体外抑菌试验(共8篇)
体外抑菌试验 篇1
抗生素作为饲料添加剂之一对畜禽疾病的防治有显著作用, 但是由于饲用抗生素的普及甚至滥用, 其在畜禽产品的残留直接危害了人类健康及生态环境的安全。益生素具有调节和促进肠道菌群平衡、抑制有害细菌、增强机体免疫力及提高饲料转化率等功能[1,2], 可在一定程度上起到替代抗生素的作用, 已日益受到业界人士的关注。乳酸菌可以产生有机酸、细菌素、过氧化氢、双乙酰等多种天然抑菌物质, 是一类具有益生素开发前景的微生物。植物乳杆菌ZR09 (Lactobacillus plantarum, ZR09) 是从发酵蔬菜汁中筛选到的一株乳酸菌。本文主要展开其体外抑菌试验, 包括抗菌谱和抑菌活性测定, 并对其抑菌机理进行了初步探讨, 以期为植物乳酸菌类益生素的开发应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 菌株和培养基
植物乳杆菌ZR09和检测菌均由浙江省农科院植物保护与微生物研究所保存。培养基:脱脂乳培养基、MRS和普通肉汤培养基。
1.2 检测菌种子液的制备
将斜面保存的检测菌分别接种于肉汤培养基中, 37℃培养18~24h, 使菌体浓度达到108CFU/m L左右, 作为种子菌液备用。
1.3 植物乳杆菌的活化
用接种环转接冻干管中的植物乳杆菌ZR09至灭菌脱脂乳培养基中, 37℃培养5~7h至凝固, 反复活化3~4代。将活化的菌株转至MRS液体培养基中, 37℃培养16~18h。
1.4 植物乳杆菌发酵上清液的制备
将菌体浓度约为3.5×107CFU/m L的ZR09在无菌条件下按1%接种到MRS液体培养液中, 37℃培养48h, 8000r/min离心10min。取上清液, 经细菌过滤器 (滤膜直径为0.22μm) 过滤除菌, 收集滤液即为无菌发酵上清液, 4℃下保存备用。
1.5 抗菌谱的测定
将检测菌液 (菌数约为107cfu/m L) 0.1m L分别均匀涂在肉汤固体平板上, 自然干燥30 min后, 将牛津杯 (内径为6mm) 均匀放置在平板上, 吸取0.1m LZR09发酵上清液于杯中, 37℃培养24~48h, 测量抑菌圈直径。各重复3次, 取平均值。在牛津杯中添加MRS液体培养基0.1m L作为对照。
1.6 抑菌活性的测定
在30m L肉汤培养液中按1%的接种量接入检测菌种子液, 加入ZR09发酵上清液1m L, 对照试管中加入MRS液体培养基1m L。37℃、200r/min振荡培养, 8h后取少量菌液测定其OD600, 按公式计算抑菌率。
1.7 抑菌机理初探
在30m L肉汤培养液中按1%的接种量接入金黄色葡萄球菌种子液, 37℃、200r/min振荡培养8h, 加入ZR09发酵上清液1m L, 对照试管中加入MRS液体培养基1m L。30min后各取对照组和试验组中的少量菌体于JEM-1400透射电子显微镜下观察菌体内部结构。
2 结果与分析
2.1 抗菌谱测定结果
植物乳杆菌ZR09对各类细菌的抑制作用见表1。由此可知, ZR09对沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌的抑制作用最强, 对变形杆菌、铜绿假单孢杆菌和鲍曼不动杆菌的作用次之, 对蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌无抑制作用。
注:十十十十表示抑菌圈直径在30mm以上, 十十十表示抑菌圈直径在25~30mm之间, ++表示抑菌圈直径在15~20mm之间, 十表示抑菌圈直径在10~15mm之间, 一表示无抑菌活性。
2.2 抑菌活性测定结果
在细菌培养液中加入3.2%的ZR09的发酵上清液, 培养8h。结果表明, ZR09对沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和藤黄八叠球菌的生长具有很强的抑制作用, 抑菌率均达90%以上, 对变形杆菌和铜绿假单孢杆菌的抑菌率稍差, 为80%左右, 对鲍曼不动杆菌的抑菌率为70.2%。
2.3 抑菌机理的研究
经ZR09发酵上清液作用30min后的金黄色葡萄球菌在透射电镜下形态结构发生改变, 菌体皱缩、扭曲, 菌体破裂, 胞内物质外流 (图1-1) 。对照组中的金黄色葡萄球菌成圆球状, 表面光滑, 饱满 (图1-2) 。说明植物乳杆菌的抑菌机理极可能是其活性物质通过破坏细菌细胞壁膜, 从而导致胞内物质外泄, 引起细菌死亡。
3 小结
植物乳杆菌ZR09的抑菌活性测定结果表明其对多种致病菌包括沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌率均大于90%, 对变形杆菌、铜绿假单孢杆菌的抑菌为80%左右, 具有良好的益生素开发前景。透射电镜结果表明经ZR09发酵上清液能使金黄色葡萄球菌菌体皱缩、扭曲, 菌体破裂, 胞内物质外流, 初步推断其抑菌机理是通过产生的活性物质破坏靶标细菌细胞壁膜, 导致胞内物质外泄, 从而引起细菌死亡, 至于其杀死细菌的具体作用机制及对其他细菌的作用是否有所差异, 还有待于进一步的研究。
参考文献
[1]杨雪海, 赵娜, 魏金涛, 李绍章.植物乳杆菌对致病性大肠杆菌的抑制效果研究[J].饲料研究, 2011 (1) :27-28.
[2]Shah NP.Functional cultures and health benefits[J].International Dairy Journal, 2007, 17 (11) :1262-1277
体外抑菌试验 篇2
【摘要】 目的:探索两面针药材的体外抑菌作用。方法:采用纸片琼脂扩散法,观察两面针药材提取物对临床常见感染病菌的抑制作用。结果:两面针提取物对9种临床常见感染细菌(金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、伤寒沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌、肺炎链球菌)均有不同程度的体外抑制作用。结论:两面针药材提取物在体外对9种临床常见感染细菌有抑制作用。
【关键词】 两面针;琼脂扩散法;体外抑菌作用
【Abstract】:Objective To study on the antibscterial action of extracts of Zanthoxylum nitidum(Roxb.)DC.in vitro.Methods To observe the antibscterial action of extracts of Zanthoxylum nitidum(Roxb.)DC.On common clinical bacterials with disc agar diffusion method.Results The extracts of Zanthoxylum nitidum(Roxb.)DC.showed strong inhibitory effects on common clinical pathogens such as Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus aeruginosus, Bacillus subtilis ,Salmonella typhi,, Klebsiella pneumoniae and Hemolytic streptococcuses.Conclusion The extracts of Zanthoxylum nitidum(Roxb.)DC.has strong inhibition on bacteria in vistro.The results provide a basis for clinical application of Zanthoxylum nitidum(Roxb.)DC.
【Key words】:Zanthoxylum nitidum(Roxb.)DC.; disc agar diffusion method;bacteriostatic action in vitro.
【中图分类号】R28 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949(2015)02-0099-01
基金项目:国家自然科学基金项目“两面针生物活性与化学特征相关指纹图谱的研究”(30760302);广西壮族自治区科技厅自然科学基金项目(0832127)
兩面针是广西特色药材之一,其植物来源为芸香科植物两面针 Zanthoxylum nitidum(Roxb.)DC.的根,广泛应用于中医处方、中成药及精细化工产品中,具有驱风化湿、消肿止痛、行气之功效[1,2]。现代药理研究表明两面针具有良好的抑菌、抗炎、镇痛、抗肿瘤、抗氧化等作用[3~5]。为阐明两面针的抗炎抑菌作用,本文采集广西南宁,崇左,百色,玉林,钦州等22个产地的两面针药材,对两面针药材提取物的体外抑菌作用进行了较为系统的研究。
1 材料和方法
主要仪器和试剂:M-H琼脂[6] ,购自北京陆桥技术有限责任公司;氯化钠,二甲基亚砜(DMSO)等有机试剂均为国产分析纯;无菌绵羊全血,广西医科大学实验动物中心提供。实验菌种均购自中国药品生物制品检验所。两面针药材,采自广西崇左等22个产地。
1.1样品配置
取药材,洗净泥沙,切薄片,阴干,粉碎,过40目筛,称取药粉6g,加氯仿40mL回流提取,滤过,回收氯仿,残渣用乙醇定容到10mL量瓶中。
提取物用直径为 0.22μm 的微孔滤膜过滤除菌,选用新华层析滤纸,用打孔机制成直径6mm圆片。高压灭菌烘干后,加药液浸泡过夜,置恒温箱中烘干,4℃ 保存[6]。
1.2 直接菌落法制备菌悬液:取各菌37℃18~24h 纯培养物,用无菌生理盐水校正到浓度相当于0.5麦氏标准比浊标准,无菌生理盐水1∶10稀释备用。
1.3 体外抑菌研究
采用纸片琼脂扩散法进行抑菌试验。用无菌棉签将菌液分别均匀涂布于M-H琼脂平板表面,含药虑纸片紧贴于琼脂表面,接种好的平皿置室温待菌液被琼脂吸收后把琼脂平皿倒置放入35℃±2℃培养箱孵育16~20h(链球菌20~24 h)观察结果。每个药物抑菌试验重复3次,抑菌结果为3次试验平均值。抑制菌指数判断:如抑菌圈直径等于6mm,说明对该菌种无抑制作用;抑菌圈直径越大,抑菌作用越强。
2 结果;
3 讨论;
所选广西各产地两面针药材提取物对9种细菌均有不同程度的抑制作用,对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、伤寒沙门氏菌、 肺炎克雷伯氏菌抑制作用较强,而对大肠埃希氏菌 和链球菌的抑制作用较差,对铜绿假单胞菌抑制作用最弱。综合比较22个产地中,广西崇左和玉林产的两面针药材抑菌活性较高。但各产地药材对9种细菌的抑菌活性强度不尽相同。两面针药材抑菌作用的活性成分和体内试验有待进一步研究。
参考文献
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典一部.北京:化学工业出版社,2005,116~117.
[2] 中华本草.1999年版四部,1999:3821.
[3] 刘华钢,黄秋洁,赖茂祥.中药两面针的研究概况. 时珍国医国药. 2007,18(1):222~223.
[4] 姚荣成,胡疆.两面针化学成分及其药理活性研究概况. 药学实践杂志.2004,22(5):264~267.
[5] 秦三海,刘华钢,王博龙,等.氯化两面针碱体外诱导肺癌SPC-A-1、舌癌Tca8113两种肿瘤细胞株凋亡的研究.中国药理学通报.2007,23(2): 279~280.
体外抑菌试验 篇3
1 试验材料
试验药物:自制复方中草药“乳痈散”, 由聊城大学农学院预防兽医实验室自制的方剂, 主要成分有蒲公英、金银花、连翘、紫花地丁、木通、路路通、漏芦、通草等。
试验菌种:聊城大学农学院预防兽医实验室保存, 3种菌株分别为大肠杆菌 (YG0805062株) 、葡萄球菌 (LQ0809108株) 、链球菌 (LQ0902037株) , 均来自聊城及周围地区奶牛场。
试剂及培养基:5%绵羊鲜血琼脂培养基、血清肉汤培养基按常规方法配制。
仪器:离心机、高压蒸汽灭菌器、无菌工作台、天平、平皿、三角瓶等。
2 试验方法
2.1 中草药水提取物的制备
按复方“乳痈散”组方准确称取每味中草药, 常规加水浸泡2 h, 水煎2次, 每次开锅20 min, 合并两次滤液, 离心、过滤、浓缩至每毫升药液含药量1 g。调节p H值至7.4, 分装、高压灭菌, -20℃保存待用。
2.2 抑菌试验
培养基准备:按照常规方法制备5%绵羊鲜血琼脂培养基、血清肉汤培养基, 放置冰箱待用。
细菌复壮:将试验的3种菌株分别接种到5%绵羊鲜血琼脂培养基上, 培养24 h, 复壮;然后将复壮后的3种菌株再分别接种到血清肉汤培养基中, 37℃振荡培养24 h。
菌种接种及加药:用“L”型玻璃棒在无菌工作台内将上述血清肉汤培养菌液分别均匀涂布于5%绵羊鲜血琼脂培养基表面, 每个菌株做3个重复培养基, 再用直径8 mm的打孔器在每个血琼脂培养基上打分布均匀的4个孔, 并在酒精灯上稍微烘烤封底。然后将药液分别加入其中3孔, 每孔加50μL, 另一孔加等量的无菌血清肉汤作为阴性对照。然后将平板置于37℃恒温培养箱内培养24 h。
观察并记录:培养24 h后, 将培养平皿从恒温箱内取出, 分别用游标卡尺测量抑菌直径 (mm) , 每孔按不同方向测量2次, 最终每个菌株取3个平板共9孔18次测量结果的平均值。
结果判定标准:抑菌圈直径 (d) ≥20 mm为极敏, 20>d≥15 mm为高敏, 15>d≥10 mm为中敏, 10>d>6 mm为低敏, d≤6 mm为无抑菌效果。
3 结果
3.1 乳痈散的抑菌效果 (见表1)
mm
如表1所示, 乳痈散对大肠杆菌、链球菌高敏, 葡萄球菌中敏, 体外抑菌效果较好。
3.2 阴性对照结果
9个试验平板中的9孔的抑菌圈为零, 没有抑菌作用, 孔周围都生长有一层菌苔。
4 小结
体外抑菌试验 篇4
1 材料和方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验菌株
试验菌株种类,见表1。
1.1.2 供试药物
复方恩诺沙星可溶性粉,山西奥福莱动物药业有限公司,生产批号040502,200g,恩诺沙星12g,乙酰甲喹20g。
1.1.3 培养基
MH琼脂培养基,MH肉汤培养基,鲜血MH琼脂培养基,血清MH肉汤培养基。
1.1.4 试验仪器
定性试纸,试管,培养皿,打孔器,镊子,无菌棉,酒精灯,温箱。均由本试验室提供。
1.2 试验方法
1.2.1 药敏纸片制备
取新华1号定性滤纸,用打孔机打成6.25mm直径的圆形小纸片。取圆纸片100片放入清洁干燥的青霉素空瓶中,瓶口以单层牛皮纸包扎。经15磅15~20min高压灭菌后,放在37℃温箱或烘箱中1~2d,使完全干燥。在上述含有100片纸片的青霉素瓶内加入药液0.7ml,并翻动纸片,使各纸片充分浸透药液,翻动纸片时不能将纸片捣烂。放37℃温箱内干燥后即加盖密封,切勿受潮,置阴暗干燥处存放备用[4,5,6]。
1.2.2 试验菌液制备
从培养了16~24h的斜面上挑取菌落于灭菌生理盐水中,并将其悬液浊度调至0.5号麦氏标准管,直接用此盐水悬液作为接种物,菌量约1×108cfu/ml[7,8,9]。
1.2.3 供试药液配制
精确称取1g药物先加入0.1mol/L的Na OH溶液10ml,再加入p H7.2的PBS液32ml,混匀[10]。
1.2.4 K-B纸片法
用无菌棉拭子蘸取调好的菌液,并在管壁上拧压除去多余菌液后置于培养基平板表面反复推涂,以保证细菌在平板表面均匀分布,盖上平皿盖在室温干燥3~5min,用无菌镊子或纸片分配器放置药敏纸片,各纸片中心距不小于24mm,纸片据平板内缘应大于15mm。贴完纸片后,在15min内将平板反转过来,置于温箱中,培养24h后观察结果[11]。
1.2.5 试管倍比稀释法
药物的浓度按倍比稀释来建立,试验要在无菌条件下于适宜的玻璃试管中进行。试验中取10支试管排成一列,在第1管中加入1ml药液和1ml灭菌肉汤。第2~10管均加入1ml灭菌肉汤。第1管混匀后取1ml的量加入到第2管中,混匀后从第2管中取1ml的量加入到第3管中,依次类推到第10管,混匀后取1ml的量弃掉。另取两管分别加入1ml灭菌肉汤和而不加药物,其中一管作为细菌生长情况对照,另一管作为空白对照。将2.2.2中制备好的试验菌液加入到第1~11管中,每管加入量为0.1ml,35℃培养16~24h后肉眼观察,呈明显不混浊的试管所含最小的药物浓度为最小抑菌浓度(MIC);继续培养至48h,肉眼观察呈不混浊的试管所含最小的药物浓度为最小杀菌浓度(MBC)[12,13]。
2 试验结果
K-B纸片法试验结果,见表2。最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)试验结果,见表3。
3 讨论
3.1 影响药敏试验结果的因素
药敏试验结果易受抗菌药物纸片含药量、培养基、接种细菌菌量、培养时间等因素的影响。
抗菌药物纸片含药量是影响抑菌圈大小的主要因素,而纸片含药量又与纸片的重量、吸水性、直径等有关,首先制备药敏纸片应选则合格纸片,要求所用滤纸的吸水性好,均匀,不含无关的化学物质和色素等,直径为6.25 mm,制备药敏纸片时药物应称量准确,药液应摇匀,浸泡应充分,制备好的纸片应妥善保存,保存条件以低温干燥为佳,最好保存于-20℃,以防药力降低。药敏纸片制备后立即用标准敏感菌株作敏感试验,并记录其抑菌圈直径,每次用前应复查1次。
药敏试验强调使用专门培养基MHA,但考虑到本试验所用的试验菌株均来自发病畜禽体内分离的病原菌(购自中监所),为了能够使多种细菌都能生长发育良好,有些细菌如沙门氏菌、巴氏杆菌和链球菌等特选用了鲜血MH琼脂培养基,血清MH肉汤培养基。制备K–B法培养基厚度应为4mm,平皿用直径90mm的较好。据报道,做药敏试验的培养基厚度相差2mm,抑菌圈直径最大也会相差2mm,为了防止因培养基厚度而造成的试验误差,应严格控制每个琼脂平板的厚度,用直径为90mm的平皿倾注约15m1普通营养琼脂液体,保证琼脂厚度为4mm。
接种菌量应稀释到浓度为0.5麦氏比浊管,相当于1×108cfu/ml,若菌稀释倍数偏高,菌液浓度偏低,导致接种菌量太少,虽然菌性不变,但抑菌圈直径常增大,易将耐药药物误判为敏感药物,相反,若菌料稀释倍数偏低,菌液浓度偏高,导致接种菌量太多,抑菌圈直径常变小,有可能将敏感药物误判为耐药药物。
细菌培养时间。细菌培养时间过长,细菌能恢复生长,使抑菌圈变小,培养时间过短,抑菌圈还未最终形成,这都可能影响药敏试验结果的判定,有可能将敏感药物与耐药药物混淆,因此测定了细菌培养时间,分别制定了不同病原菌观察结果最佳时间。
总之,在试验操作的各个环节中都应严格按照试验要求进行,尽可能地避免系统误差,减小随机误差,以提高试验数据的可信度。
3.2 结果分析
药敏试验的目的是对抗生素临床治疗效果进行预测,查出耐药性,减少治疗错误,同时可以根据敏感、中介、耐药的提示结合MIC可以方便地制定用药方案。药敏试验时,正确选择病原菌显得更为重要,本试验所用的试验菌株均来自发病畜禽体内分离的病原菌,可以有效反映复方恩诺沙星可溶性粉的抗菌谱,结果表明其对来源于鸡及猪的病原性大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄菌、鸡巴氏杆菌、猪巴氏杆菌、病原性链球菌均敏感,对鸡沙门氏菌不敏感,复方恩诺沙星可溶性粉对畜禽主要致病菌的最小抑菌浓度(MIC)为0.0279~3.575μg/ml,最小杀菌浓度为(MBC)为0.055~7.11μg/ml。
药敏试验是一种体外试验,细菌在体外对抗生素耐药,在体内也会耐药,而在体外敏感的体内就不一定敏感,所以耐药是药敏试验的正结果。因此,在预侧体内结果时,耐药的结果可以确信,而敏感的应保持怀疑。虽然药敏试验是药物在体外的抑菌试验,结果能否完全代表药物在动物体内的动力学代谢过程及药物在动物体内的抑菌效果有待进一步研究,但可以从侧面提供用药的依据,指导生产及时准确地控制细菌性疾病。
有条件的养殖场最好开展细菌耐药性监测。用药物之前最好先做药敏试验。用药要科学合理,剂量要足,疗程要够,防止药物浓度达不到杀菌浓度而使细菌产生耐药性。尽量减少预防性投药,不滥投药,尽量交换用药,并注意联合用药,防止交叉耐药性的产生。搞好消毒,防止耐药菌株的扩散。
4结论
复方恩诺沙星可溶性粉对大肠杆菌1555、大肠杆菌216、大肠杆菌1515、绿脓杆菌2087、金黄色葡萄菌547、鸡巴氏杆菌458、猪巴氏杆菌437、链球菌608敏感,对沙门氏菌cvcc533不敏感。
复方恩诺沙星可溶性粉对畜禽主要致病菌的最小抑菌浓度(MIC)为0.0279~3.575μg/ml,最小杀菌浓度为(MBC)为0.055~7.11μg/ml。
参考文献
[1]熊焰,李德生,张和民,等,中国兽医科技[J].1999,29(3):35-36.
[2]刘运德,楼永良.微生物学检验[M].人民卫生出版社,2003.
[3]曹澎泽.兽医微生物学及免疫学技术[M].北京农业大学出版社,1992.
[4]石岩,梅世昌.医学动物试验实用手册[M].中国农业出版社,2002.
[5]任家琰,马海利.动物病原微生物[M].中国农业出版社,2001.
[6]叶顺章,张有才.现代性传播疾病实验诊断技术[M].广东科技出版社,1999.
[7]戴自英.实用抗菌药物学[M].上海科学技术出版社,1992.
[8]王秀茹.预防医学微生物及检验技术[M].人民卫生出版社,2002.
[9]周庭银,赵虎.临床微生物学诊断与图解[M].上海科学技术出版社,2001.
体外抑菌试验 篇5
1 材料
1.1 试验菌种
大肠杆菌K88, 购自中国兽医药品监察所。
1.2 试验药材
黄芩、黄连、黄柏、鱼腥草、穿心莲、五味子、连翘、艾草, 均由北京农业职业学院中兽医实验室提供。
1.3 主要试剂
营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、麦康凯琼脂培养基, 均购自北京奥博星生物技术责任有限公司。
1.4 主要仪器
生化培养箱 (型号为LRH-150) , 购自上海一恒科技有限公司;高压蒸气灭菌器 (型号为Q-LS-18S) , 购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂;超净工作台 (型号为VS-1300L) , 购自苏净安泰空气技术有限公司;电子天平 (型号为SL502N) , 购自上海羽通仪器仪表厂。
2 方法
2.1 供试中药的处理
称取已过200目筛的中药50 g, 置于烧杯中, 添加200 m L蒸馏水, 浸泡30 min, 然后煎煮至沸腾, 煮沸后文火煎煮30 min, 用4层纱布过滤药液。取药渣加100 m L蒸馏水, 煮沸后再文火煎煮30 min, 过滤药液。合并两次药液, 用文火浓缩至50 m L, 使其终浓度至1 g/m L, 2 500 r/min离心15 min, 取上清液, 121℃灭菌15 min, 放入4℃冰箱, 备用。
2.2 试验菌的制备
将标准菌接种于新鲜肉汤培养基中, 置37℃恒温培养箱中培养16~18 h。将试验菌肉汤培养物稀释1 000倍后置4℃冰箱中保存, 备用。
2.3 琼脂平板打孔法
先制备营养琼脂平板, 用移液器吸取0.1 m L菌液加入平皿中, 然后用涂布器将菌液均匀涂布在营养琼脂平板上;再用直径为0.6 cm的打孔器在营养琼脂平板上等距离打6个孔, 孔径大小、深度保持均匀;将打好的孔在酒精灯火焰上略微加热, 让底部的培养基稍微熔化后重新凝固封孔, 以防止加入的药液从底部漏出, 影响试验结果。将供试药液0.2 m L加于孔中, 每种药液做3个重复平皿;置于4℃冰箱中作用1 h后, 再在37℃恒温箱中培养24 h, 观察结果, 测量抑菌圈的直径, 求出每种药液3个平皿抑菌圈直径的平均值。结果判定标准:抑菌圈直径小于10 mm为耐药 (–) , 10~15 mm为中度敏感 (+) , 15 mm以上为高度敏感 (++) [1]。
2.4 牛津杯法
在制备好的营养琼脂平板上加入0.1m L菌液, 用涂布器将菌液涂布均匀;在培养基表面均匀垂直摆放4个牛津杯, 轻轻加压, 使其与培养基接触无空隙;在杯中加入不同药液, 每种药液做3个重复平皿;置于4℃冰箱中作用1 h后, 再在37℃恒温箱中培养24 h, 观察结果。以牛津杯周围没有肉眼可见细菌生长区域为抑菌圈, 用游标卡尺测量抑菌圈的直径, 求出每种药液3个平皿抑菌圈直径的平均值。根据抑菌圈直径的平均值判断中药对细菌的敏感性, 抑菌圈直径小于10 mm为耐药 (R) , 10~15 mm为中度敏感 (I) , 15 mm以上为高度敏感 (S) 。
2.5 试管两倍稀释法测定最小抑菌浓度 (MIC)
每种中药取11支15 mm×150 mm的灭菌试管, 置于试管架上, 每个试管中加入2.0 m L无菌肉汤培养基, 然后取中药2.0 m L加入1号试管中, 用移液器吹吸混匀后取出2.0 m L加入2号试管中, 依次倍比稀释到9号试管, 9号试管的中药和培养基混匀后取出2.0 m L弃去。中药的稀释度依次为1∶2, 1∶4, 1∶8, 1∶16, 1∶32, 1∶64, 1∶128, 1∶256, 1∶512, 10号试管作为不加药物的培养基对照, 以便观察培养基是否适合于细菌生长, 11号试管加中药2.0 m L, 混匀后取出2.0 m L弃去, 不接种细菌, 以便观察中药是否被污染。取0.1 m L菌液分别加入上述1~10号管中, 混匀后11支试管一起放入37℃生化培养箱中培养24 h后观察结果。若试管中肉汤培养基混浊, 表明有细菌生长;若试管中肉汤培养基完全清亮, 表明无细菌生长。将无细菌生长试管中的液体接种到麦康凯琼脂平板上, 在37℃恒温箱中培养24 h仍无细菌生长, 表示该试管中药的浓度就是该中药的MIC。
3 结果与分析
3.1 药物敏感性测定结果
3.1.1 琼脂平板打孔法
注:-表示耐药, +表示中度敏感, ++表示高度敏感。
结果见表1。
从表1结果可见, 黄芩、黄柏、穿心莲对大肠杆菌基本无抑菌效果, 连翘的抑菌效果较低, 黄连、鱼腥草、五味子、艾草对大肠杆菌的抑菌效果为高度敏感, 其中五味子和艾草的抑菌圈达到20 mm, 对大肠杆菌的抑菌效果最好。
3.1.2 牛津杯法结果见表2。
从表2结果可见, 牛津杯法和琼脂平板打孔法的结果基本一致, 黄柏、穿心莲对大肠杆菌基本无抑菌效果, 黄芩、连翘抑菌效果较低, 黄连、鱼腥草、五味子、艾草对大肠杆菌的抑菌效果为高度敏感, 其中艾草的抑菌圈直径达到20 mm, 对大肠杆菌的抑菌效果最好。
注:R表示耐药, I表示中度敏感, S表示高度敏感。
3.2 药物MIC测定结果
8种中草药对大肠杆菌的体外MIC测定结果见表3。
注:-表示无细菌生长, +表示有菌生长, 随+数增加表示浑浊度越高, 细菌生长越多。
从表3可见, 五味子和艾草对大肠杆菌的抑菌效果较好, MIC为62.5 mg/m L;黄连和鱼腥草对大肠杆菌的抑菌效果次之, MIC为125 mg/m L, 黄芩、黄柏、穿心莲、连翘对大肠杆菌基本无抑菌效果, 但液体的混浊度随药物浓度的增加有减少趋势。
4讨论
大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的传染病, 主要危害猪、家禽和兔等, 流行范围广, 全年发病, 发病率和死亡率高, 同时血清型较多, 免疫效果不明显。养殖场一旦发生大肠杆菌病就很难根除, 仔猪和雏鸡即使耐过, 也会因生长缓慢, 饲料报酬低, 给养殖业造成巨大的经济损失。目前防治大肠杆菌病主要用抗生素, 但抗生素的过量使用会破坏肠道的先天免疫力, 引起菌群失调症, 形成耐药菌株, 导致疾病的非典型化和混合感染, 从而加大防治的难度。残留在畜产品中的抗生素直接或间接地危害人类身体健康, 导致耐药性的增加。超量的抗生素排入环境, 又会增加环境中耐药菌的产生, 还可严重破坏环境的生态平衡, 已成为新型的环境污染。中草药在我国资源丰富、价格低廉, 相对于抗生素而言含有多种药效成分, 多靶点作用, 毒性较低, 不易产生耐药性, 在防病抗菌的同时, 还能促进动物生长, 增强免疫力, 提高整体抗病能力。因此, 中草药作为替代抗生素, 在解决抗药性和药物残留等方面将越来越受到重视。本试验旨在研究常见的8种中草药对大肠杆菌的体外抑菌作用, 从本试验结果可以看出, 黄连、鱼腥草、五味子、艾草对大肠杆菌的抑菌效果为高度敏感, 五味子和艾草的MIC为62.5 mg/m L, 黄连和鱼腥草的MIC为125 mg/m L, 大肠杆菌对其他4种中草药均不敏感。说明部分中草药对大肠杆菌具有一定的抗菌作用。因此, 养殖业工作者在加大对抗生素监管的同时应寻找安全、有效、无残留的中草药来解决抗生素的滥用问题。
摘要:为了寻找抗生素的替代品, 试验采用琼脂平板打孔法、牛津杯法和试管两倍稀释法检测了黄芩、黄连、黄柏、鱼腥草、穿心莲、五味子、连翘、艾草8种中草药对大肠杆菌的抑制作用。结果表明:黄连、鱼腥草、五味子、艾草对大肠杆菌的抑菌效果为高度敏感, 五味子和艾草的最小抑菌浓度 (MIC) 为62.5 mg/m L, 黄连和鱼腥草的MIC为125 mg/m L, 大肠杆菌对其他4种中草药均不敏感。说明部分中草药对大肠杆菌具有一定的抗菌作用。
关键词:大肠杆菌,中草药,体外,抑菌试验,最小抑菌浓度
参考文献
体外抑菌试验 篇6
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料来源。
2008年7月, 辽宁省营口市鲅鱼圈开发区某鸡场送检疑似大肠杆菌病死鸡若干只, 死亡时间不超过12 h。
1.1.2 主要试剂及仪器。
伊红美兰琼脂:由北京奥博星生物技术有限责任公司提供;糖发酵试验用各种糖:购自中国医药 (集团) 沈阳有限公司生化试剂分公司;药敏纸片:购自上海伊华医学科技有限公司;普通琼脂、普通肉汤、血液琼脂平板、糖发酵管参照参考文献[2]方法配制。
1.2 方法
1.2.1 细菌分离培养。
在临床中采集具有典型大肠杆菌病理变化的鸡心血、肝, 无菌接种在普通琼脂平板及普通肉汤中, 37℃培养24h, 选取表面光滑、边缘整齐、表面灰白半透明菌落接种在伊红美兰培养基上, 于37℃鉴别培养24h后, 选取典型菌落进行纯培养。取各菌株的纯培养物分别进行生化特性鉴定。
1.2.2 细菌形态学观察。
无菌取病死鸡心血、肝, 涂片, 瑞氏染色、革兰氏染色, 镜检。取在伊红美兰培养基上培养18h的新鲜菌落进行革兰氏染色, 镜检。
1.2.3 生化试验。
糖发酵及生化反应按常规进行。
1.2.4 溶血性试验。
无菌采取绵羊红细胞, 用玻璃珠脱纤, 溶化琼脂培养基, 待琼脂冷却至45℃左右时, 按琼脂的10%加入脱纤血, 轻轻摇晃, 使血液混合均匀, 制成血液琼脂平板。将待检大肠杆菌分别划线接种于血液琼脂平板上, 37℃中培养24 h后, 观察结果。
1.2.5 动物试验。
(1) 菌液制备:细菌接种于普通肉汤中, 37℃培养18 h, 4℃冰箱保存备用。 (2) 致病性:从市场购10日龄AA肉鸡, 饲养1周, 确保健康。随机分为A、B两组, 每组5只, A组为试验组, B组为对照组, A组颈部皮下注射0.2 mL肉汤菌液, B组腹腔接种0.2 mL灭菌生理盐水。隔离饲养、观察。
1.2.6 药敏试验。
将待检菌株的肉汤培养物用无菌生理盐水稀释10倍后, 每个琼脂平板接种0.1 mL, 用曲玻棒均匀涂布后, 将不同的药敏片相隔4.5~5 cm贴在琼脂平板表面, 置37℃培养18 h后, 测定抑菌环的直径, 结果判定依据《纸片法抗菌药物敏感试验操作标准 (第四版) 》。
2 结果
2.1 细菌分离培养
分离株在普通琼脂平板上37℃培养24 h后, 生长良好, 呈中等大小、边缘整齐、表面光滑微凸, 灰白色半透明的菌落。在伊红美兰平板上, 形成中等大小, 边缘整齐, 有金属光泽的黑色菌落。
2.2 细菌形态学观察
病死鸡心血、肝及伊红美兰培养物涂片染色镜检后, 均可见有两端钝圆的革兰氏阴性小杆菌。多数散在, 少数有2~3个相连。
2.3 生化试验结果
糖发酵试验结果显示分离菌均能发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、木糖、果糖、鼠李糖、山梨醇及阿拉伯胶糖, 均不发酵蔗糖、卫矛醇、肌醇。各菌株吲哚试验和M.R试验阳性、VP试验阴性, 根据试验结果判定, 所分离的3株菌均为大肠杆菌。 (见表1)
注:糖发酵试验:⊕表示产酸产气;+表示产酸;-表示不发酵
2.4 溶血性试验
试验结果表明, 在血液琼脂平板上, 所分离的3个菌株菌落周围均形成宽约3 mm透明的溶血环, 判定为β溶血。
2.5 致病性试验
2.5.1 在肉汤中生长特性。
大肠杆菌在肉汤中37℃培养18 h后, 呈现均匀混浊, 管壁与液面有菌膜, 底部有粘性沉淀。
2.5.2 致病性。
A组肉仔鸡1只接种后第3 d死亡, 其余4只第4 d全部死亡, B组肉仔鸡全部健活。剖检死亡鸡发现其肝脏肿大、质脆、有坏死灶, 表面被覆一层黄白色纤维素性渗出物;肺充血淤血, 其中2只鸡肺部有坏死灶;脾脏肿大;十二指肠有出血性肠炎变化;盲肠扁桃体出血肿胀。
采取病死鸡心血、肝、脾接种到普通肉汤及伊红美兰培养基上, 均有细菌生长。该菌培养特性及革兰氏染色特性与接种菌一致, 肉汤培养物作生化试验, 生化特性与接种菌完全相同, 表明此菌与接种细菌为同种细菌。
2.6 药敏试验结果
药敏试验结果判定方法参照《纸片法抗菌药物敏感试验操作标准 (第四版) 》, 表明该菌对复达欣、先锋Ⅵ、菌必治、庆大霉素敏感, 对氧哌嗪青霉素、呋喃妥因、氧氟沙星中度敏感, 而卡那霉素、氟哌酸、链霉素、头孢呋肟、红霉素、氨苄青霉素、环丙沙星对它没有抑制作用。
3 讨论
3.1大肠杆菌是夏季肉鸡生产危害较大的传染病, 从本菌分离鸡场看, 其发病的主要诱因是饲养管理不当, 通风不良, 以及连日阴雨造成的地面潮湿。提示防控本病的关键是加强饲养管理, 日常提供优质全价饲料;严格卫生防疫制度, 在夏季注意防暑, 补充维生素和电解质, 创造良好的饲养条件。
3.2鸡场在发病前, 技术人员曾长期应用环丙沙星、氟哌酸、红霉素等药物作为预防肠道疾病的药物添加在饲料中, 造成分离菌对多种药物的抗药性。因此在用药物治疗大肠杆菌病的时候, 应根据药敏试验结果, 选择敏感药物交替按疗程服用, 以期达到较好的治疗效果[4]。
3.3由于各地优势血清型存在差异, 有效而通用的菌苗尚未出现[5], 在本地区本病的预防仍处于空白阶段。从本试验可以看出, 所分离菌的具有溶血性及较强致病性, 若应用本菌制备大肠杆菌自家苗灭活苗, 用于本场大肠杆菌病的预防, 将会收到较好的预防效果。
参考文献
[1]甘孟侯.禽病学[M].北京:中国农业出版社.1999.167~168.
[2]韩文瑜, 何昭阳, 邓玉斌.病原细菌检验技术[M].长春:吉林科学技术出版社.1992, 41~50, 80.
[3]甘孟侯, 李文刚, 陈洪科.禽病诊断与防治[M].北京:中国农业出版社, 1996, 120.
[4]王双山, 张敬礼, 刘庆昌, 等.肉鸡大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验[J].河南农业科学, 2003 (6) :43245.
体外抑菌试验 篇7
1 材料与方法
1.1 试验材料
病料为疑似猪链球菌感染致死的脾和肝样本。供试试剂:染色液、常规试剂, 由青岛农业大学兽医微生物实验室自制;板蓝根、金银花、黄连、怀菊花、地锦草、马齿苋、仙鹤草, 均购于山东省医药药材公司。试验动物为健康小鼠, 均为22 g左右, 由青岛药品检验检疫局提供。
1.2 试验方法
1.2.1 细菌学检查。
在无菌条件下取病死猪的肝和脾, 用灭菌的接种环插入组织中, 取少量组织或液体涂片, 干燥、火焰固定后进行革兰氏染色后镜检[2]。
1.2.2 生化及生长试验。
将分离出的纯培养菌株接种在血清琼脂培养基上, 37℃培养24 h后, 取鲜血琼脂平板上发生溶血的典型菌落进行各种常规生化试验和鉴别生化试验:分别接种于葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、木糖、山梨醇、菊糖等培养基上观察是否产酸;将分离菌株分别接种在上述培养基中进行生长试验。
1.2.3 动物致病性试验。
健康小鼠10只, 随机分为2组, 每组5只, 其中试验组用分离的24 h肉汤纯培养菌株腹腔注射5只小鼠, 0.5 m L/只;另外一组注射无菌生理盐水作对照, 0.5 m L/只。观察其死亡和发病情况, 并对死亡小鼠进行细菌分离。
1.2.4 中草药体外抑菌试验。
醇提物的制备:将药材分别粉碎, 称取各中药粉末10 g, 以75%乙醇回流提取2次, 每次1.5 h;合并提取液, 挥干溶剂后即为中药醇提物。将醇提物用甲醇溶解, 蒸馏水稀释至含生药1 g/m L, 流通蒸汽灭菌30 min, 置冰箱4℃保存。待测菌制备:将菌种接种于LB培养基上, 37℃培养24 h复壮;再接种于LB培养基, 37℃培养18 h (10个/m L) , 待用。采用试管2倍稀释法, 按文献方法略加改进测定最小抑菌浓度 (MIC) 。
2 结果与分析
2.1 细菌学检查
对病料进行涂片、染色镜检, 可见革兰氏阳性球菌呈成对或短链状排列。血平板上有疑似菌落, 较小, 凸起, 灰白色, 较干燥, 光滑, 边缘整齐, 周围有透明溶血环。挑取鲜血琼脂平板上的典型菌落, 进行革兰氏染色、镜检。可见革兰氏阳性球菌有的单在, 有的呈双球型, 有的呈短链状排列。
2.2 生化及生长试验
分离细菌在37℃下能生长, 在10℃和45℃下均不能生长。分离菌生化试验结果见表1。
注:“+”表示生长, “-”表示不生长。
2.3 动物试验
在接种后36~84 h试验组和对照组呈现不同的症状变化, 其中试验组2只分别于接种48、72 h后死亡, 另外3只表现为食欲减退、精神沉郁, 颌下淋巴结肿胀;剖检革兰氏染色镜检, 发现有大量单个、成对或呈4~6个的短链革兰氏阳性球菌。对照组未见异常现象。
2.4 中草药体外抑菌试验
中草药提取物对猪链球菌的MIC见表2。由表2可知, 黄连醇提物的抗菌活性最强, 仙鹤草、地锦草醇提物抗菌活性较强, 金银花醇提物抗菌活性较弱, 马齿苋、板蓝根、怀菊花效果均不明显。
3 结论与讨论
综合临床诊断、分离菌株的形态染色特性、培养特性、生化特性及动物试验, 确诊本次病原为猪链球菌[3,4,5,6]。中草药的成分复杂, 其抗菌作用可能是单一成分, 也可能是几种成分共同作用的结果。试验仅对7种中草药的醇提物进行了体外链球菌抑菌试验, 其中黄连醇提物的抗菌活性最强, 这些提取物往往是多种成分混合物, 究竟哪种成分抑菌效果最好, 还有待进一步研究。另外, 这几种药物对猪链球菌的体内抑菌效果还有待进一步研究。
摘要:猪链球菌病是猪的一种常见传染病。采集了疑似猪链球菌感染致死猪的脾和肝样本, 对猪链球菌病进行了病原分离、微生物学检查及中草药体外抑菌试验。结果表明, 黄连醇提物的抗菌活性最强;仙鹤草、地锦草醇提物抗菌活性较强;金银花醇提物抗菌活性较弱。
关键词:猪链球菌,分离鉴定,中草药,体外抑菌
参考文献
[1]杨建江, 韩文瑜, 雷连成, 等.猪链球菌耐药性的检测[J].中国兽医科技, 2004, 34 (7) :48-50.
[2]杨霞, 卢中华, 张红英, 等.猪链球菌病病原的生化分群鉴定和药敏试验[J].中国畜牧兽医, 2004, 31 (4) :32-34.
[3]王金合, 郭素琴, 陈益.猪链球菌的分离鉴定及药敏试验[J].郑州牧业工程高等专科学校学报, 2006, 26 (3) :1-2.
[4]白静.猪链球菌病病原分离鉴定及防治研究[J].安徽农业科学, 2007, 35 (7) :1944-1947.
[5]李立虎.猪链球菌病的研究进展[J].畜牧与饲料科学, 2009 (2) :173174.
体外抑菌试验 篇8
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料来源
于牡丹区某猪场发生黄痢仔猪, 用灭菌棉拭子从腹泻仔猪直肠采集粪便10份, 进行细菌的分离鉴定。
1.1.2 主要试剂和培养基
营养琼脂、营养肉汤购自北京奥博星生物技术有限责任公司。伊红美蓝琼脂 (EMB) 、三糖铁培琼脂 (TSI) 、尿素酶琼脂基础, 40%尿素水、MR-VP培养基、硫酸亚铁琼脂、克氏枸橼酸盐培养、吲哚培养基、V-P试剂 (甲乙液) 、Kovacs氏靛基质购自北京路桥技术有限公司, 甲基红试剂自制。
1.1.3 仪器设备
YXOGO2型电热式高压蒸汽灭菌器, 山东新华医疗器械厂, 1989.9;500型恒温培养箱, 山东潍坊医疗器械厂, 1991.5;90947型上皿电子天平, 上海精科公司天平仪器厂, 1999.9;SKM型数显恒温电热套, 山东鄄城光明仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 细菌分离
用棉拭子采集黄痢仔猪的直肠粪便, 混悬于装有灭菌生理盐水的的灭菌离心管中, 靠壁旋动拭子, 挤出液体, 摇动离心管彻底洗涤拭子的粪便于管中。用接种环挑取上述粪便悬液1~3环, 接种于伊红美兰琼脂培养基平板, 置于37℃恒温培养箱24h后观察培养特性。将伊红美兰培养基中的红色菌落, 置于37℃纯培养24h, 观察菌落的生长情况, 取培养基纯培养的单个菌落进行涂片, 革兰氏染色、镜检。
1.2.2 增菌培养
取纯培养细菌接种于营养肉汤中, 42℃培养24h。
1.2.3 生化特性试验
对培养细菌进行糖发酵试验、三糖铁试验、MR试验、VP试验、尿酶试验、枸橼酸盐利用试验、硫化氢生成试验[3]。
1.2.4 中药药敏片的制备
取大黄、白芍、黄连、黄芩、石菖蒲、艾叶、连翘、侧柏叶、夏枯草各100克分别煎煮, 方法如下, 加水过药面, 文火煎煮, 煎煮时间第一次1.5h, 第二次40min, 第三次30min。将3次药液合并后浓缩为100ml (相当于1g/ml生药) [4]。
自制药敏片:制作直径6mm的滤纸片, 高压蒸汽灭菌后烘干, 然后把滤纸片浸于浓缩液中, 每毫升抗菌药液中, 装滤纸片100片, 浸泡1~2h后, 60℃烘干箱烘干, 密封冷藏备用。
1.2.5 药敏试验
从细菌纯培养物上, 选择形态完整的菌落接种于营养肉汤培养基中, 37℃培养24h后肉汤呈混浊状。震荡摇匀, 用灭菌棉拭子蘸取菌液, 均匀接种于普通琼脂平板上, 分别记录、编号[5]。
将镊子于酒精灯火焰上灭菌后略停, 取药敏片贴到平皿培养基表面, 在平皿中央贴一片, 外周可等距离贴4片。用镊子轻按药敏片几秒钟, 使其完全贴于琼脂表面, 置于37℃培养18h后观察结果, 用游标卡尺测量抑菌圈直径。
2 结果
2.1 细菌分离
从病料中分离到的细菌, 在营养肉汤中呈均匀混浊, 管底形成白色沉淀, 液面管壁有菌环。在营养琼脂培养基上形成圆形, 中等大小隆起较湿润的灰白色菌落;在伊红美兰琼脂平板上形成紫黑色带金属光泽的菌落;镜检为中等大小、两端钝圆、多以单个存在的革兰氏阴性杆菌。具有典型大肠杆菌培养特性和形态特征。
2.2 细菌的生化特性
细菌能分解葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇等, 吲哚试验阳性, MR试验阳性, V-P试验性阴性, 尿酶试验阴性, 枸橼酸盐利用试验阴性, 硫化氢生成试验阴性。三糖铁琼脂培养基显示为黄色, 产气。结果符合大肠杆菌特征, 见表1。
2.3 药敏试验
药敏试验结果见表2。根据抑菌环直径的测量结果, 表明中药黄连对仔猪大肠杆菌具有较高敏感度体外抑菌作用;而白芍具有中度敏感抑菌作用;夏枯草、黄芩、艾叶、石菖蒲、连翘大黄极低敏感抑菌作用。
3 分析与讨论
从腹泻仔猪粪便棉拭子中分离得到的细菌, 经革兰氏染色、形态学观察、生化特性以及培养特性鉴定为大肠杆菌。
药敏试验的结果说明, 该细菌对黄连有较高的敏感度, 因此黄连可作为该场防治大肠杆菌的药物。对白芍中度敏感, 可以作为被选药物。对于敏感度极低的中药如连翘、石菖蒲抑菌圈为8mm, 有某种可能是它们根本没有抑菌效果, 所出现的抑菌圈是一种假象, 在该药敏片周围形成一圈高饱和溶液, 大肠杆菌在这种高饱和溶液中无法生长。
与临床上常用的抗生素相比, 除黄连外其他8种药物抑菌效果都不理想。其中黄芩的抑菌圈为11.6mm与郭阳等 (2009) 研究的黄芩抑菌圈为10.6mm不一致, 但是相差不多。黄连19mm与郭阳等 (2009) 研究的的黄连抑菌圈为13.6mm差距明显, 石菖蒲8mm, 艾叶9.5mm, 侧柏叶10mm, 夏枯草11.3mm, 与黄衍强等 (2009) 研究的石菖蒲8.8mm, 艾叶9.4mm, 侧柏叶9mm, 夏枯草12.6mm抑菌圈不一致, 其差别不大, 均在2mm内, 这也间接证明我的推论的石菖蒲、艾叶、侧柏叶、夏枯草的水煎液没有抑菌效果或者抑菌的效果极低。其所产生的抑菌圈是因在药敏片周围形成的一圈高饱和中药溶液, 致使大肠杆菌在这种环境中无法生长。
仅仅从试验结果来看, 除黄连外, 其他8种中药不能代替抗生素治疗细菌感染。但是中药组方机体外抑菌试验证明, 对耐药菌株和非耐药菌株都有较好的抑菌作用。这说明中草药进过合理的配伍, 在体外也有很好的抑菌杀菌作用[6]。以复方白头翁汤对仔猪黄痢的治愈率最高, 达86.21%[7]。
在实际应用中, 有时体外药敏试验的结果与临床治疗效果不一样, 这是由于药物作用的发挥是通过药物与机体相互作用完成的, 受多方面因素影响, 如药物的剂型、剂量、给药途径、联合用药时药物的相互作用, 以及机体对药物的吸收、分布、转化和排泄、机体的生物学个体差异和技能状态、饲养管理和环境条件的。例如, 中药注射液治疗仔猪大肠杆菌病不仅所用时间短 (3d) , 病程也短 (4d) , 治疗率最高 (95.0%) , 而且在减少耐药菌株的产生及无药残、无毒副作用方面优于其他抗菌药[8], 试验的药敏试验是药物直接作用于病原体, 无其他外界环境因素影响。耐药性大肠杆菌存在原因是长期不合理使用抗菌药物, 如饲料中盲目添加较高剂量的抗生素进行催肥和保健, 治疗过程中不进行药敏试验, 频繁更换抗生素等滥用抗菌药物现象很普遍[9]。
为了减少细菌耐药性的产生, 提高抗菌药物的疗效, 可采取下列措施: (1) 合理使用抗菌药物, 用药时应严格掌握适应症、合理的剂量与疗程。 (2) 杜绝或尽量少用抗菌药物作为饲料添加剂。因为小剂量长期用药, 实际上就是诱导细菌耐药的过程。 (3) 抗菌药物的轮换用药, 药物间隔一段时间在猪群中使用, 可以提高大肠杆菌对药物的敏感性[9]。 (4) 定期对养殖场进行细菌分离和药敏试验, 筛选出最佳治疗药物, 一旦发病即可迅速采取先关治疗措施。大肠杆菌是条件致病菌, 普遍存在于猪肠道内。当环境条件改变或者注抵抗力下降时易发。因此, 平时加强饲养管理, 减少应激因素是预防大肠杆菌病的关键。
注:TSI:A=产酸 (黄色) ;+阳性;-阴性;+:90~100阳性;-:0~10阴性
注:抑菌直径d≥15mm为高敏感;15mm>d≥10mm为中敏;d<10mm为低敏。
摘要:从牡丹区某一猪场仔猪黄痢的病死猪粪便样品中, 分离获得大肠杆菌样品, 经过形态学、培养特性、生化试验结果确定为大肠杆菌。将单味中药大黄、白芍、连翘、黄连、石菖蒲、艾叶、侧柏叶、夏枯草、黄芩煎液浓缩, 取直径6mm的无菌滤纸片制成药敏片, 大黄抑菌圈直径为9mm, 白芍13mm, 连翘8mm, 黄连19mm, 石菖蒲8mm, 艾叶9.5mm, 侧柏叶10mm, 夏枯草11.3mm, 黄芩11.6mm, 结果表明黄连的抑菌圈最大。刘倩
关键词:仔猪,大肠杆菌,单味中药,药敏试验
参考文献
[1]史巧.猪源致病性大肠杆菌药敏检测及复方安普霉素、多西环素抗菌制剂研究[D].四川:四川农业大学, 2008:10~11
[2]梁剑平, 等.兽用中国草药研究开发展望[J].中国兽医医药杂志, 2005 (4) :21~23
[3]唐丽杰.微生物学实验[M].1版.黑龙江:哈尔滨工业出版社, 2005:138~141
[4]黄衍强, 等.6种中草药抗耐药性大肠杆菌的抑菌效果试验[N].右江民族医学院学报, 2009 (3) :3
[5]郭洋, 何利昆, 马晓威.五种中药对仔猪白痢大肠杆菌的体外抑制试验[J].现代畜牧兽医, 2009 (4)
[6]孙世友, 王自然.仔猪大肠杆菌病的重要治疗试验[J].兽药天地, 2006 (1) :43~44
[7]王春光, 等.复方白头翁口服液治疗仔猪黄白痢[J].中国兽医科技, 2004. (2) :65
[8]赵坤, 刘兴友, 等.中药制剂对仔猪大肠杆菌性腹泻的治疗效果[J].安徽农业科学, 2006, 34 (11) :2408~2409
[9]周华林, 熊江林, 王长义, 谭华祥, 杨绪波.猪致病性大肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析[J].中国畜牧兽医, 2009 (1) :109~111
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