体外胚胎生产（精选7篇）
体外胚胎生产 篇1
摘要：自1959年张明觉首先把体外受精的兔受精卵移植给受体母兔获得世界上第一个“试管哺乳动物”以来, 体外受精技术逐步完善, 已相继在30余种哺乳动物上获得成功。我国哺乳动物体外受精研究起步较晚, 但二十世纪末期发展很快, 本文就牛体外胚胎生产技术研究进展简要综述。
关键词：牛,体外受精,研究进展
体外受精技术 (In vitro fertilizafion.IVF) 包括有卵母细胞的体外成熟、精子获能、体外受精、早期胚胎培养和移植等一系列程序。胚胎体外生产也称体外受精技术, 是继人工授精、胚胎移植技术之后, 家畜繁殖领域的第三次革命。哺乳动物体外受精已有一百余年的历史。早在1878年, 澳大利亚科学家Schenk就用兔进行过实验。目前体外受精胚胎已开始直接在哺乳动物遗传品种改良中得到应用, 同时也是胚胎克隆、转基因动物等研究的主要实验材料。
1 体外受精基本流程
牛体外受精步骤一是卵母细胞的采集, 其中腹腔镜和超声扫描活提取卵泡法是自活体卵巢内获取卵母细胞的常用方法, 取卵数量多, 母畜可持续利用, 但操作方法复杂, 且受条件限制。二是卵母细胞的体外成熟其方法多采用微滴法。三是精子获能, 目前主要运用肝素、咖啡因和钙离子载体诱导获能。四是体外受精和早期胚胎的体外培养等几个步骤。近年来体外胚胎生产技术研究发展逐步完善, 牛体外受精技术已经基本成熟。
2 体外受精研究进展
20世纪70年代以前虽然已经在光镜下进行牛卵子及受精卵的形态学研究。但是直到80年代才取得了牛体外受精的重大突破。自Brackett获得第一头试管牛以来, 日本、美国、英国、丹麦、新西兰、意大利的许多学者都先后致力于牛体外受精的研究, 生产出大量的牛胚胎, 并开始向产业化方向迈进。日本1988年生产试管牛160头。从1989年就开始利用体外受精技术大批量生产肉牛胚胎用于胚胎移植, 以生产日本本地黑牛。到1995年, 日本牛的体外受精技术实施单位达102个, 共移植4642头, 产犊1216头, 囊胚率达30%左右。20世纪末期, 我国牛的体外受精方面有重大突破, 1989年以来, 旭日干等 (1989) 、范必勤 (1989) 、朱裕鼎 (1989) 、卢克焕等 (1990) 、秦鹏春 (1990) 、石德顺 (1992) 等相继获得了试管牛。
随着商业性牛胚胎移植的迅速发展, 牛胚胎的需求量日益增加, 极大地促进了对牛体外受精技术的研究。1986年, CRISTER等和HANADA等分别获得了牛卵母细胞IVM-IVF、异体培养、非手术移植试管犊牛年。Parrish等首次采用精子上游法 (Swim-up) 分离活精子, 大大改进了牛精子体外获能的方法。1987年, 卢克焕等用肝素 (100μg/m L) 处理上浮的牛精子进行精子体外获能, 对体外成熟的牛卵母细胞进行体外受精, 将受精卵移到中间受体绵羊的输卵管内发育, 再移植到19头牛受体牛子宫角, 结果14头牛妊娠。1988年, GOTO等和卢克焕等分别获得牛卵泡卵母细胞IVM-IVF-IVC试管犊牛。1989年, Lu等将38枚IVM-IVF胚胎 (其中2枚为IVC胚胎, 36枚为绵羊异体发育胚胎) 移植给20头受体牛, 结果15头牛妊娠, 其中13头妊娠期满, 产下21头活犊。在我国广西, 石德顺利用IVM-IVF-IVC-FC路线, 生产了大批牛胚胎, 并经过胚胎移植, 获得了200余头试管黄牛犊。在内蒙, 旭日干课题组在澳大利亚和加拿大的胚胎生产基地上, 利用体外受精技术, 生产了近4万枚胚胎, 并在国内进行胚胎移植, 获得了良种试管牛犊350余头。
由于牛的体外受精技术具有很大的商业价值, 其研究的深度、广度和实用化程度不断增加, 主要集中在提高卵母细胞的体外成熟率、体外受精率、体外发育率 (包括卵裂率、桑椹胚发育率和囊胚发育率) 、移植受胎率等几项指标。经过近10年的研究, 人们逐渐揭示影响卵母细胞体外成熟率的各种因素, 并从中探索出提高体外成熟率的途径。在继续探索扩大卵母细胞来源、提高卵母细胞成熟率和体外受精率的同时, 许多学者重点研究了如何提高体外受精胚胎的体外发育率。其中, 我国的卢克焕等在1987~1989年间, 利用绵羊输卵管作为中间受体, 进行了大量的体外受精卵发育研究, 并获得高达60%的桑椹胚-囊胚发育率。花田章等 (1986-1989) 以兔输卵管为中间受体也获得了49%的囊胚发育率。但这种中间受体培养法费用高, 技术过程复杂, 胚胎回收率也较低, 不适合大批量生产牛胚胎。在完全体外培养条件下, 体外成熟卵母细胞的卵裂率最高为91.4% (74/81) ;体外受精卵至桑椹胚和囊胚阶段的发育率为45.1% (60/133) (Yang和Lu1990) 我国广西农业大学卢晟盛 (1994) 利用TCM199+10%OCS与颗粒细胞单层 (GCM) 共培养, 囊胚发育率为47.1%。刘建民等 (1993) 利用输卵管上皮细胞和颗粒细胞两种共培养系统, 桑囊率为66% (85/129) 胚胎最终产值为35% (以受精时卵母细胞数目为基数) 。尽管国内外在试管牛的研究方面做了大量工作, 所采用的培养系统能使90%以上的卵母细胞发育成熟, 80%的卵子完成正常受精和卵裂, 但其中能在体外发育为可供移植的囊胚仅占20%~30%, 而且影响体外生产牛胚胎的因素非常多, 不同实验室、生产厂家的生产条件又很不一致, 导致体外受精卵的卵裂率和囊胚体外发育率结果不稳定, 因而其体外受精的总成功率仍偏低, 一般仅为35%左右。因此, 目前对牛卵母细胞体外成熟、体外受精和受精卵的体外发育培养的系列研究仍然在继续。
3 影响牛体外受精的因素
3.1 卵母细胞的质量及来源
牛体外受精技术所遇到的第一个问题便是卵巢内获得更多质量好的卵母细胞用于IVF。体外受精前 (约6h) 和受精后较短的时间内 (如IVF后20h) , 卵丘细胞的完整性对卵母细胞的受精是有益的。所以筛选卵丘细胞完整、致密的卵母细胞进行体外成熟培养。家畜体内成熟的卵母细胞的数量是有限的, 即使经过超排处理, 每次也不过5~10个, 不能满足实验室内大量生产胚胎的要求。而利用成本低、取材方便的屠宰场废弃的牛卵巢作为卵子来源, 存在没有母牛系谱、生产性能和健康等方面资料记录的缺陷。活体取卵为充分利用有价值的良种母牛的卵母细胞及选择优质的卵子提供了方便, 而且良种母牛还可以继续繁殖, 但操作繁琐。如果能在牛IVF上开发利用腔前卵泡卵母细胞, 就可能从一头牛卵巢中获得上百枚卵子。
3.2 卵母细胞成熟培养
卵巢卵母细胞必须经过体外培养后才能进入成熟阶段, 用于体外受精。哺乳类动物卵巢表面可见卵泡中回收的卵母细胞在体外条件下自发地完成核成熟, 而要使卵母细胞在体外成功地受精并发育至可移植胚胎, 仅有细胞核成熟并释放第一极体是不够的。因为体外核成熟的完成并不保证细胞质的正常成熟。到目前为止, 尽管人们在牛卵母细胞的体外培养方面作了大量工作, 所采用的培养系统能使90%以上的卵母细胞发育成熟, 80%的卵子完成正常受精和卵裂, 但其中能够发育为可供移植的囊胚只占20%~30%, 对目前的成熟培养系统需做进一步的改进和完善。
3.3 体外受精过程及胚胎培养
影响体外受精的因素包括卵母细胞的来源和成熟状态、精子来源和密度、精子的活力、培养基的选择、受精滴的大小、精卵比例、精卵相互作用时间、湿度、温度和气相等方面。
3.3.1 精子的来源
用同样获能处理的冻精、鲜精用于体外受精, 卵子受精率和受精卵发育率, 鲜精高于冻精, 这与冷冻中产生的精子受冻害有关。
3.3.2 体外受精
体外受精中通常选择经几次离心洗涤的精子, 以除去精子在附睾和精清中形成的蛋白质分子的去能外衣以及冷冻稀释液中的其它物质。但反复离心对精子有害, 使大量精子流失。研究证明精子有自动进入培养液和精液建立联系的本能。基于精子的这种自动迁移的能力, 对人类精液研究提出了一种叫“漂浮”的分离精子的方法。该方法应用于哺乳动物的体外受精中, 特别是应用冷冻精液进行体外受精。
3.3.3 精卵比例
受精时精子密度和单位精卵子数, 是影响体外受精效果的重要因素, 动物种类不同而有差异。高浓度的精子与卵子相遇, 若精子获能率不高, 就不会发生多精入卵。但随着卵母细胞成熟时间延长, 多精入卵率随之增高。如何控制精卵相互作用时间是体外受精技术值得探讨的问题。3.3.4不同体外培养系统对胚胎发育的影响在IVF胚胎体外培养的研究中, 采用的培养液主要有两类:复杂的培养液 (TCM-199、IHam’s F10等) 和简单的化学成分明确的培养液 (SOF、CR1等) 。TCM199是最早广泛使用的胚胎的早期基础液, 营养成分复杂全面, 对胚胎发育的影响呈多元性, 在1992年前胚胎的早期培养中使用较少, 主要用于卵细胞的体外培养。
4 牛IVF-ET技术各项技术指标现状及经济效益评估
到目前为止, 体外受精主要在牛和羊的胚胎生产上得到广泛的应用, 因此也称之为胚胎的体外生产。迄今为止, 体外受精在各主要技术环节上的效率基本成熟。
目前人们一般都以牛卵母细胞的体外成熟率、体外受精率、体外发育率 (包括卵裂率、桑椹胚发育率和囊胚发育率) 和移植受胎率等几个指标来对牛IVF技术进行综合评价。一般每头黄牛和奶牛分别可采15枚和20枚卵母细胞, 培养后有90%达到成熟, 可用于体外受精。受精后培养卵子的受精率可达80%经过培养后, 有70%的卵发育至8~16细胞期, 30%的卵子可达到桑椹胚期, 有20%的卵子发育至囊胚期。即从1头黄牛可以得到3枚、1头奶牛可获得4枚囊胚。如果鲜胚移植, 受胎率普遍为50%上下, 即可获得1.5~2头牛犊, 如果冷冻保存IVF胚解冻后生存率为70%, 移植受胎率为40%, 这样以来, 平均从每头牛的遗弃卵巢中至少也可获得一头以上的良种后代。这只是目前的一般水平, 但也有水平较高的。例如日本家畜事业改良团 (1990年) 通过改进技术, 平均从每头牛采到20~30枚卵, 囊胚发生率为20%, 这样平均每头牛可得到4~6枚鲜胚, 移植率达58%, (152/208) , 冻胚移植率也达到52% (31/74) 。按这一比例来计算, 即使冻胚移植, 也能从每头屠宰良种牛获得2~3头IVF小牛。根据以上材料, 我们可以对IVF技术的经济效益做一大略的估算: (1) IVF胚 (囊胚) 生产量, 从一个年屠宰母牛1万头的小型屠宰场取巢, 按每头牛出3枚鲜胚, 一年可生产至少3万枚囊胚。按每枚200元 (30美元) 计, 价值约600万元 (90万美元) 。 (2) IVF小牛生产量:按70%的冻胚生存率和40%的受胎率 (双胚移植) 计算, 3万枚IVF胚可生产良种小牛4000头, 按每头3000元计, 价值可达1200万元 (200万美元) 。从以上估算来看, 比起出售胚胎, 建立受体牛基地, 移植IVF胚的效益更大, 这一点尤其适合我国的国情。胚胎工程学者们正在探索着新的技术途径, 如对供体母牛的活体取卵技术引, 对腔前期或小腔期卵母细胞的体外培养等, 且已取得了显著成效, 相信随着这些技术的日益成熟和完善, 利用体外受精技术将会产生越来越大的经济效。
5 前景展望
牛体外受精的研究和应用无疑将对养牛业的发展以及动物生物工程的进一步深化带来极为深远的影响。近年来, 牛体外受精生产工艺研究已取得了巨大的成绩, 有理由相信, 随着生物技术的发展和对牛卵母细胞成熟、控制机理、胚胎早期培养所需营养促生长因子等方面的深入研究与探讨, 牛体外受精、胚胎生产将会得到进一步完善, 从而为现代生物工程技术和畜牧业生产提供更多的胚胎来源与相关技术。可以预料, 随着科学技术的进一步完善。生产牛体外胚胎将会具有很大的潜力。
目前, 在牛体外受精研究中, 唯有IVF胚胎8细胞以后发育至桑椹、囊胚阶段体外培养的条件尚不完善。IVF胚胎培养48h后出现8~16细胞阶段的发育阻滞现象, 相当数量 (约25以上) 的胚胎发育停滞、退化、死亡。即使体外培养7~8d后, 克服了4~8细胞阻滞而发育到桑、囊阶段, 其质量远不如自然排卵和超排后所获的胚胎。鉴于以上情况, 牛体外受精研究应以提高IVF胚胎质量为主, 同时兼顾提高数量, 其重点应放在改善IVF胚胎体外发育培养系统的研究方面。
参考文献
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体外胚胎生产 篇2
1 材料与方法
1.1 试剂
常规成熟液(TCM-199):10%胎牛血清(FCS)、10μg/m L促卵泡激素(FSH)、1μg/m L促黄体激素(LH)、1μg/m L雌二醇(E2)。
核质同期成熟培养液:TCM-199+5μg/m L放线菌酮(CHX)。
受精液(SOF):10%发情羊血清(ESS)、10μg/m L肝素。试验中用于卵母细胞成熟、体外受精和体外发育液等所涉及的生化试剂均购自Sigma公司,配制各种液体所用水均为Milli Q过滤的超纯水。
1.2 卵巢、卵母细胞采集及体外成熟
卵巢,采自齐齐哈尔市牛羊定点屠宰厂(场)。绵羊屠宰后立即取下卵巢,置于35℃灭菌生理盐水的保温桶内,在2~4 h内运回实验室。用38℃的灭菌生理盐水清洗卵巢3次,用连有10号针头的10 m L注射器(内有2 m L吸卵液)抽吸直径为2~6 mm的卵泡。将抽取的含有卵母细胞的卵泡液置于直径为60 mm的平皿中。在体视镜下检出卵母细胞,然后除去蜘蛛网状卵、裸卵及透明带变形的卵。采用微滴培养法在直径为35 mm的细胞培养皿中作6~8个微滴(50μL/滴),在培养箱预平衡2 h。每滴放入20~25枚A、B级卵丘-卵母细胞复合体(COCs),每滴上覆盖石蜡油。试验组首先在核质同期成熟培养液体外预成熟4 h,然后移入常规成熟液中体外成熟24 h;对照组在常规体外成熟培养液体外成熟28 h,培养条件为38.5℃、5%CO2、饱和湿度培养箱。
1.3 精子获能及体外受精
精子获能处理:羊冷冻精液在38℃水浴中解冻15 s,然后将解冻后的精液贴壁缓慢加入含3%白蛋白(BSA)的合成输卵管液(HSOF),经密度梯度离心(2 000 r/min,5 min),沉淀后的精子团再用5 m L HSOF离心洗涤(1 200 r/min,5 min)1次。去上清液后用受精液将精子密度稀释至5×106个/m L用于体外受精。
受精前2 h做好受精液小滴,每滴50μL,上盖石蜡油,放入CO2培养箱中平衡。在精子处理的同时,用200μL移液器反复吹打培养成熟的卵丘-卵母细胞复合体。使卵子间相互分离。洗涤3次后,将20个COCs移入受精液滴中。然后将培养皿放入38.5℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中进行体外受精。
1.4 囊胚滋养层细胞囊泡(TVS)的制作
收集体外受精9日龄的孵化囊胚滋养层和14日龄的伸展囊胚滋养层,5~10个/500μL于20%FCS+胚胎培养液(SOFaa)中,38.5℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养24 h。
1.5 早期胚胎的体外培养
精子与卵子受精培养18 h,将假定的受精卵移入HSOF中洗涤3次,用吸管轻轻反复抽吸,以除掉卵丘细胞和黏附在受精卵上的精子。然后在SOF液中洗涤2次,将对照组胚胎分别移入SOFaa、SOFaa+1%维生素C培养液微滴内,试验组胚胎移入SOFaa+1%维生素C+TVS中,预先在培养箱内平衡2 h。将20~25枚受精卵分别移入50μL的发育培养液(2%的必需氨基酸、1%的非必需氨基酸、2 mmol/L的谷氨酰胺、8 mg/m L BSA、1%维生素)中,在38.5℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中继续培养7~9 d。受精开始后48 h统计卵裂率,每隔48 h换2/3液体,第6,8天统计囊胚率。
1.6 肉羊体外受精胚胎共移植
将经过SOFaa+1%维生素C+TVS体外培养的胚胎作为试验组,SOFaa培养的胚胎作为对照组分别对肉羊进行胚胎移植,统计移植受胎率及产羔率。
1.7 数据的统计与分析
试验重复3次,采用Excel 2003软件建立数据库进行数据整理,采用SPSS 17.0软件对数据进行单因素方差分析,结果以“平均值±标准差”表示,以P<0.05作为差异显著性判断标准。
2 结果与分析
2.1 不同体外成熟方法对肉羊体外受精胚胎发育的影响
结果见表1。
注:同列数据肩标字母不同表示差异显著(P<0.05),字母相同表示差异不显著(P>0.05)。
由表1可见:肉羊卵母细胞经体外预成熟4 h,然后按常规程序进行成熟培养、体外受精、体外培养,试验组卵裂率、桑葚胚率、囊胚率均显著高于对照组(P<0.05);试验组移植受胎率显著高于对照组(P<0.05)。
2.2 不同体外培养系对肉羊体外受精胚胎发育的影响
结果见表2。
注:同列数据肩标字母不同表示差异显著(P<0.05),字母相同表示差异不显著(P>0.05)。
由表2可见,3种培养液系统胚胎的卵裂率无显著差异(P>0.05),但桑葚胚率、囊胚率SOFaa+维生素C+TVS和SOFaa+维生素C与SOFaa之间差异显著(P<0.05)。
2.3 TVS与肉羊体外受精胚胎共移植对妊娠率、产羔率的影响
结果见表3。
%
注:同列数据肩标字母不同表示差异显著(P<0.05),字母相同表示差异不显著(P>0.05)。
由表3可见:TVS与肉羊体外受精胚胎共移植,第1次妊娠检查(30~43 d)妊娠率较高,试验组显著高于对照组(P<0.05);第2次妊娠检查时试验组妊娠率降低,第2次妊娠检查至产羔,试验组有3只羊流产,对照组有2只羊流产,最终产羔率二者之间差异显著(P>0.05)。TVS与体外胚胎共移植妊娠率及产羔率显著高于对照组(P>0.05)。
3 讨论
3.1 卵母细胞不同成熟方法对体外胚胎发育的影响
屠体或活体采集的卵母细胞的细胞核成熟早于细胞质成熟,即细胞核与细胞质成熟不同步。这很可能是导致体外受精的胚胎发育能力较低的原因之一。因此,将卵母细胞进行同期化处理对提高体外胚胎的发育能力具有重要意义。王晓英等[6]研究表明,放线菌酮(CHX)具有抑制卵母细胞核成熟的作用,而且影响了后期胚胎的发育效果(呈负相关)。这可能与核成熟抑制剂的作用浓度、时间及后期胚胎的发育培养环境条件有关。本试验证明了CHX具有核质同期化的促进作用,但后期胚胎发育条件的改善对胚胎后期的发育阻滞的影响不同,这一点与上述试验结果不同。
3.2 不同培养体系对体外受精效果的影响
对于胚胎发育来说,氧化还原平衡很重要。早期胚胎的发育阻滞多发生于8细胞期。外源添加抗氧化剂对于胚胎维持氧化还原水平具有积极作用。研究表明,体外胚胎生产过程中,体外操作中常导致线粒体功能紊乱、细胞凋亡和胚胎发育阻滞[7,8,9]。体外胚胎培养液中通过与TVS及维生素C共培养,减少了由环境因素造成大分子物质损伤,避免细胞膜、DNA、蛋白和脂肪的受损,阻止体外成熟造成的一系列的发育损害[10]。贾秀芬等[2]研究表明,在小鼠体外受精胚胎培养液中添加50μmol/L维生素C时胚胎囊胚发育率最高;添加100μmol/L维生素E时囊胚发育率最高。M.MORI等[11]研究表明,牛体外胚胎与维生素及TVS共培养有相互促进作用,并显著高于对照组,这与本试验结果一致。
3.3 TVS与体外胚胎共移植对体外胚胎移植受胎率的影响
囊胚滋养层囊泡分泌的干扰素是反刍动物胚胎附植前发出的妊娠信号,是建立母体妊娠识别的核心因子[12],具有维持黄体功能及妊娠中发挥重要作用的生物学功能[13]。如果胚胎在要求时间内不能产生足够的干扰素,子宫内膜就不能充分与干扰素反应,导致早期妊娠失败[14]。由于体外受精胚胎分泌的干扰素少,胚胎移植时与TVS共移植可增强胚胎与子宫间的妊娠识别信号,提高妊娠率。本试验中,试验组TVS与胚胎共移植组妊娠率及产羔率显著高于对照组(P<0.05),这与笔者前期进行的TVS与牛低品质胚胎共移植的效果一致。
4 结论
采用CHX对肉羊卵母细胞进行预处理4 h后进行常规的体外成熟处理,对其核成熟具有抑制作用,达到了核质同期的目的;经过常规体外受精后通过SOFaa+TVS+维生素C共培养可显著提高肉羊体外受精胚胎质量(P<0.05),以达到体外高效生产肉羊胚胎的目的。
摘要：为了探讨放线菌酮(CHX)对卵母细胞预成熟的影响及囊胚滋养层细胞囊泡(TVS)、维生素C对肉羊体外胚胎质量的影响,试验采用从屠宰厂(场)收集的肉羊卵巢,抽取卵巢表面2~8 mm的卵泡卵母细胞进行体外成熟、体外受精和早期胚胎体外培养。结果表明:经过5%CHX预成熟的卵母细胞卵裂率、桑葚胚率、囊胚率显著高于对照组(P<0.05);在体外受精及早期胚胎培养液(SOFaa)中添加1%维生素C组与TVS共培养组的卵裂率和囊胚发育率均高于其他试验组(P<0.05);体外胚胎与TVS共移植受胎率显著高于对照组(P<0.05)。说明核质同期成熟处理及抗氧化剂可以用于高效生产体外胚胎。
体外受精-胚胎移植患者的护理 篇3
1 资料与方法
1.1 临床资料
对2007年1~12月来我中心进行IVF-ET治疗的585对不孕夫妇, 其中, 妊娠266例, 宫外孕9例, 流产34例, 在不同的治疗周期中采取不同的护理措施。
1.2 具体方法及相应护理措施
1.2.1 控制超促排卵 (COH) 生育年龄妇女自然周期每月排
1个卵, 为提高试管婴儿成功率, 希望获得多个卵子, 因而需要用药物 (HMG/FSH) 控制促排卵。
相应护理:护士在注射促排药物时要做到计量准确, 不残留药液, 注射时应两侧臀部交替, 防止注射区域发生硬结, 影响疗效。需要理解的是控制促排卵药物价格昂贵, 部分患者因刺激失败而不得不中途放弃或改变方案, 如少数患者过度刺激 (OHSS) 而产生腹腔积液、胸腔积液等较重现象而放弃本周期治疗[2]。与患者沟通, 使其充分理解, 与医护人员配合。585例患者中有3例患者出现OHSS, 给予住院治疗。遵医嘱白蛋白50 ml 2次/d静脉输液。护理上每日定时测腹围、称体重、记录24 h尿量。此3例患者经过2周治疗, 基本痊愈。
1.2.2 取卵 (OR) B超监测卵泡发育决定注射绒毛膜促性腺激素日, 36 h后即可在静脉麻醉下经阴道B超引导下取卵。
相应护理:取卵手术前一日护士应用碘伏液行阴道冲洗。手术晨用生理盐水彻底冲洗阴道, 建立静脉通道, 以配合无痛麻醉, 术中应与麻醉师配合, 密切注意生命体征。术后给予抗感染治疗。此手术中患者无需承受任何痛苦。但大多数患者均有心理负担, 因为她们担心取卵数目不够或卵子质量不好, 对此, 我们要提前向患者耐心解释, 让患者对手术有一个初步的了解, 取得她们的合作。
1.2.3 受精与培养 (Insemination) 取卵6~8 h后将洗涤后的精子加入卵培养皿中, 使之体外受精。
相应护理:这一过程需48~72 h, 遵医嘱予黄体酮60 mg每日肌内注射。这期间患者往往心绪不宁, 总是询问受精与胚胎发育情况。我们应理解患者此时心情, 尽量安慰患者, 告之医生会精益求精地做好这项工作, 但话语要得体。
1.2.4 胚胎移植 (ET) 取卵72 h后将分裂6~8个细胞的胚胎移植至患者宫腔内[3]。
相应护理:在移植后嘱患者仰卧2 h, 保持平静、放松心态, 不要过于紧张, 以免引起子宫收缩, 影响胚胎着床。2 h后, 将患者送至病房, 继续休息24 h。护士主动关心体贴患者, 做好生活护理, 每日肌内注射保胎药物, 做到及时准确。ET后3~5 d可以出院[4]。
1.3 出院指导
嘱患者回家后注意休息, 按时按量注射保胎药物。于ET后4 d, 来院抽血验E2、P值, 了解雌孕激素水平。ET后14 d抽血验E2、P、HCG。如确定怀孕, 护士应配合医生做好保胎治疗工作, 随之应建立随访。
2 结果
585例进行体外受精-胚胎移植的患者中妊娠266例, 临床妊娠率为45.4%。
3 讨论
不孕症患者的心态主要表现为自卑、沮丧、愧对家人, 感到受到不公正待遇等。她们承受着身心上的痛苦, 治疗也会给她们带来经济上的压力, 而且IVF-ET整个过程环节很多, 每一步骤都可以影响成功。因此, 患者会出现焦虑、易怒、多疑、悲观甚至厌世等不良心理。所以使患者自始至终保持良好的心态很重要。通过对585对夫妇的观察, 发现只有患者认为护士具有较丰富的医学知识, 态度和蔼, 才愿意与护士交流。护士也容易发现患者现存的潜在的心理问题, 实施心理护理时也容易改变患者不正确的态度和观点, 从而使护患交流更有效, 让患者充分理解治疗结局, 才会取得她们更好的合作。
摘要：目的:介绍体外受精-胚胎移植 (IVF-ET) 手术的方法及护理体会。方法:重视心理护理, 严格按照医嘱准时准量给药, 做好取卵与移植术前、术中及术后的全方位护理。结果:2007年1～12月, 共进行585例体外受精、胚胎转植, 临床妊娠率为45.4%。结论:良好的全方位护理是IVF-ET成功的重要保证。
关键词：体外受精,胚胎移植,护理
参考文献
[1]黄荷凤, 周馥贞, 金帆, 等.现代辅助生育技术[J].北京:人民军医出版社, 2005:69-70.
[2]张伟良, 姚瑞芬.在体外受精-胚胎移植术中的配合与护理[J].现代护理, 2002, 8 (8) :591-592.
[3]李萍, 王治英, 王丽波.对体外受精-胚胎移植剖宫产术产妇实施舒适护理的效果分析[J].解放军护理杂志, 2005, 22 (3) :100-101.
[4]周萍.体外受精-胚胎移植术患者的心理护理[J].当代护士, 2003, (2) :78-79.
[5]何玉敏, 吴佩雁, 杨美如, 等.体外受精胚胎移植术孕妇妊娠期间心理问题预见性护理[J].中国妇幼保健, 2006, 21 (23) :3240-3242.
激素对小鼠胚胎体外发育的影响 篇4
关键词：激素,小鼠胚胎,体外发育,影响
早期胚胎体外培养技术在发育生物学、胚胎移植、转基因动物等领域的研究工作中都有很重要的作用[1]。早期胚胎发育是一个复杂的过程,在此过程中,可受到各种激素的影响,激素通过不同途径来调控早期胚胎发育[2,3]。目前,在不孕治疗中经常使用到各种促排卵激素,在孕妇妊娠期间也经常使用一些激素类药物,有报道,使用不同剂量和不同种类的激素,可能影响到胚胎的质量[4,5,6,7]。另外,环境中也存在着多种激素的类似物,这些激素和激素类似物对胚胎发育的影响研究,目前还缺乏系统性,尤其是较高浓度的激素水平如何影响胚胎的发育、胚胎发育与激素的浓度之间是否存在着剂量依存性、同种激素对不同发育阶段的胚胎的影响等,这些都还不十分明了,很有必要进行深入的研究。本研究旨在以小鼠为试验动物模型,在基础胚胎发育培养液中分别加入不同种类和不同浓度的激素,以探讨其对鼠早期胚胎体外发育的影响机理。
1 材料与方法
1.1 试验试剂
孕马血清促性腺激素(PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(HCG)购自宁波第二激素厂,HTF培养液购于美国In-Vitro公司,透明质酸酶购自Vitrolife公司,BSA粉剂购自Bovoma X公司,FBS(胎牛血清)购自Gibco公司。胚胎操作液配制:CZB-HEPES(Na Cl为478.9mg/100m L,KCl为36.3mg/100m L,KH2PO4为15.9mg/100m L,Mg SO4为14.195mg/100m L,Na HCO3为210.0mg/100m L,C6H12O6为100.0mg/100m L,Ca Cl2·2H2O为25.0mg/100m L,乳酸钠(60%糖浆)为370mg/100m L,链霉素为50mg/100m L,青霉素为60mg/100m L,HEPES为238.0mg/100m L)。使用时,添加BSA粉剂4mg/m L,过滤除菌,使用前加温,用于体外胚胎的收集和清洗操作。
1.2 试验动物及处理
昆明品系性成熟小鼠,6~8周龄,购自浙江中医药大学动物实验中心,饲养于光照控制(10L∶14D)、恒温恒湿的饲养室,自由采食饮水。雌鼠于17∶30左右腹腔注射10IU孕马血清促性腺激素(PMSG),48h后腹腔注射10IU人绒毛膜促性腺激素(HCG),HCG注射后与正常雄鼠按1∶1比例合笼,次日清晨检查有无阴栓。有阴栓者于注射HCG后14~21h采用颈椎脱臼法处死小鼠。
1.3 胚胎收集
取出输卵管移入操作液,在体视显微镜下找到输卵管膨大部,划破输卵管膨大部使受精卵(云雾状)游离出来。用枪头吸出卵团,移入含透明质酸酶的液滴中反复吹打,镜下观察,当受精卵游离出来后,用移卵管(自制巴氏管)吸出来移入新液滴内清洗3次,备用。
1.4 试验分组与胚胎培养
1.4.1 检查通过2-细胞阻滞情况。
收集洗净的胚胎,选择形态较好的受精卵分为2组,分别置于HTF+10%FBS和HTF+4mg/m L BSA培养液小滴中。于37℃、5%CO2、95%空气、饱和湿度的培养箱中培养,24h后观察2-细胞发育情况并做好记录。
1.4.2 检查培养体系。
收集洗净的胚胎,选择形态较好的受精卵分为多组,分别置于HTF+10%FBS培养液小滴中。于37℃、5%CO2、95%空气、饱和湿度的培养箱中培养,每24h观察1次,并记录各发育阶段胚胎数目。
1.4.3 激素对胚胎发育的影响。
选择形态较好的受精卵分为多组,分别置于添加100、50、10IU/m L的HCG和100、50、10IU/m L PMSG的HTF+10%FBS培养液中。于37℃、5%CO2、95%空气、饱和湿度的培养箱中培养,每24h观察发育情况,并记录各发育阶段的胚胎个数。以不添加激素的HTF+10%FBS培养液作为对照组(CK)。
2 结果与分析
2.1 培养液中添加FBS和BSA检查培养系统突破2-细胞阻滞效果
在试验体系中,分别在HTF培养液中添加胎牛血清-FBS(10%)和牛血清白蛋白-BSA(4mg/m L),检查培养系统能否突破小鼠胚胎发育的2-细胞阻滞情况,结果发现:添加FBS和选购的BSA均可以使原核期胚胎突破2-细胞阻滞,而以添加血清效果较好,在以下的试验中将选择HTF添加血清作为基础培养液(见表1)。
2.2 培养体系检查
应用HTF+FBS培养原核期胚胎,可以平均获得2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑椹胚和囊胚的比例分别为80.3%、78.3%、76.0%、75.5%、68.5%,各发育阶段胚胎个数的具体数值见表2。
2.3 小鼠胚胎发育各阶段的显微摄影
培养后每间隔24h,在相差显微镜下观察胚胎的发育情况,并拍照,各发育阶段胚胎的形态如图1所示。各发育阶段胚胎发育正常,培养系统相对稳定。
注:A为2-细胞与4-细胞胚胎;B为8-细胞胚胎;C为桑椹胚和囊胚;D为囊胚;E为囊胚腔扩大;F为孵化的囊胚。
2.4 激素对小鼠原核胚胎体外发育的影响
不同浓度的激素对小鼠胚胎体外发育的影响结果见表3。由表3可知,添加激素后,各发育阶段胚胎的发育率与对照组相比均有所下降,原核期胚胎的2-细胞发生率与对照组相比有所下降,但未发现浓度依赖性;添加不同浓度的HCG使4-细胞胚胎及其后的各阶段胚胎发育下降尤为明显,并且未发现发育到囊胚阶段;添加不同浓度的PMSG,囊胚的发育率与对照组之间也存在着显著差异;添加HCG似乎可以降低胚胎异常分裂率,而添加PMSG似乎使异常分裂胚胎的比例升高,具体情况如何还需要深入的研究。
注:2-细胞发育率=2-细胞数/1-细胞胚胎数;4-细胞发育率=4-细胞数/2-细胞数;8-细胞发育率=8-细胞数/2-细胞数;桑椹胚发育率=桑椹胚数/2-细胞数;囊胚发育率=囊胚数/2-细胞数;异裂率=异裂数/1-细胞胚胎数。
3 结论与讨论
胚胎的早期发育过程中,很容易受到激素的影响,在辅助生殖实施过程中,往往需要使用激素进行超数排卵处理,激素对早期胚胎的发育影响研究可以为人类辅助生殖技术提高成功率提供一定的理论基础。近年来,随着动物胚胎工程的发展,试管动物、转基因动物和体细胞核移植动物已相继出现,而生产这些动物的一个关键步骤就是胚胎的体外培养,获得稳定的体外发育率是这些技术广泛推广的基础。
试验发现,应用HTF添加10%血清的培养系统可以很好地支持小鼠胚胎体外发育,使用的系统在多次试验检测过程中相对比较稳定,几次试验培养的原核期(1-细胞期)胚胎可以在体外发生分裂,并可以发育到囊胚阶段。
昆明品系小鼠早期胚胎体外培养中表现出严重2-细胞阻滞现象[8],应用模拟输卵管培养液添加血清和血清白蛋白的方式可以突破2-细胞阻滞,在本研究中进口血清突破2-细胞阻滞的效果要好于选购的BSA。这可能与血清中含有多种促进胚胎发育的细胞因子有关[9]。
PMSG和HCG这2种激素经常被用于动物的超数排卵。孕马血清促性腺激素(Pregnant mare serum gonadotropin,PMSG)具有体内的FSH和LH的作用,而人绒毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin,HCG)是模拟体内LH的作用,促进黄体发育,FSH和LH二者在体内促进卵泡发育、排卵和黄体发育。HCG由人胎盘和胞体滋养层细胞合成,现已可高度纯化,并可由基因重组生成。自1978年首例经体外受精胚胎植入创造的Louise Brown诞生后,近10余年来随着ART技术的进展,HCG的临床应用也日益广泛,但其在妊娠早期的功能迄今仍未完全明了。虽然HCG对维持黄体功能是必需的,在不孕症患者诱导排卵出现黄体功能障碍时,重复给予HCG能有效地支持黄体功能[10],但也有HCG溶解黄体的报道,试验表明在大鼠、小鼠、兔和羊于胚胎植入前和植入时,给予1次或多次HCG,会导致产生不同程度的胚胎死亡[11]。特别是最近用促性腺激素诱导排卵,在体内或体外受精治疗不孕症时,常继之出现缩短黄体期致胚胎植入失败、妊娠率降低等现象,其机理也还很少阐明。在程渭玉等[12]的研究中也表明HCG对胚胎的毒性,且存在时间、剂量依赖关系。试验添加不同浓度的HCG使4-细胞胚胎及其后的各阶段胚胎发育下降尤为明显,并且未发现发育到囊胚阶段的胚胎。
体外胚胎生产 篇5
1临床资料
153例均为2005年7月-2008年4月在苏州市立医院生殖中心行IVF-ET的患者, 平均年龄32.2岁, 不孕年限5.3年, 原发不孕98例, 继发不孕55例, 宫外孕3例, 自然流产6例, 轻度卵巢过度刺激综合征 (OHSS) 8例, 无重度OHSS发生, 临床妊娠率41.5%。
2护理
2.1 心理护理
不孕患者的心态与一般妇科患者不同, 主要表现为自卑、沮丧、愧对家人, 感到受到不公正待遇等。辅助生殖技术给她们带来了希望, 同时也让患者产生焦虑、恐惧、抑郁、失落等一系列心理问题, 这些心理问题在Paola Salvatore研究中得到证实[2]。这些问题如得不到及时发现和疏导, 将会严重影响患者的身心健康。在整个治疗过程中, 首先热情接待她们, 对那些不切实际的想法给予理解, 详细介绍影响生育的各个环节、手术的步骤、治疗的作用及有失败的可能, 使她们有信心、有准备, 同时也应对其丈夫进行宣教, 使其理解和配合治疗。
2.2 按医嘱准时、准量用药
合理的超排卵对获得高质量的卵细胞、提高IVF-ET成功率、降低卵巢过度刺激综合征的发生有重要意义。因此在治疗时应严格执行医嘱, 尽量做到准时、定量给药。护士在抽取药液时要做到剂量准确、不残留药液, HMG、FSH、HCG均为粉剂, 在溶解时, 应将稀释液沿着安瓿壁缓慢注入, 防止泡沫产生。如已产生泡沫, 需要等待泡沫消失后再抽取, 以免在排气过程中造成药液的浪费。注射时应双侧臀部交替注射, 防止注射区域发生硬结, 影响疗效。
2.3 取卵术前护理
2.3.1 患者准备工作。
取卵术前1d, 行阴道擦洗, 1次/d。要求做到窥阴器暴露宫颈后, 用卵圆钳夹住干棉球揩净阴道内的分泌物, 再用5%PVP碘溶液棉球擦洗阴道及穹隆周围, 并旋转窥阴器, 使溶液能充分涂擦到阴道各部, 并置换PVP棉球, 用同样方法重复2次。同时向患者介绍取卵步骤、手术安全性及可能出现的并发症等, 让患者消除恐惧心理, 树立成功信心, 以良好的心态接受手术, 并能在术中与医生护士紧密配合。
2.3.2 物品准备。
注射HCG日即通知实验室医生按时做好试剂准备工作。需麻醉的通知麻醉科医生, 术前1h将取卵包、取卵用恒温台、B超仪、吸引器等一切准备就绪。
2.3.3 丈夫准备。
向患者丈夫做好宣教, 嘱在妻子取卵前3～5d排精1次。取卵术日按时到医院取精液送至实验室, 并告知取精时要注意无菌操作和精液保温。
2.4 取卵术后护理。
护送患者至恢复室, 静卧2h, 术后30min测血压、脉搏1次, 观察患者腹痛情况, 发现异常立即通知医生。嘱患者每天按时按医嘱注射黄体酮, 服用抗生素预防感染。回家后如有腹痛、腹胀及时就诊。
2.5 胚胎移植术后的护理
平卧2h, 即可起床。出院后注意不要过度疲劳即可, 注意休息, 避免使用腹压及体育运动, 保持良好情绪。坚持按医嘱肌注黄体酮, 并告知黄体酮有利于孕卵着床和发育, 对胎儿发育没有影响。黄体酮为油剂, 注射后容易形成硬结, 不易吸收。不要在硬结形成处注射, 应两侧臀部交替注射, 可热敷注射部位, 以减少硬结形成, 促进药物吸收。告知患者注意有无腹胀、胸闷、纳差、呕吐等OHSS的表现。对移植后患者进行电话随访, 如有发热及OHSS症状, 及时来院检查和治疗。不孕患者是一个特殊的就医群体, 长期的社会压力、家庭矛盾、高额医疗费用、对妊娠的迫切期望, 致使患者表现出不同程度的焦虑或抑郁[3]。本组153例患者, 通过医生的认真积极治疗, 护士的全程精心护理, 特别是心理护理, 取得了较高的临床妊娠率, 而且无一例中重度OHSS发生, 虽然样本量不够, 但也能说明医护人员共同做好每一个环节, 想患者所想, 让患者积极配合, 是成功的重要保证。
摘要：目的:探讨对接受体外授精-胚胎移植 (IVF-ET) 助孕夫妇实行综合护理的价值及体会。方法:对153例IVF-ET技术助孕的患者均实施有针对性的心理疏导及全程护理。结果:临床妊娠率41.5%, 流产6例, 无严重卵巢过度刺激综合征 (OHSS) , 宫外孕3例。结论:重视并做好每个护理环节, 尤其是心理护理, 是提高IVF-ET成功率及减少并发症的有效方法。
关键词：不孕症,体外授精-胚胎移植术,护理
参考文献
[1]黄荷凤.现代辅助生育技术〔M〕.北京:人民卫生出版社, 2003, 111.
[2] Paolo, Salvatore MD.Psychopath-ology, personality, and maritalrelationship in patients undergoing in vitro fertilization proce-dures〔J〕.Fertility and Sterility, 2001, 75 (6) :1119-1125.
体外胚胎生产 篇6
1 资料与方法
1.1 不孕症定义
按照世界卫生组织的规定, 男女双方若无不愿生育的愿望, 同居一年以上, 且均未采取避孕措施, 仍未能受孕者则称为不孕症。
1.2 实施IVF-ET适应症
1) 女方因输卵管因素阻断精卵结合;2) 排卵障碍;3) 子宫内膜异位症;4) 男方少、弱精症;5) 不明原因不育;6) 女性免疫性不孕。
1.3 临床资料
回顾性分析2000年3月～2003年5月接受常规IVF-ET整个治疗过程的患者188例, 新鲜胚胎移植214个周期, 年龄22～42岁, 不孕不育年限1～10年;不孕不育原因:输卵管因素84例, 排卵障碍55例, 免疫性因素16例, 子宫内膜异位症7例, 男方因素18例, 不明原因8例。
1.4 方法
根据患者年龄及卵巢功能选用不同促排卵方案, <35岁者用长方案, ≥35岁者用短方案, 常规取卵、洗卵及实验室胚胎培养。取卵后根据取卵数目及血雌二醇 (E2) 水平黄体支持, 于取卵及次日各注射黄体酮20mg, 然后每日黄体酮40mg持续至末次月经后70天左右。取卵后48小时～72小时挑选质量好的胚胎2～4枚移植于距离宫低1cm～1.5cm处的宫腔内, 移植液15μl～20μl。
2 结果
经过追踪调查, 在实施IVF-ET的188例患者中, 有18例在移植后的1.5年之内发生了自然妊娠现象。其中输卵管因素11例, 占整个治疗病人的5.85% (11/188) , 这些病人输卵管均为通而不畅、迂曲、积水、输卵管伞端上举, 有3例为IVF-ET成功后发生的自然妊娠;排卵障碍4例, 占2.13% (4/188) , 其中多囊卵巢综合症 (PCOS) 3例, 黄素化卵泡未破裂综合症1例;不明原因1例, 占0.53% (1/188) ;男方因素2例, 占1.06% (2/188) , 这2例病人的丈夫在实施IVF-ET前, 精液质量检查显示为轻中度少弱精, IVF-ET失败后男方又经过系统的生精治疗;其它因素导致的不孕不育未发现自然妊娠现象。
3 讨论
本组病例不孕不育年限多在一年以上, 多方求医而未能生育, 故来我院要求实施IVF-ET治疗。李尚为[1]等报道, 在IVF-ET过程中, 长方案促性腺激素释放激素激动剂 (GnRH-a) 联合促性腺激素 (Gn) 是最常用的方法, 但在GnRH-a降调节过程中可能发生意外妊娠。本组病例在降调节过程中未发生妊娠现象, 但在移植后的1.5年之内有18例发生了自然妊娠, 长短方案均有, 占本组统计病例9.57% (18/188) , 究其原因可能与下列因素有关:
3.1 心理方面的变化
不孕不育病人在经历等待、药物和手术治疗无效后, 多数患者出现不同程度的心理应激反应, 文献报道[2], 心理应激所导致的心血管反应和下丘脑-垂体-肾上腺轴反应, 如心率加速、泌乳素、皮质醇水平升高等, 与低妊娠率有关。这些患者往往把最后一线希望寄托于辅助生殖技术 (ART) , 有的患者出现负面的心理反应, 我们通过心理评估、心理咨询给患者心理治疗, 有效缓解了病人的负性心理, 提高了妊娠率, 降低了治疗中断率;有的患者把这种治疗作为最后的治疗手段, 成功与否在此一举, 心理上对生育这一问题不再抱有太多的期望, 从而自觉缓解了负性心理影响。这可能是本组1例不明原因和部分因输卵管通而不畅、迂曲患者发生自然妊娠的原因之一。因此临床工作者对不孕不育患者的心理应激应高度重视, 评估筛查出有心理负担倾向及有心身疾病者, 对其情绪、认知、隐私和治疗等予以恰当的干预。
3.2 药物的影响
由于GnRH-a骤发作用诱发排卵, 同时升高的LH刺激颗粒细胞分泌孕激素 (P) 作用于子宫内膜以利于种植;还由于GnRH-a的骤发作用使血清P水平升高, 影响输卵管的蠕动及纤毛的活动;还可能有利于卵子和精子在输卵管内受精和早期胚胎的发育, 从而对妊娠产生有利的影响。这可能是黄素化卵泡未破裂综合症及部分输卵管因素患者自然妊娠的重要原因。
3.3 一般认为, 多囊卵巢综合症 (PCOS) 患者的排卵障碍与体内雄激素水平有直接关系
赵军招[3]等报道, 单次经阴道小卵泡穿刺术能改善异常的内分泌相, 缩短月经周期, 降低窦卵泡数, 自然恢复排卵并妊娠。据此推测在实施IVF-ET抽吸卵泡液的同时, 也损坏部分卵巢间质, 导致卵巢内的雄激素合成减少, 从而解除了卵泡的选择受阻和减少对卵泡成熟的抑制, 使卵巢自然恢复排卵。
3.4 病变输卵管的正常功能恢复
实施IVF-ET前, 所有患者都进行了经子宫输卵管造影或通液检查, 结果显示双侧输卵管阻塞、积水、迂曲上举、通而不畅, 这是影响正常妊娠的重要原因。但可能部分患者通过造影剂的机械冲击作用, 恢复了输卵管的通畅和盆腔正常的解剖结构, 加上促排卵药物的作用, 使输卵管恢复了正常的功能。为此, 对于进行了输卵管造影显示迂曲、上举、通而不畅、积水的患者, 建议不要急于实施IVF-ET, 等待半年左右不能怀孕后再考虑此项技术治疗。
参考文献
[1]李尚为, 傅锦媚.促性腺激素释放激素激动剂降调节中发生妊娠的原因及处理[J].生殖医学杂志, 2007;16 (5) :321-322.
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体外胚胎生产 篇7
1 移植前中医辨证施治
肾气虚证:本证多因先天禀赋不足, 房劳过度, 久病失养或多次流产损伤肾气致冲任精气亏虚, 不能摄精成孕, IVF-ET则胎元不纳。证见久婚不孕, 月经先期, 经期延长, 经量或多或少或停经, 兼有头晕耳鸣, 神疲乏力, 腰酸腿软, 小便频数, 舌淡红苔薄, 脉沉细弱。治法:补肾益气, 固精纳气。方药:自拟补肾益气汤。方药组成:熟地、山药、山萸肉、枸杞子、菟丝子、覆盆子、五味子、车前子、人参、补骨脂、益智仁、蛤蚧。阳虚者, 阳虚气弱, 命门火衰, 冲妊虚寒, IVF-ET则胎元不纳。证见久婚不孕, 月经后期量少, 经血暗有块, 小腹冷痛喜按, 带下量多色白清稀, 兼有头晕目眩, 腰腿冷痛, 夜尿频多, 眶黑唇黯, 舌淡苔白, 脉沉迟弱。治法:补肾温阳。方药:《景岳全书》右归丸。方药组成:熟地、山药、山萸肉、菟丝子、枸杞子、鹿角片、杜仲、当归、制附子、肉桂。阴虚者, 因房劳多产, 久病失养, 伤阴耗血, 天癸乏源, 冲妊虚热, IVF-ET则胎元不纳。证见久婚不孕, 月经先期量少色红质稀, 经期短或闭经, 兼有头晕耳鸣, 腰酸腿软, 五心烦热, 口燥咽干, 舌红少苔, 脉细数。治法:滋肾阴清虚热。方药:《小儿药证直訣》六味地黄丸。方药组成:熟地、山药、山芋肉、茯苓、泽泻、丹皮。
气血虚弱证:多因饮食伤脾, 气血生化乏源, 冲妊、胞宫血虚, IVF-ET则胎元不纳。证见久婚不孕, 面色萎黄, 头晕目昏, 胸闷气短, 倦怠乏力, 腹胀少食、或者便溏, 舌淡白苔白, 脉细弱。治法:健脾益气, 补血调经。方药:《太平惠民和剂局方》十全大补丸。方药组成:人参、白术、茯苓、当归、川芎、白芍、熟地、黄芪、肉桂、甘草。
肝气郁结证:本证多因怒气伤肝, 肝气郁结, 冲任失疏, 气机不畅, 天癸气血不达;肝气克脾, 生化乏源, 冲任血亏, IVF-ET则胎元不纳。证见久婚不孕, 月经不调, 周期长短、经期时间、经量均不定, 胸胁闷胀, 经前乳胀, 经期小腹胀痛, 舌紫黯边或尖有瘀斑或瘀点, 脉弦。治法:疏肝解郁, 理血调经。方药:《太平惠民和剂局方》逍遥散。方药组成:当归、白芍、柴胡、茯苓、白术、薄荷、生姜、炙甘草。
痰湿内阻证:本证多因饮食伤脾, 阳虚脾寒, 脾运不健, 聚湿生痰, 冲任内阻、天癸气血不达, IVF-ET则胎元不纳。证见久婚不孕, 月经后期, 经量少不畅, 经期延长或闭经, 形体肥胖, 带下量多, 色白无臭, 头晕胸闷, 动则气喘, 舌淡白苔白滑, 脉滑。治法:健脾益气, 燥湿化痰。方药:《叶氏妇科证治·调经》苍附导痰汤加味。方药组成:人参、白术、茯苓、苍术、厚朴、陈皮、半夏、制南星、枳实、神曲、香附、甘草。
血热证:多因血分热盛, 热扰冲任、胞宫, IVF-ET则胎死腹中。阳盛血热者, 多因素体阳盛, 复感风热, 热灼血分, 血分实热, 热扰冲妊、胞宫, 证见月经先期, 量多色红质稠, 经期延长, 伴有午后潮热, 口渴心烦, 便燥溲黄, 舌红苔黄, 脉数。治法:清热凉血。方药:《傅青主女科》清经散。方药组成:青蒿、地骨皮、丹皮、黄柏、熟地、白芍、茯苓。阴虚血热者, 多因失血伤阴, 血分虚热, 热扰冲任、胞宫。证见月经先期, 量少色红质稀, 伴有颧红潮热, 手足心热, 口燥咽干, 舌红苔少, 脉细数。治法:滋阴清热。方药:《傅青主女科》两地汤。方药组成:生地、麦冬、玄参、地骨皮、阿胶、白芍。肝郁血热者, 多因肝气郁结, 郁久化火, 热扰冲任、胞宫。证见月经先后无定期, 量多少不定, 经期延长, 经前胸乳胀痛, 经期腹痛重, 舌黯红边或尖有瘀斑或瘀点。脉弦数。治法:疏肝解郁, 清热调经。方药:《古今医统》丹栀逍遥散。方药组成:当归、白芍、柴胡、茯苓、白术、煨生姜、薄荷、丹皮、栀子、甘草。
寒凝血滞证:素体阳虚嗜食寒凉之品, 经期产后复感寒邪, 冲任、胞宫寒凝血滞, IVF-ET则胎元不纳。证见久婚不孕, 月经后期, 经行不畅, 色紫暗有块, 经期小腹冷痛拒按, 舌紫黯苔白润, 脉沉紧。治法;温经散寒, 化瘀调经。方药:《医林改错》少腹逐瘀汤。方药组成:小茴香、煨生姜、延胡索、没药、当归、川芎、肉桂、赤芍、生蒲黄、五灵脂。
血瘀证:以上各证兼见经色紫暗有块, 经期小腹痛、夜间痛重, 舌紫黯边或尖有瘀斑或瘀点, 脉涩。其治疗中均应加入活血化瘀药, 如桃仁、红花、益母草, 重者加三棱、莪术, 严重者加水蛭、土鳖虫。
2 验案举例
张xx, 女, 30岁, 本市坊子区, 2010年10月3日初诊。
主诉:胚胎移植2次失败。
现病症:患者婚后1年, 经常小腹疼痛拒按, 带下黄色黏液状, 有臭味, 性交、劳倦后小腹疼痛加重, 在本市某医院确诊为盆腔附件炎, 1年后治愈。婚后同居3年未孕, 再次检查确诊为左侧输卵管不通, 右侧输卵管通而不畅。前1、2年在本市某医院做过两次胚胎移植术均未成功, 要求中医治疗再做第3次胚胎移植。刻诊:患者14岁月经初潮, 较规则, 面色萎黄, 眼圈黧黑, 近1年来月经38天来潮, 经期3~5天, 量少色暗, 小腹痛喜按, 腰酸腿软、畏寒, 带下量多、清稀, 舌淡白苔白, 脉沉弱。
西医诊断:慢性附件炎, 继发不孕。中医辨证:肾阳虚。
治法:补肾温阳。方药:《景岳全书》右归丸。方药组成:熟地20g、山药20g、山萸肉15g、莵丝子10g、枸杞子10g、杜仲10g、当归10g、鹿角10g、肉桂6g、制附子10g。1日1剂, 水煎服。40天肾阳虚证消失, 停服中药进行胚胎移植成功, 后经随访, 足月顺产一婴儿。
IVT-ET失败的主要原因, 母体患有病证, 中医进行辨证施治, 首先从月经入手, 月经先期多为气虚、血热。月经后期多为肾虚、血虚、血寒、气滞。月经先后无定期多为肝郁。月经过多为气虚、血热、血瘀。月经过少多为肾虚、血虚、血瘀、痰湿。经期延长多为气虚、血热、血瘀。结合全身症状、体征、舌、脉象以确立病证, 进行治疗, 可提高IVF-ET的成功率和正常分娩率。
参考文献
[1]韩望, 郑源强, 石艳春.人类辅助生殖技术研究进展[J].中国妇幼健康研究, 2008, 19 (6) :606-609.
[2]林戈, 卢光绣.“试管婴儿”技术30年-回顾和展望[J].生命科学, 2010, 22 (12) :1200-1206.