联合抑菌（精选7篇）
联合抑菌 篇1
硫酸阿米卡星是广谱、半合成的氨基糖苷类抗生素, 对各种革兰阳性菌、阴性菌及若干分枝杆菌属均有较强的抗菌活性, 1976年获FDA批准使用。硫酸阿米卡星最突出的优点是能耐受多种肠道革兰阴性杆菌和绿脓杆菌所产生的乙酰转移酶、磷酸转移酶及核苷酸转移酶[1], 并且对其他氨基糖苷类产生耐药性的菌株依然敏感。甘氨酸作为一种新型的细胞保护剂和内毒素颉颃剂[2,3,4], 能明显降低血浆肠源性内毒素水平和转氨酶活性, 下调肝脏组织脂多糖结合蛋白 (LBP) mRNA及CD14基因和蛋白的表达[5], 使肝脏功能得到明显改善。
硫酸阿米卡星与甘氨酸联合应用在国内外尚未见报道, 本研究通过对大肠杆菌、绿脓杆菌及沙门杆菌进行硫酸阿米卡星与甘氨酸的体外联合抑菌试验, 以期了解硫酸阿米卡星与甘氨酸体外联用能否增强抑菌效果, 为临床用药提供指导意义。
1 材料与方法
1.1 试验菌株
大肠杆菌标准菌株 (菌株编号为ATCC29522) 、绿脓杆菌标准菌株 (菌株编号为ATCC27853) , 均购自中国兽医药品监察所;猪源性致病性沙门杆菌、大肠杆菌及绿脓杆菌各10株, 分离自临床。
1.2 药品
硫酸阿米卡星, 批号为37021349, 含量为674 IU/mg, 齐鲁某公司生产;甘氨酸, 批号为12020568, 含量为99.9%, 天津某公司生产。
1.3 培养基
MH肉汤培养基、营养琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、绿脓杆菌鉴别培养基, 均购自中国陆桥技术有限公司。
1.4 主要仪器
双人双面超净工作台 (型号为SW-CJ-2F) , 苏州净化设备有限公司生产;电热恒温培养箱 (型号为DHP-9272) , 山东龙口市先科仪器公司生产;立式压力蒸气灭菌器 (型号为B×M-30R) , 上海博讯实业有限公司生产;紫外分光光度计, 上海奥析科学仪器有限公司生产;电子分析天平, 豪斯国际贸易上海有限公司生产;大龙微量移液器 (10~50μL、200~1 000μL) , 上海赛颇生物科技有限公司生产。
1.5 菌液的制备
试验前将菌种培养、复壮并划线分离出单个菌落, 挑取2~3个单个菌落接种到3~5 m L MH肉汤培养基中, 于37℃培养8~10 h, 以平板计数法[6]进行细菌计数。
1.6 药液的制备
将硫酸阿米卡星与甘氨酸分别用p H值为7.8的磷酸盐缓冲液和生理盐水配制成浓度为1 280μg/m L和65 536μg/m L的储备液, 无菌滤器过滤, 备用。
1.7 单药最小抑菌浓度 (MIC) 的测定
参考抗生素敏感试验[7]中微量肉汤稀释法分别测定硫酸阿米卡星与甘氨酸对36株细菌 (临床菌株和标准菌株) 的MIC值, 接菌量为1×105cfu/m L, 37℃培养18~24 h, 观察结果。每个菌落重复3次。同时以大肠杆菌标准菌株、绿脓杆菌标准菌株进行质量控制。
1.8 联合药敏试验
采用微量肉汤棋盘稀释法[8]测定硫酸阿米卡星与甘氨酸联用对30株细菌 (临床菌株) 体外联合抑菌的MIC值。以硫酸阿米卡星和甘氨酸对应菌MIC值的16, 8, 4, 2, 1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32倍浓度在96孔反应板上按纵列和横列进行联合。接菌量为1×105cfu/m L, 37℃培养18~24 h, 观察结果。
1.9 结果判定
以部分抑菌浓度 (FIC) 指数作为联合药敏试验的判断依据。判断标准:FIC<0.5为协同作用, 0.5≤FIC≤1为相加作用, FIC>1为无关作用。计算公式:FIC指数=硫酸阿米卡星联合时的MIC/硫酸阿米卡星单用时的MIC+甘氨酸联合时的MIC/甘氨酸单用时的MIC。
2 结果
2.1 硫酸阿米卡星与甘氨酸单用及联合应用对大肠杆菌的抑菌结果 (见表1)
注:1号菌株为大肠杆菌标准菌株。
2.2 硫酸阿米卡星与甘氨酸单用及联合应用对绿脓杆菌的抑菌结果 (见表2)
注:12号菌株为绿脓杆菌标准菌株。
2.3 硫酸阿米卡星与甘氨酸单用及联合应用对沙门杆菌的抑菌结果 (见表3)
3 讨论
研究发现, 单用硫酸阿米卡星对大肠杆菌和绿脓杆菌的抗菌活性较好, 其MIC值在0.25~2μg/m L之间, 仅有1株大肠杆菌MIC值达到4μg/m L。沙门杆菌对硫酸阿米卡星具有一定的耐药性, 其MIC值在4~8μg/m L之间。甘氨酸对大肠杆菌、绿脓杆菌及沙门杆菌的MIC值均在8 192~16 384μg/m L之间, 说明甘氨酸只有在高浓度时具有一定的抑菌作用。硫酸阿米卡星及甘氨酸联合应用的MIC值比单独用药至少降低1倍, 联合用药抗菌活性均有所提高, 其中对沙门杆菌的抑制作用最为显著, 说明联合应用能够增强抑菌效果。
两种药物联合应用后对大肠杆菌和绿脓杆菌主要表现为相加作用, 均占83.3%, 最佳用药比例为16∶1;对沙门杆菌表现为协同作用, 占100%, 最佳用药比例为32∶1, 说明沙门杆菌对两种药物联合非常敏感。上述结果表明, 不同细菌对两种药物联合的敏感性不同, 联合用药的最佳比例也存在一定差异, 在处方的筛选过程中需要充分考虑该因素。
4 结论
硫酸阿米卡星与甘氨酸体外联合可增强抑菌效果, 联用后不仅解决了硫酸阿米卡星本身对机体的不良影响, 同时也决了硫酸阿米卡星在杀菌过程中产生内毒素对机体的不良损害, 具有一定的临床指导意义。这一研究为清除内毒素污染、防治内毒素的致病作用奠定了临床基础, 也为临床指导用药提供了参考。
参考文献
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[5]陈玺华, 王锋, 韩德五, 等.甘氨酸抗内毒素性休克和肝损伤的作用及其机制[J].中华实验外科杂志, 2003, 20 (5) :415-417.
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[8]倪语星, 洪秀华.细菌耐药性监测与抗感染治疗[M].北京:人民军医出版社, 2002.
联合抑菌 篇2
1材料
1. 1菌株
宠物源大肠埃希菌( G5) ,由青海大学农牧学院动物医学系预防实验室提供。
1. 2供试药品
硫酸庆大霉素注射液[规格为10 mL: 0. 2 g,批准文号为兽药字( 2008 ) 270111505,批号为20110306],陕西秦东生物药业有限公司生产; 磺胺嘧啶钠注射液[规格为10 mL: 1 g,批准文号为兽药字( 2006) 040231634,批号为20110401],山西芮城大禹动物药品有限责任公司生产; 注射用青霉素钾[规格为160万U / 支,批准文号为兽药字( 2005) 160071253,批号为201062826],张家口科泰动物药业有限公司生产; 柴胡注射液[规格为2 g/10 mL,批准文号为兽药字( 2006) 270155137,批号为110102],西乡长江动物药品有限责任公司生产; 黄芪多糖注射液[规格为10 mL: 0. 2 g,批准文号为兽药字( 2006) 03001272,批号为1007013],河北远征药业有限公司生产。
将各种药物用适宜溶剂溶解,稀释后浓度为1 000 μg / mL,121 ℃ 高压蒸气灭菌20 min后置4 ℃ 冰箱中备用,使用期限为1周。
1. 3培养基
营养肉汤、营养琼脂,均按常规方法配制。
2方法
2. 1制备菌液
2. 1. 1菌种的培养复活菌种后,挑取新鲜培养的大肠埃希菌单个菌落3个,接种于3 mL的营养肉汤中,37 ℃培养24 h。
2. 1. 2菌液浓度的确定采用平皿表面计数法。吸取上述菌液1 mL,用生理盐水进行1 × 10- 1递度稀释,分别取1 ×10- 5,1 × 10- 6,1 × 10- 7,1 × 10- 8,1 × 10- 9,1 ×10- 105个稀释度的菌液各0. 1 mL,在5个营养琼脂平板上摊开,37 ℃培养24 h后计数,得1 × 10- 10稀释度的菌落数9个,则原菌液浓度为9 × 1010cfu / mL。临用前用营养肉汤稀释使最终菌液浓度为9 ×105cfu / mL。
2. 2单药最小抑菌浓度( MIC) 的测定
参照参考文献[3]。采用试管2倍稀释法分别测定硫酸庆大霉素注射液、磺胺嘧啶钠注射液、青霉素钾、柴胡注射液及黄芪多糖注射液5种抗菌药物对大肠埃希菌的MIC。
2. 3体外联合抑菌试验
采用棋盘法。根据测得的各药物单独对大肠埃希菌的MIC,以其中2种药物MIC的4,2,1,1/2,1/4倍分别进行联合[4]。结果判断依据: FIC指数= ( 甲药联合时的MIC/甲药单测时的MIC ) + ( 乙药联合时的MIC / 乙药单测时的MIC) ; FIC指数≤0. 5为协同作用;0.5
3结果
3. 1 MIC的测定结果
硫酸庆大霉素注射液、磺胺嘧啶钠注射液、青霉素注射液、柴胡注射液及黄芪多糖注射液这5种抗菌药物对大肠埃希菌的MIC分别为6,13,4,47,36 μg/mL。
3. 2体外联合抑菌试验( 结果见表1 ~ 6)
根据FIC计算公式得FIC = 1 + 0. 5 = 1. 5,说明硫酸庆大霉素注射液与柴胡注射液联合抑菌试验呈无关作用。
根据FIC计算公式得FIC = 0. 5 + 0. 5 = 1,说明硫酸庆大霉素注射液与黄芪多糖注射液联合抑菌试验呈相加作用。
注: - 表示无细菌生长,+ 表示有细菌生长; A为单药对照硫酸庆大霉素注射液,B为单药对照柴胡注射液。
注: - 表示无细菌生长,+ 表示有细菌生长; A为单药对照硫酸庆大霉素注射液,C为单药对照黄芪多糖注射液。
根据FIC计算公式得FIC =1 +1 =2,说明磺胺嘧啶钠注射液与柴胡注射液联合抑菌试验呈无关作用。
注: - 表示无细菌生长,+ 表示有细菌生长; B为单药对照柴胡注射液,D为单药对照磺胺嘧啶钠注射液。
注: - 表示无细菌生长,+ 表示有细菌生长; C为单药对照黄芪多糖注射液,D为单药对照磺胺嘧啶钠注射液。
根据FIC计算公式得FIC = 1 + 2 = 3,说明磺胺嘧啶钠注射液与黄芪多糖注射液联合抑菌试验呈颉颃作用。
根据FIC计算公式得FIC = 0. 5 + 0. 5 = 1,说明青霉素钾与柴胡注射液联合抑菌试验呈相加作用。
注: - 表示无细菌生长,+ 表示有细菌生长; B为单药对照柴胡注射液,E为单药对照青霉素钾。
根据FIC计算公式得FIC =0. 5 +0. 5 =1,说明青霉素钾与黄芪多糖注射液联合抑菌试验呈相加作用。
注: - 表示无细菌生长,+ 表示有细菌生长; C为单药对照黄芪多糖注射液,E为单药对照青霉素钾。
4讨论
隔夜茶水抑菌活性的研究 篇3
本实验采用滤纸片扩散法研究产自四川省成都市的普通绿茶对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、青霉菌四种常见微生物的抑制作用,为隔夜茶水抑菌作用的利用提供科学的理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
绿茶:普通绿茶(特级),购买于攀枝花联盟超市数量2包,每包200 g。
培养基:牛肉膏蛋白胨培养基和察氏培养基。
菌种:枯草芽孢杆菌(Bacillus subtitles)、大肠杆菌(Escherichia coli)、黑曲霉(Aspergillus niger)、青霉(Penicillium),攀枝花学院生物与化学工程学院生物实验室提供。
打孔器;无菌操作台。
1.2 分析方法
采用滤纸片扩散法[3],由于滤纸片已浸渍有隔夜茶水,如果能杀死或抑制平皿中试验菌的生长,则在滤纸片周围会出现一个无菌生长的透明带,即抑菌圈,抑菌圈直径越大,说明隔夜茶水对此种试验菌的抑制效果越好。
1.3 一道、二道隔夜茶水抑菌活性的测定
1.3.1 绿茶的泡制
一道茶的泡制:取30 g绿茶于150 mL开水中,泡制12 h,抽滤,取滤液,121 ℃灭菌15 min,茶水浓度为0.20 g/mL,再用无菌水稀释为0.15 g/mL,0.10 g/mL,0.08 g/mL。
二道茶的泡制:取30 g绿茶于150 mL开水中,待茶叶基本泡胀后将水倒出,再加入100 mL开水,泡制12 h。抽滤,取滤液,121 ℃灭菌15 min,仍将二道隔夜茶初始浓度记为0.20 g/mL,再用无菌水稀释为0.15 g/mL,0.10 g/mL,0.08 g/mL。
1.3.2 菌悬液的制备
每种菌种分别挑取两环菌苔,各用无菌水制成含菌数为106 cfu/mL的菌悬液使用。
1.3.3 抑菌圈的测定
采用滤纸片扩散法,用打孔器将滤纸制成直径6 mm的圆片,160 ℃灭菌30 min备用。再用无菌镊子将滤纸片放入不同浓度的一道、二道隔夜茶水中,每种浓度的提取液用3片滤纸片浸泡,将各种待试菌悬液各取1 mL在固体培养基上涂布制得含菌平板,用无菌镊子将浸透各种浓度的的滤纸片贴在含菌平板上,每个平皿等距离放四片,其中三片浸过隔夜茶水,另外一片只浸有生理盐水。每个处理做三次重复,把每个处理过的培养皿放到恒温培养箱中培养。将枯草芽孢杆菌和大肠杆菌于37 ℃的恒温培养箱里培养24 h,将黑曲霉和青霉置于28 ℃的恒温培养箱里培养48 h。之后再用普通直尺对光测量抑菌圈直径的大小,比较各原液对各试验菌种的抑菌效力。
1.4 隔夜茶水最小抑菌浓度(MIC)的测定
泡制浓度为0.20g/mL的一道隔夜茶水,用适量无菌水进行稀释,得到浓度为0.100、0.091、0.077、0.071、0.067、0.063、0.059、0.056、0.053、0.050 g/mL隔夜茶水。取1 mL提取稀释液与9 mL培养基混合均匀后倒入平板,凝固后加入100 μL 106 cfu/mL的菌悬液涂布均匀,放至37 ℃/28 ℃培养24 h后观察结果,以不长菌落的最高稀释浓度为最小抑菌浓度(MIC)。
2 结果与分析
2.1 不同浓度隔夜茶水的抑菌效果
注:“—”表示在滤纸片周围没有抑菌圈出现。
注:“—”表示在滤纸片周围没有抑菌圈出现。
从表1和表2实验数据可以看出,隔夜茶水对两种霉菌没有抑制作用,对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌有抑制作用,抑制作用随着浓度的增加而增强,且一道茶的抑菌效果强于二道茶。
2.2 一道隔夜茶水最小抑菌浓度的测定
“-”表示无菌生长;“+”表示有菌生长。
由表3可以看出,一道隔夜茶水对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度分别为0.063 g/mL、0.077 g/mL。
3 结 论
实验证实了隔夜茶对细菌有良好的抑制效果,作为一种废弃资源具有很好的应用前景。隔夜茶水之所以具有抑菌作用主要是因为其含有茶多酚,而茶多酚抑菌的结构基础主要是其分子中的酚羟基。而隔夜茶不能抑制霉菌,这可能与霉菌能以茶多酚为碳源维持生长,分泌对茶多酚有高亲和的高分子物质、有抗性的酶或促进含铁细胞分泌铁以隔绝茶多酚的抑菌性等有关[4]。所以从隔夜茶中提取茶多酚用于食品保鲜防腐,既无毒副作用,食用又安全。茶叶能够保存较长的时间而不变质,这是其他的树叶、菜叶、花草所达不到的。茶多酚参入其他有机物(主要是食品)中,能够延长贮存期,防止食品退色,提高纤维素稳定性,有效保护食品各种营养成份,为其综合开发利用开辟新的途径。
参考文献
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[2]陆志科,谢碧霞.植物源天然食品防腐剂的研究进展[J].食品工业科技,2003,24(1):94-96.
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不同来源白鲜抑菌效果比较 篇4
白鲜皮是一种尚未完全开发利用的很有价值的药用资源, 含有多种化学成分, 其中白鲜碱和梣酮是其中的主要有效成分, 文献报道, 白鲜皮有抑菌作用, 为进一步验证和研究其抑菌活性, 本实验利用不同产地的白鲜皮, 观察其对大肠杆菌、金黄色葡萄菌、枯草芽孢杆菌3种常见菌种的抑制作用, 以比较不同来源的白鲜皮的抑菌效果。
1 材料与方法
1.1 实验材料
2012年夏季, 分别在吉林省长春、柳河、通化, 辽宁清原、内蒙古阿荣旗采集白鲜鲜样, 采后室内清洗、干燥。
1.2 方法
1.2.1 采用HPLC法测根皮中梣酮和黄柏酮含量。
1.2.2 白鲜皮抑菌效果比较。
实验所用细菌为大肠杆菌 (Escherichia coli) 、金黄色葡萄球菌 (Staphyloccocus aureus) 、枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 由通化师范学院生物系微生物实验室提供, 采用营养琼脂培养基培养细菌, 121℃, 灭菌20min, 37℃恒温培养箱培养。纯化后, 斜面保存。 (1) 不同处理方法白鲜皮抑菌效果比较。5份样品分别用无菌水、95%乙醇溶液和分析纯 (AR) 甲醇溶液3种试剂, 浸泡72h, 比较抑菌效果。 (2) 不同产地的白鲜皮抑菌效果比较。取直径为5mm经灭菌的滤纸片, 分别在上述三种溶液中浸泡30min备用, 然后放在分别涂有上述三种菌的平板上, 同时做对照, 每个处理重复3次, 37℃恒温培养箱中倒置培养24h, 观察结果, 测量抑菌环直径。
2 结果与分析
2.1 不同处理方法白鲜皮抑菌效果比较
在无菌水、95%乙醇和甲醇溶液三个处理中, 只有浸泡在甲醇溶液中的样品对3种菌都有一定的抑制作用, 对大肠杆菌的抑菌效果最明显, 金黄色葡萄球菌次之, 对枯草芽孢杆菌无抑菌作用。
2.2 不同产地的白鲜皮抑菌效果比较
不同产地的白鲜皮对实验细菌的抑菌作用不同, 白鲜皮提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有抑制效果, 尤其对大肠杆菌效果更为明显, 对枯草杆菌无明显抑菌效果。如表1所示, 对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌效果最好的来源于内蒙, 最差的均来源于通化, 效果最好的抑菌环直径是最差的1.88倍。
2.3 不同产地的白鲜皮抑菌活性物质比较
通过抑菌活性物质含量比较发现, 白鲜皮中梣酮含量来自清原的为0.073%最低, 内蒙产地的梣酮含量0.321%是所有产地中最高的;黄柏酮含量, 柳河为0.787%, 其余产地含量均大于1%, 最高含量为通化1.882% (见表2) 。文献报道白鲜皮内梣酮为主要抑菌物质, 但本实验结果却是梣酮含量与抑菌效果不成正比, 可能是由于所采样品生长年限不同引起的。
3 小结
3.1 不同处理方法白鲜皮抑菌效果比较
通过对吉林、辽宁、内蒙古三个省5份地区样品白鲜皮对细菌抗菌作用的比较, 在水浸、95%乙醇溶液浸泡和甲醇溶液浸泡, 甲醇溶液处理的样品有抑菌效果, 其他两种溶液均无明显效果。
3.2 不同产地白鲜皮抑菌效果比较
5份样品中, 抑菌效果最好的来源于内蒙, 并对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌效果较为明显。在供试样品中, 内蒙的样品抑菌环直径最大, 生长年限长, 故抑菌效果可能与生长年限有关。
3.3 不同产地白鲜皮抑菌活性物质比较
不同产地白鲜皮梣酮与黄柏酮含量存在较大差异, 梣酮含量以内蒙产地最高, 含量0.321%;黄柏酮含量以通化产地最高, 达到1.882%。文献报道梣酮为主要的抑菌活性物质, 与本实验结果存在一定差异, 本实验结果表明其抗菌作用可能是两种物质共同作用的结果。因未对两种物质分离提纯进行单独研究, 也没有深入研究两种物质的结构特点和抗菌作用机制, 所以两种物质各自的抗菌作用怎样还有待进一步研究确定。
参考文献
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[3]郭静.白鲜皮提取物止血作用及其理研究[D].成都:成都中医药大学2006, 4 (2) :89-92.
抑菌铜推广联盟在沪成立 篇5
据文献报道，戊二醛交联生物材料时需要1 d时间，而京尼平交联生物材料时需要3 d才可达到较稳定的交联效果[6]，所以本研究考察了用两种交联剂分别交联1～3天后复合生物海绵的各种生物特性。
从实验结果可见，用戊二醛交联的复合生物海绵其交联度高于京尼平交联的复合生物海绵。而交联度越高，表明生物材料间形成的分子内或分子间交联比例就越高，由此引起的生物材料的收缩就越严重，进而使生物材料变得越僵硬，柔韧性和吸水性均下降[7,8]。
抑菌凝胶敷料的生物学评价 篇6
关键词：抑菌凝胶敷料,细胞毒,皮肤刺激,生物学评价
人体皮肤是与外界环境接触的天然屏障,但由于外界疾病因素和创伤等造成损害时,常常会引起水分、电解质的丢失,开放性的创面往往还会引起感染[1]。在早期有效的封闭创面可以很好的减少细菌感染和并发症的产生。抑菌凝胶敷料是南阳市汇博生物技术有限公司研发的一款产品,其主要成分是羟乙基纤维素、甘油和聚六亚甲基单胍盐酸盐,通过浸润伤口覆盖层来湿润伤口,用于溃疡、烧烫伤、术后等伤口护理。为了保证该凝胶敷料应用于人体安全无毒副作用,我们按照国家相关技术要求对该款产品进行生物安全性评价。
1 实验材料和方法
1.1 实验材料:
CO2培养箱购自上海一恒,FC全自动酶标仪购自Thermo,AE2000倒置显微镜购自厦门麦克奥迪,抑菌凝胶敷料(南阳市汇博生物技术有限公司),DMEM高糖培养基(以色列BI公司),胎牛血清(以色列BI公司),L929细胞(购自中科院上海生命科学院),成年新西兰兔,质量2.0～3.Okg,由章丘市金丰肉兔养殖专业合作社提供[许可证号:SCXK(鲁)2014-0006],饲养条件为温度22～24℃,湿度40%～60%。
1.2 实验方法
1.2.1 体外细胞毒性试验:
依据国家标准GB/T16886.5进行[2],实验一共分为4组:实验组,材料浸提液;空白对照组,DMEM高糖培养基;阴性对照组,高密度聚乙烯;阳性对照组,5%o的DMSO溶液。取对数生长期的细胞消化并加入细胞培养液,调节细胞密度为1×104个细胞/ml。试验步骤:将配制好的细胞悬液接种96孔培养板,每组各设6孔,每孔接种100υ1细胞悬液。置5%CO2培养箱37℃培养24 h后,弃去原培养液。阴性对照组加入新鲜细胞培养液,阳性对照组加入5%DMSO溶液,实验组加入试验样品浸提液,每孔100μI,置C02培养箱继续培养48 h。更换培养液后的48 h,置显微镜下观察细胞形态。每孔加入20μI质量浓度为5 g/L的MTT溶液,继续培养4 h后弃去孔内液体,加入150μI DMSO,置振荡器上振荡10 min,在酶标仪450 nm波长下测定OD值(吸光度值),按下式计算相对增殖率(RGR)。
式中:RGR-相对增殖率,%;A-供试品组吸光度;AO-阴性对照组吸光度。
根据分级标准判定(阳性对照组至少为3级反应)。
样品毒性分级标准:0级≥100;1级,80～99;2级,50～79;3级,30～49;4级,0～29。样品合格与否标准:0级和1级判为合格,2级结合形态分析综合评价,3～4级者判为不合格:
1.2.2 皮内刺激试验:
依据.国家标准GB/T 16886.10进行检测[3],实验分为两组,样品组:样品和生理盐水按照1:5(w/w)在70℃下浸提24 h。阴性对照:同上方法制备不含被测样品的0.9%氯化钠注射液作为阴性对照液。选用两只新西兰兔,实验前一天,彻底去除动物背部脊柱两侧被毛,以备注射浸提液。在每只兔脊柱一侧的前5个点使用1 ml注射器皮内注射0.2 ml的样品浸提液,同样,在每只兔脊柱后5个点皮内注射生理盐水。注射后在24 h、48 h和72 h观察记录各注射部位情况。
2 结果
2.1 细胞毒性试验:
阴性对照组和空白对照组,细胞贴壁生长良好,数目正常。阳性对照组细胞变圆,脱离培养孔,呈现漂浮状。实验组细胞生长良好,保持小鼠成纤维细胞的基本形态。空白对照和阴性对照组的平均吸光度值都是0.84,而阳性对照组只有0.18。实验组的增殖率为90.5%,按照细胞毒分级标准为1级,符合国家规定的标准。
2.2 皮内刺激试验:
实验观察72 h表明,样品浸提液组和生理盐水组动物皮肤反应均无红斑,水肿,产品材料等级评分为0,无刺激反应,显示材料对皮肤没有潜在毒性。
3 讨论
作为医用高分子材料,除了要求无毒、不引起生物体病变,还要求材料对于生物体具有良好的组织相容性。羟乙基纤维素属于纤维素衍生物的一种,是碱纤维素和环氧乙烷经醚化反应制备而成的白色或淡黄色无味无毒的纤维状或粉末状的非离子型水溶性纤维素醚[4]。该原料具有很多优良的性质,使其在工业方面得到广泛的应用:具有良好的水溶性,在冷水和热水中均可溶解,对水和盐水具有极强的亲和力,稳定性好,在酸性条件下也不会产生沉淀。羟乙基纤维素的主要用途是作为增黏剂来使用,能够和水中的分散剂、高分子化合物发生作用使体系的黏度大幅度上升,其本身具有非离子型的特性,在水介质中不会离子化,所以可以和许多水溶性的聚合物、表面活性剂、盐共存,是含高浓度电解质溶液的一种优良的胶体增稠剂,并且对许多一价和二价的高浓度电解质溶液有增稠作用。综合以上内容,羟乙基纤维素是一种十分优良的增稠凝胶敷料基质。
新型环保型高分子聚合物——聚六亚甲基单胍盐酸盐具有优越的杀菌活性,属于新一代的杀菌剂,其优越性能主要体现在一下几方面:(1)具有高效的杀菌能力,仅需少量添加就表现出优异的杀菌性能,平均杀灭率99.9%。(2)安全系数高,无毒副作用,对皮肤黏膜、眼睛无刺激,体外细胞毒试验显示细胞毒性小于1级。(3)作用时间持久,独特的杀菌机理,不会引起细菌耐药,长久有效。(4)环境友好型杀菌剂,无色无味、不挥发、不含重金属和酚类物质,对各类处理表面无腐蚀。凭借这些优越的性能,该类杀菌剂广泛应用于医疗卫生、日用化学、纺织、造纸、水产、农业等领域。在本产品中,胍盐作为杀菌防腐剂显示出卓越的性能。前期的微生物抑菌试验中,该产品对伤口中常见的诸如大肠杆菌、绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌等细菌都显示出强大的杀灭效果,杀菌率达到了l00%。
目前对于医疗器械材料的生物相容性评价方法包括动物试验和体外试验,根据材料的性质和作用部位的不同,使用不同的评价方法。目前来说,被中国药典和ISO收录的方法有几十种,但是中国国家标准GB/T16886是国内最权威的医疗器械生物学评价方法。根据产品的预期用途,对该伤口抑菌凝胶敷料进行细胞毒和皮内刺激等生物学评价,目的是为了预知和避免该材料应用于人体后可能导致的不良反应,为进一步的临床研究提供依据。
参考文献
[1]程娟,柯军,颜林.壳聚糖创伤敷料的生物学评价[J].中国医疗器械信息,2011,6(9):40-42.
[2]中华人民共和国国家质量监督检验总局GB16886.5-2005医疗器械生物学评价第5部分,体外细胞毒性试验[S].北京:中国标准出版社,2003.
[3]中华人民共和国国家质量监督检验总局GB16886.10-2005医疗器械生物学评价第10部分,刺激与迟发型超敏反应试验[S].北京:中国标准出版社,2003.
植物乳杆菌ZR09体外抑菌试验 篇7
1 材料与方法
1.1 菌株和培养基
植物乳杆菌ZR09和检测菌均由浙江省农科院植物保护与微生物研究所保存。培养基:脱脂乳培养基、MRS和普通肉汤培养基。
1.2 检测菌种子液的制备
将斜面保存的检测菌分别接种于肉汤培养基中, 37℃培养18~24h, 使菌体浓度达到108CFU/m L左右, 作为种子菌液备用。
1.3 植物乳杆菌的活化
用接种环转接冻干管中的植物乳杆菌ZR09至灭菌脱脂乳培养基中, 37℃培养5~7h至凝固, 反复活化3~4代。将活化的菌株转至MRS液体培养基中, 37℃培养16~18h。
1.4 植物乳杆菌发酵上清液的制备
将菌体浓度约为3.5×107CFU/m L的ZR09在无菌条件下按1%接种到MRS液体培养液中, 37℃培养48h, 8000r/min离心10min。取上清液, 经细菌过滤器 (滤膜直径为0.22μm) 过滤除菌, 收集滤液即为无菌发酵上清液, 4℃下保存备用。
1.5 抗菌谱的测定
将检测菌液 (菌数约为107cfu/m L) 0.1m L分别均匀涂在肉汤固体平板上, 自然干燥30 min后, 将牛津杯 (内径为6mm) 均匀放置在平板上, 吸取0.1m LZR09发酵上清液于杯中, 37℃培养24~48h, 测量抑菌圈直径。各重复3次, 取平均值。在牛津杯中添加MRS液体培养基0.1m L作为对照。
1.6 抑菌活性的测定
在30m L肉汤培养液中按1%的接种量接入检测菌种子液, 加入ZR09发酵上清液1m L, 对照试管中加入MRS液体培养基1m L。37℃、200r/min振荡培养, 8h后取少量菌液测定其OD600, 按公式计算抑菌率。
1.7 抑菌机理初探
在30m L肉汤培养液中按1%的接种量接入金黄色葡萄球菌种子液, 37℃、200r/min振荡培养8h, 加入ZR09发酵上清液1m L, 对照试管中加入MRS液体培养基1m L。30min后各取对照组和试验组中的少量菌体于JEM-1400透射电子显微镜下观察菌体内部结构。
2 结果与分析
2.1 抗菌谱测定结果
植物乳杆菌ZR09对各类细菌的抑制作用见表1。由此可知, ZR09对沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌的抑制作用最强, 对变形杆菌、铜绿假单孢杆菌和鲍曼不动杆菌的作用次之, 对蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌无抑制作用。
注:十十十十表示抑菌圈直径在30mm以上, 十十十表示抑菌圈直径在25~30mm之间, ++表示抑菌圈直径在15~20mm之间, 十表示抑菌圈直径在10~15mm之间, 一表示无抑菌活性。
2.2 抑菌活性测定结果
在细菌培养液中加入3.2%的ZR09的发酵上清液, 培养8h。结果表明, ZR09对沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和藤黄八叠球菌的生长具有很强的抑制作用, 抑菌率均达90%以上, 对变形杆菌和铜绿假单孢杆菌的抑菌率稍差, 为80%左右, 对鲍曼不动杆菌的抑菌率为70.2%。
2.3 抑菌机理的研究
经ZR09发酵上清液作用30min后的金黄色葡萄球菌在透射电镜下形态结构发生改变, 菌体皱缩、扭曲, 菌体破裂, 胞内物质外流 (图1-1) 。对照组中的金黄色葡萄球菌成圆球状, 表面光滑, 饱满 (图1-2) 。说明植物乳杆菌的抑菌机理极可能是其活性物质通过破坏细菌细胞壁膜, 从而导致胞内物质外泄, 引起细菌死亡。
3 小结
植物乳杆菌ZR09的抑菌活性测定结果表明其对多种致病菌包括沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌率均大于90%, 对变形杆菌、铜绿假单孢杆菌的抑菌为80%左右, 具有良好的益生素开发前景。透射电镜结果表明经ZR09发酵上清液能使金黄色葡萄球菌菌体皱缩、扭曲, 菌体破裂, 胞内物质外流, 初步推断其抑菌机理是通过产生的活性物质破坏靶标细菌细胞壁膜, 导致胞内物质外泄, 从而引起细菌死亡, 至于其杀死细菌的具体作用机制及对其他细菌的作用是否有所差异, 还有待于进一步的研究。
参考文献
[1]杨雪海, 赵娜, 魏金涛, 李绍章.植物乳杆菌对致病性大肠杆菌的抑制效果研究[J].饲料研究, 2011 (1) :27-28.