体外分离培养（精选7篇）
体外分离培养 篇1
驯鹿是一种珍贵的经济动物, 在我国分布范围很小, 仅限于大兴安岭西北坡, 数量稀少, 是我国二级保护动物。驯鹿为半野生状态, 是主要以苔藓、石蕊等木质素含量较低的软纤维植物为主食的反刍动物[1];因此, 驯鹿胃肠道的消化和免疫功能与一般家养的反刍动物相比产生了一些适应性变化, 从而不能适应普通的圈养生活, 圈养的部分驯鹿因消化不良等引起疾病而死亡, 因此有必要对驯鹿的胃肠道生理特点进行深入的了解, 从而建立驯鹿瘤胃上皮细胞的体外培养方法对体外研究驯鹿瘤胃的生理功能有重大意义。
有资料显示, 对于反刍动物瘤胃上皮细胞的培养技术早在1980年就有记录, P.Gálfi等[2]采取胰蛋白酶消化法对牛瘤胃上皮细胞进行分离, 并成功培养了牛的瘤胃上皮细胞。此后, 研究者们在此基础上对反刍动物瘤胃上皮细胞的培养技术进行了多次改进, 但大多局限于牛和绵羊[3], 其他反刍动物瘤胃上皮细胞体外培养的技术鲜有报道, 而对驯鹿瘤胃上皮细胞体外培养的技术未见报道。
本研究以内蒙古呼伦贝尔市敖鲁古雅乡的中国驯鹿为研究对象, 结合牛、羊瘤胃上皮细胞的培养技术对驯鹿的瘤胃上皮细胞进行原代分离及体外培养, 以期为相关的体外研究提供一定的技术支持。
1 材料
1.1 试验动物
驯鹿, 内蒙古自治区呼伦贝尔市某猎民点淘汰的驯鹿。
1.2 主要试剂
细胞培养试剂:M199培养基和胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂 (insulin-transferrin-selenium-X) (ITS) , 购自Gibco公司;胰蛋白酶 (trypsin) 、L-谷氨酰胺、Na HCO3, 购自Sigma公司;胎牛血清 (FBS) , Hyclone公司生产;两性霉素B, 购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
细胞培养用液:磷酸盐缓冲液 (PBS) , M199培养基添加了15%的FBS、2 mmol/L L-谷氨酰胺、2μg/m L ITS、200 IU/m L青霉素及200μg/m L链霉素等。
细胞鉴定试剂:细胞角蛋白一抗 (醛缩酶A, CK19) , 购自Sigma公司;即用型快捷免疫组化MaxVisionTM试剂盒和苏木素体细胞快速染色液, 由福州迈新生物技术有限公司提供。
其余试剂为实验室常规试剂。
2 方法
2.1 驯鹿瘤胃上皮细胞的分离
将取来的瘤胃组织用4℃灭菌生理盐水冲洗去食糜及污染物后, 浸入4℃灭菌PBS溶液 (含500μg/m L青霉素, 250μg/m L链霉素, 0.5μg/m L两性霉素B, 100μg/m L庆大霉素) 中, 带回实验室;钝性分离瘤胃组织的黏膜上皮层和固有层, 并取2~4 cm2的上皮层以上述PBS溶液反复清洗3次, 再用不含抗生素的灭菌PBS溶液浸泡10 min;置入约15 m L 0.25%Trypsin-0.02%EDTA消化液中于37℃水浴中连续振荡消化, 每30 min取其消化液过滤并于显微镜下观察, 同时更换新的消化液, 直至消化液中出现非上皮细胞。将主要包含上皮细胞的消化液用200目的不锈钢细胞滤网过滤收集并用15 m L含有10%血清的培养液终止消化。将混合液转移至离心管, 吹打混匀后1 500 r/min离心10 min;弃去上清液, 加入PBS缓冲溶液后, 充分吹打混匀, 1 500 r/min离心10 min;如此反复洗涤2次, 第2次弃去上清液后, 加入10 m L完全培养液, 充分吹打混匀后, 调整细胞密度至1×105/m L, 并转移至细胞培养瓶中, 于37℃、5%CO2的培养箱中静置培养, 24 h后观察有无染菌, 在显微镜下观察其生长状况。
2.2 驯鹿瘤胃上皮细胞的传代培养
培养基采用M199加15%的FBS, 将细胞分装于25 cm2培养瓶中, 置于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养48~72 h后, 更换培养液, 弃去未贴壁的细胞, 根据细胞生长情况, 每3~4 d全量换液1次。待细胞达到80%~90%融合时, 用0.25%Trypsin-0.02%EDTA消化液消化3~4 min, 显微镜下观察, 如细胞隆起, 胞质回缩变圆、变亮, 加入含有血清的培养液终止消化, 并用移液枪轻轻吹打使之悬浮, 再转移至离心管中离心、洗涤 (方法同原代培养) , 最后转移至细胞培养瓶中, 继续于37℃、5%CO2的培养箱中静置培养。
2.3 驯鹿瘤胃上皮细胞的形态学观察及免疫细胞化学鉴定
在显微镜下对细胞的形态和生长情况进行观察。
根据上皮细胞的标志性中间丝蛋白为细胞角蛋白, 对驯鹿瘤胃上皮细胞的角蛋白进行免疫细胞化学的鉴定。取对数生长的瘤胃上皮细胞用37℃的0.25%Trypsin-0.02%EDTA消化液消化下来, 在6孔细胞培养板中进行常规的盖玻片爬片培养 (3 d) ;取出爬片, 用4%多聚甲醛固定15 min;PBS洗涤3次, 加0.5%Triton作用20 min;PBS洗涤3次, 加3%H2O2孵育15 min;PBS洗涤3次, 加封闭血清孵育20 min;加入一抗, 37℃孵育60 min;PBS冲洗3次, 加入通用型二抗工作液37℃孵育30 min;PBS洗涤3次;DAB显色;自来水冲洗;苏木素核复染, 自来水冲洗;显微镜下观察照像。空白对照用PBS代替一抗。
3 结果
3.1 驯鹿瘤胃上皮细胞的分离结果
瘤胃上皮细胞经0.25%Trypsin-0.02%EDTA消化液消化第4次起在显微镜下可观察到大量上皮细胞分散存在, 直到消化至第6次, 细胞数量开始减少, 且组织变得黏腻。收集后于显微镜下观察, 可见细胞数量多, 单个散在, 大小均一, 具有较好的折光度 (见228页彩图1A) 。调整细胞密度进行培养, 培养的细胞在72 h后有大部分贴壁, 细胞颜色发暗, 呈多角形, 并已开始生长, 呈岛屿状分布;也有未贴壁悬浮的细胞, 细胞折光度好, 体积较小, 形态较圆 (见228页彩图1B) 。96 h后生长迅速, 细胞增殖明显, 可见典型的铺路石状生长, 进入对数生长期 (见228页彩图1C) 。随后的7~9 d, 细胞生长融合成片, 呈单层状生长 (见228页彩图1D) 。
3.2 驯鹿瘤胃上皮细胞的传代培养结果
传1代后的细胞可在12 h内贴壁, 并迅速进入对数期生长增殖, 细胞形态完整, 生长良好 (见228页彩图2A) , 可在3~4 d铺满细胞瓶。传2代后细胞增殖迅速, 但细胞形态发生变化, 大小极不均一, 部分细胞胞体宽大、扁平, 胞浆内出现空泡和黑色颗粒 (见228页彩图2B) , 后期细胞增殖减慢, 甚至生长停滞, 逐渐死亡, 从瓶壁脱落。
3.3 驯鹿瘤胃上皮细胞的形态学及免疫细胞化学鉴定结果
细胞经分离培养48 h后, 可见细胞单个或数个贴壁, 呈扁平多角形, 胞浆丰富, 轮廓清晰。进入对数期后, 细胞呈小岛屿状生长, 各细胞岛屿间可见有细胞连接。7~9 d时, 各细胞岛屿连接成片, 呈铺路石样生长, 是典型的上皮形态 (见228页彩图3A) 。经免疫细胞化学方法的鉴定, 可见细胞胞浆为黄褐色, 即角蛋白CK19染色呈阳性 (见228页彩图3B) , 可判断所培养细胞为上皮细胞。
4 讨论
近年来, 我国驯鹿的数量一直徘徊在千只左右, 内蒙古大兴安岭北部敖鲁古雅民族自治乡的驯鹿是我国唯一的驯鹿种群, 均为鄂温克族所豢养, 呈半野生状态。虽然我国于2003年实行了生态移民, 但移民后的2个月间 (7—9月份) 有200多头驯鹿因消化不良引起疾病死亡, 驯鹿种群数量由搬迁前的800多只下降至不足600只[4]。无奈大部分鄂温克族人又牵着驯鹿返回原始森林过着游牧生活, 不定期地迁居, 是中国最后的狩猎部落。因此, 加强驯鹿圈养的相关科学研究, 不仅能恢复驯鹿种群的数量, 也是结束“中国最后狩猎部落”的有效办法。
P.Gálfi等[2]首次培养牛的瘤胃上皮细胞时采用剪切瘤胃乳头的方法进行分离及培养, 成功建立了牛的瘤胃上皮细胞的体外培养方法;同样类似的方法于第2年成功地培养了绵羊瘤胃上皮细胞[5];F.Stumpff等[6]在前人的培养技术基础上改进了取材方法, 设计并制作了一种模具, 使胰蛋白酶只作用于乳头来分离上皮细胞;沈赞明等[7]在培养奶公牛瘤胃上皮细胞时, 钝性分离瘤胃黏膜上皮与固有层以获得较为纯净的上皮细胞。本试验在总结前人试验的基础上, 采用钝性分离瘤胃黏膜得到上皮层的方法, 对上皮组织整体进行胰蛋白酶消化, 经试验鉴定获得了可扩增培养的瘤胃上皮细胞。本试验方法简便易行, 具有较强的可操作性。
有研究表明, 胃肠道上皮细胞的原代培养已在实践中大量应用。有人指出, 人的胃黏膜上皮细胞是以胶原酶和透明质酸酶对胃黏膜进行处理得到的[8];猪小肠黏膜上皮细胞采用组织块贴壁法能获得活性好的黏膜上皮细胞[9];而周传丽等[10]报道, 利用Ⅺ型胶原酶和Ⅰ型中性蛋白酶的混合液灌注仔猪小肠能消化分离小肠黏膜上皮组织得到形态完整、容易贴壁生长的小肠绒毛细胞团。本试验采用0.25%的胰蛋白酶-0.02%EDTA对驯鹿瘤胃黏膜上皮进行处理, 结果表明, 可以获得大量活性较好的上皮细胞, 易于培养。
反刍动物的瘤胃壁由黏膜、黏膜下层、肌层和浆膜4层构成。瘤胃黏膜表面被覆复层扁平上皮, 其由外至内分为角质层、颗粒层、棘细胞层和基底层[11], 其中角质细胞没有细胞活性, 而基细胞具有很强的分裂增殖能力, 其次为颗粒细胞[2]。分离瘤胃上皮细胞时选择胰酶多次连续振荡消化可获得大量上皮细胞, 但在细胞的游离状态下不能确切区分每一层的细胞。本试验中发现, 角质细胞不贴壁, 不生长, 不影响其他细胞的贴壁和生长, 在换液时会随细胞培养液被弃掉。由本试验结果可以推测, 尽管细胞贴壁生长但由于处于非生理的条件下, 在显微镜下观察均呈典型的上皮样生长, 不体现颗粒细胞、棘细胞或是基细胞的形态特性。
角蛋白存在于上皮细胞胞浆中构成上皮细胞内细胞骨架, 是上皮细胞中特异性的抗原, 具有多种表型。有人对仔猪小肠黏膜上皮细胞[9]和肾小管上皮细胞[12]的CK18进行了鉴定;多曙光等[13]对牛乳腺上皮细胞中的CK5和CK8进行了鉴定;李海甲[14]培养的兔气管黏膜细胞是采用广谱抗角蛋白单克隆抗体进行免疫组织化学染色。本试验在形态鉴定的基础上, 对所培养细胞中的角蛋白CK19进行了免疫细胞化学的染色, 呈阳性反应。
尽管对于瘤胃细胞的原代培养有大量文献佐证, 但未见有关其传代培养的报道。本试验经多次反复尝试与改进, 成功地进行了驯鹿瘤胃上皮细胞的传1代体外培养, 但对于驯鹿瘤胃上皮细胞能否连续传代培养, 是否受培养条件局限, 仍需进一步验证。
J.J.Gildea等[15]分别用传统的方法和三维细胞培养技术培养了人的肾上皮细胞, 结果表明, 用三维细胞培养技术获得的细胞在基因表达、基质分泌及细胞功能活动等方面与传统细胞培养技术获得的细胞有差异, 而与体内细胞的生长情况更为相似, 而且三维细胞培养既能保留体内细胞微环境的物质结构基础, 又能体现细胞培养的直观性及条件可控制性, 所得到的研究结果也更为可靠。由此启示人们, 今后可以从这一方面加以突破。
中国驯鹿瘤胃上皮细胞体外分离培养方法的初步建立为体外研究中国驯鹿瘤胃上皮细胞的生理功能奠定了试验基础。
a.贴壁细胞;b.悬浮细胞。
体外分离培养 篇2
目的 探索成体狗骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离、体外培养,为其将来应用提供实验依据.方法 无菌条件下抽取狗肋骨骨髓,Ficoll分离液(密度1.077g/ml)梯度离心分离单个核细胞,在含10%新生牛血清的DMEM中,37℃、5%CO2、饱和湿度下常规培养,取贴壁细胞并进行传代,观察细胞的生长形态.结果 取得较高纯度的成体狗骨髓MSCs,并保持细胞的活性;成体狗骨髓MSCs在体外培养中,为贴壁生长的单个核球形细胞,培养3～4d后开始大量增殖,为纺锤形和星形多突起的细胞贴壁生长,6～8d细胞达到70%～90%融合.传代细胞3～4d即可再次传代.结论 采用Ficoll分离液进行梯度离心分离,可获较高纯度的MSCs,是实用、便捷和可行的.方法 ;而且在体外培养的条件下能大量增殖,形成形态均一的细胞集落,可以成为进一步进行细胞扩增或其它实际应用的基础.
作 者：雷开键 杜一平姜雄 熊永祥 贾钰铭 宋玉光 林萍 罗华 作者单位：宜宾市第二人民医院肿瘤科,四川,宜宾,644000 刊 名：四川医学 ISTIC英文刊名：SICHUAN MEDICAL JOURNAL 年，卷(期)： 28(10) 分类号：Q813.1 关键词：间充质干细胞 细胞培养 体外 骨髓 狗
体外分离培养 篇3
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验动物
10只6周龄生殖系统发育健全的雄性昆明小白鼠,西安交通大学医学院实验动物中心提供。
1.1.2 主要试剂
胶原酶Ⅳ、DMEM培养基,Gibco公司生产;胰蛋白酶、Percoll细胞分离液(A.P)、Hepes,Amresco公司生产;胎牛血清,Hyclone公司生产;辅酶Ⅰ,Genview公司生产;四唑氮蓝、脱氢表雄酮、台盼蓝、苏木精,Sigma公司生产。
1.2 方法
1.2.1 小鼠睾丸间质细胞的分离
取10只6周龄生殖系统发育健全的雄性昆明小白鼠,采用颈椎脱臼法处死,在无菌条件下切开阴囊,取出睾丸,去除睾丸被膜和血管,暴露生精小管,用Hank’s液反复冲洗。用吸管轻轻吹打,尽量使间质组织与曲精细管分散,用小剪刀将生精小管剪成1～4 mm3的碎块,加入1 mg/mL胶原酶溶液,于37 ℃、5% CO2条件下孵育10 min,1 000 r/min离心5 min;弃去上清液,加入0.25%胰蛋白酶和1.5 mg/mL的透明质酸酶溶液作用10～15 min;加入适量的胎牛血清终止消化,用孔径为200目的尼龙网过滤悬液,收集滤液,以1 000 r/min离心5 min;弃上清液,将沉淀的细胞用少量Hank’s液吹起摇匀,制成细胞悬液。
1.2.2 小鼠睾丸间质细胞的Percoll分离
用PBS将Percoll配制成45%、50%、 55%、60%、65%、70%的梯度液;将制备好的各级Percoll梯度液按密度从高到低逐层轻轻放置到10 mL离心管中,将细胞悬液置于最上层,每层1 000 μL,于4 ℃、800 g离心40 min会出现多条模糊的带;用吸管将55%～65%之间的细胞带小心转移至事先标记好的10 mL离心管中,用培养液洗涤2次,最后用少量的培养液重悬沉淀制成细胞悬液,分别用台盼蓝和3β-HSD进行染色[2]。
1.2.3 小鼠睾丸间质细胞的培养
将纯化后的细胞用培养液调整浓度至1×105个/mL,加入培养液(DMEM +10%胎牛血清+1%L谷氨酰胺+非必需氨基酸),置于34 ℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养,每24 h观察细胞生长状况;分别在细胞培养24,48,72小时将爬有间质细胞的盖玻片取出进行H.E.染色;待细胞长至培养皿底层90%左右开始传代,采用柠檬酸钠和KCl的混合盐溶液或胶原酶Ⅳ+0.25%胰蛋白酶进行消化或以物理方法进行细胞的传代处理。
1.2.4 数据处理
采用SPSS11.0软件对所得数据进行处理和分析。
2 结果
2.1 细胞存活率与纯度的测定结果
消化分离出的睾丸间质细胞悬液经0.4%台盼蓝溶液染色后在光镜下观察,死细胞被染成淡蓝色,活细胞拒染,计数200个细胞,统计4次,细胞存活率为(90.72±0.50)%。Percoll梯度液纯化后的间质细胞经3β-HSD染色后计数100个细胞,统计4次,纯度为(86.00±0.82)%。
2.2 细胞的形态学观察结果(见图1,2)
刚分离的睾丸间质细胞为圆形细胞,培养至10小时时细胞的形状即开始发生变化。H.E.染色后可见细胞的胞质轮廊为多角形或不规则形状,被染成红色,有3～4个突起伸出;细胞核呈圆形或卵圆形,被染成蓝色或蓝紫色,位于胞质中央;有1个或2个核仁,位于核的边缘,清晰可见。
2.3 不同处理方法对睾丸间质细胞消化传代的影响(见表1)
由表1可见:以物理方法处理的细胞死亡率低,更容易贴壁,但此种方法费用高;采用柠檬酸钠和KCl的混合盐溶液进行消化的细胞也较容易贴壁,但是细胞的死亡率较高。
注:同行数据肩标字母相同表示差异不显著(P>0.05),不同表示差异显著(P<0.05)。
3 讨论
3.1 睾丸间质细胞的分离培养
睾丸既是产生精子的器官,又是分泌雄性激素的内分泌器官。目前,对睾丸生殖细胞的分离培养以组织块培养法和胰蛋白酶消化接种法为主,而其他分离方法如曲细精管培养法[8]、钢网过滤筛选法[9]也有报道。一般组织块培养法操作简便,但对杂细胞的污染不容易控制;胰蛋白酶消化法利用酶对组织间质的作用使细胞团分散成单个细胞,使用此法能获得大量的活细胞,能较快地建立细胞系,但胰酶会作用于细胞膜,长时间的胰酶环境会使细胞受到损伤;而对睾丸间质细胞的分离应采取胶原酶、胰蛋白酶联合限时消化,能避免消化时间过长而损伤睾丸间质细胞和避免精原细胞的污染,消化后的混合液再用200目的钢筛过滤,以除去筋膜和大量的成纤维细胞,从而能提高睾丸间质细胞的纯度。
3.2 睾丸间质细胞的Percoll分离及3β-HSD的染色鉴定
Percoll是一种经聚乙烯吡咯烷酮(PVP)处理的硅胶颗粒,无毒,惰性,且与生物膜不发生黏附,利用它分离的细胞能保留完整的生物学活性。刘建中等[3]利用Percoll法对小鼠睾丸间质细胞进行分离并取得较高的纯度,而Yang J M等[10]报道的试验结果却相反。此试验根据睾丸间质细胞处于55%～65%的Percoll层内来获取间质细胞,在此浓度范围内取得的睾丸间质细胞的纯度较高,形态典型,且体外培养细胞的特征与前人报道的一致[11]。3β-HSD是甾体类激素合成的关键酶之一,在睾丸间质细胞中表达,是公认的睾丸间质细胞的鉴定指标。3β-HSD是睾丸间质细胞的重要标志,仅见于睾丸间质细胞光面内质网内,而不存在于睾丸的其他细胞中。在3β-HSD染色液的作用下,细胞质被染成蓝色的即为睾丸间质细胞。试验就是基于这一特征进行了3β-HSD染色鉴定。
3.3 睾丸间质细胞的消化传代方法
试验从6周龄小鼠的睾丸中分离睾丸间质细胞,以胶原酶Ⅳ+0.25%胰蛋白酶消化、物理方法(梯度密度离心法)和柠檬酸钠+KCl消化分离、纯化细胞。采用的培养液是DMEM,传代时以不同的处理方法进行分离细胞。结果发现以物理方法处理的细胞死亡率低、更容易贴壁,而且容易操作,但是这种方法费用高。采用柠檬酸钠和KCl的混合盐溶液进行消化的细胞也较容易贴壁,但这种方法费时,细胞的死亡率较高,可能是盐溶液处理的时间过长所致。用0.25%的胰蛋白酶消化细胞,虽然对细胞有一定的损伤,但是只要控制好时间,适合于进行大量细胞传代培养,因为这种方法省时。不同的消化传代方法各有优缺点,应根据试验方法和具体条件而定。
4 结论
从本试验结果看,采用胶原酶Ⅳ和0.25%胰蛋白酶限时消化和物理方法相结合,不仅使睾丸间质细胞完全分离,提高细胞的收获率,而且减轻了酶对睾丸间质细胞的损伤;同时对分离得到的细胞悬液进行Percoll密度梯度离心,有效地去除了消化的组织碎片和避免了杂细胞的污染,提高了细胞的纯度。但是,使用此种方法是否对睾丸间质细胞的功能造成影响还有待进一步的研究验证。
参考文献
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[10]YANG J M,MARC A.Cadmium induced damage to primary cultures of rat Leydig cells[J].Reproductive Toxicology,2003,17:553-560.
体外分离培养 篇4
1 材料和方法
1.1 朱砂七
由陕西省眉县金渠药材分公司太白山草药研究所卫拉船中药师提供并鉴定, 自然风干, 粉碎, 备用。
1.2 主要仪器和试剂
紫外可见分光光度计 (型号为UV1102) , 上海天美科学仪器有限公司生产;循环水多用真空泵 (型号为SHB-B95) , 郑州长城工贸有限公司生产;旋转蒸发仪 (型号为RE-52A) , 上海亚荣生化仪器厂生产;电热恒温水浴锅 (型号为HH.SY21-Ni-6c) , 北京市长风仪器仪表公司生产;超声波清洗器 (型号为KQ-250) , 昆山市超声仪器有限公司生产;生化培养箱 (型号为HPS-250) , 苏州安泰技术有限公司生产;超净工作台 (型号为SW-CJ-IF) , 苏州安泰技术有限公司生产。乙醇、葡萄糖、浓硫酸和苯酚等均为国产分析纯;磷酸氢二钾、氯化钠、琼脂粉、牛肉膏、蛋白胨, 均购自北京奥博星生物技术责任有限公司。
1.3 菌种
金黄色葡萄球菌 (Sta.aureus) 、大肠埃希菌 (E.coli) 、沙门菌 (S.almonella) 、无乳链球菌 (S.agalatiae) 、绿脓杆菌 (P.aeruginosa) 、深红沙雷菌 (Ser.rubidaea) , 均由西北农林科技大学兽医微生物学实验室从患乳房炎奶牛乳汁中分离得到。
1.4 PCP的提取
将朱砂七粉碎, 称取90 g, 用石油醚和95%乙醇各脱脂2 h;加入900 mL纯化水, 超声处理45 min;于90～100 ℃水浴加热回流提取3次, 时间分别为3 h、2 h和1 h;纱布过滤除去药渣, 合并滤液, 减压浓缩至150 mL;5 000 r/min离心15 min, 向上清液中加入无水乙醇, 使乙醇终浓度为80%, 静置过夜;过滤, 取沉淀物, 得到PCP粗品。将粗品依次用95%乙醇、丙酮、乙醚反复洗涤数次, 45 ℃烘干即得PCP。
1.5 PCP含量的检测
1.5.1 标准曲线的绘制
精确称取葡萄糖标准品50 mg, 用500 mL 容量瓶定容, 得0.1 mg/mL的标准溶液。用移液枪移取标准溶液0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mL, 分别置于10 mL容量瓶中;各瓶再加入5%苯酚溶液1.0 mL, 混匀;迅速加入5 mL浓硫酸, 摇匀;静置10 min后加纯化水至刻度, 定容;再静置20 min, 于30 ℃水浴中加热20 min, 取出冷却至室温。另设纯化水同上平衡操作作为空白对照。用紫外分光光度计在300～600 nm之间扫描葡萄糖的最大吸收波长, 在最大吸收波长处测定上述溶液的吸光度值, 以吸光度值为纵坐标, 葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线, 并计算得回归方程。
1.5.2 PCP含量的测定
称取PCP 10 mg, 配成浓度为0.1 mg/mL的供试液, 同上述方法处理, 测定吸光度值, 并代入回归方程计算得PCP相对含量。
1.6 PCP体外抑菌试验
1.6.1 琼脂扩散法抑菌试验
将PCP配成浓度为100 mg/mL的溶液, 并以纯化水作为空白对照。在无菌条件下, 用灭菌L型玻璃棒将细菌均匀涂抹在直径为90 mm的琼脂平板上, 用直径为4 mm的打孔器打孔, 分别在孔内加满纯化水和PCP溶液, 于37 ℃培养18～24 h后观察抑菌环大小并测量抑菌环直径, 重复3次取平均值。
1.6.2 最小抑菌浓度 (MIC) 和最小杀菌浓度 (MBC) 的测定
将PCP配成浓度为200 mg/mL的药液。采用二倍稀释法, 在无菌条件下, 取无菌试管11支 (规格为15 mm×100 mm) , 每管加入肉汤1 mL, 在第1管中加入药液1 mL, 然后连续倍比稀释至第8管, 并从第8管弃去1 mL。第9, 10, 11管分别为药物对照组 (不加细菌) 、细菌生长对照组 (不加药液) 和肉汤对照组 (不加细菌和药物) 。除第9, 11管外, 其余每管均加入细菌悬液25 μL。接种完毕后, 于37 ℃培养18～24 h 。试验重复3 次, 肉眼观察, 不发生混浊变化的最高提取物稀释倍数即为该提取物的MIC。吸取已测定出MIC的试管培养液各100 μL, 用灭菌L型玻璃棒将细菌均匀涂抹到适宜的琼脂板上, 于37 ℃恒温培养18～24 h, 以菌落数不超过5个的最低提取物浓度为该提取物的MBC[6]。
2 结果
2.1 PCP的鉴别及含量测定结果
经紫外分光光度法测定, 葡萄糖标准溶液和PCP溶液均在490 nm有最大吸收波长, 结果见图1, 2。
以葡萄糖为标准, 得回归方程A=2.946C+0.080 7, R=0.994 8, 线性范围为0～60 μg/mL, 见图3。
采用超声波辅助水提醇沉法对90 g朱砂七进行多糖的提取, 得到4.835 g PCP, 提取率为5.372%, 提取物中PCP含量为87.65%。
2.2 PCP的琼脂扩散法抑菌试验结果
100 mg/mL的PCP对金黄色葡萄球菌、沙门菌和绿脓杆菌的抑菌直径分别为10.30, 10.12, 9.22 mm;对大肠埃希菌、无乳链球菌和深红沙雷菌均无抑制作用。
2.3 PCP的MIC和MBC测定结果
PCP对金黄色葡萄球菌、沙门菌的MIC分别为3.125, 6.25 mg/mL;对金黄色葡萄球菌、沙门菌的MBC分别为12.5, 25.0 mg/mL;对绿脓杆菌未测出MIC和MBC。
3 讨论
植物多糖是一类分子结构复杂且庞大的糖类物质。近年来, 国内外学者已对多种中药多糖的提取、含量测定及药理活性进行了研究。植物多糖的提取有多种方法, 如超声波提取法、碱液浸提法、酸液浸提法、热提法等。本研究以超声波辅助水提醇沉法提取PCP, 提取率为5.372%, 高于崔军见等[3]采用传统回流的提取方法提取的PCP (提取率为5.1%) 。苯酚-硫酸法是测定多糖含量的常用方法, 具有简便和准确的优点[7,8], 因此用于本研究中PCP含量的测定, 但在试验中应注意操作的一致性, 特别是加硫酸时, 迅速加入、慢慢加入、直接滴到液面和沿管壁流入对最后结果都会造成差异, 需要特别注意;另外, 还要注意反应时间的一致性, 以及在加入浓硫酸之后、水浴加热之前一定要摇匀[9]。
许多植物多糖具有抑菌活性。如甘草多糖对枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、酿酒酵母菌均有较强的抑制作用[10];金樱子多糖具有一定的抑菌活性, 特别是对大肠埃希菌、副伤寒杆菌、白葡萄球菌的抑制作用很强[11];从决明子和凤凰木种子中提取的多糖制成的多糖膜剂, 对革兰阳性菌 (枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌) 和革兰阴性菌 (大肠埃希菌) 均具有抗菌活性, 其通过破坏细菌细胞的形态发挥抑菌作用。由于菌种所限, 本试验仅选取了6种奶牛乳房炎常见致病菌进行抑菌试验, 而PCP对其他菌种的抑菌作用还有待进一步研究, 本试验结果初步表明PCP具有一定的抑菌作用, 其对革兰阴性菌和革兰阳性菌的抑菌作用未见明显差异。从MIC和MBC的测定结果可知, 不同浓度PCP的抑菌活性之间存在显著差异, 临床应用时应选择其最佳抑菌浓度。
摘要：为了研究朱砂七多糖 (PCP) 的提取及其对奶牛乳房炎分离菌的体外抑制作用, 试验采用水提醇沉法提取PCP, 苯酚-硫酸法测定PCP含量, 琼脂扩散法和二倍稀释法测定PCP对从患乳房炎奶牛乳汁中分离的6株致病菌的体外抑菌作用。结果表明:PCP提取率为5.372%;提取的PCP含量为87.65%;PCP对金黄色葡萄球菌、沙门菌和绿脓杆菌均有不同程度的抑制作用, 且抑菌作用随着PCP浓度的升高而增强, 对大肠埃希菌、无乳链球菌和深红沙雷菌无抑制作用。说明朱砂七多糖具有一定的体外抑菌作用。
关键词：朱砂七,多糖,水提醇沉法,苯酚-硫酸法,体外抑菌
参考文献
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体外分离培养 篇5
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料来源。
2008年7月, 辽宁省营口市鲅鱼圈开发区某鸡场送检疑似大肠杆菌病死鸡若干只, 死亡时间不超过12 h。
1.1.2 主要试剂及仪器。
伊红美兰琼脂:由北京奥博星生物技术有限责任公司提供;糖发酵试验用各种糖:购自中国医药 (集团) 沈阳有限公司生化试剂分公司;药敏纸片:购自上海伊华医学科技有限公司;普通琼脂、普通肉汤、血液琼脂平板、糖发酵管参照参考文献[2]方法配制。
1.2 方法
1.2.1 细菌分离培养。
在临床中采集具有典型大肠杆菌病理变化的鸡心血、肝, 无菌接种在普通琼脂平板及普通肉汤中, 37℃培养24h, 选取表面光滑、边缘整齐、表面灰白半透明菌落接种在伊红美兰培养基上, 于37℃鉴别培养24h后, 选取典型菌落进行纯培养。取各菌株的纯培养物分别进行生化特性鉴定。
1.2.2 细菌形态学观察。
无菌取病死鸡心血、肝, 涂片, 瑞氏染色、革兰氏染色, 镜检。取在伊红美兰培养基上培养18h的新鲜菌落进行革兰氏染色, 镜检。
1.2.3 生化试验。
糖发酵及生化反应按常规进行。
1.2.4 溶血性试验。
无菌采取绵羊红细胞, 用玻璃珠脱纤, 溶化琼脂培养基, 待琼脂冷却至45℃左右时, 按琼脂的10%加入脱纤血, 轻轻摇晃, 使血液混合均匀, 制成血液琼脂平板。将待检大肠杆菌分别划线接种于血液琼脂平板上, 37℃中培养24 h后, 观察结果。
1.2.5 动物试验。
(1) 菌液制备:细菌接种于普通肉汤中, 37℃培养18 h, 4℃冰箱保存备用。 (2) 致病性:从市场购10日龄AA肉鸡, 饲养1周, 确保健康。随机分为A、B两组, 每组5只, A组为试验组, B组为对照组, A组颈部皮下注射0.2 mL肉汤菌液, B组腹腔接种0.2 mL灭菌生理盐水。隔离饲养、观察。
1.2.6 药敏试验。
将待检菌株的肉汤培养物用无菌生理盐水稀释10倍后, 每个琼脂平板接种0.1 mL, 用曲玻棒均匀涂布后, 将不同的药敏片相隔4.5～5 cm贴在琼脂平板表面, 置37℃培养18 h后, 测定抑菌环的直径, 结果判定依据《纸片法抗菌药物敏感试验操作标准 (第四版) 》。
2 结果
2.1 细菌分离培养
分离株在普通琼脂平板上37℃培养24 h后, 生长良好, 呈中等大小、边缘整齐、表面光滑微凸, 灰白色半透明的菌落。在伊红美兰平板上, 形成中等大小, 边缘整齐, 有金属光泽的黑色菌落。
2.2 细菌形态学观察
病死鸡心血、肝及伊红美兰培养物涂片染色镜检后, 均可见有两端钝圆的革兰氏阴性小杆菌。多数散在, 少数有2～3个相连。
2.3 生化试验结果
糖发酵试验结果显示分离菌均能发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、木糖、果糖、鼠李糖、山梨醇及阿拉伯胶糖, 均不发酵蔗糖、卫矛醇、肌醇。各菌株吲哚试验和M.R试验阳性、VP试验阴性, 根据试验结果判定, 所分离的3株菌均为大肠杆菌。 (见表1)
注:糖发酵试验:⊕表示产酸产气;+表示产酸;-表示不发酵
2.4 溶血性试验
试验结果表明, 在血液琼脂平板上, 所分离的3个菌株菌落周围均形成宽约3 mm透明的溶血环, 判定为β溶血。
2.5 致病性试验
2.5.1 在肉汤中生长特性。
大肠杆菌在肉汤中37℃培养18 h后, 呈现均匀混浊, 管壁与液面有菌膜, 底部有粘性沉淀。
2.5.2 致病性。
A组肉仔鸡1只接种后第3 d死亡, 其余4只第4 d全部死亡, B组肉仔鸡全部健活。剖检死亡鸡发现其肝脏肿大、质脆、有坏死灶, 表面被覆一层黄白色纤维素性渗出物;肺充血淤血, 其中2只鸡肺部有坏死灶;脾脏肿大;十二指肠有出血性肠炎变化;盲肠扁桃体出血肿胀。
采取病死鸡心血、肝、脾接种到普通肉汤及伊红美兰培养基上, 均有细菌生长。该菌培养特性及革兰氏染色特性与接种菌一致, 肉汤培养物作生化试验, 生化特性与接种菌完全相同, 表明此菌与接种细菌为同种细菌。
2.6 药敏试验结果
药敏试验结果判定方法参照《纸片法抗菌药物敏感试验操作标准 (第四版) 》, 表明该菌对复达欣、先锋Ⅵ、菌必治、庆大霉素敏感, 对氧哌嗪青霉素、呋喃妥因、氧氟沙星中度敏感, 而卡那霉素、氟哌酸、链霉素、头孢呋肟、红霉素、氨苄青霉素、环丙沙星对它没有抑制作用。
3 讨论
3.1大肠杆菌是夏季肉鸡生产危害较大的传染病, 从本菌分离鸡场看, 其发病的主要诱因是饲养管理不当, 通风不良, 以及连日阴雨造成的地面潮湿。提示防控本病的关键是加强饲养管理, 日常提供优质全价饲料;严格卫生防疫制度, 在夏季注意防暑, 补充维生素和电解质, 创造良好的饲养条件。
3.2鸡场在发病前, 技术人员曾长期应用环丙沙星、氟哌酸、红霉素等药物作为预防肠道疾病的药物添加在饲料中, 造成分离菌对多种药物的抗药性。因此在用药物治疗大肠杆菌病的时候, 应根据药敏试验结果, 选择敏感药物交替按疗程服用, 以期达到较好的治疗效果[4]。
3.3由于各地优势血清型存在差异, 有效而通用的菌苗尚未出现[5], 在本地区本病的预防仍处于空白阶段。从本试验可以看出, 所分离菌的具有溶血性及较强致病性, 若应用本菌制备大肠杆菌自家苗灭活苗, 用于本场大肠杆菌病的预防, 将会收到较好的预防效果。
参考文献
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[2]韩文瑜, 何昭阳, 邓玉斌.病原细菌检验技术[M].长春:吉林科学技术出版社.1992, 41~50, 80.
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[4]王双山, 张敬礼, 刘庆昌, 等.肉鸡大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验[J].河南农业科学, 2003 (6) :43245.
体外分离培养 篇6
1 材料
1.1 药品与试剂
石菖蒲、五倍子、黄芩、黄连、黄柏、菊花、大黄、金银花、秦皮、艾叶、白头翁、白芍、甘草、栀子、诃子、马齿苋、郁金、地榆、石榴皮、土茯苓、木香21种中草药, 均购于常德市某中药店;猪大肠杆菌供试细菌, 2014年6月份从常德市某猪场腹泻猪病料中分离、鉴定并保存;营养肉汤培养基、营养琼脂培养基 (按常规方法制备[3], 高压灭菌, 保存于4℃冰箱中, 备用) , 购自杭州微生物试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
生化培养箱 (型号为LRH-150) 、电热恒温 (鼓风) 干燥箱 (型号为DHG-9240A) , 上海一恒科学仪器有限公司生产;立式压力蒸汽灭菌器 (型号为BXM-30R) , 上海博迅医疗生物仪器股份有限公司生产;电子天平 (型号为BS223S) , 北京赛多利斯仪器系统有限公司生产;粉碎机 (型号为FW100) , 天津市泰斯特仪器有限公司生产;垂直净化工作台 (型号为SP-DJ) , 上海浦东物理光学仪器厂生产;冰箱 (型号为BCD-215KS) , 青岛海尔股份有限公司生产;试管、烧杯、培养皿、移液枪、打孔器等, 均为市售。
2 方法
2.1 中草药组方及复方药液的制备
将21种单味中草药按一定比例组成8组复方。复方1:石菖蒲、五倍子、黄芩、菊花;复方2:石菖蒲、黄芩、大黄、金银花;复方3:大黄、黄芩、秦皮、艾叶;复方4:白头翁、黄连、黄柏、秦皮;复方5:马齿苋、白头翁、黄柏、五倍子、甘草;复方6:郁金、诃子、黄芩、大黄、黄连、栀子、黄柏、白芍;复方7:地榆、石榴皮、土茯苓;复方8:黄连、白头翁、木香、甘草[4]。
采用水煎法制备复方中草药水提液。分别称取粉碎后的中草药复方制剂50 g, 置于500 m L烧杯中, 加入400 m L纯化水, 浸泡1 h后, 强火加热至沸腾, 改用文火煎煮30 min, 4层纱布过滤, 药渣再加入适量纯化水, 按上述方法煎熬过滤除去滤渣, 合并2次滤液, 过滤, 加热浓缩至50 m L, 使药液浓度为1 g/m L。将药液装入100 m L生理盐水瓶中, 高压蒸汽灭菌后, 置于4℃冰箱中保存, 备用。
2.2 试验菌的制备
用接种环挑取临床病猪分离并保存的猪大肠杆菌, 接种到营养肉汤培养基中, 在37℃恒温培养箱中培养24 h, 接种于营养琼脂培养基上, 置37℃恒温培养箱中培养24 h。挑取典型菌落接种于新鲜营养肉汤培养基中, 37℃培养16~18 h。用灭菌纯化水稀释培养液, 使菌种浓度达1×105~1×109cfu/m L, 保存, 备用。
2.3 复方中草药制剂敏感性的测定
采用平板打孔法[5]进行药物敏感性试验。用灭菌移液枪吸取菌液25μL于营养琼脂平板上, 并用玻璃刮铲涂布均匀, 菌液干燥后用孔径6 mm的打孔器均匀打孔, 去除孔内琼脂并用少量琼脂封闭孔底。将复方中草药水提液加入孔中, 以满而不溢为宜, 置于4℃冰箱中1 h后取出, 于37℃恒温箱中培养24 h, 测量抑菌圈直径, 每种药重复3次。判断抑菌效果, 以无抑菌圈为不敏感, 抑菌圈直径小于10 mm为低敏, 10~15 mm为中度敏感, 大于15 mm为高度敏感[6]。
2.4 中草药复方制剂最小抑菌浓度的测定
采用2倍稀释法测定各组复方中草药制剂对猪大肠杆菌的体外最小抑菌浓度 (MIC) 。以复方1水提液为例, 其他操作相同。按无菌操作规程取6个灭菌的试管, 编号, 用移液枪分别加入2 m L营养肉汤培养基, 第1管中加入浓度为1 g/m L的灭菌复方1水提液2 m L, 混匀后吸取2 m L加至第2管中, 依次类推, 直至第5管, 第5管中吸取2 m L混合液弃去, 使之成为1︰2、1︰4、1︰8、1︰16、1︰32的5个浓度梯度, 第6管做阴性对照。然后向各试管中加入25μL的菌液, 混合均匀。置于37℃恒温培养箱培养18~24 h, 观察试管中细菌生长状况, 以浑浊度为指标检测瓶中有无细菌生长。因药物颜色的影响, 无法用肉眼准确观察判断药物的最小抑菌浓度, 需结合平板接种进行判断。将25μL各浓度混合液加入到营养琼脂平板培养皿上, 用玻璃刮铲涂匀, 置于37℃恒温培养箱中培养18~24 h后, 观察并记录各培养皿琼脂平板上的菌落生长状况, 以无菌生长的最低稀释浓度为复方中草药最小抑菌浓度。
3 结果与分析
3.1 复方中草药制剂敏感性测定
在复方中草药制剂浓度为1 g/m L时, 中草药复方3、复方7对猪大肠杆菌呈高度敏感, 抑菌圈直径分别为16 mm和25 mm;复方6呈中度敏感, 抑菌圈直径为13 mm;复方1为低敏, 抑菌圈直径为7 mm;其他复方中草药制剂对猪大肠杆菌不敏感。
3.2 复方中草药制剂最小抑菌浓度测定
注:“-”表示无菌生长;“+”表示有菌生长, 随“+”数增加菌落长势增强。
结果见表1。
由表1可见, 复方3、复方7水提液对猪大肠杆菌体外抑菌效果较好, 最小抑菌浓度为250 mg/m L;复方1、复方6、复方8水提液对猪大肠杆菌抑菌效果次之, 最小抑菌浓度为500 mg/m L;复方5水提液有一定抑菌作用, 其菌落数随药物浓度升高呈降低趋势;复方2、复方4无抑菌作用。
4 讨论与结论
本试验结果表明, 8组复方中草药水提液对临床病猪分离的猪大肠杆菌敏感性及抑菌作用效果不同, 复方3、复方7水提液对猪大肠杆菌体外抑菌效果较好, 复方1、复方6、复方8水提液对猪大肠杆菌抑菌效果次之;复方5水提液抑菌作用效果较差;复方2、复方4无抑菌作用。组方中某些单味中草药单独体外抑菌作用效果较好, 组成复方后效果不明显, 如五倍子水提液单独作用时对猪大肠杆菌体外抑菌效果较好[7], 组方后 (复方5) 抑菌作用不明显;大黄单独作用时对猪大肠杆菌效果不明显[7], 组方后 (复方3) 抑菌效果较好。复方中草药抑菌作用效果与单味中草药抑菌效果存在较大差异, 主要原因是:1) 由于复方中草药成分复杂多样, 组成复方后可能存在药物的协同作用或拮抗作用;2) 因不同中草药有效活性成分提取方法不同, 试验所选用的8组复方均采用混合后水煎法制备水提液, 可能会降低某些成分提取, 影响药物体外抑菌作用效果;3) 高压灭菌、复方制剂的浓度和纯度等其他因素, 对体外抑菌作用效果也可产生一定的影响, 而且复方中草药成分多样, 抑菌机制复杂, 影响因素较多, 有待深入研究。复方中草药体外抑菌作用好的组方在临床应用时由于环境不同, 机体生理机能状况等因素, 使中草药体内外的抑菌效果并不完全一致[8]。因此, 还要进行动物试验将体外抑菌试验效果与机体内部作用结合, 才能为复方中草药制剂的研制开发提供更有力的依据。
中药组方配伍是中医药研究的重点与难点之一, 也是中医辨证论治理论精髓的具体体现[9]。在兽医临床上应用复方中草药制剂治疗畜禽疾病更利于健康生态养殖模式。本试验测得的复方中草药对临床分离猪大肠杆菌的体外抑菌作用结果, 对兽医临床用复方中草药治疗猪大肠杆菌引起的感染起到一定参考价值。
参考文献
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体外分离培养 篇7
在微生态产品中,芽孢杆菌和肠球菌是两个主要菌种,它们多以混合形式应用。由于其具有不同的生长特性和作用机制,在这个混合的群体中,它们究竟发生哪些相互作用,是解决这类产品在实际应用的一个关键性问题。目前对两者的研究较少,本试验研究了芽孢杆菌与肠球菌的相互影响及相互作用情况,从而探究它们之间的作用机制,进而为芽孢杆菌制剂的应用机理及推广使用提供理论依据。
1 材料
1.1 菌株
芽孢杆菌(菌株编号为Pab02),四川农业大学微生态实验室保藏菌种;肠球菌(菌株编号为ECW-1),分离自四川农业大学动物营养所肉鸡场健康肉鸡,经鉴定为鸡肠球菌。
1.2 培养基
EC选择性培养基[4],购自成都禹道商贸有限公司;营养肉汤、营养琼脂培养基,购自成都化夏化学试剂有限公司。
1.3 主要仪器
超净工作台(型号为SW-CJ-2PD),苏州安泰空气技术有限公司生产;隔水式恒温培养箱(型号为DHP-9272),购自上海齐欣科学仪器有限公司;水浴振荡器(型号为SHA-C),江苏省金坛市城东久久实验仪器厂生产、离心机(型号为Legend Micro21R),赛默飞世尔科技公司生产;高压蒸气灭菌锅(型号为SYQ-DSX-2808),上海申安医疗器械厂生产;冰箱(型号为HR-215S),海尔集团生产;紫外-可见分光光度计(型号为WFJ7200),尤尼柯(上海)仪器有限公司生产。
2 方法
2.1 肠球菌的分离、鉴定
利用EC选择性培养基从鸡粪便中分离肠球菌,分离、纯化后观察菌落形态,进行染色[5]和生理生化鉴定[6]。
2.2 菌悬液的制备
将芽孢杆菌划线接种至营养琼脂培养基进行活化,取活化的芽孢杆菌和分离得到的肠球菌,分别接种至LB液体培养基中,然后在不同培养条件下(芽孢杆菌为37℃摇床培养,肠球菌为37℃静置培养)培养48 h。
采用平板菌落计数法[7]对芽孢杆菌和肠球菌培养液进行活菌计数,调节两种细菌的菌体浓度,并稀释至等浓度后备用。
2.3 芽孢杆菌和肠球菌的共培养
取2.2中等浓度的两种细菌悬液,试验组按照1∶2、1∶1、2∶1比例将芽孢杆菌和肠球菌混合,对照组为各自的芽孢杆菌和肠球菌。按照2%的接种量接种至LB液体培养基,置37℃条件下静置培养。接种后每4 h取样测定各菌液的OD600值1次[8,9]。试验结束后,采用平板计数法计数各组菌悬液的活菌总数。
2.4 琼脂扩散试验
取芽孢杆菌和肠球菌菌悬液分别涂于营养琼脂培养基上,用打孔器在培养基上打出均匀的孔或用牛津杯代替打孔,然后再取芽孢杆菌和肠球菌的48 h培养液,4 000 r/min离心30 min,取上清液分别注入孔或牛津杯中[10](涂布芽孢杆菌的注入肠球菌上清液,涂布肠球菌的则注入芽孢杆菌上清液),37℃条件下培养36 h,观察结果。
3 结果与分析
3.1 肠球菌的分离纯化、菌落形态及染色特性
经EC选择性培养基分离得到疑似菌落,染色观察初步判定为疑似肠球菌,然后进行纯化得到纯化菌株,编号为ECW-1。在EC选择性培养基上,ECW-1菌株的菌落呈白色,针尖大小,圆形,菌落边缘整齐,表面平滑湿润,半透明。挑起单个菌落进行革兰氏染色观察,结果呈阳性,细胞为卵圆形,常呈单个或二三个成对排列。
3.2 肠球菌ECW-1的生化鉴定
结果见表1。
注:+表示为阳性反应,-表示为阴性反应。
由表1可知,可初步鉴定ECW-1为鸡肠球菌。
3.3 菌悬液的制备
经平板菌落计数法计数,每毫升菌液中含芽孢杆菌1.72×108cfu,肠球菌0.68×108cfu,根据此结果将芽孢杆菌稀释2倍成等浓度备用。
3.4 芽孢杆菌和肠球菌混合培养条件下的生长曲线
结果见287页彩图1。
由287页彩图1可知,芽孢杆菌的生长速度较肠球菌缓慢。在混合培养中,芽孢杆菌与肠球菌的混合培养物的生长速度介于肠球菌和芽孢杆菌之间。虽然混合培养的比例(1∶1,2∶1,1∶2)不同,但混合培养物的生长进入稳定期后,其OD值基本上与肠球菌对照组相近,但均远低于芽孢杆菌对照组的OD值。
从试验结果看,混合培养的生长环境对芽孢杆菌的生长有一定影响(可能与菌种本身的遗传特性、接种量、菌种质量和环境条件有关)[11]。
3.5 芽孢杆菌和肠球菌混合培养的活菌数检测
结果见287页彩图2。
由287页彩图2可知:在混合培养物中,肠球菌的数量均高于其他菌的数量,其中以芽孢杆菌和肠球菌比例为2∶1时最大;而芽孢杆菌的数量均远低于对照组。
提示在混合培养中存在两种菌的相互作用,最初芽孢杆菌的数量多于肠球菌的数量而先行生长,在其生长过程中为肠球菌提供营养物质,激发了肠球菌的生长,使其生长速度加快,随着肠球菌数量的增加转而抑制了芽孢杆菌的生长。
3.6 琼脂扩散试验
结果见图3。
由图3可知,在肠球菌的培养液中含有抑制芽孢杆菌生长的物质,在加入肠球菌培养液的牛津杯周围有明显的抑菌圈(图3B);而在芽孢杆菌的培养液中有促进肠球菌生长的物质,在其琼脂孔周围呈现肠球菌旺盛生长的现象(图3A)。
3.7 琼脂扩散试验琼脂孔周围菌群的生化鉴定
结果见表2。
注:+表示为阳性反应,-表示为阴性反应。
由表2可知,可鉴定为鸡肠球菌。
4 讨论
从试验结果看,芽孢杆菌与肠球菌之间可能存在两种相互作用,一种是芽孢杆菌最初的数量远多于肠球菌而先行生长繁殖。由于芽孢杆菌为好氧菌,其生长过程中消耗了环境中的氧,从而为兼性厌氧的肠球菌生长创造了有利环境,与此同时芽孢杆菌在生长过程中为肠球菌提供营养物质,使其迅速生长繁殖。随着肠球菌数量的增加,鸡源肠球菌在生长过程中产生的代谢产物(如乳酸等)及一些次生代谢产物(如细菌素、胞外多糖EPS等)抑制了芽孢杆菌的生长繁殖[12]。
这两种菌之间的相互作用提示我们,微生态制剂在肠道紊乱调节中发挥着重要作用,而引起消化道功能紊乱的因素十分复杂,且相互影响,因此恢复其功能的措施也各不相同[12]。微生态制剂调节肠道紊乱的作用机理包括:一方面补充肠道的正常菌群或促进有益菌的增殖;另一方面有益菌群对病原菌有明显的生物颉颃作用,此外还可提高机体适应外界环境的能力。在本试验中,鸡源肠球菌对芽孢杆菌就具有明显的颉颃作用,这提示在应用此菌改善动物肠道功能方面要考虑到这种关系。
由上述结果可看出,芽孢杆菌可促进肠球菌的生长繁殖,通过此项研究可以为芽孢杆菌制剂的应用机理及推广使用提供理论依据,同时也可指导生产实践中一些畜禽肠道类疾病的诊断与治疗,为改善肠道功能提供一定的参考依据。
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