞。本实验中流式细胞仪的检测结果显示体外培养传代后的成肌细胞CD34和Pax7 阳性细胞贴壁较晚, 而M-cadherin的阳性细胞在26 h前贴壁的细胞中都有表达。
最近的一些研究结果提示, 细胞的物理性状与它们的成熟度相关。从形态学的观察来看, 肌肉细胞中可以分辩出Round 和 Thick 2 种细胞[9], Round细胞高水平表达Pax7 , 而Thick 细胞表达相应的成肌分化信号。从肌肉中获得的细胞也表现出细胞大小的差异, 从4～10 μm不等[10], 并与特定的成肌分子标记表达相关。本研究中流式细胞仪对肌肉细胞FSC和SSC的分析显示, 细胞贴壁的速度与其大小及所含颗粒状态有关, 由此推测可能与细胞密度相关。
密度梯度离心是一种按照细胞密度分离不同细胞亚群的方法。Kastner 等[6]采用五步密度梯度离心法分离在体外培养8 d的肌肉卫星细胞, 以MyoD/MEF2A作为阳性细胞标志, 结果发现在55% Percoll组分中阳性率最高, 而在25%～35% 和35%组分中阳性率显著降低。这些年来研究者们逐渐认识到Pax7 和CD34阳性细胞比MyoD/MEF2A 阳性细胞更加具有干细胞特征[11]。因此我们增加15% Percoll 组分, 以分离更具有干细胞特征的肌肉形成细胞, 结果显示Pax7 和CD34阳性细胞主要富集于15%～25% 和25%～35% Percoll 界面间;而处于稍晚成肌阶段, 表达 M-cadherin的阳性细胞主要富集于25%～35% Percoll 界面间;表达这些标志的阳性细胞在35%～55% Percoll 界面间的细胞中均为阴性。因此, 可以采用15%～25% Percoll 密度梯度离心法快速分离肌肉来源的干细胞。
参考文献
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体外成熟培养 篇2
组织型纤溶酶原激活剂 (tissue-plasminogen activator, t PA) 具有丝氨酸蛋白酶的性质, 它能将大量的细胞外无活性的纤溶酶原转化为有活性的纤溶酶, 参与细胞外基质的降解及重构[5]。刘以训等[6,7]研究发现, 大鼠颗粒细胞添加促性腺激素及促性腺激素释放激素, 可显著增加t PA活性, 卵泡刺激素可以通过激活颗粒细胞中的细胞外信号调节激酶 (ERK1/2) 、P38丝裂原活化的蛋白激酶 (P38MAPK) 信号通路促进t PA的表达, 推测t PA可能与卵丘细胞扩散有关。但是这一推测尚缺乏直接的试验证据。
透明质酸 (hyaluronic acid, HA) 是卵丘细胞分泌的一种非硫酸化葡糖胺聚糖, 是卵丘外基质的基本组成成分[8]。在排卵相关因素的刺激下, 及在HA合成关键酶———透明质酸合成酶2 (hyaluronan synthase 2, HAS2) 的作用下, 卵丘细胞合成和分泌含有大量HA的细胞外基质导致卵丘细胞扩散[9]。多项研究表明, HAS2在小鼠[10]、羊[11]的颗粒细胞及人[12]、猪[13]和牛[14]的卵巢中均有表达。另外, 虽然环氧合酶2 (cyclooxygenase-2, COX2) 在卵丘-卵母细胞复合体 (cumulus-oocyte complexes, COCs) 成熟过程中的具体作用尚未明确, 但是多项研究认为其与卵丘细胞发育有关[15], 而且COX2在牛排卵前卵泡的颗粒细胞中也有表达[16]。
为了探讨t PA与牛卵丘细胞扩散可能的调控关系, 本研究通过在体外成熟体系中添加不同浓度t PA (0, 0.1, 1, 10 ng/m L) , 运用实时定量PCR技术了解其对HAS2和COX2 mRNA相对表达量的影响, 并统计不同浓度t PA作用下的卵丘细胞扩散程度, 现将结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 主要仪器和试剂
PCR仪 (型号为AG 22331 Hamburg) 、低温高速离心机 (型号为5415R) , Eppendorf公司生产;立式光学显微镜 (型号为SZX16) , Nikon公司生产;CO2饱和湿度培养箱 (型号为3310n Thermo) 、凝胶成像系统 (型号为Tanon Gis-1000) , 购自上海天能科技公司;实时定量PCR仪 (型号为Lightcycler480) , 罗氏公司生产;倒置显微镜成像系统 (型号为TE2000) , Nikon公司生产;高压灭菌器 (型号为SX-500) , TO-MY公司生产。
t PA (批号为enz263) , PROSPEC公司生产;TCM199 (批号为H10395) , GIBCO公司生产;雌二醇 (E2, 批号为P5640) , Sigma公司生产;FSH, 宁波第三制药厂生产;Prime ScriptTMRT-PCR regent Kit (批号为DRR037S) 、2×SYBR premix EX TaqTM (批号为DRR041A) , Ta KaRa公司生产;RNA fast 200微量RNA提取试剂盒 (批号为220010) , 上海飞捷公司生产;胎牛血清 (FCS, 批号为SV30087.1) , Hy Clone公司生产;其他试剂均为国产或进口分析纯。
1.2 COCs的采集及体外成熟培养
牛卵巢取自当地屠宰场, 置于37℃的灭菌生理盐水中, 用带有18号针头的注射器抽取直径为2~8 mm卵泡中的卵泡液和COCs, 置于灭菌培养皿中, 体视镜下捡出3层以上有致密卵丘细胞层及细胞质均匀的COCs, 随机放入含300μL成熟培养液的4孔培养板中, 置于38.5℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中进行培养。成熟液分为以下4种:成熟液Ⅰ (基础培养液) , 即TCM199+10%FCS+10 mmol/L Hepes+1μg/m L E2+0.01 IU/m L FSH;成熟液Ⅱ, 即基础培养液+0.1 ng/m L t PA;成熟液Ⅲ, 即基础培养液+1 ng/m L t PA;成熟液Ⅳ, 即基础培养液+10 ng/m L t PA。
1.3 牛卵丘细胞和COCs的获取
将体外成熟培养16 h的4组牛COCs分别用以下2种试验检测:1) 将上述培养的COCs于16小时时从培养箱中取出, 采用涡旋法分离获得卵丘细胞, 供基因表达检测用。2) 在体视显微镜下, 挑选出细胞质均匀、卵丘细胞层数较一致且卵母细胞位于正中央、较规则的圆形COCs, 用洗卵液和成熟液各清洗2次后, 将COCs分别放入50μL成熟液Ⅰ、成熟液Ⅱ、成熟液Ⅲ和成熟液Ⅳ的小滴中 (每组3滴, 每滴3枚, 重复4次) , 在38.5℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中进行体外成熟培养, 于体外成熟16小时时将其从培养箱中取出, 于倒置显微镜下观察卵丘细胞扩散情况。
1.4 RNA的提取及反转录
卵丘细胞总RNA的提取:采用RNA fast 200微量RNA提取试剂盒按其说明进行RNA的提取, 然后将其反转录为c DNA, 反转录体系 (10μL) :5×Prime Script Buffer 2μL, Prime Script RT Enzyme MixⅠ0.5μL, Random 6 mers (引物) 0.5μL, Oligo d T引物0.5μL, 用RNA补足10μL。于PCR仪进行反转录, 经筛选, 最佳反应条件为:37℃15 min, 85℃5 s。
1.5 实时定量PCR
实时定量PCR引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成, 引物序列见表1。
采用SYBR GreenⅠ荧光染料法进行实时定量PCR扩增的检测。PCR反应体系 (20μL) 为:c DNA2μL, 上、下游引物各 (10μmol/L) 0.4μL, 2×SYBR premix EX TaqTM10μL, d H2O 7.2μL。于实时定量PCR仪分别进行HAS2、COX2和GAPDH的PCR反应, 反应条件为:95℃预变性1 min;95℃变性10 s, 59℃退火30 s, 72℃延伸20 s, 共40个循环;72℃延伸7 min。HSA2, COX2和GAPDH mRNA相对表达量采用2-ΔCt进行计算[17], ΔCt=CtHAS2/COX2–CtGAPDH。
1.6 卵丘细胞扩散程度的检测
在倒置显微镜下, 采用Cellsens Standard软件以两点圆方法作圆, 在体外成熟16 h后, 测量各组COCs卵丘细胞扩散面积, 以圆的面积作为评价卵丘细胞膨胀程度的标准。
1.7 数据的统计
试验数据采用Graph Pad Prism 5软件进行单因子方差分析 (One-way ANOVA) , 结果用平均值±标准差表示, 用于基因表达每组重复3次, 用于扩散每组重复4次。
2 结果
2.1 PCR产物特异性的检测结果
由HAS2、COX2、GAPDH基因扩增曲线可知, 扩增效果良好;经熔解曲线分析可知, HAS2、COX2、GAPDH分别在84.0℃、77.5℃和87.5℃出现单一产物峰, 见图1~3。
2.2 不同浓度t PA对卵丘细胞HAS2基因相对表达量的影响
分别在体外成熟培养体系中添加不同浓度t PA (0, 0.1, 1, 10 ng/m L) , 检测各组卵丘细胞中HAS2基因相对表达差异, 结果表明:与不添加t PA相比, 添加t PA卵丘细胞的HAS2 mRNA相对表达量均较低;t PA添加量为1 ng/m L时最低, 与对照组比较差异显著 (P<0.05) , 见图4。
2.3 不同浓度t PA对卵丘细胞COX2基因相对表达量的影响
分别在体外成熟培养体系中添加不同浓度t PA (0, 0.1, 1, 10 ng/m L) , 检测各组卵丘细胞中COX2基因相对表达量, 结果表明, 与不添加t PA相比, 添加10 ng/m L t PA卵丘细胞COX2 mRNA相对表达量较高, 两者间差异显著 (P<0.05) , 见图5。
注:字母完全不同表示差异极显著 (P<0.05) 。
注:字母完全不同表示差异极显著 (P<0.05) 。
2.4 不同浓度t PA对卵丘细胞细胞扩散情况的影响
分别在体外成熟培养体系中添加不同浓度t PA (0, 0.1, 1, 10 ng/m L) , 检测各组卵丘细胞扩散情况, 结果表明, 当t PA添加浓度为1 ng/m L时, 卵丘细胞扩散面积显著低于0, 0.1 ng/m L (P<0.05) , 见图6。卵丘细胞扩散结果见图7。
注:字母完全不同表示差异极显著 (P<0.05) 。
3 讨论
3.1 t PA与卵丘细胞中HAS2 mRNA的表达
在COCs成熟后期, 卵丘细胞通过合成和分泌含大量HA的细胞外基质, 造成其自身膨胀和黏液化的发生。研究表明, HA合成关键酶———HAS2是促使HA合成和卵丘细胞扩散的关键酶[9]。另外, t PA能将大量的细胞外无活性的纤溶酶原转化为有活性的纤溶酶, 从而参与细胞外基质的降解及重构[4]。而且, t PA在COCs成熟过程中的表达和活性与FSH密切相关[5,18]。由此可知, HAS2和t PA都具有调节卵丘细胞间基质状态的作用, 可是两者在COCs体外成熟进程中有何相互调节关系尚未见报道。本研究利用实时定量PCR技术检测了不同浓度t PA对卵丘细胞HAS2基因表达的影响, 结果表明:添加1, 10 ng/m L t PA后, HAS2在卵丘细胞mRNA的表达量显著低于未添加组, 说明t PA可能抑制了卵丘细胞中HAS2基因的表达;在卵丘细胞扩散过程中, HAS2表达量越高, 卵丘细胞扩散程度越大。故此推测, 在卵丘细胞扩散发生过程中, t PA下调HAS2基因的表达可能与抑制卵丘细胞扩散有关。
3.2 t PA与卵丘细胞中COX2 mRNA的表达
在体外成熟过程中, 卵丘细胞与壁颗粒细胞分泌的COX2被认为与卵母细胞发育有关[15], 而Lim等推测COX2可能影响了卵丘细胞扩散。本研究结果显示, COX2基因在10 ng/m L t PA添加组中的表达水平显著高于不添加组, 推测成熟过程中COX2基因表达量的上升与添加t PA有关。众所周知, 在COCs体外成熟过程中, 多种促卵母细胞成熟因子在成熟早期大量表达, 随着卵母细胞的逐渐成熟, 卵丘细胞扩散启动, 卵丘细胞的表达量降低。故此推测, 在体外成熟过程中添加t PA后, 卵丘细胞扩散可能受到抑制而造成COX2的表达量上升。这一推测尚需进一步试验验证。
3.3 卵丘细胞的扩散情况
本研究从形态学角度观察了t PA对卵丘细胞扩散的影响, 结果表明:各添加组COCs的扩散程度均低于未添加组, 添加1 ng/m L和10 ng/m L显著低于未添加。这一结果进一步验证了t PA对扩散基因HAS2有抑制作用的结论。刘以训等[5]报道, 在大鼠颗粒细胞中, FSH可诱导t PA的表达。关洪敏等[17]研究显示, FSH可促进牛卵丘细胞中t PA mRNA的表达, 并随着FSH浓度的增加而升高。还有多项研究显示, FSH是促使卵丘细胞扩散的关键激素[18,19]。综上所述, 本研究结果有助于深入理解FSH调节卵丘扩散的内在机制, 推测t PA可能是影响牛卵丘细胞扩散的重要反向调节因子。
4 结论
体外成熟培养 篇3
有资料显示, 对于反刍动物瘤胃上皮细胞的培养技术早在1980年就有记录, P.Gálfi等[2]采取胰蛋白酶消化法对牛瘤胃上皮细胞进行分离, 并成功培养了牛的瘤胃上皮细胞。此后, 研究者们在此基础上对反刍动物瘤胃上皮细胞的培养技术进行了多次改进, 但大多局限于牛和绵羊[3], 其他反刍动物瘤胃上皮细胞体外培养的技术鲜有报道, 而对驯鹿瘤胃上皮细胞体外培养的技术未见报道。
本研究以内蒙古呼伦贝尔市敖鲁古雅乡的中国驯鹿为研究对象, 结合牛、羊瘤胃上皮细胞的培养技术对驯鹿的瘤胃上皮细胞进行原代分离及体外培养, 以期为相关的体外研究提供一定的技术支持。
1 材料
1.1 试验动物
驯鹿, 内蒙古自治区呼伦贝尔市某猎民点淘汰的驯鹿。
1.2 主要试剂
细胞培养试剂:M199培养基和胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂 (insulin-transferrin-selenium-X) (ITS) , 购自Gibco公司;胰蛋白酶 (trypsin) 、L-谷氨酰胺、Na HCO3, 购自Sigma公司;胎牛血清 (FBS) , Hyclone公司生产;两性霉素B, 购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
细胞培养用液:磷酸盐缓冲液 (PBS) , M199培养基添加了15%的FBS、2 mmol/L L-谷氨酰胺、2μg/m L ITS、200 IU/m L青霉素及200μg/m L链霉素等。
细胞鉴定试剂:细胞角蛋白一抗 (醛缩酶A, CK19) , 购自Sigma公司;即用型快捷免疫组化MaxVisionTM试剂盒和苏木素体细胞快速染色液, 由福州迈新生物技术有限公司提供。
其余试剂为实验室常规试剂。
2 方法
2.1 驯鹿瘤胃上皮细胞的分离
将取来的瘤胃组织用4℃灭菌生理盐水冲洗去食糜及污染物后, 浸入4℃灭菌PBS溶液 (含500μg/m L青霉素, 250μg/m L链霉素, 0.5μg/m L两性霉素B, 100μg/m L庆大霉素) 中, 带回实验室;钝性分离瘤胃组织的黏膜上皮层和固有层, 并取2~4 cm2的上皮层以上述PBS溶液反复清洗3次, 再用不含抗生素的灭菌PBS溶液浸泡10 min;置入约15 m L 0.25%Trypsin-0.02%EDTA消化液中于37℃水浴中连续振荡消化, 每30 min取其消化液过滤并于显微镜下观察, 同时更换新的消化液, 直至消化液中出现非上皮细胞。将主要包含上皮细胞的消化液用200目的不锈钢细胞滤网过滤收集并用15 m L含有10%血清的培养液终止消化。将混合液转移至离心管, 吹打混匀后1 500 r/min离心10 min;弃去上清液, 加入PBS缓冲溶液后, 充分吹打混匀, 1 500 r/min离心10 min;如此反复洗涤2次, 第2次弃去上清液后, 加入10 m L完全培养液, 充分吹打混匀后, 调整细胞密度至1×105/m L, 并转移至细胞培养瓶中, 于37℃、5%CO2的培养箱中静置培养, 24 h后观察有无染菌, 在显微镜下观察其生长状况。
2.2 驯鹿瘤胃上皮细胞的传代培养
培养基采用M199加15%的FBS, 将细胞分装于25 cm2培养瓶中, 置于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养48~72 h后, 更换培养液, 弃去未贴壁的细胞, 根据细胞生长情况, 每3~4 d全量换液1次。待细胞达到80%~90%融合时, 用0.25%Trypsin-0.02%EDTA消化液消化3~4 min, 显微镜下观察, 如细胞隆起, 胞质回缩变圆、变亮, 加入含有血清的培养液终止消化, 并用移液枪轻轻吹打使之悬浮, 再转移至离心管中离心、洗涤 (方法同原代培养) , 最后转移至细胞培养瓶中, 继续于37℃、5%CO2的培养箱中静置培养。
2.3 驯鹿瘤胃上皮细胞的形态学观察及免疫细胞化学鉴定
在显微镜下对细胞的形态和生长情况进行观察。
根据上皮细胞的标志性中间丝蛋白为细胞角蛋白, 对驯鹿瘤胃上皮细胞的角蛋白进行免疫细胞化学的鉴定。取对数生长的瘤胃上皮细胞用37℃的0.25%Trypsin-0.02%EDTA消化液消化下来, 在6孔细胞培养板中进行常规的盖玻片爬片培养 (3 d) ;取出爬片, 用4%多聚甲醛固定15 min;PBS洗涤3次, 加0.5%Triton作用20 min;PBS洗涤3次, 加3%H2O2孵育15 min;PBS洗涤3次, 加封闭血清孵育20 min;加入一抗, 37℃孵育60 min;PBS冲洗3次, 加入通用型二抗工作液37℃孵育30 min;PBS洗涤3次;DAB显色;自来水冲洗;苏木素核复染, 自来水冲洗;显微镜下观察照像。空白对照用PBS代替一抗。
3 结果
3.1 驯鹿瘤胃上皮细胞的分离结果
瘤胃上皮细胞经0.25%Trypsin-0.02%EDTA消化液消化第4次起在显微镜下可观察到大量上皮细胞分散存在, 直到消化至第6次, 细胞数量开始减少, 且组织变得黏腻。收集后于显微镜下观察, 可见细胞数量多, 单个散在, 大小均一, 具有较好的折光度 (见228页彩图1A) 。调整细胞密度进行培养, 培养的细胞在72 h后有大部分贴壁, 细胞颜色发暗, 呈多角形, 并已开始生长, 呈岛屿状分布;也有未贴壁悬浮的细胞, 细胞折光度好, 体积较小, 形态较圆 (见228页彩图1B) 。96 h后生长迅速, 细胞增殖明显, 可见典型的铺路石状生长, 进入对数生长期 (见228页彩图1C) 。随后的7~9 d, 细胞生长融合成片, 呈单层状生长 (见228页彩图1D) 。
3.2 驯鹿瘤胃上皮细胞的传代培养结果
传1代后的细胞可在12 h内贴壁, 并迅速进入对数期生长增殖, 细胞形态完整, 生长良好 (见228页彩图2A) , 可在3~4 d铺满细胞瓶。传2代后细胞增殖迅速, 但细胞形态发生变化, 大小极不均一, 部分细胞胞体宽大、扁平, 胞浆内出现空泡和黑色颗粒 (见228页彩图2B) , 后期细胞增殖减慢, 甚至生长停滞, 逐渐死亡, 从瓶壁脱落。
3.3 驯鹿瘤胃上皮细胞的形态学及免疫细胞化学鉴定结果
细胞经分离培养48 h后, 可见细胞单个或数个贴壁, 呈扁平多角形, 胞浆丰富, 轮廓清晰。进入对数期后, 细胞呈小岛屿状生长, 各细胞岛屿间可见有细胞连接。7~9 d时, 各细胞岛屿连接成片, 呈铺路石样生长, 是典型的上皮形态 (见228页彩图3A) 。经免疫细胞化学方法的鉴定, 可见细胞胞浆为黄褐色, 即角蛋白CK19染色呈阳性 (见228页彩图3B) , 可判断所培养细胞为上皮细胞。
4 讨论
近年来, 我国驯鹿的数量一直徘徊在千只左右, 内蒙古大兴安岭北部敖鲁古雅民族自治乡的驯鹿是我国唯一的驯鹿种群, 均为鄂温克族所豢养, 呈半野生状态。虽然我国于2003年实行了生态移民, 但移民后的2个月间 (7—9月份) 有200多头驯鹿因消化不良引起疾病死亡, 驯鹿种群数量由搬迁前的800多只下降至不足600只[4]。无奈大部分鄂温克族人又牵着驯鹿返回原始森林过着游牧生活, 不定期地迁居, 是中国最后的狩猎部落。因此, 加强驯鹿圈养的相关科学研究, 不仅能恢复驯鹿种群的数量, 也是结束“中国最后狩猎部落”的有效办法。
P.Gálfi等[2]首次培养牛的瘤胃上皮细胞时采用剪切瘤胃乳头的方法进行分离及培养, 成功建立了牛的瘤胃上皮细胞的体外培养方法;同样类似的方法于第2年成功地培养了绵羊瘤胃上皮细胞[5];F.Stumpff等[6]在前人的培养技术基础上改进了取材方法, 设计并制作了一种模具, 使胰蛋白酶只作用于乳头来分离上皮细胞;沈赞明等[7]在培养奶公牛瘤胃上皮细胞时, 钝性分离瘤胃黏膜上皮与固有层以获得较为纯净的上皮细胞。本试验在总结前人试验的基础上, 采用钝性分离瘤胃黏膜得到上皮层的方法, 对上皮组织整体进行胰蛋白酶消化, 经试验鉴定获得了可扩增培养的瘤胃上皮细胞。本试验方法简便易行, 具有较强的可操作性。
有研究表明, 胃肠道上皮细胞的原代培养已在实践中大量应用。有人指出, 人的胃黏膜上皮细胞是以胶原酶和透明质酸酶对胃黏膜进行处理得到的[8];猪小肠黏膜上皮细胞采用组织块贴壁法能获得活性好的黏膜上皮细胞[9];而周传丽等[10]报道, 利用Ⅺ型胶原酶和Ⅰ型中性蛋白酶的混合液灌注仔猪小肠能消化分离小肠黏膜上皮组织得到形态完整、容易贴壁生长的小肠绒毛细胞团。本试验采用0.25%的胰蛋白酶-0.02%EDTA对驯鹿瘤胃黏膜上皮进行处理, 结果表明, 可以获得大量活性较好的上皮细胞, 易于培养。
反刍动物的瘤胃壁由黏膜、黏膜下层、肌层和浆膜4层构成。瘤胃黏膜表面被覆复层扁平上皮, 其由外至内分为角质层、颗粒层、棘细胞层和基底层[11], 其中角质细胞没有细胞活性, 而基细胞具有很强的分裂增殖能力, 其次为颗粒细胞[2]。分离瘤胃上皮细胞时选择胰酶多次连续振荡消化可获得大量上皮细胞, 但在细胞的游离状态下不能确切区分每一层的细胞。本试验中发现, 角质细胞不贴壁, 不生长, 不影响其他细胞的贴壁和生长, 在换液时会随细胞培养液被弃掉。由本试验结果可以推测, 尽管细胞贴壁生长但由于处于非生理的条件下, 在显微镜下观察均呈典型的上皮样生长, 不体现颗粒细胞、棘细胞或是基细胞的形态特性。
角蛋白存在于上皮细胞胞浆中构成上皮细胞内细胞骨架, 是上皮细胞中特异性的抗原, 具有多种表型。有人对仔猪小肠黏膜上皮细胞[9]和肾小管上皮细胞[12]的CK18进行了鉴定;多曙光等[13]对牛乳腺上皮细胞中的CK5和CK8进行了鉴定;李海甲[14]培养的兔气管黏膜细胞是采用广谱抗角蛋白单克隆抗体进行免疫组织化学染色。本试验在形态鉴定的基础上, 对所培养细胞中的角蛋白CK19进行了免疫细胞化学的染色, 呈阳性反应。
尽管对于瘤胃细胞的原代培养有大量文献佐证, 但未见有关其传代培养的报道。本试验经多次反复尝试与改进, 成功地进行了驯鹿瘤胃上皮细胞的传1代体外培养, 但对于驯鹿瘤胃上皮细胞能否连续传代培养, 是否受培养条件局限, 仍需进一步验证。
J.J.Gildea等[15]分别用传统的方法和三维细胞培养技术培养了人的肾上皮细胞, 结果表明, 用三维细胞培养技术获得的细胞在基因表达、基质分泌及细胞功能活动等方面与传统细胞培养技术获得的细胞有差异, 而与体内细胞的生长情况更为相似, 而且三维细胞培养既能保留体内细胞微环境的物质结构基础, 又能体现细胞培养的直观性及条件可控制性, 所得到的研究结果也更为可靠。由此启示人们, 今后可以从这一方面加以突破。
中国驯鹿瘤胃上皮细胞体外分离培养方法的初步建立为体外研究中国驯鹿瘤胃上皮细胞的生理功能奠定了试验基础。