抑菌效果（共11篇）
抑菌效果 篇1
牙膏是由多种无机物和有机物组成的, 它包括摩擦剂、洗涤泡沫剂、粘合剂、保湿剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂和水分[1]。摩擦剂是牙膏的主体, 常用量在30%～55%之间, 为了增加去污效果, 还需加入洗涤泡沫剂如十二醇硫酸钠, 用量在2%～3%左右。这两种成份在牙膏中主要起到洁白牙齿作用。另外, 牙膏中还离不开抑制甚至杀死细菌的作用的防腐剂, 牙膏中的防腐剂主要对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌[2,3,4,5]几种最为常见的致病菌具有抑制作用。大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌, 主要寄生在大肠内, 侵入人体, 可引起感染, 如腹膜炎、胆囊炎、膀胱炎及腹泻等症状。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性[6], 是人类化脓感染中最常见的病原菌, 可引起局部化脓感染等炎症。绿脓杆菌是一种致病力较低但抗药性强的杆菌, 是伤口感染较常见的一种细菌。本文主要通过检测添加一定量防腐剂的牙膏, 是否具备抑制这三种细菌的作用, 以便确定牙膏能否达到合格要求。
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验样品:五种牙膏, 代号分别为:LP、MP、HP、LP-HE、LP-BA, 由北京保洁公司提供。
仪器设备:比浊仪 (LR101564) , 法国梅里埃;立式压力蒸汽灭菌器, 上海华线医用核子仪器有限公司;隔水式恒温培养箱 (GNP-9160) , 上海精宏实验设备有限公司;微型混合器 (H-1) , 上海康禾光电仪器有限公司;电子天平 (MP200B) , 上海精密科学仪器有限公司;生物安全柜 (HFSafe-900) , 上海申力科学仪器有限公司;恒温冰箱 (HR-231CKBY) , 杭州华日电器有限公司。
试剂及培养基:胰蛋白消化大豆肉汤, OXOID LTD;胰蛋白消化大豆琼脂, OXOID LTD;MCTA菌量测定琼脂, OXOID LTD;0.85%生理盐水;TMLB稀释液 (制备方法: 酶消化的酪蛋白5.0g, 动物组织的酶消化物10.0g, 酵母提取物2.0g, 亚硫酸氢钠0.1g, 土温10.0g, 总量:1000mL) 。
微生物菌种:金黄色葡萄球菌 (ATCC#6538) , 大肠杆菌 (ATCC#8739) , 绿脓杆菌 (ATCC#9027) 。
1.2 实验方法
细菌悬液的准备:将适量细菌培养物接种到9mL胰蛋白消化大豆肉汤中, 在30℃环境下培养18～24h, 然后将菌液接种到胰蛋白消化大豆琼脂上, 在30℃环境下培养18～24h[7]。培养结束后, 将纯度检验合格的细菌, 用灭菌生理盐水将菌落的浓度调整到0.5个麦氏浊度使得细菌浓度在2×108cfu/mL左右, 亦可用分光光度计进行细菌定量。
细菌悬液的培养:定量调制好的菌液用灭菌的生理盐水作为稀释液将菌液稀释成105、106、107每个浓度取2份, 每份各1mL接种到MTCA琼脂平板上, 30℃培养4天, 培养结束后数出每个平板上的所有菌落并记录结果, 最后计算出菌悬液的细菌浓度。
细菌浓度=两个平板菌落总数的平均数×稀释倍数
样品准备:无菌条件下将40g产品分别注入3个灭过菌的盎司玻璃器皿中, 原始菌液调制到0.5个麦氏浊度 (细菌浓度在2×108cfu/mL左右) 的菌悬液, 按以下方式接种到容器中并混合均匀 (见表1) , 样品密封并在常温下完成实验。
样品培养:依次取出1.0mL接种好的样品混合物, 分别用9mL TMLB将混合物稀释后接种于MCTA平板, 30℃环境下培养4天, 培养结束后计数并做记录, 作为第一次检测结果。从试验开始到第7、14、21、28天时重复一次的实验, 再检测4次, 分别作为第二次到第五次的检测结果。
2 结果与分析
根据牙膏抑菌标准要求, 样品抑菌效果至少在第7天比原始细菌悬液理论浓度减少一个log值, 而第14天要比原始细菌悬液理论浓度减少三个log值, 且以后不会出现菌落增长;如在第7天和第14天没有达到标准将认为该牙膏抑菌效果不合格, 如果样品符合第14天的检测标准要求, 但14天后菌落增长的数目超过第14天细菌数目的0.5个log值, 也认为该牙膏抑菌效果不合格。
2.1 原始细菌悬液的计数结果
检验时, 为了验证比浊仪调制的菌悬液0.5麦氏浊度中的细菌浓度是否在2.0×108cfu/mL左右, 必需对加入样品的原始菌悬液也要进行平板计数, 0.5麦氏浊度的菌悬液的检验结果见表2。
由表2可见, 细菌的原始菌悬液符合实验方法中对原始细菌悬液浓度应在2.0×108cfu/mL左右的要求。
2.2 LP牙膏的计数结果
LP牙膏每次检验时都用TMLB把1.0mL接种好的样品混合物稀释成1:100, 然后取1mL倒入平板, 再加20mL的MCTA琼脂, 混合均匀后冷却至常温, 最后在30℃的恒温培养箱中培养4天, 按照上述方法培养检验, 抑菌检验结果见图1。
由图1可见, LP牙膏中防腐剂没有抑菌效果, 不是合格产品。
2.3 MP、HP、LP-HE、LP-BA四牙膏的计数结果
MP、HP、LP-HE、LP-BA四种牙膏, 检验时用TMLB把1.0mL接种好的样品混合物稀释成适当浓度 (1:100) , 每个浓度取2份, 每份各1mL倒入平板, 按照LP牙膏的检验方法进行抑菌检测, 检验结果见表3。
备注:1—为金黄色葡萄球菌, 2—大肠杆菌, 3—绿脓杆菌;表中细菌浓度单位为:104cfu/mL。
由表3可见, MP、HP、LP-HE、LP-BA四种牙膏, 抑菌效果都达到牙膏抑菌标准要求, 为抑菌合格样品。
3 总结与讨论
LP牙膏在第7天的时候只比原始细菌悬液理论浓度减少了1个log值, 而且没有在第14天的时候比原始的细菌悬液理论浓度减少3个log值, 并且在第14天后实验细菌的数目一直没有减少, 还出现增长的现象, 这表明该牙膏抑菌效果不达标;MP牙膏抑菌效果检验, 三种细菌5次培养都没有细菌生长, 抑菌效果达标;HP牙膏抑菌效果检验表明, 金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌在5次培养中都没有细菌生长, 仅大肠杆菌在第7天时有生长,
且比原始细菌悬液理论浓度减少了4个log值, 在第14天后的培养中检验中都没有生长, 说明该牙膏具备抑菌效果且达标;LP-HE与HP一样, 有类似抑菌效果, 且在第7天时大肠杆菌生长仅比原始细菌悬液理论浓度减少了2个log值;LP-BA与MP一样, 有类似抑菌效果, 但在第7天以后的培养才没有金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长。结论, LP牙膏不能对实验细菌起到抑制作用, 而MP、HP、LP-HE、LP-BA牙膏能有效的抑制细菌增长。一般牙膏中能够抗菌的常用成分主要为苯甲酸、对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等防腐剂。允许使用该类成分的剂量都进行过严格的“最大无作用剂量”毒性检验, 将这个剂量缩小100倍, 定为人的每日允许摄入量, 制定出某种防腐剂添加入某种食品的最大用量, 防腐剂只要使用不过量, 对人体健康不会产生危害。
摘要：初步研究牙膏对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌三种比较常见致病菌的抑制效果, 检验牙膏抑菌合格与否。用“抗菌有效性”方法, 研究LP、MP、HP、LP-HE、LP-BA五种牙膏抑菌效果。LP牙膏中三种细菌浓度维持在106cfu/mL以上, 其余四种牙膏在第14天后没有细菌生长, 其中MP在4个周期5次检验中都没有细菌生长, LP-BA有类似抑菌效果, 但第2次检验时, 金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的浓度分别为4×104cfu/mL和35×104cfu/mL, HP与LP-H有类似抑菌效果, 在第2次检验时仅大肠杆菌生长, 细菌浓度分别为1×106cfu/mL和2×106cfu/mL。LP牙膏不能对实验细菌起到抑制作用, 而其余四种牙膏能有效的抑制细菌增长。
关键词：牙膏,菌落总数,大肠杆菌,金黄色葡萄球菌,绿脓杆菌
参考文献
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[7]沈萍, 范秀容, 李广武.微生物学实验 (第三版) [J].北京:高等教育出版社, 1999:195-196.
抑菌效果 篇2
洋葱的抑菌作用研究
采用平板菌落计数法,通过计算抑菌率,比较了不同浓度的生熟洋葱汁液对常见的2种细菌的抑制作用.结果表明:不同浓度的洋葱汁液之间以及生熟洋葱汁液之间的`抑菌效果差异均达到极显著水平;高浓度的洋葱汁液的抑茵效果极显著优于低浓度洋葱汁液;同种浓度下生洋葱汁液的抑菌效果极显著优于熟洋葱汁液;洋葱汁液对金黄色葡萄球菌的抑制作用极显著大于对大肠杆茼的抑制作用.
作 者：赵锦慧 周琳 ZHAO Jin-hui ZHOU Lin 作者单位：周口师范学院,生命科学系,河南,周口,466000 刊 名：周口师范学院学报 英文刊名：JOURNAL OF ZHOUKOU NORMAL UNIVERSITY 年，卷(期)： 26(2) 分类号：Q939 关键词：洋葱 抑菌作用 抑菌率抑菌效果 篇3
【关键词】提取方法；中草药；抑菌效果
【中图分类号】R-0 【文献标识码】B 【文章编号】1671-8801（2016）02-0218-01
不同的中草药成分提取方式对于不同的细菌产生的抑制效果存在着一定的差异性，对相同种类的中药采取不同的提取方式，其提取液也会对不同的菌种产生不同的抑制性，所以中草药不同，也需要行以对应的合适的提取方式[1]。本文将择取6种中药提纯法进行分析。
1 水煎提取法
水煎提取法指的是将清水作为主要的溶剂，把药材投入其中进行加热煮沸，在一段时间之后提取其中所包含的成分的方式，是一种比较传统且常用的方式，在实际应用当中也被称为是煮提法以及煎浸法，这种方式相对来说比较适合有效成分可以溶于水、并且在热环境下保证性质稳定的中草药。
通过水煎法进行药液提取，其抑菌效果相对来说不是非常显著，究其原因，水提法相对来说提取温度比较高，有一定的隐患会对热稳定性造成破坏，令提取液的抑菌效果在一定程度上降低，而且在水提液当中仅仅包含水溶性成分。根据当代药理学当中的相关研究，在大黄当中含有广谱抗菌效果、保肝利胆、利尿，调节肾脏功能等。有学者借助煎煮法自大黄当中提取了蒽醌成分，在大黄与清水煮沸三次，每次混合15倍量的水，每次持续20分钟的情况下提取效果最理想。
2 超声波提取法
在最近这些年以来，超声波提取法是一种在中草药成分提取、分离操作当中比较常用的方式，同时它也是在最近这些年中国药典当中收载、应用得比较多的处理样品的方式，它拥有较高的提取效率，且花费的时间比较短、操作相对简单易行等。这种提取方式是借助超声波空化作用以及机械作用、热效应等，令药物的有效成分尽快溶出，除此之外，超声波的次级效应（机械振动扩散、乳化以及击碎等效应）也可以在一定程度上令有效成分尽快扩散并释放，随后和溶剂充分地混合，有利于加速成分提取，同时超声波的作用能够促进酶成分以及细胞参与到生理生化进程当中，进而提升酶活性，令细胞的新陈代谢加快[2]。
超声波所拥有的空化效应、机械效应以及热效应之间形成彼此联系的关系，借助超声波频率控制以及强度控制来强调其中一种作用，降低或者避免另外一种作用，进而提升有效成分的提取概率，超声波提取法所拥有的优势能够令重要生产分离提取提供出比较合理的生产工艺以及生产流程、生产参数等，它的主要作用是借助超声波振荡来对药材的细胞组织结构进行破坏，令有效成分浸出，不过它的有效成分依然是水溶性的，不过却在一定程度上避免水煮提取法产生的高温形成的破坏效应。黄芩乌梅提取液的抑菌效果有较大的差异，超声-微波联合萃取的方式相对比较理想；
地榆使用超声波法效果和其他方式并没有明显的差异。
3 乙醇回流提取法
所谓乙醇回流法，指的是借助乙醇等具备较强挥发性的有机溶液来进行药物成分的提取，随后对浸出液进行加热并蒸馏，挥发性溶剂在彻底挥发之后还会被冷凝处理，这样循环，重复地对药物进行回流浸提，一直到有效成分完全回流提取。当前回流法可以分成回流热浸法以及回流冷浸法两种。不过在回流法的进行过程当中，因为需要进行持续性的加热，其浸提液的受热时间也相对比较长，因此不适合对一些受热容易发生破坏效应的药物的成分浸出操作。
对于乙醇回流提取法来说，五倍子提取液所起到的抑菌效果最为理想，它含有的2-羟基-6-十五烷基苯甲酸成分拥有较好的抑菌活性；另外，乌梅使用乙醇回流法抑菌效果也最理想。从整体上来看，乙醇回流提取法值得进行推广。
4 微波提取法
使用微波方式来进行有效成分的提取，对于药物的水溶性以及脂溶性成分的顺利提出有较为理想的效果。借助微波，破碎并溶解细胞壁以及细胞膜，提升药物的实际有效成分以及有效部位的提取概率，它的原理是微波场当中，对微波能力差异进行吸收，令基体物质部分区域受到选择性的加热，进而令被萃取的物质自基体或者是体系当中尽快分离出来。当前在临床当中微波提取的方式由于药物成分溶解时间、微波剂量等因素都还有优化的空间，而且这些因素都有可能会影响到提取液的抑菌效果，因此尚且还需要进行深入分析，如果不能对其进行良好的优化，可能会存在一定的降低提取率、影响抑菌效果的隐患。
5 水提醇沉提取法
就中药药液澄清度来看，水提醇沉法是一种比较经典的方式，在很多药剂生产过程当中都有一定的应用，它的原理主要是借助中药中的成分能够溶于清水以及醇成分物质的特征，借助清水，提出有效物质之后对提取液进行适当的浓缩，融入乙醇进行反复、数次的沉降处理，排除不溶解物质，制得澄明液体。
这种方式能够提取中药材当中大多数有效成分，而且还能够去除无法溶于乙醇的蛋白质、多糖等不必要的杂质，确保制剂澄明度。不过需要控制乙醇的浓度，避免过多或过少，造成无法彻底溶解或者不能充分发挥除杂效果。使用水提醇沉提取法的提取液起到的抑菌效果最理想，这是因为乙醇在除杂的过程当中可能会对其抑菌效果产生影响所造成的。
6 半仿生提取法
所谓半仿生提取法，是就生物药剂学角度入手，结合经过消化道给药的各种中药制剂的特征所创立的提取新技术方式，这种方式模仿了口服类药物在人体胃肠道当中进行转运的过程，使用指定种类的酸性水、碱性水来对药物进行连续性的提取操作，它的主要目的是充分地对含有较高比例的指标成分的活性混合体进行提取，不过提取的过程当中酸碱性有一定可能会对中药当中的抑菌成分产生一定的影响[3]。在实际使用的过程当中，使用这种方式来进行药液提取，其抑菌效果不是非常显著，需要借助比例分割、正交等方式来进行酸碱水pH值的调节和优化。
结语：
总的来说，中草药需要结合其有效成分以及最终目标产物来选择最为合适的提取方式，并且需要对提取方式进行不断的优化，以期能够实现最理想的提取效果。
参考文献：
[1]张莉，吴润，刘磊，等.不同提取方法对中草药抑菌效果的影响[J].甘肃农业大学学报，2012，47（02）：25-33.
[2]褚夫江，金小宝，刘文彬，等.不同提取方法对中药罗仙子体外抑菌活性的影响[J].时珍国医国药，2014，25（08）：1806-1808.
不同来源白鲜抑菌效果比较 篇4
白鲜皮是一种尚未完全开发利用的很有价值的药用资源, 含有多种化学成分, 其中白鲜碱和梣酮是其中的主要有效成分, 文献报道, 白鲜皮有抑菌作用, 为进一步验证和研究其抑菌活性, 本实验利用不同产地的白鲜皮, 观察其对大肠杆菌、金黄色葡萄菌、枯草芽孢杆菌3种常见菌种的抑制作用, 以比较不同来源的白鲜皮的抑菌效果。
1 材料与方法
1.1 实验材料
2012年夏季, 分别在吉林省长春、柳河、通化, 辽宁清原、内蒙古阿荣旗采集白鲜鲜样, 采后室内清洗、干燥。
1.2 方法
1.2.1 采用HPLC法测根皮中梣酮和黄柏酮含量。
1.2.2 白鲜皮抑菌效果比较。
实验所用细菌为大肠杆菌 (Escherichia coli) 、金黄色葡萄球菌 (Staphyloccocus aureus) 、枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 由通化师范学院生物系微生物实验室提供, 采用营养琼脂培养基培养细菌, 121℃, 灭菌20min, 37℃恒温培养箱培养。纯化后, 斜面保存。 (1) 不同处理方法白鲜皮抑菌效果比较。5份样品分别用无菌水、95%乙醇溶液和分析纯 (AR) 甲醇溶液3种试剂, 浸泡72h, 比较抑菌效果。 (2) 不同产地的白鲜皮抑菌效果比较。取直径为5mm经灭菌的滤纸片, 分别在上述三种溶液中浸泡30min备用, 然后放在分别涂有上述三种菌的平板上, 同时做对照, 每个处理重复3次, 37℃恒温培养箱中倒置培养24h, 观察结果, 测量抑菌环直径。
2 结果与分析
2.1 不同处理方法白鲜皮抑菌效果比较
在无菌水、95%乙醇和甲醇溶液三个处理中, 只有浸泡在甲醇溶液中的样品对3种菌都有一定的抑制作用, 对大肠杆菌的抑菌效果最明显, 金黄色葡萄球菌次之, 对枯草芽孢杆菌无抑菌作用。
2.2 不同产地的白鲜皮抑菌效果比较
不同产地的白鲜皮对实验细菌的抑菌作用不同, 白鲜皮提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有抑制效果, 尤其对大肠杆菌效果更为明显, 对枯草杆菌无明显抑菌效果。如表1所示, 对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌效果最好的来源于内蒙, 最差的均来源于通化, 效果最好的抑菌环直径是最差的1.88倍。
2.3 不同产地的白鲜皮抑菌活性物质比较
通过抑菌活性物质含量比较发现, 白鲜皮中梣酮含量来自清原的为0.073%最低, 内蒙产地的梣酮含量0.321%是所有产地中最高的;黄柏酮含量, 柳河为0.787%, 其余产地含量均大于1%, 最高含量为通化1.882% (见表2) 。文献报道白鲜皮内梣酮为主要抑菌物质, 但本实验结果却是梣酮含量与抑菌效果不成正比, 可能是由于所采样品生长年限不同引起的。
3 小结
3.1 不同处理方法白鲜皮抑菌效果比较
通过对吉林、辽宁、内蒙古三个省5份地区样品白鲜皮对细菌抗菌作用的比较, 在水浸、95%乙醇溶液浸泡和甲醇溶液浸泡, 甲醇溶液处理的样品有抑菌效果, 其他两种溶液均无明显效果。
3.2 不同产地白鲜皮抑菌效果比较
5份样品中, 抑菌效果最好的来源于内蒙, 并对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌效果较为明显。在供试样品中, 内蒙的样品抑菌环直径最大, 生长年限长, 故抑菌效果可能与生长年限有关。
3.3 不同产地白鲜皮抑菌活性物质比较
不同产地白鲜皮梣酮与黄柏酮含量存在较大差异, 梣酮含量以内蒙产地最高, 含量0.321%;黄柏酮含量以通化产地最高, 达到1.882%。文献报道梣酮为主要的抑菌活性物质, 与本实验结果存在一定差异, 本实验结果表明其抗菌作用可能是两种物质共同作用的结果。因未对两种物质分离提纯进行单独研究, 也没有深入研究两种物质的结构特点和抗菌作用机制, 所以两种物质各自的抗菌作用怎样还有待进一步研究确定。
参考文献
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抑菌效果 篇5
杉木心材精油抑菌活性及其化学成分研究
通过水蒸气蒸馏法提取杉木心材精油,并进行柱层析分离、气-质联用分析和抑菌活性试验,比较分析了精油含量、化学组成和抑菌活性成分.结果表明,杉木心材精油含量为1.794～2.076(w/w);气-质联用分析共分离出47个色谱峰,鉴定出27个化合物(占精油总量的.99%),其中主要成分为柏木脑(76.27%);杉木心材精油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、伤寒沙门氏菌等均有较明显的抑制作用;柏木脑是杉木精油的主要抑菌活性成分.
作 者：叶舟 林文雄 陈伟 俞新妥 YE Zhou LIN Wenxiong CHEN Wei YU Xintuo 作者单位：福建农林大学生命科学学院,福州,350002刊 名：应用生态学报 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY年，卷(期)：200516(12)分类号：Q599 S78关键词：杉木 精油 抑菌活性 柏木脑
抑菌效果 篇6
关键词：菊芋；提取物；辣椒；疫霉菌；抑菌效果；石油醚；乙酸乙酯
中图分类号： S482.2+92文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0139-02
收稿日期：2014-04-02
基金项目：国家现代农业产业技术体系建设专项（编号：CARS-25-G-49）。
作者简介：李屹（1973—），女，河南巩义人，研究员，主要从事蔬菜病虫害防治。Tel：（0971）5311167；E-mail：ly525414@sina.com。辣椒疫病是由辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）侵染引起的一种毁灭性真菌性病害，于1918年在美国首次被发现，迄今已在世界各地的辣椒种植区普遍发生[1]。在20世纪50年代，我国最早在江苏发现辣椒疫病，目前该病已危及我国的青海、新疆、上海、北京、陕西、贵州、四川等许多地区[2-8]，并呈逐年加重趋势，给辣椒生产造成严重损失，是辣椒的主要病害之一。辣椒疫病是一种土传病害，可经雨水、土壤、气流等多种途径传播，发病时可造成茎秆坏死、叶片枯萎、果实腐烂，甚至整株萎蔫死亡，从而导致田间大面积出现死秧[9]。利用化学药剂防治辣椒疫病效果甚微，且容易造成环境污染，开发无害、高效的新型生物农药是当前病害防治的发展方向。本试验采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮及乙醇共5种溶剂，对菊芋叶片的有效成分进行提取，对提取物进行辣椒疫霉菌抑菌效果试验，确定最佳溶剂，并开展辣椒盆栽验证试验，为利用菊芋开发高效、安全的新型无公害植物源农药奠定基础。
1材料与方法
1.1菊芋叶片不同溶剂提取物对辣椒疫霉菌的室内抑菌效果
1.1.1供试样品供试植物为菊芋，种植于青海大学农林科学院，鲜叶于秋季霜前采集，室内自然阴干，用粉碎机粉碎制成植物干粉，密封于塑料袋中备用。
1.1.2培养基与试剂真菌培养基为 PDA 培养基；石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮及乙醇等生化试剂均为分析纯，市购。
1.1.3供试菌种辣椒疫霉菌菌种由青海省蔬菜遗传与生理重点实验室提供，将菌株接种于PDA液体培养基中进行活化，25 ℃培养2～3 d；活化菌株转接到PDA固体平板上，25 ℃ 培养2～5 d，至菌丝覆盖整个平板。
1.1.4菊芋叶片不同提取物的制备5种溶剂提取物提取方法分别为：分别称取菊芋叶片干粉材料2、1.2、2.4、2、3 kg，分别加入乙醇10 L、氯仿6 L、乙酸乙酯12 L、丙酮10 L、石油醚15 L，浸提2次，浸提2 d；合并2次浸提液，减压浓缩，分别得到菊芋叶片乙醇、氯仿、乙酸乙酯、丙酮和石油醚粗提物。
1.1.5菊芋叶片提取物的抑菌活性测定将各粗提物配制成一定浓度；一方面分别取一定量各溶剂提取物加入到温度40 ℃左右、已熔化的PDA固体培养基中，摇匀，倒入灭菌培养皿中，使菊芋叶片提取物在PDA培养基中终浓度为 12.5 mg/mL，以添加相对应的有机溶剂为对照，另一方面使各菊芋叶片提取物在PDA培养基中的终浓度分别为25、20、15、12.5、10、7.5、5、2.5 mg/mL；待培养基凝固，于中央接入直径为9 mm 的辣椒疫霉菌菌块，于25 ℃培养72 h，“十”字交叉法测量菌落直径，计算菌落纯生长量和抑菌率：纯生长量=菌落平均直径-菌饼直径；抑菌率=（对照纯生长量-处理纯生长量）/对照纯生长量×100%。
1.1.6数据分析数据用Excel和DPS软件进行分析处理。
1.2盆栽验证试验
1.2.1供试材料供试辣椒品种为乐都长辣椒；供试试剂为菊芋叶片乙酸乙酯粗提物和25%甲霜灵可湿性粉剂。
1.2.2试验方法辣椒采用盆栽，每盆栽种辣椒3株，在辣椒8～10叶期处理；试验设菊芋叶片粗提物50倍液、25%甲霜灵可湿性粉剂 400倍液、清水处理为空白对照共3个处理，采用灌根方式，沿每株辣椒根部灌入10 mL试剂或清水；24 h后使用注射器吸取游动疫霉菌孢子浓度为1×104个/mL 的悬浮液5 mL，注入离辣椒幼苗根茎约2 cm处，保持土壤湿度饱和、温度为25 ℃左右。每个处理重复3次，每次重复用辣椒5盆。孢子悬浮液制备方法为：将在CN培养基上培养的疫霉菌单孢纯化菌株，于28 ℃条件下连续光照培养5～7 d以形成大量孢子囊；挑取产生孢子囊的菌丝块放入试管中，加入无菌水20 mL，放入4 ℃冰箱中预冷1 h，移至室温20 min，振荡即得游动孢子悬浮液，用无菌水进行稀释调节。
1.2.3调查内容及统计方法分别于施药后7、14、21 d调查发病情况，统计发病率、病情指数及防治效果，计算公式：发病率=发病株数/调查总株数×100%。病情指数DI：DI=∑（s×n）/（N×5）×100%，式中，s为各病情级别的代表数值；n为各病情级别的植株数；N为调查总植株数。防治效果=（对照区病情指数-防治区病情指数）/防治区病情指数×100%。病害分级标准为：0级：无病；1级：幼苗根茎部轻微变黑，叶片不萎蔫或可恢复性萎蔫；2级：幼苗根茎部变黑1～2 cm，叶片不可恢复性萎蔫，下部叶片偶有脱落；3级：幼苗根茎部变黑超过2 cm，叶片明显萎蔫或落叶明显；4级：幼苗根部变黑缢缩，除生长点外全部落叶或整株萎蔫；5级：植株枯死。
nlc202309021101
2结果与分析
2.1菊芋叶片不同溶剂提取物对辣椒疫霉菌的抑菌效果
由表1可知，菊芋叶片各溶剂提取物12.5 mg/mL处理，辣椒疫霉菌的菌丝纯生长量与对照处理相比，均存在显著差异，各溶剂提取物对真菌生长均起到一定的抑制作用；石油醚、乙酸乙酯提取物对辣椒疫霉菌的抑制效果最好，抑菌率达到100.00%，显著高于其他提取物处理；丙酮提取物次之，抑菌率为（27.51%±2.823）%；乙醇提取物对疫霉菌抑菌效果相对最差，抑菌率仅为（3.99±1.009）%。
表1菊芋叶片不同溶剂提取物12.5 mg/mL对辣椒疫霉菌的抑菌效果
溶剂纯生长量（cm）菊芋叶片提取物仅溶剂（对照）抑菌率
（%）石油醚0±0e1.35±0.089100.00±0a乙酸乙酯0±0e5.20±0.347100.00±0a氯仿13.92±0.454c17.20±0.32719.10±1.282c丙酮5.25±0.278d7.24±0.10627.51±2.823b乙醇32.22±0.202b33.56±0.5443.99±1.009d空白对照45.20±0.700a注：同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。
由表2可知，乙酸乙酯提取物对辣椒疫霉菌的抑菌效果最为显著，当浓度为5 mg/mL时，抑菌率达100.00%，当浓度降到2.5 mg/mL时，抑菌率为（27.91±2.076）%；石油醚提取物的抑菌效果次之，浓度为7.5 mg/mL时，抑菌率达10000%，当浓度逐渐降低时，抑菌率也显著降低；氯仿提取物和丙酮提取物在2.5～10 mg/mL时的抑菌效果相差不大，浓度大于10 mg/mL时，丙酮提取物的抑菌效果增加程度明显大于氯仿，在20 mg/mL时，丙酮提取物的抑菌率达10000%，氯仿提取物在25 mg/mL时抑菌率才达到100.00%；乙醇提取物的抑菌效果最差，浓度小于10 mg/mL几乎没有抑菌效果，当浓度大于12.5 mg/mL时，抑菌率随浓度的增加而增大，当浓度为 25 mg/mL 时，抑菌率为（72.43±0.472）%。表2不同溶剂
2.2菊芋叶片提取物防治辣椒疫病盆栽验证试验
由表3可知，施药后7 d，菊芋叶片粗提物50倍液及25%甲霜灵可湿性粉剂 400倍液2个处理均未发病，清水对照发病率达17.78%、病情指数达4.00%；施药后14 d，菊芋叶片粗提物50倍液处理的辣椒未发病，25%甲霜灵可湿性粉剂 400倍液处理的辣椒发病率为8.89%、病情指数为178%，清水对照发病率达37.78%、病情指数达14.67%；施药后 21 d，菊芋叶片粗提物50倍液处理的辣椒仍未发病，25%甲霜灵可湿性粉剂 400倍液处理的辣椒发病率为13.33%、病情指数为4.89%，病情发展较为缓慢，清水对照发病率达到57.78%、病情指数达到35.11%。菊芋叶片提取物50倍液处理的辣椒全程无疫病发生，对辣椒疫病有较好的防治效果。表3菊芋叶片提取物对辣椒疫病的防治效果
3结论与讨论
试验结果表明，菊芋叶片不同提取物对辣椒疫霉菌均具有抑菌效果，溶剂提取物浓度为12.5 mg/mL时，石油醚和乙酸乙酯提取物对辣椒疫霉菌的抑菌率达到100.00%，显著高于其他提取物；乙酸乙酯提取物的抑菌效果最为显著，当浓度为5 mg/mL时，抑菌率达到100.00%， 浓度降到2.5 mg/mL时， 抑菌率尚有（27.91±2.076）%，显著高于同浓度其他溶剂提取物；菊芋叶片乙酸乙酯提取物50倍液对辣椒疫病具有良好的防治效果，药后21 d防效仍达到100.00%，优于化学药剂25%甲霜灵可湿性粉剂 400倍液的防治效果。
我国是农业大国，农药在农业生产中发挥着十分重要的作用。随着人们健康意识的提高，农药残留超标已成为严重影响农产品市场竞争力的重要问题，开发新型农药已成当务之急[10]。植物源农药来源于自然，具有环保、长效、易光解、无残留等特点，能保持农产品的高品质， 是发展有机农业、促进农业可持续发展的理想农药。菊科植物是最重要的植物源农药来源，在有杀虫活性的1600种植物中，有1/10是菊科
植物[11]。研究表明，菊芋能抵御多种植物疾病，极少虫害，含有抗虫抑菌活性物质，具有耐旱、耐寒、耐盐及抗病虫害等特点[12]。目前，国内外对菊芋用于治理沙漠和深加工方面的研究较多，有关菊芋叶片生物活性物质及其抑菌活性的研究较少。韩睿等已经开展菊芋叶片有效成分提取分离技术研究[13]。通过本试验，证明了菊芋提取液对辣椒疫霉菌具有很好的抑制作用，这对于充分利用菊芋资源、开发研制新型植物源杀菌剂、拓展菊芋的应用领域提供了一定的依据。在盆栽验证试验中，只设定了1个提取液浓度，不能更为客观地分析其防治效果，有必要在后续试验中设计更多的浓度梯度，进一步确定菊芋提取液对辣椒疫病的防治效果及最佳防治浓度。
参考文献：
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抑菌效果 篇7
苦菜的营养价值比较高。每100g鲜菜中含粗蛋白3.4g,粗脂肪1.4g,粗纤维1.6g,胡萝卜素322mg,B族维生素0_53mg,维生素C88mg。另外还含有油脂、胆碱、转化糖、酒石酸、甘露醇、苦味素,以及8种人体必需氨基酸和其它9种氨基酸,并且比例协调[2]。
食用苦菜有助于促进人体内抗体的合成,增强机体免疫力,促进大脑机能。苦菜中丰富的铁元素有利于预防贫血,多种无机盐和微量元素有利于儿童的生长发育,多种维生素可促进伤口愈合,防止维生素缺乏。苦菜中含有的蒲公英甾醇、胆碱等成分,对金黄色葡萄球菌耐药菌株、溶血性链球菌有较强的杀菌作用,对肺炎双球菌、脑膜炎球菌、白喉杆菌、绿脓杆菌、痢疾杆菌等也有一定的杀伤作用[3]。
本试验对苦菜天然物质的提取条件以及提取液的抗菌性进行了研究,以期为发展苦菜类保健品提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
苦菜采于内蒙古农业大学职业技术学院试验田。
1.2 试剂与仪器
1.2.1 主要试剂
甲醇,95%乙醇,盐酸。
1.2.2 主要仪器设备
RE-52型旋转蒸发仪,755B型紫外可见分光光度计,TU-1901双光束紫外可见分光光度计。
1.3 菌种与培养基
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),金黄色葡萄球(Staphylococcus Aurous),大肠杆菌(Escherichia.coli)。
牛肉蛋白胨培养基。
1.4 试验方法
1.4.1 苦菜天然物质最大吸收波长的确定
准确称取烘干的苦菜粉末2.00g,加入40mL水,连接回流装置,在60℃条件下回流提取3次,1h/次,即得苦菜天然物质的提取液。离心(4000rpm,15min),通过旋转蒸发仪真空浓缩,移取一定量的苦菜天然物提取液,利用AB-8大孔吸附树脂进行纯化处理,测定不同波长下的吸光度A,绘制苦菜天然物提取液的A-λ吸收曲线。确定苦菜天然物提取液的最大吸收波长λmax。
1.4.2 苦菜天然物质提取液浓度与吸光度的相关性
准确称取烘干的苦菜粉末2.00g,按照上述试验设计提取纯化苦菜天然物质,定容至50mL。准确移取苦菜天然物质提取液,用水配制等浓度差的一系列溶液,在1.4.1所确定的最大吸收波长λmax下测定吸光值,绘制系列浓度溶液的吸光值曲线,确定A-C呈线性关系的吸光度范围值。
1.4.3 苦菜天然物质提取条件优化
1.4.3. 1 溶剂对提取的影响
准确称取烘干的苦菜粉末10.00g于烧杯中,分别用水、甲醇、95%乙醇、95%乙醇+盐酸等不同提取溶剂提取,提取温度为70℃,浸提2h,液料比为20:1,并不断搅拌。待冷却后,在旋转蒸发仪中进行浓缩,吸取1mL苦菜溶液,在波长524nm处进行吸光值的测定(提取过程下同)。
1.4.3. 2 温度对提取的影响
选择50℃、60℃、70℃、80℃、90℃一系列温度进行单因素试验,提取溶剂为水,时间为2h,液料比为20:1。
1 4.3.3时间对提取的影响
选取1、2、3、4、5h作为时间系列进行单因素试验,提取溶剂为水,温度为80℃,液料比为20:1。
1.4.3. 4 液料比对提取的影响
选择10:1、20:1、30:1、40:1、50:1的液料比进行单因素试验,提取溶剂为水,温度为80℃,时间为1.5h。
1.4.4 提取条件多因素综合影响试验
在单因素试验的基础上,采用正交法设计试验组合,对多因素进行综合研究,按正交表L9(33)对提取温度、提取时间和液料比三个因素,设计三因素三水平正交试验。
1.4.5 抑菌试验
配制牛肉蛋白胨培养基并灭菌(121℃,20min)。冷却至50℃左右,倒入灭菌培养皿中,冷却凝固。将0.2mL细菌悬液接入盛有培养基的培养皿中,涂布均匀。用灭菌的镊子将灭菌后的牛津杯放在培养基上,将200μL待试液注入牛津杯中,以待试溶液的溶剂作为对照,在37℃下培养24h,测量抑菌圈的大小。
配制液体培养基,每试管9.0mL分装,121℃湿热灭菌。以提取液作为100%原液,无菌水两倍法稀释,得一系列不同浓度的提取液。准确吸取1.0mL各浓度的提取液,加入液体培养基中,得到提取液的不同浓度系列培养基。每一系列培养基接种一种菌,每浓度重复3管,另取一不接种任何菌的管作为空白对照,置适宜温度下培养,观察生长情况。将提取液的接种管和空白管进行比色测定,二者OD值相同的最低浓度即为提取液的最低抑菌浓度(MIC),以mg/mL表示。
2 结果分析
2.1 苦菜天然物质吸光特性研究
2.1.1 苦菜天然物质的最大吸收波长
按照1.4.1试验设计提取并纯化苦菜天然物质,提取溶液在可见光区的吸收光谱如图1。
由图1可见,苦菜天然物质提取液在可见区范围的吸收峰位于524nm处,这与黄酮类在可见光区的吸收光谱相符。
2.1.2 苦菜天然物质提取液浓度与吸光度的相关性
等浓度差的系列提取液溶液的吸光曲线见图2。由2图可见,在A为0.5～1.2的范围内,提取液浓度与吸光度呈线性关系。线性回归方程为y=0.217x+0.0474,相关系数R2=0.994。
2.2提取溶剂的选择
四种溶剂对苦菜天然物质的提取效果见图3。图3表明,水提取的吸光值均高于甲醇、95%乙醇、95%乙醇+盐酸提取的吸光值,即对苦菜天然物质的提取而言,有机溶剂提取物的吸光值小于水提物的吸光值。故本试验中选用水为提取溶剂。
2.3提取温度的选择
由图4可见,在50～80℃范围内,苦菜天然物质提取液的吸光值随提取温度的升高而增大;当温度为80～90℃时,苦菜天然物质提取液的吸光值随温度的升高而减小。由此可见,苦菜天然物质适合在较高的温度条件下提取。
2.4提取时间的选择
由图5可见,在1～2h范围内,随着提取时间的延长,苦菜天然物质提取液的吸光值明显增大,即苦菜天然物质的提取量随浸提时间的延长而增加;在2～5h范围内,随着提取时间的延长,苦菜天然物质提取效果不明显。
2.5提取液料比的选择
由图6可见,当提取液料比在10:1～20:1范围时,苦菜天然物质提取液的吸光增大;提取液料比在20:1～50:1范围时,苦菜天然物质提取液的吸光值减小。
2.6多因素对提取效果的影响
在单因素试验的基础上,对提取温度、提取时间、提取液料比三个因素,进行三个水平正交试验,试验结果见表1。由表1可知,提取条件三因素的极差分别0.056、0.043、0.037,即三个因素对苦菜天然物质提取效果影响的主次顺序为:提取温度,提取时间>提取液料比。
综合分析得出,苦菜提取液的最佳提取条件为A2B2C3,即提取时间80℃,提取时间为2h,提取液料比为25:1时,苦菜中的天然物质可得到最有效的提取。
注:试验重复三次,数据取平均值。
2.7 苦菜天然物质提取液的抑菌谱测定结果
由表2可知,苦菜天然物质提取液对金黄色葡萄球菌具有明显的抑制作用,对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌也有一定的抑制作用。由此推测,苦菜天然物质提取液对G+细菌具有抑制作用。在供试菌中,对金黄色葡萄球菌的抑制作用最明显,对大肠杆菌的抑制作用相对较弱,而对枯草枯草芽孢杆菌的抑制作用不明显。
由表2还可知,苦菜提取液的最低抑菌浓度在10%以下,其中苦菜对金黄色葡萄球菌的MIC为4.0 mg/mL,但苦菜对大肠杆菌的MIC为6.0 mg/mL,对枯草芽孢杆菌MIC为8.0 mg/mL。说明该种菊科材料含有较强的抑菌物质。
3 结论
苦菜天然物质的最佳提取条件为:提取温度80℃、提取时间2h、液料比25:1。
该工艺条件下得到的苦菜天然物质提取液对金黄色葡萄球菌的抑制作用较强,而对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑制作用很弱。
摘要：通过单因素和正交试验,以提取物的吸光度值为考察指标,对苦菜天然物质的提取条件进行了研究。结果表明:水是提取苦菜中的天然物质的最好溶剂,各影响因子的影响程度依次为:提取温度>提取时间>提取液料比,其最佳提取温度80℃、提取时间2h、液料比25:1。苦菜天然物质提取液对三种细菌均具有一定的抑菌作用,而对金黄色葡萄球菌有较强的抑菌作用。
关键词：苦菜,天然物质,提取,抑菌
参考文献
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抑菌效果 篇8
1材料与方法
1.1材料
1.1.1 抗菌药物。 青霉素G、 卡那霉素、庆大霉素、头孢噻夫钠、氧氟沙星、链霉素购于河南牧翔药业股份有限公司, 批号150603。 标准药物敏感纸片购于杭州天和微生物试剂有限公司, 批号140828。 新华101 号定性滤纸购于杭州新华纸业有限公司。
1.1.2 培养基。 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤培养基 (批号:20140806) 、MH营养琼脂培养基 (批号20140618) 均购于北京奥博星生物技术有限责任公司。
1.1.3试验菌种。大肠杆菌菌种由伊犁职业技术学院动物微生物实验室提供。
1.1.4主要仪器。电热恒温培养箱 (北京市永光明医疗器械厂) 、超净工作台 (苏净公司) 、电子天平 (Mettle公司) 、微量移液器 (艾本德公司) 。
1.2 方法
1.2.1 纸片的制备。 用打孔器将新华101 号定性滤纸打成直径为6 mm的圆形小纸片。 每个青霉素瓶内放入50片, 包扎瓶口高压灭菌, 然后烘干备用。
1.2.2 PBS的配置。参照 《培养细胞学与细胞培养技术》[1]配置。
1.2.3 抗菌药物的配置。 按照厂家推荐药物治疗量[2], 制备治疗量 (标记1X) 、2 倍治疗量 ( 标记2X) 和4 倍治疗量 (标记4X) 的抗菌药物原液, 过滤除菌后置-20℃保存备用。
1.2.4 药敏纸片的制备。 在无菌条件下, 分别吸取不同浓度的药液0.5 m L, 加入装有纸片的青霉素瓶中, 用纸密封瓶口, 浸泡1 h, 让纸片将药液充分吸净。然后, 将纸片散开平铺于灭菌平皿中, 无菌室内过夜, 待纸片完全干燥后, 收集在青霉素瓶内, 密封, 贴上标签, 置于-20℃保存备用。
1.2.5 自制药敏纸片抑菌效果观察。用接种环挑取大肠杆菌接种于肉汤培养基中, 37℃培养24 h后取出, 轻轻振荡使菌液均匀混浊。 用微量移液器吸取0.5 m L注入配好的MH营养琼脂培养基中, 然后用涂菌棒将菌液均匀推开, 待菌液被培养基吸收后用灭菌镊子将制备好的药敏纸片贴在平皿内。每个平皿内贴5 个不同的纸片 (中间1 片, 周围4 片) 。 同时, 按上述方法将从市场上购买来的标准药敏纸片也贴于涂有大肠杆菌的平皿中做对比。将平皿放入电热恒温培养箱内, 37℃培养24 h后取出, 用直尺测量抑菌圈直径。
1.2.6 药物敏感实验判定标准:按抑菌圈直径大小作为敏感性高低的标准, 抑菌圈直径越大表明细菌对该药的敏感性越高[3]。 各种抗菌药物的判断标准, 见表1。
2结果与分析
2.1 自制药敏纸片与市售药敏纸片对大肠杆菌的抑菌效果
抗菌药物不同浓度的自制药敏纸片和商品化药敏纸片对大肠杆菌的抑菌效果见表2。
由表2 可知:青霉素G药物不同浓度的自制药敏纸片和商品化药敏纸片对大肠杆菌的抑菌圈直径为0。 氧氟沙星、链霉素、头孢噻夫钠3 种药物的3 个不同浓度的药敏纸片对实验菌种大肠杆菌的抑菌直径相差不显著 (4mm) 。 与商品化的药敏纸片相比, 2 倍治疗量浓度的药敏纸片和市售药敏纸片的抑菌效果最接近。 其中不管是自制的链霉素药敏纸片还是商品化的链霉素药敏纸片都对实验菌种大肠杆菌产生了耐药性, 而对实验菌种大肠杆菌抑菌效果最佳的是庆大霉素, 其次是卡那霉素, 其结果见图1。
由表2 和图1 可知: 自制药敏纸片和商品化药敏纸片相比, 自制药敏纸片是成功的, 其中2 倍治疗量浓度最佳。
3讨论
3.1药敏试验中菌液浓度的控制很重要。通过试验, 我们观察到同样的操作方法, 若每次涂布的细菌不经过比浊管比对, 它所产生的抑菌圈直径会有差异的, 影响药敏结果的准确性。
3.2 部分药物由于临床上用量较少, 在进行称量过程中比较困难, 容易造成结果出现误差, 我们一般会采用扩大药量的称量, 然后进行逐倍稀释。
3.3 由实验结果可以看出, 部分自制药敏纸片所得抑菌圈直径明显小于商品化的药敏纸片, 原因可能是受药敏纸片所含药液浓度过低、 涂菌不均匀或涂菌过厚所致。 目前市场上兜售劣质兽药的现象比较严重, 有些药物浓度达不到国家规定的标准, 药液浓度低, 自然抑菌效果就差。
参考文献
[1]张卓然主编.培养细胞学与细胞培养技术.上海:上海科学技术出版社, 2004.
[2]中国兽药委员会编.中华人民共和国兽药典.北京:化学工业出版社, 2000.
抑菌效果 篇9
1 材料与方法
1.1 试验材料
银杏叶由长沙博健生物科技有限公司提供, 产品标准号:Q/ADPG001-2008;黄芪、白术、党参等均购自福建紫金医药连锁有限公司;金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 、大肠杆菌 (Escherichia coli) 由龙岩学院动物医学研究所提供。
1.2 试验方法
1.2.1 银杏叶复方制剂的研制
按一定比例称取银杏叶粉、黄芪、白术、党参等共10 g加蒸馏水250 mL混匀。用超声波细胞粉碎机于400～500次/min振荡6 s, 间歇7 s共50次。然后于65℃恒温水浴浸提1 h, 连续2次水浴浸提, 抽滤并保留滤液。滤渣再用等量75%乙醇250 mL于65℃水浴浸提1 h, 抽滤后合并2次滤液。将滤液放于4℃冰箱过夜, 使其沉淀后分离沉淀制得样品原液。使用旋转蒸发仪进行浓缩, 制得样品浓缩液。经干燥得银杏叶复方制剂的浸膏[4]。
1.2.2复方制剂提取工艺的研究
在查阅相关资料的基础上经对比试验证实, 采用75%乙醇作溶剂并用超声波细胞粉碎机作预处理较溶剂和其他浓度的乙醇溶液可更好地提取银杏叶复方制剂[5]。因此, 采用3因素3水平的正交试验设计研究提取工艺参数, 其中固液比、浸提温度和浸提时间3个因素的3个水平分别为1:25、1:20、1:15, 75、65、60, 1、2、3按正交表L9 (33) 安排试验, 重复3次取平均值。
1.2.3 抗生素的配制
各种抗生素的浓度分别为:环丙沙星250 ug/mL、庆大霉素125 ug/mL、恩诺沙星300 ug/mL、磺胺嘧啶300 ug/mL、泰乐菌素150 ug/mL、青霉素225 ug/mL、氟苯尼考250 ug/mL。
1.2.4 复方制剂抑菌效果试验
采用滤纸片法[6]:将直径5 mm的滤纸片灭菌、烘干, 放入经最佳工艺制得的银杏叶复方制剂浸膏中浸泡3 h备用。另外取若干滤纸片分别放入75%乙醇溶液和灭菌蒸馏水中作对比空白试验。均浸泡3 h备用。将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别配制成104～105cfu/mL菌悬液。置4℃冰箱中备用。取制备好的菌悬液0.2 mL, 滴入倒有相应固体培养基的平皿表面。然后夹取含复方制剂的滤纸片均匀地放在含菌平板上。每种致病菌设3个重复, 同时作2个空白对照。24 h后测量其抑菌圈直径。
1.2.5 复方制剂最低抑菌浓度的试验
采用琼脂稀释法[6], 用75%乙醇配制复方制剂的6种不同浓度:1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125 g/mL。将以上6种浓度按1:9的比例在复方制剂中加入溶化的营养琼脂, 使复方制剂的浓度分别为:0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125 g/mL。当灭菌完后的复方制剂温度降到40～50℃时倒入灭菌的平皿中。待平板凝固后放于37℃的温箱中干燥2 h。然后取出平板冷却后加80 uL的菌悬液, 再将平板至于37℃的光照培养箱中培养, 对照组不接种菌种, 24 h后观察结果。取无菌生长的最低浓度作为最低抑菌浓度, 受试菌设3个重复。
1.2.6 抑菌效果对比试验
在无菌条件下制备好带菌平板培养基。将直径5 mm的抗菌滤纸片分别置于银杏叶复方制剂液和上述抗生素药液中浸泡2 h, 取出沥干。将沥干后的抗菌滤片放在带菌平板培养基上, 每皿3片, 每片之间的距离要相等。金黄色葡萄球菌置于30～32℃培养24 h。大肠杆菌置于37℃培养24 h。测定抑菌圈直径的大小。
2 试验结果
2.1 复方制剂提取工艺的研究结果
提取工艺条件的确定[7]采用正交试验设计方案, 按L9 (33) 进行试验后的各试样的统计分析结果见表1。
从表1的结果可知, 影响提取率的主要为固液比, 其次是浸提温度和浸提时间;最佳提取工艺条件固液比为1:25, 浸提温度为65℃, 浸提时间为1 h。
2.2银杏叶复方制剂的抑菌效果
抑菌效果试验, 参考NCCLS推荐的标准进行判断[8]。银杏叶复方制剂及常见抗菌药物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌效果见表2。从表2可以看出, 金黄色葡萄球菌对银杏叶复方制剂表现为高敏, 大肠杆菌对银杏叶复方制剂表现为低敏。银杏叶复方制剂对金黄色葡萄球菌的抑菌效果优于青霉素, 但是不及环丙沙星、恩诺沙星、磺胺嘧啶、泰乐菌素、氟苯尼考、庆大霉素。银杏叶复方制剂对大肠杆菌的抑菌效果优于恩诺沙星、磺胺嘧啶、氟苯尼考、青霉素, 但是不及环丙沙星、庆大霉素、泰乐菌素。
注:系3个重复的平均数。“-”表示未见明显的抑菌圈。
2.3 最低抑菌浓度试验
最低抑菌浓度试验结果见表3。可知银杏叶复方制剂对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度分别为0.05、0.025 g/mL。
注:“-”表示平板没有细菌生长, “+”表示有细菌生长。
3 结论与分析
3.1 银杏叶复方制剂
在前期对银杏叶提取物研究的基础上[2,3], 采用超声波辅助提取法, 通过正交试验得到银杏叶复方制剂的最佳浸提条件固液比为1:25, 浸提温度为65℃, 浸提时间为1 h。该试验的优点是采用了超声波细胞粉碎技术, 利用超声波产生的强烈振动、高的加速度、强烈的空化效应、搅拌等作用, 对工艺条件进行优化, 并且免去了高温对有效成分的影响。试验还应用旋转蒸发仪对中草药液在真空下进行浓缩。此法的优点是能回收乙醇, 可更好地保护银杏叶复方制剂中的活性成分。
3.2 抑菌试验
银杏叶复方制剂对金黄色葡萄球菌有很强的抑制作用, 但是对大肠杆菌的抑菌效果不明显。前期研究表明银杏叶提取物对大肠杆菌有较好的抑菌效果[2,3], 说明银杏叶复方制剂对大肠杆菌的抑菌效果不及银杏叶提取物效果好。这种差异主要与二者成分有关, 银杏叶复方制剂中的党参、白术主要属于补益补气药, 无抑菌效果[9];黄芪对金黄色葡萄球菌有抑菌效果, 但对大肠杆菌抑菌效果不明显[10]。因此, 银杏叶复方制剂对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌效果, 而对大肠杆菌的抑菌效果不明显。
摘要：试验研究了银杏叶复方制剂的最佳提取工艺条件, 并用银杏叶复方制剂与抗菌药物对畜禽常见致病菌的抑菌效果进行了对比试验。研究表明:银杏叶复方制剂的最佳提取工艺条件为固液比1:25、浸提温度65℃、浸提时间1h。抑菌试验表明:金黄色葡萄球菌对银杏叶复方制剂表现为高敏, 大肠杆菌对银杏叶复方制剂表现为低敏。银杏叶复方制剂对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最低抑菌浓度分别为0.025g/mL、0.05g/mL。
关键词：银杏叶,复方制剂,提取工艺,体外抑菌
参考文献
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抑菌效果 篇10
1 仪器与材料
1.1 仪器
电子天平 (浙江凯丰集团有限公司, 型号:KF10002) ;水浴锅 (江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司, 编号:LKTC-B1-T) ;超净工作台;微量加样器;YX-280D-Ⅱ电热蒸汽灭菌器。
1.2 饮片
大黄购自安徽大别山中药饮片有限公司 (批号:150316) , 诃子购自亳州市永刚饮片厂有限公司 (批号:150922) , 红花购自安徽井泉集团中药饮片有限公司 (批号:20150902) , 经鉴定均符合《中华人民共和国药典》2015版一部的规定。
1.3 试药
壳聚糖 (批号:F20100928, 国药集团化学试剂有限公司) ;冰乙酸 (批号:201502280, 成都市科龙化工试剂厂) ;胰酪大豆胨液体培养基 (批号:150506, 北京三药科技开发公司) ;胰酪大豆胨琼脂培养基 (批号:140917, 北京三药科技开发公司) ;沙氏葡萄糖液体培养基 (批号:1409182, 北京三药科技开发公司) ;沙氏葡萄糖琼脂培养基 (批号:150123, 北京三药科技开发公司) ;pH=7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 (批号:140728, 北京三药科技开发公司) 。
1.4 菌种
金黄色葡萄球菌[CMCC (B) 26003], 白色念珠菌[CM-CC (F) 98001], 铜绿假单胞菌[CMCC (B) 10104]均购自江苏省食品药品检验院。
2 方法
2.1 培养基制备
按照培养基说明书进行配制, 将配置好的培养基加入锥形瓶以及试管中, 密封好, 放入灭菌锅中于121℃下灭菌30min, 冷却后, 置于冰箱中保存备用, 其中金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌培养基温度为32℃, 白色念球菌培养基为25℃。
2.2 菌种活化
在无菌条件下用划线法将冷冻保存的标准菌株接入琼脂培养基中, 25℃下培育24h进行活化。将活化好的菌种在无菌条件下挑单个菌落接入已灭菌的液体培养基, 金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌在25℃条件下培养, 白色念珠菌在32℃条件下培养24h, 作为原菌液, 再用生理盐水稀释, 金黄色葡萄球菌稀释至10-6, 白色念珠菌稀释至10-4, 备用。
2.3 供试品制备
壳聚糖溶液配制:取壳聚糖2g, 加1%醋酸200mL, 搅匀, 40℃水浴放置24h, 得到1%壳聚糖胶体溶液。样品1:疮灵液水提液;样品2:取疮灵液水提液50mL, 加95%乙醇至乙醇浓度为60%, 冷处静置24h, 抽滤, 取上清液, 挥去乙醇, 加水定容至50mL;样品3:取疮灵液水提液50mL, 缓慢加入1%壳聚糖胶体溶液5mL, 搅匀, 冷处静置24h, 4 000r/min离心20min, 取上清液, 加水定容至50mL;样品4:取疮灵液水提液50mL, 8 000r/min离心10min, 取上清液, 加水定容至50mL。
2.4 最小抑菌浓度 (MIC) 测定
取9管装有1mL液体培养基的试管, 以无菌操作法在第1支试管中加入供试药液1mL, 摇匀, 吸取1mL溶液加入第2管中, 摇匀, 同法稀释至第9支试管。取菌液0.5mL加入以上各管, 培养24h, 其中金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌培养温度为32℃, 白色念珠菌为25℃。观察有无细菌生长并记录, 肉眼观察有无混浊, 混浊为阳性, 澄清为阴性。肉眼观察药物最低浓度管无菌生长者为受试药对该菌的MIC。
2.5 最小杀菌浓度 (MBC) 测定
从最小抑菌浓度 (MIC) 试验结果为“-”的试管中, 用接种环蘸取适量划线涂布于固体培养基上, 培养24h, 其中金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌培养温度为32℃, 白色念珠菌为25℃, 观察有无菌落生长。以培养基表面无细菌生长的最小药物浓度为受试药对该菌的MBC。
3 结果
由抑菌试验结果可知, 壳聚糖沉淀法制得的样品3和离心法制得的样品4在现有浓度下对铜绿假单胞菌未测出最小杀菌浓度MBC, 而醇沉法制得的样品2对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和铜绿假单胞菌均有良好的抑菌杀菌作用, 明显优于其他三种样品。因此, 本实验优选醇沉法作为疮灵液水提液的纯化工艺。见表1。
4 讨论
引起外科感染的常见化脓性致病菌主要为革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌, 但是随着抗菌药物、免疫抑制剂、激素及创伤性诊断治疗手段的广泛应用[2], 真菌引起的感染也成为严重的外科术后并发症[3]。因此本文选用金黄色葡萄球菌作为革兰氏阳性菌的代表菌, 铜绿假单胞菌作为革兰氏阴性菌的代表菌以及白色念珠菌作为真菌的代表菌, 进行抑菌试验, 检测各样品的抑菌效果。
金黄色葡萄球菌属于革兰氏阳性球菌, 是人类化脓感染中最常见的病原菌, 金黄色葡萄球菌可通过多种途径侵入机体, 可引起疖、痈、外科切口和创伤等局部化脓感染, 也可引起肺炎、化脓性关节炎、骨髓炎、脑膜炎等, 甚至败血症、脓毒血症等全身感染[4]。有研究表明, 金黄色葡萄球菌引起的感染分为三种类型:一是化脓性炎症, 如肺炎、脑膜炎、败血症、脓毒血症等;二是毒素性疾病, 如食物中毒、烫伤引起的皮肤综合征以及毒性休克综合征等;三是肠炎[5]。近年来, 耐药的金黄色葡萄球菌已成为医院感染的重要来源之一, 也成为全世界需要共同面对的严重问题。
铜绿假单胞菌是一种革兰氏阴性菌, 广泛分布于土壤、水、空气及人体皮肤、肠道、呼吸道中[6], 在儿童皮肤分离率可达25%, 是医院感染的重要病原菌之一[7], 也是医院外科伤口感染的最常见致病菌。其检出率长居临床分离的革兰氏阴性非发酵菌首位[8]。
白色念珠菌是一种真菌, 当人体免疫功能或一般防御力下降或正常菌群相互制约作用失调时大量繁殖, 侵入细胞引起疾病。切口感染是外科手术后常见并发症, 随着广谱抗菌药物、肾上腺皮质激素以及免疫抑制剂的广泛应用, 导致条件致病性真菌大量繁殖, 特别是老年性疾病的术后切口内真菌感染增多, 成为重要的医院感染之一[3]。
壳聚糖沉淀法被广泛运用于制剂纯化工艺, 壳聚糖本身具有天然抗菌性能, 能够有效抑制细菌和真菌生长与繁殖, 但是壳聚糖的抑菌作用受分子量、浓度、pH值以及菌株本身的影响。壳聚糖对于革兰氏阳性菌的抑菌能力随着分子量的上升而降低, 而对于革兰氏阴性菌则相反。一般随着壳聚糖溶液浓度增加, 抑菌能力增强。壳聚糖在酸性条件下抑菌杀菌能力强, 随着pH升高, 抑菌能力减弱, 当pH>7时, 壳聚糖不具有杀菌能力。此外, 壳聚糖对革兰氏阳性菌的抑菌作用强于革兰氏阴性菌, 对真菌抑制作用较弱[9]。这些可能是影响壳聚糖沉淀法抑菌杀菌效果的原因。
本研究综合比较各样品的最小抑菌浓度MIC值与最小杀菌浓度MBC值, 发现乙醇沉淀法制得的样品对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌的抑菌效果优于壳聚糖沉淀法和离心制得的样品。故应选用乙醇沉淀法作为疮灵液水提液的纯化工艺。
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抑菌效果 篇11
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 粗叶悬钩子叶子
采自福建省永定县, 晒干备用。
1.1.2 供试菌株
大肠杆菌 (Escherichia coli) 、沙门氏菌 (Salmonella sp) 、金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aurreus) , 由龙岩学院生命科学学院微生物实验室提供。
1.1.3 培养基
大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌采用牛肉膏蛋白胨培养基。
1.1.4 主要仪器设备
FW80高速万能粉碎机 (天津市泰斯特仪器有限公司) 、DK-S24型电热恒温水浴锅 (上海森信实验仪器有限公司) 、2XZ-2型旋片式真空泵 (临海市谭氏真空设备有限公司) 、D2F-6020真空干燥箱 (上海精宏实验设备有限公司) 、LDZX-30KBS立式压力蒸汽灭菌器 (上海申安医疗器械厂) 、SW-CJ-1FD型单人双面净化工作台 (苏州净化设备有限公司) 、SHP-150生化培养箱 (上海精宏实验设备有限公司) 、DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱 (上海精宏实验设备有限公司) 。
1.2 方法
1.2.1 粗叶悬钩子叶子乙醇提取物提取条件研究
粗叶悬钩子叶子经粉碎后过筛, 取一定质量粉末, 以80%乙醇为浸提溶剂, 在前期单因素试验的基础上, 选取料液比、提取时间、提取温度三个因素的最优试验范围, 以提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径大小作为指标, 通过正交试验确定最佳提取条件。提取液经过滤除渣、弃滤液沉淀物后, 置于真空度为0.09MPa (60℃) 的真空干燥箱中浓缩, 制得粗叶悬钩子叶子乙醇提取物浸膏, 4℃保藏备用。正交试验因素水平见表1。
1.2.2 粗叶悬钩子叶子乙醇提取物抑菌效果测定
采用纸片法[5], 取直径7mm灭菌滤纸片, 放入由最佳提取条件制得的粗叶悬钩子叶子乙醇提取物的浸膏中浸泡12h备用。挑取各供试菌种进行斜面活化后, 挑取部分菌落于无菌生理盐水中, 制成菌悬液 (菌体溶度约为104~105CFU/mL) 。取各供试菌悬液0.2mL, 涂布于相应的平板中, 放置15min后, 将已风干的滤纸片贴在平板上, 每个平板贴3片, 并以生理盐水为对照, 每种供试菌重复3次。各供试菌在培养一段时间后, 测定滤纸片抑菌圈直径大小 (mm) , 并参考NCCLS推荐的标准进行判断[6]。以抑菌圈直径>20mm为极敏;抑菌圈直径在15~20mm之间为高敏;抑菌圈直径在10~14mm之间为中敏;抑菌圈直径<10mm为低敏;无抑菌圈为耐药。
1.2.3 粗叶悬钩子叶子乙醇提取物最低抑菌浓度测定
采用琼脂稀释法[7], 制备粗叶悬钩子叶子乙醇提取物终浓度分别为200、100、50、25、12.5g/mL的平板。取各供试菌悬液100μL, 涂布于相应的平板中, 放置15min后, 培养、观察其生长情况。每个浓度重复3次。另取同一浓度系列, 不接种任何菌作为空白对照, 以无菌落生长的最低浓度为最低抑菌浓度[8]。
2 结果与分析
2.1 粗叶悬钩子叶子乙醇提取物提取条件
正交试验结果见表2, 正交试验结果方差分析见表3。由表2和表3可知, A (料液比) 、B (提取时间) 、C (提取温度) 三个因素对粗叶悬钩子叶子乙醇提取物抑菌效果的影响顺序从主到次依次为A (料液比) >B (提取时间) >提取温度 (C) 。由表2中的极差数据R可见, A1值在A内较大, B1值在B内较大, C2值在C内较大, 理论上最优水平为A1B1C2。由于A1B1C2不存在于正交试验组合中, 需要补做试验, 通过3次重复试验测得抑菌圈直径为16.48mm, 此结果与正交试验中的A1B2C2 (16.26mm) 的结果非常接近, 因此将粗叶悬钩子叶子乙醇提取物的最佳提取条件确定为A1B2C2, 即料液比为1︰10 (g/mL) 、提取时间为1.5h、提取温度为70℃, 此时粗叶悬钩子叶子乙醇提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为16.26mm。
注:F0.05 (2, 2) =19.00, F0.01 (2, 2) =99.00。
2.2 粗叶悬钩子叶子乙醇提取物抑菌效果
粗叶悬钩子叶子乙醇提取物对供试菌的抑菌效果见表4。由表4可知, 该提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好, 其次是沙门氏菌、大肠杆菌, 抑菌圈分别为16.48mm、15.82mm、15.50mm。
2.3 粗叶悬钩子叶子乙醇提取物最低抑菌浓度
粗叶悬钩子乙醇提取物对供试菌的最低抑菌浓度见表4。由表4可知, 该提取物对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度分别为100mg/mL、50mg/mL和50mg/mL。
3 讨论
粗叶悬钩子具有较高的营养和药用价值, 在我国传统中医药中应用广泛。目前, 有关粗叶悬钩子的药理活性研究仅有零星报道, 主要集中在抗肝损伤方面[4], 而有关粗叶悬钩子的抗菌作用研究还未见报道。现代药理学研究表明, 粗叶悬钩子叶子的化学成分复杂, 其活性成分主要包括三萜、黄酮、鞣质、甾醇等化合物[4], 而且这些化合物具有抗菌、杀菌作用[9]。本试验以80%乙醇为浸提溶剂, 研究了粗叶悬钩子叶子乙醇提取物对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果, 结果发现, 以提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径大小作为指标, 粗叶悬钩子叶子乙醇提取物的最佳提取条件为料液比1∶10、提取时间1.5h、提取温度70℃。在此条件下进行抑菌试验, 粗叶悬钩子叶子乙醇提取物对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌具有明显的抑菌效果, 其抑菌圈直径分别为15.50mm、15.82mm和16.48mm, 最低抑菌浓度分别为100mg/mL、50mg/mL和50mg/mL。因试验选用的菌种较少, 有关粗叶悬钩子的抗菌作用还有待于深入研究。
摘要：目的:研究粗叶悬钩子叶子乙醇提取物的抑菌效果。方法:以80%乙醇为浸提溶剂, 研究粗叶悬钩子叶子乙醇提取物对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果。结果:粗叶悬钩子叶子乙醇提取物的最佳提取条件为料液比1∶10, 提取时间为1.5h, 提取温度为70℃, 在此条件下进行抑菌试验, 粗叶悬钩子叶子乙醇提取物对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌具有明显的抑菌效果, 其抑菌圈直径分别为15.50mm、15.82mm和16.48mm, 最低抑菌浓度分别为100mg/mL、50mg/mL和50mg/mL。结论:粗叶悬钩子叶子乙醇提取物对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均具有明显的抑菌效果。
关键词：粗叶悬钩子叶子,提取物,抑菌效果
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