抑菌试验（共10篇）
抑菌试验 篇1
抗生素作为饲料添加剂之一对畜禽疾病的防治有显著作用, 但是由于饲用抗生素的普及甚至滥用, 其在畜禽产品的残留直接危害了人类健康及生态环境的安全。益生素具有调节和促进肠道菌群平衡、抑制有害细菌、增强机体免疫力及提高饲料转化率等功能[1,2], 可在一定程度上起到替代抗生素的作用, 已日益受到业界人士的关注。乳酸菌可以产生有机酸、细菌素、过氧化氢、双乙酰等多种天然抑菌物质, 是一类具有益生素开发前景的微生物。植物乳杆菌ZR09 (Lactobacillus plantarum, ZR09) 是从发酵蔬菜汁中筛选到的一株乳酸菌。本文主要展开其体外抑菌试验, 包括抗菌谱和抑菌活性测定, 并对其抑菌机理进行了初步探讨, 以期为植物乳酸菌类益生素的开发应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 菌株和培养基
植物乳杆菌ZR09和检测菌均由浙江省农科院植物保护与微生物研究所保存。培养基:脱脂乳培养基、MRS和普通肉汤培养基。
1.2 检测菌种子液的制备
将斜面保存的检测菌分别接种于肉汤培养基中, 37℃培养18~24h, 使菌体浓度达到108CFU/m L左右, 作为种子菌液备用。
1.3 植物乳杆菌的活化
用接种环转接冻干管中的植物乳杆菌ZR09至灭菌脱脂乳培养基中, 37℃培养5~7h至凝固, 反复活化3~4代。将活化的菌株转至MRS液体培养基中, 37℃培养16~18h。
1.4 植物乳杆菌发酵上清液的制备
将菌体浓度约为3.5×107CFU/m L的ZR09在无菌条件下按1%接种到MRS液体培养液中, 37℃培养48h, 8000r/min离心10min。取上清液, 经细菌过滤器 (滤膜直径为0.22μm) 过滤除菌, 收集滤液即为无菌发酵上清液, 4℃下保存备用。
1.5 抗菌谱的测定
将检测菌液 (菌数约为107cfu/m L) 0.1m L分别均匀涂在肉汤固体平板上, 自然干燥30 min后, 将牛津杯 (内径为6mm) 均匀放置在平板上, 吸取0.1m LZR09发酵上清液于杯中, 37℃培养24~48h, 测量抑菌圈直径。各重复3次, 取平均值。在牛津杯中添加MRS液体培养基0.1m L作为对照。
1.6 抑菌活性的测定
在30m L肉汤培养液中按1%的接种量接入检测菌种子液, 加入ZR09发酵上清液1m L, 对照试管中加入MRS液体培养基1m L。37℃、200r/min振荡培养, 8h后取少量菌液测定其OD600, 按公式计算抑菌率。
1.7 抑菌机理初探
在30m L肉汤培养液中按1%的接种量接入金黄色葡萄球菌种子液, 37℃、200r/min振荡培养8h, 加入ZR09发酵上清液1m L, 对照试管中加入MRS液体培养基1m L。30min后各取对照组和试验组中的少量菌体于JEM-1400透射电子显微镜下观察菌体内部结构。
2 结果与分析
2.1 抗菌谱测定结果
植物乳杆菌ZR09对各类细菌的抑制作用见表1。由此可知, ZR09对沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌的抑制作用最强, 对变形杆菌、铜绿假单孢杆菌和鲍曼不动杆菌的作用次之, 对蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌无抑制作用。
注:十十十十表示抑菌圈直径在30mm以上, 十十十表示抑菌圈直径在25~30mm之间, ++表示抑菌圈直径在15~20mm之间, 十表示抑菌圈直径在10~15mm之间, 一表示无抑菌活性。
2.2 抑菌活性测定结果
在细菌培养液中加入3.2%的ZR09的发酵上清液, 培养8h。结果表明, ZR09对沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和藤黄八叠球菌的生长具有很强的抑制作用, 抑菌率均达90%以上, 对变形杆菌和铜绿假单孢杆菌的抑菌率稍差, 为80%左右, 对鲍曼不动杆菌的抑菌率为70.2%。
2.3 抑菌机理的研究
经ZR09发酵上清液作用30min后的金黄色葡萄球菌在透射电镜下形态结构发生改变, 菌体皱缩、扭曲, 菌体破裂, 胞内物质外流 (图1-1) 。对照组中的金黄色葡萄球菌成圆球状, 表面光滑, 饱满 (图1-2) 。说明植物乳杆菌的抑菌机理极可能是其活性物质通过破坏细菌细胞壁膜, 从而导致胞内物质外泄, 引起细菌死亡。
3 小结
植物乳杆菌ZR09的抑菌活性测定结果表明其对多种致病菌包括沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌率均大于90%, 对变形杆菌、铜绿假单孢杆菌的抑菌为80%左右, 具有良好的益生素开发前景。透射电镜结果表明经ZR09发酵上清液能使金黄色葡萄球菌菌体皱缩、扭曲, 菌体破裂, 胞内物质外流, 初步推断其抑菌机理是通过产生的活性物质破坏靶标细菌细胞壁膜, 导致胞内物质外泄, 从而引起细菌死亡, 至于其杀死细菌的具体作用机制及对其他细菌的作用是否有所差异, 还有待于进一步的研究。
参考文献
[1]杨雪海, 赵娜, 魏金涛, 李绍章.植物乳杆菌对致病性大肠杆菌的抑制效果研究[J].饲料研究, 2011 (1) :27-28.
[2]Shah NP.Functional cultures and health benefits[J].International Dairy Journal, 2007, 17 (11) :1262-1277
抑菌试验 篇2
探 究 抗 生 素 抑 菌 效 果 试 验 报 告
实 验 报 告
实验目的:探究丌同种类抗生素的灭菌效果
实验器材:培养皿，量筒，滴管，锥形瓶，显微镜等
实验药品:琼脂，牛肉膏，蛋白胨，????、????溶液，菌落培养液，氯霉素，青霉素，硫酸庆大霉素等
实验基本原理:
一、常用的抗生素的分类:
1.倍他-内酰胺类:(1).V、阿莫西林、哌拉西林针;(2).头孢类:如头孢氨苄、头孢拉定;2.大环内酯类(红霉素类):、罗红霉素、阿奇霉素、克拉霉素等;3.喹诺酮类:诺氟沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星等;4.氨基糖苷类:
5.四环素类:土霉素、四环素、米诺环素，美满环素等; 6.氯霉素类抗生素:、甲砜霉素、无味氯霉素等 7.其他类:甲氧苄啶、磺胺嘧啶、克林霉素、呋喃唑酮等。
(本实验中选择生活中最常见的青霉素、氯霉素和硫酸庆大霉素)
二、抗生素抗菌的机理分类:
1.阻碍细菌细胞壁的合成。以这种方式作用的抗生素主要是 β-内酰胺类抗生素(头孢菌素类)。
2.不细菌核糖体或其反应底物相互所用，抑制蛋白质的合成。以这种方式作用的抗生素包括四环素类抗生素、大环内酯类抗生素、氨基糖苷类抗生素(庆大霉素)、氯霉素等。
3.不细菌细胞膜相互作用，增强细菌细胞膜的通透性、打开膜上的离子通道，让细菌内部的有用物质漏出菌体或电解质平衡失调而死。
4.阻碍细菌 DNA 的复制和转录 5.影响叶酸代谢
实验步骤:
?用蒸馏水清洗用具并制作九只培养基。
?适当稀释菌落培养基后，各取 0.1ml 菌液，使用涂布平板法分别接种到九只培养基上。
?将九只培养基编号，并均分为 A、B、C 三组。
?用滤纸剪出 18 个直径 2cm 的圆片，6 个浸泡青霉素，6 个浸泡氯霉素，6 个浸泡硫酸庆大素。完成后贴在培养基上，每只培养基贴 2 片。
?将做好标记的培养
基培养一段时间，观察细菌生长情况。
?取出平板，测量出抑菌圈的直径大小，并做好记录。
?整理数据，得出结论。
结 果 统 计 表
(注:抑菌圈半径记为 R1;圆片半径 1cm 记为 R2)
实验结论: 硫酸庆大霉素抑菌效果最好，青霉素抑菌效果最差。
篇二:实验 11-抗生素的抑菌试验
实验十一抗生素的抑菌试验
一 目的要求
1、掌握纸片法测定抗生素抗菌作用的基本方法 2、了解抗生素的抗菌谱
二 实验原理
抗生素是某些植物不微生物生长到对数期前后所产生的次生代谢产物，其在低浓度下可其它微生物生长具抑制作用或杀死作用的物质。抗生素对敏感微生物的作用机理分为抑制细胞壁的形成、破坏细胞膜的功能、干扰蛋白质合成及阻碍核酸的合成。
由亍丌同微生物对丌同抗生素的敏感性丌一样，抗生素的作用对象就有一定的范围，这种作用范围成为抗生素的抗菌谱，作用对象广的抗生素称为广谱抗生素，作用对象少的抗生素称为窄谱抗生素。而且当某种抗生素长时间用亍敏感微生物生长后，即使同一种菌的丌同菌株对丌同药物的敏感性也常发生改变，甚至出现耐药菌株，亦即产生抗性菌株，则抗生素将失去对抗性菌株生长的抵制，只以采用新的抗生素才可能控制抗性菌株的生长不繁殖，因而丌断开发新的抗生素是保健人类身体健康的重要工作。新抗生素产生菌的分离筛选应通过拮抗菌发酵，然后以发酵产物迚行抗菌活性实验，根据实验结果而获得产新抗生素的菌株。微生物代谢产物的抗菌活性常以管碟法不纸法迚行检测，根据透明抑菌圈的有无不大小作为依据。
三 实验器材
1、菌种 枯草杆菌、大肠杆菌。
2、培养基 MH(Mueller-Hintion)琼脂。
3、试剂 青霉素、链霉素。
四 方法步骤
1、无菌滤纸片 以孔径 6mm 打孔器将滤纸打为圆形纸片，放入培养皿内，121?蒸汽湿热灭菌，100?烘干2h。
2、抗生素溶液制备 将取适量青霉素、链霉素，以无菌水溶解。
3、指示菌悬浮液的制备 枯草杆菌、大肠杆菌斜面菌种分别以无菌水洗下菌苔细胞，到入无菌三角瓶内，制备适宜浓度的细胞悬浮液。
4、混菌平板制备 取批示菌细胞悬浮液 1mL 加入无菌培养皿内，再加入温度为 43~45?的 PDA 培养基或牛肉膏蛋白胨琼脂培养基 20mL，立即振荡使细胞不培养基混合均匀，静置冷凝。
5、平板加抗生素溶液 将滤纸片在抗生素溶液中充分浸泡 2min 以上，然后将纸片放亍混菌平板上，每皿呈三角形放 3 点，每点贴放纸片 2 张。
6、培养不观察 将平板放亍每 24h 测量一次透明抑菌圈直径，共测量 3 次。
五 结果
1、实验结果
测量每个平板 3 个抑菌圈直径，计算每次测量各平板 3个抑菌圈直径的平均值，结果填亍表内。
表 1 青霉素对供试菌的抑菌效果(抑菌圈直径:mm)
培养时间
菌种名
表 2 链霉素对供试菌的抑菌效果(抑菌圈直径:mm)
培养时间
菌种名
2、结果分析
120
144
168
120
144
168菌液制备
1)对数生长法:从琼脂平板上选取至少 3~5 个形态特征一致的菌落，用接种环转移至含 4~5ml 的肉汤培养管(如胰酶消化大豆肉汤)中，35?培养 2~6h。用无菌盐水或肉汤调整菌液浊度相当
亍 0.5 麦氏标准。
2)直接菌落法:从培养 18-24h 的非选择性培养基(如血琼脂)平板上，挑取单个菌落，直接用肉汤或无菌盐水制成 0.5 麦氏标准浊度的悬液。接种
细菌悬液制备后 15min 内接种至 MH 琼脂平板。用无菌棉拭醮取菌悬液，在管内壁液面上方旋转紧压，将多余菌液挤去，最后沿平板内缘涂抹一周。贴药敏纸片
涂布后的平板在室温下干燥 3~5min，用纸片分配器或无菌镊子将纸片贴亍琼脂表面并轻压，使纸片不琼脂表面完成接触。各纸片中心相距应大亍 24mm，纸片贴上后就丌能再移动位置。培养
将平板倒置放入 35?孵箱(厌氧菌敏平板应放置亍5%~10%CO2 环境中)，16~18h 读取结果，葡萄球菌和肠球菌必须培养 24h 以检测对苯唑西林和万古霉素的耐药性。结果判断
抑菌圈的直径(包含纸片的直径)，以毫米数报告(取整数)。根据 CLSI 判定标准测量抑菌圈直径大小可以判断细菌对该抗生素是敏感、中介还是耐药，如下图。
敏感(S):表示常觃剂量的测定药物在体内所达到的浓度能抑制或杀灭待测菌。
中介(I):丌是敏感性的度量，而是一个“缓冲区”，用以防止因微小的技术因素失控导致的结果偏差，因而其临床意义是丌确定的，故丌应作临床报告。
耐药(R):表示常觃剂量的测定药物在体内达到有效浓度时丌
能抑制待测菌生长。
五、结果不思考题
1、记录各菌对丌同药物的敏感程度 2、思考题
(1)圆纸片药敏试验操作时应注意什么事项,(2)试述药敏试验的意义
实验十二细菌对抗生素的药物敏感试验
各种微生物对化学药物、抗生素等敏感性各异，即使同一种菌的丌同菌株对丌同药物的敏感性也常发生改变，甚至出现耐药菌株，亦即产生耐药性变异。因此，测定细菌对药物的敏感程度，对亍临床治疗中选择用药，及
时控制感染具有重要意义。
常用方法有纸片弥散法和试管稀释法。
实验目的 一、纸片法 材料
1(菌种:枯草杆菌、大肠杆菌。
2(培养基:普通琼脂平皿培养基。
3(抗菌药物:青霉素、链霉素、氯霉素、庆大霉素纸片。
4(其他:无菌棉棒、镊子、酒精缸等。
方法
1(用灭菌棉棒分别沾取金黄色葡萄球菌 1 号和 2 号及痢疾杆菌肉汤培养物，分别涂布在琼脂表面，每种菌涂一个平皿(沾菌棉棒用后，放入消毒缸中，勿乱丢)。
2(用小镊子沾酒精烧灼消毒，待冷后镊取一种药物纸片，贴在涂有细菌的平皿上，然后将镊子再沾酒精烧灼后，镊取另一种药物纸片，贴布亍琼脂平皿另一处，如此将几种药物纸片贴完，各纸片距离要大致相等。
3(将已做好的药敏琼脂平皿，置 37?培养 18,24 小时，观察
各药物纸片的抑菌效果。即观察药物纸片周围有无抑菌圈，如有，在平皿底面用尺量其直径大小，测定药物敏感程度。各种抗生素抑菌圈直径不敏感标准见表 12-1。
篇三:抗生素抑菌试验报告
实验报告:抗生素灭菌效果探究
高二(6)班 王一峰 实验器材:培养皿，恒温箱，锥形瓶，滴管，显微镜等 实验药品:琼脂，菌落培养液，多种抗生素。
实验基本原理:抗菌素抗菌的机理大致有如下几种:
1.阻碍细菌细胞壁的合成。以这种方式作用的抗生素主要是 β-内酰胺类抗生素(青霉素，头孢菌素类)。哺乳动物的细胞没有细胞壁，丌受这类药物的影响。
2.不细菌细胞膜相互作用，增强细菌细胞膜的通透性、打开膜上的离子通道，让细菌内部的有用物质漏出菌体或电解质平衡失调而死。以这种方式作用的抗生素有多粘菌素和短杆菌肽等。
3.不细菌核糖体或其反应底物(如 tRNA、mRNA)相互所用，抑制蛋白质的合成——这意味着细胞存活所必需的结构蛋白和酶丌能被合成。以这种方式作用的抗生素包括四环素(四环素，金霉素，土霉素)类抗生素、大环内酯类抗生素(红霉素，乙酰螺旋霉素)、氨基糖苷类抗生素(链霉素，庆大霉素，卡那霉素)、氯霉素等。
4.阻碍细菌 DNA 的复制和转录。阻碍 DNA 复制将导致细菌细胞分裂繁殖受阻，阻碍 DNA 转录成 mRNA则导致后续的 mRNA 翻译
合成蛋白的过程受阻。以这种方式作用的主要是人工(来自: 写 论 文 网:抗生素抑菌实验实
验报告)合成的抗菌剂喹诺酮类(如氧氟沙星，诺氟沙星)。
5.影响叶酸代谢。抑制细菌叶酸代谢过程中的二氢叶酸合成酶和二氢叶酸还原酶，妨碍叶酸代谢。因为叶酸是合成核酸的前体物质，叶酸缺乏导致核酸合成受阻，从而抑制细菌生长繁殖，主要是磺胺类和甲氧苄啶。
通过观察培养皿上涂抹抗生素后产生的抑菌圈大小，同时结合显微镜的观察，比较丌同抗菌机理的抗生素的抑菌效果。
实验步骤:
1.用蒸馏水洗净培养皿。在培养皿底部的纱布上放一块薄琼脂片。用滴管均匀低价菌落培养液(内含大肠杆菌，化脓链球菌，金黄色葡萄球菌，霉菌等等)。菌落大致形成直径为 20mm 的圆。
2.制做多个基本相当的培养皿。分别滴加 2~3 滴抗生素:
(1)阿莫西林(或盘尼西林)溶液
(2)诺氟沙星溶液
(3)红霉素软膏浸液
(4)盐酸林可霉素注射液
抗生素覆盖区均为直径为 5mm 的圆。
3.其中，第一种方案作用机理是阻碍细菌细胞壁合成，第二种方案是阻碍 DNA 转录和复制，第三和第四种方案都是通过不细菌核糖体或反应底物结合抑制蛋白质合成。
4.将四个培养皿放在恒温箱中，等待结果。
实验现象:四个培养皿均出现大小丌一的抑菌圈，光学显微镜成像显示，抑菌圈是以抗生素为圆心的同心圆，抑菌圈范围内细菌生长明显受到抑制或消失。抑菌圈外的菌落存在细菌生长。
通过尺可以量得，阿莫西林的抑菌效果最佳，抑菌圈直径约为 8mm。而诺氟沙星抑菌圈直径约为 6mm，红霉素和林可霉素抑菌圈直径和诺氟沙星为代表的喹诺酮类抗生素大小基本相同。但是显微镜成像显示抑菌范围内的细菌数目减少量丌如阿莫西林多，也未发现胞体破裂，抗生素大量分布的现象。
实验结论:
抑菌试验 篇3
关键词：菊芋；提取物；辣椒；疫霉菌；抑菌效果；石油醚；乙酸乙酯
中图分类号： S482.2+92文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0139-02
收稿日期：2014-04-02
基金项目：国家现代农业产业技术体系建设专项（编号：CARS-25-G-49）。
作者简介：李屹（1973—），女，河南巩义人，研究员，主要从事蔬菜病虫害防治。Tel：（0971）5311167；E-mail：ly525414@sina.com。辣椒疫病是由辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）侵染引起的一种毁灭性真菌性病害，于1918年在美国首次被发现，迄今已在世界各地的辣椒种植区普遍发生[1]。在20世纪50年代，我国最早在江苏发现辣椒疫病，目前该病已危及我国的青海、新疆、上海、北京、陕西、贵州、四川等许多地区[2-8]，并呈逐年加重趋势，给辣椒生产造成严重损失，是辣椒的主要病害之一。辣椒疫病是一种土传病害，可经雨水、土壤、气流等多种途径传播，发病时可造成茎秆坏死、叶片枯萎、果实腐烂，甚至整株萎蔫死亡，从而导致田间大面积出现死秧[9]。利用化学药剂防治辣椒疫病效果甚微，且容易造成环境污染，开发无害、高效的新型生物农药是当前病害防治的发展方向。本试验采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮及乙醇共5种溶剂，对菊芋叶片的有效成分进行提取，对提取物进行辣椒疫霉菌抑菌效果试验，确定最佳溶剂，并开展辣椒盆栽验证试验，为利用菊芋开发高效、安全的新型无公害植物源农药奠定基础。
1材料与方法
1.1菊芋叶片不同溶剂提取物对辣椒疫霉菌的室内抑菌效果
1.1.1供试样品供试植物为菊芋，种植于青海大学农林科学院，鲜叶于秋季霜前采集，室内自然阴干，用粉碎机粉碎制成植物干粉，密封于塑料袋中备用。
1.1.2培养基与试剂真菌培养基为 PDA 培养基；石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮及乙醇等生化试剂均为分析纯，市购。
1.1.3供试菌种辣椒疫霉菌菌种由青海省蔬菜遗传与生理重点实验室提供，将菌株接种于PDA液体培养基中进行活化，25 ℃培养2～3 d；活化菌株转接到PDA固体平板上，25 ℃ 培养2～5 d，至菌丝覆盖整个平板。
1.1.4菊芋叶片不同提取物的制备5种溶剂提取物提取方法分别为：分别称取菊芋叶片干粉材料2、1.2、2.4、2、3 kg，分别加入乙醇10 L、氯仿6 L、乙酸乙酯12 L、丙酮10 L、石油醚15 L，浸提2次，浸提2 d；合并2次浸提液，减压浓缩，分别得到菊芋叶片乙醇、氯仿、乙酸乙酯、丙酮和石油醚粗提物。
1.1.5菊芋叶片提取物的抑菌活性测定将各粗提物配制成一定浓度；一方面分别取一定量各溶剂提取物加入到温度40 ℃左右、已熔化的PDA固体培养基中，摇匀，倒入灭菌培养皿中，使菊芋叶片提取物在PDA培养基中终浓度为 12.5 mg/mL，以添加相对应的有机溶剂为对照，另一方面使各菊芋叶片提取物在PDA培养基中的终浓度分别为25、20、15、12.5、10、7.5、5、2.5 mg/mL；待培养基凝固，于中央接入直径为9 mm 的辣椒疫霉菌菌块，于25 ℃培养72 h，“十”字交叉法测量菌落直径，计算菌落纯生长量和抑菌率：纯生长量=菌落平均直径-菌饼直径；抑菌率=（对照纯生长量-处理纯生长量）/对照纯生长量×100%。
1.1.6数据分析数据用Excel和DPS软件进行分析处理。
1.2盆栽验证试验
1.2.1供试材料供试辣椒品种为乐都长辣椒；供试试剂为菊芋叶片乙酸乙酯粗提物和25%甲霜灵可湿性粉剂。
1.2.2试验方法辣椒采用盆栽，每盆栽种辣椒3株，在辣椒8～10叶期处理；试验设菊芋叶片粗提物50倍液、25%甲霜灵可湿性粉剂 400倍液、清水处理为空白对照共3个处理，采用灌根方式，沿每株辣椒根部灌入10 mL试剂或清水；24 h后使用注射器吸取游动疫霉菌孢子浓度为1×104个/mL 的悬浮液5 mL，注入离辣椒幼苗根茎约2 cm处，保持土壤湿度饱和、温度为25 ℃左右。每个处理重复3次，每次重复用辣椒5盆。孢子悬浮液制备方法为：将在CN培养基上培养的疫霉菌单孢纯化菌株，于28 ℃条件下连续光照培养5～7 d以形成大量孢子囊；挑取产生孢子囊的菌丝块放入试管中，加入无菌水20 mL，放入4 ℃冰箱中预冷1 h，移至室温20 min，振荡即得游动孢子悬浮液，用无菌水进行稀释调节。
1.2.3调查内容及统计方法分别于施药后7、14、21 d调查发病情况，统计发病率、病情指数及防治效果，计算公式：发病率=发病株数/调查总株数×100%。病情指数DI：DI=∑（s×n）/（N×5）×100%，式中，s为各病情级别的代表数值；n为各病情级别的植株数；N为调查总植株数。防治效果=（对照区病情指数-防治区病情指数）/防治区病情指数×100%。病害分级标准为：0级：无病；1级：幼苗根茎部轻微变黑，叶片不萎蔫或可恢复性萎蔫；2级：幼苗根茎部变黑1～2 cm，叶片不可恢复性萎蔫，下部叶片偶有脱落；3级：幼苗根茎部变黑超过2 cm，叶片明显萎蔫或落叶明显；4级：幼苗根部变黑缢缩，除生长点外全部落叶或整株萎蔫；5级：植株枯死。
nlc202309021101
2结果与分析
2.1菊芋叶片不同溶剂提取物对辣椒疫霉菌的抑菌效果
由表1可知，菊芋叶片各溶剂提取物12.5 mg/mL处理，辣椒疫霉菌的菌丝纯生长量与对照处理相比，均存在显著差异，各溶剂提取物对真菌生长均起到一定的抑制作用；石油醚、乙酸乙酯提取物对辣椒疫霉菌的抑制效果最好，抑菌率达到100.00%，显著高于其他提取物处理；丙酮提取物次之，抑菌率为（27.51%±2.823）%；乙醇提取物对疫霉菌抑菌效果相对最差，抑菌率仅为（3.99±1.009）%。
表1菊芋叶片不同溶剂提取物12.5 mg/mL对辣椒疫霉菌的抑菌效果
溶剂纯生长量（cm）菊芋叶片提取物仅溶剂（对照）抑菌率
（%）石油醚0±0e1.35±0.089100.00±0a乙酸乙酯0±0e5.20±0.347100.00±0a氯仿13.92±0.454c17.20±0.32719.10±1.282c丙酮5.25±0.278d7.24±0.10627.51±2.823b乙醇32.22±0.202b33.56±0.5443.99±1.009d空白对照45.20±0.700a注：同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。
由表2可知，乙酸乙酯提取物对辣椒疫霉菌的抑菌效果最为显著，当浓度为5 mg/mL时，抑菌率达100.00%，当浓度降到2.5 mg/mL时，抑菌率为（27.91±2.076）%；石油醚提取物的抑菌效果次之，浓度为7.5 mg/mL时，抑菌率达10000%，当浓度逐渐降低时，抑菌率也显著降低；氯仿提取物和丙酮提取物在2.5～10 mg/mL时的抑菌效果相差不大，浓度大于10 mg/mL时，丙酮提取物的抑菌效果增加程度明显大于氯仿，在20 mg/mL时，丙酮提取物的抑菌率达10000%，氯仿提取物在25 mg/mL时抑菌率才达到100.00%；乙醇提取物的抑菌效果最差，浓度小于10 mg/mL几乎没有抑菌效果，当浓度大于12.5 mg/mL时，抑菌率随浓度的增加而增大，当浓度为 25 mg/mL 时，抑菌率为（72.43±0.472）%。表2不同溶剂
2.2菊芋叶片提取物防治辣椒疫病盆栽验证试验
由表3可知，施药后7 d，菊芋叶片粗提物50倍液及25%甲霜灵可湿性粉剂 400倍液2个处理均未发病，清水对照发病率达17.78%、病情指数达4.00%；施药后14 d，菊芋叶片粗提物50倍液处理的辣椒未发病，25%甲霜灵可湿性粉剂 400倍液处理的辣椒发病率为8.89%、病情指数为178%，清水对照发病率达37.78%、病情指数达14.67%；施药后 21 d，菊芋叶片粗提物50倍液处理的辣椒仍未发病，25%甲霜灵可湿性粉剂 400倍液处理的辣椒发病率为13.33%、病情指数为4.89%，病情发展较为缓慢，清水对照发病率达到57.78%、病情指数达到35.11%。菊芋叶片提取物50倍液处理的辣椒全程无疫病发生，对辣椒疫病有较好的防治效果。表3菊芋叶片提取物对辣椒疫病的防治效果
3结论与讨论
试验结果表明，菊芋叶片不同提取物对辣椒疫霉菌均具有抑菌效果，溶剂提取物浓度为12.5 mg/mL时，石油醚和乙酸乙酯提取物对辣椒疫霉菌的抑菌率达到100.00%，显著高于其他提取物；乙酸乙酯提取物的抑菌效果最为显著，当浓度为5 mg/mL时，抑菌率达到100.00%， 浓度降到2.5 mg/mL时， 抑菌率尚有（27.91±2.076）%，显著高于同浓度其他溶剂提取物；菊芋叶片乙酸乙酯提取物50倍液对辣椒疫病具有良好的防治效果，药后21 d防效仍达到100.00%，优于化学药剂25%甲霜灵可湿性粉剂 400倍液的防治效果。
我国是农业大国，农药在农业生产中发挥着十分重要的作用。随着人们健康意识的提高，农药残留超标已成为严重影响农产品市场竞争力的重要问题，开发新型农药已成当务之急[10]。植物源农药来源于自然，具有环保、长效、易光解、无残留等特点，能保持农产品的高品质， 是发展有机农业、促进农业可持续发展的理想农药。菊科植物是最重要的植物源农药来源，在有杀虫活性的1600种植物中，有1/10是菊科
植物[11]。研究表明，菊芋能抵御多种植物疾病，极少虫害，含有抗虫抑菌活性物质，具有耐旱、耐寒、耐盐及抗病虫害等特点[12]。目前，国内外对菊芋用于治理沙漠和深加工方面的研究较多，有关菊芋叶片生物活性物质及其抑菌活性的研究较少。韩睿等已经开展菊芋叶片有效成分提取分离技术研究[13]。通过本试验，证明了菊芋提取液对辣椒疫霉菌具有很好的抑制作用，这对于充分利用菊芋资源、开发研制新型植物源杀菌剂、拓展菊芋的应用领域提供了一定的依据。在盆栽验证试验中，只设定了1个提取液浓度，不能更为客观地分析其防治效果，有必要在后续试验中设计更多的浓度梯度，进一步确定菊芋提取液对辣椒疫病的防治效果及最佳防治浓度。
参考文献：
[1]朱宗源，陆金萍，周新根，等. 上海郊区青椒疫病病原菌鉴定及其生物学特性[J]. 上海农业学报，1992，8（3）：36-41.
[2]陈坚忠. 青海高海拔地区辣椒疫病的发生及防治措施[J]. 作物杂志，2008（4）：83-84.
[3]程沄，沈崇尧，段道怀. 青椒疫菌为北京地区青椒死秧的主要原因[J]. 植物病理学报，1988，18（1）：9-14.
[4]王志田，史载诚，赵林忠，等. 哈密地区辣椒疫霉菌的鉴定及部分生物学测定[J]. 新疆农业科学，1990（2）：69-71.
[5]王燕华，杨顺宝. 上海地区甜椒疫病菌的鉴定[J]. 上海农业科技，1982（1）：20-21.
[6]常彩涛，巩振辉，王鸣. 陕西辣椒疫病菌种的鉴定[J]. 西北农业学报，1993，2（1）：87-90.
[7]杨学辉，袁洁，谢海呈. 贵州省辣椒主栽品种抗疫病性鉴定[J]. 西南农业学报，2005，18（6）：791-793.
[8]彭化贤，刘波微，李薇. 四川辣椒疫霉菌生物学特性和辣椒抗霉疫病性鉴定方法初探[J]. 云南农业大学学报，2005，20（1）：140-144.
[9]易图永，谢丙炎，张宝玺，等. 辣椒疫病防治研究进展[J]. 中国蔬菜，2002（5）：52-55.
[10]吴光旭，何庭玉，刘爱媛，等. 植物中抗病原真菌的活性物质[J]. 植物学通报，2004，21（3）：367-375.
[11]李云寿，邹华英，唐绍宗，等. 14种菊科植物提取物对菜青虫的杀虫活性[J]. 华东昆虫学报，2000，9（2）：99-101.
[12]Stanley J K，Nottingham S F. Biology and chemistry of Jerusalem artichoke[M]. New York：CRC Press，2008.
[13]韩睿，王丽慧，钟启文，等. 菊芋叶片提取物抑菌活性研究[J]. 现代农业科技，2010（5）：120-123.高宇，王志英，赵红盈，等. 白蜡吉丁啮小蜂雌蜂对寄主挥发物的触角电位和行为反应[J]. 江苏农业科学，2015，43（1）：141-143.
抑菌试验 篇4
1 试验材料
试验药物:自制复方中草药“乳痈散”, 由聊城大学农学院预防兽医实验室自制的方剂, 主要成分有蒲公英、金银花、连翘、紫花地丁、木通、路路通、漏芦、通草等。
试验菌种:聊城大学农学院预防兽医实验室保存, 3种菌株分别为大肠杆菌 (YG0805062株) 、葡萄球菌 (LQ0809108株) 、链球菌 (LQ0902037株) , 均来自聊城及周围地区奶牛场。
试剂及培养基:5%绵羊鲜血琼脂培养基、血清肉汤培养基按常规方法配制。
仪器:离心机、高压蒸汽灭菌器、无菌工作台、天平、平皿、三角瓶等。
2 试验方法
2.1 中草药水提取物的制备
按复方“乳痈散”组方准确称取每味中草药, 常规加水浸泡2 h, 水煎2次, 每次开锅20 min, 合并两次滤液, 离心、过滤、浓缩至每毫升药液含药量1 g。调节p H值至7.4, 分装、高压灭菌, -20℃保存待用。
2.2 抑菌试验
培养基准备:按照常规方法制备5%绵羊鲜血琼脂培养基、血清肉汤培养基, 放置冰箱待用。
细菌复壮:将试验的3种菌株分别接种到5%绵羊鲜血琼脂培养基上, 培养24 h, 复壮;然后将复壮后的3种菌株再分别接种到血清肉汤培养基中, 37℃振荡培养24 h。
菌种接种及加药:用“L”型玻璃棒在无菌工作台内将上述血清肉汤培养菌液分别均匀涂布于5%绵羊鲜血琼脂培养基表面, 每个菌株做3个重复培养基, 再用直径8 mm的打孔器在每个血琼脂培养基上打分布均匀的4个孔, 并在酒精灯上稍微烘烤封底。然后将药液分别加入其中3孔, 每孔加50μL, 另一孔加等量的无菌血清肉汤作为阴性对照。然后将平板置于37℃恒温培养箱内培养24 h。
观察并记录:培养24 h后, 将培养平皿从恒温箱内取出, 分别用游标卡尺测量抑菌直径 (mm) , 每孔按不同方向测量2次, 最终每个菌株取3个平板共9孔18次测量结果的平均值。
结果判定标准:抑菌圈直径 (d) ≥20 mm为极敏, 20>d≥15 mm为高敏, 15>d≥10 mm为中敏, 10>d>6 mm为低敏, d≤6 mm为无抑菌效果。
3 结果
3.1 乳痈散的抑菌效果 (见表1)
mm
如表1所示, 乳痈散对大肠杆菌、链球菌高敏, 葡萄球菌中敏, 体外抑菌效果较好。
3.2 阴性对照结果
9个试验平板中的9孔的抑菌圈为零, 没有抑菌作用, 孔周围都生长有一层菌苔。
4 小结
东紫苏根中抑菌活性成分的研究 篇5
采用生物活性跟踪法从东紫苏根中分离出3个具有广谱抑菌活性的物质,通过波谱分析并与文献值比较,分别鉴定为卢氏冬凌草素5(Ⅰ)、槲皮素(Ⅱ)和木犀草素(Ⅲ),其中化合物工为首次从该属植物中分离得到.抑菌试验表明:3个化合物对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等有不同程度的抑菌和杀菌作用.
作 者：胡浩斌 王鑫 刘建新 曹宏 简毓峰 HU Hao-bin WANG Xin LIU Jian-xin CAO Hong JIAN Yu-feng 作者单位：胡浩斌,HU Hao-bin(陇东学院化学系,甘肃,庆阳,745000)王鑫,刘建新,WANG Xin,LIU Jian-xin(陇东学院生命科学系,甘肃,庆阳,745000)
抑菌试验 篇6
1 材料和方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验菌株
试验菌株种类,见表1。
1.1.2 供试药物
复方恩诺沙星可溶性粉,山西奥福莱动物药业有限公司,生产批号040502,200g,恩诺沙星12g,乙酰甲喹20g。
1.1.3 培养基
MH琼脂培养基,MH肉汤培养基,鲜血MH琼脂培养基,血清MH肉汤培养基。
1.1.4 试验仪器
定性试纸,试管,培养皿,打孔器,镊子,无菌棉,酒精灯,温箱。均由本试验室提供。
1.2 试验方法
1.2.1 药敏纸片制备
取新华1号定性滤纸,用打孔机打成6.25mm直径的圆形小纸片。取圆纸片100片放入清洁干燥的青霉素空瓶中,瓶口以单层牛皮纸包扎。经15磅15~20min高压灭菌后,放在37℃温箱或烘箱中1~2d,使完全干燥。在上述含有100片纸片的青霉素瓶内加入药液0.7ml,并翻动纸片,使各纸片充分浸透药液,翻动纸片时不能将纸片捣烂。放37℃温箱内干燥后即加盖密封,切勿受潮,置阴暗干燥处存放备用[4,5,6]。
1.2.2 试验菌液制备
从培养了16~24h的斜面上挑取菌落于灭菌生理盐水中,并将其悬液浊度调至0.5号麦氏标准管,直接用此盐水悬液作为接种物,菌量约1×108cfu/ml[7,8,9]。
1.2.3 供试药液配制
精确称取1g药物先加入0.1mol/L的Na OH溶液10ml,再加入p H7.2的PBS液32ml,混匀[10]。
1.2.4 K-B纸片法
用无菌棉拭子蘸取调好的菌液,并在管壁上拧压除去多余菌液后置于培养基平板表面反复推涂,以保证细菌在平板表面均匀分布,盖上平皿盖在室温干燥3~5min,用无菌镊子或纸片分配器放置药敏纸片,各纸片中心距不小于24mm,纸片据平板内缘应大于15mm。贴完纸片后,在15min内将平板反转过来,置于温箱中,培养24h后观察结果[11]。
1.2.5 试管倍比稀释法
药物的浓度按倍比稀释来建立,试验要在无菌条件下于适宜的玻璃试管中进行。试验中取10支试管排成一列,在第1管中加入1ml药液和1ml灭菌肉汤。第2~10管均加入1ml灭菌肉汤。第1管混匀后取1ml的量加入到第2管中,混匀后从第2管中取1ml的量加入到第3管中,依次类推到第10管,混匀后取1ml的量弃掉。另取两管分别加入1ml灭菌肉汤和而不加药物,其中一管作为细菌生长情况对照,另一管作为空白对照。将2.2.2中制备好的试验菌液加入到第1~11管中,每管加入量为0.1ml,35℃培养16~24h后肉眼观察,呈明显不混浊的试管所含最小的药物浓度为最小抑菌浓度(MIC);继续培养至48h,肉眼观察呈不混浊的试管所含最小的药物浓度为最小杀菌浓度(MBC)[12,13]。
2 试验结果
K-B纸片法试验结果,见表2。最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)试验结果,见表3。
3 讨论
3.1 影响药敏试验结果的因素
药敏试验结果易受抗菌药物纸片含药量、培养基、接种细菌菌量、培养时间等因素的影响。
抗菌药物纸片含药量是影响抑菌圈大小的主要因素,而纸片含药量又与纸片的重量、吸水性、直径等有关,首先制备药敏纸片应选则合格纸片,要求所用滤纸的吸水性好,均匀,不含无关的化学物质和色素等,直径为6.25 mm,制备药敏纸片时药物应称量准确,药液应摇匀,浸泡应充分,制备好的纸片应妥善保存,保存条件以低温干燥为佳,最好保存于-20℃,以防药力降低。药敏纸片制备后立即用标准敏感菌株作敏感试验,并记录其抑菌圈直径,每次用前应复查1次。
药敏试验强调使用专门培养基MHA,但考虑到本试验所用的试验菌株均来自发病畜禽体内分离的病原菌(购自中监所),为了能够使多种细菌都能生长发育良好,有些细菌如沙门氏菌、巴氏杆菌和链球菌等特选用了鲜血MH琼脂培养基,血清MH肉汤培养基。制备K–B法培养基厚度应为4mm,平皿用直径90mm的较好。据报道,做药敏试验的培养基厚度相差2mm,抑菌圈直径最大也会相差2mm,为了防止因培养基厚度而造成的试验误差,应严格控制每个琼脂平板的厚度,用直径为90mm的平皿倾注约15m1普通营养琼脂液体,保证琼脂厚度为4mm。
接种菌量应稀释到浓度为0.5麦氏比浊管,相当于1×108cfu/ml,若菌稀释倍数偏高,菌液浓度偏低,导致接种菌量太少,虽然菌性不变,但抑菌圈直径常增大,易将耐药药物误判为敏感药物,相反,若菌料稀释倍数偏低,菌液浓度偏高,导致接种菌量太多,抑菌圈直径常变小,有可能将敏感药物误判为耐药药物。
细菌培养时间。细菌培养时间过长,细菌能恢复生长,使抑菌圈变小,培养时间过短,抑菌圈还未最终形成,这都可能影响药敏试验结果的判定,有可能将敏感药物与耐药药物混淆,因此测定了细菌培养时间,分别制定了不同病原菌观察结果最佳时间。
总之,在试验操作的各个环节中都应严格按照试验要求进行,尽可能地避免系统误差,减小随机误差,以提高试验数据的可信度。
3.2 结果分析
药敏试验的目的是对抗生素临床治疗效果进行预测,查出耐药性,减少治疗错误,同时可以根据敏感、中介、耐药的提示结合MIC可以方便地制定用药方案。药敏试验时,正确选择病原菌显得更为重要,本试验所用的试验菌株均来自发病畜禽体内分离的病原菌,可以有效反映复方恩诺沙星可溶性粉的抗菌谱,结果表明其对来源于鸡及猪的病原性大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄菌、鸡巴氏杆菌、猪巴氏杆菌、病原性链球菌均敏感,对鸡沙门氏菌不敏感,复方恩诺沙星可溶性粉对畜禽主要致病菌的最小抑菌浓度(MIC)为0.0279~3.575μg/ml,最小杀菌浓度为(MBC)为0.055~7.11μg/ml。
药敏试验是一种体外试验,细菌在体外对抗生素耐药,在体内也会耐药,而在体外敏感的体内就不一定敏感,所以耐药是药敏试验的正结果。因此,在预侧体内结果时,耐药的结果可以确信,而敏感的应保持怀疑。虽然药敏试验是药物在体外的抑菌试验,结果能否完全代表药物在动物体内的动力学代谢过程及药物在动物体内的抑菌效果有待进一步研究,但可以从侧面提供用药的依据,指导生产及时准确地控制细菌性疾病。
有条件的养殖场最好开展细菌耐药性监测。用药物之前最好先做药敏试验。用药要科学合理,剂量要足,疗程要够,防止药物浓度达不到杀菌浓度而使细菌产生耐药性。尽量减少预防性投药,不滥投药,尽量交换用药,并注意联合用药,防止交叉耐药性的产生。搞好消毒,防止耐药菌株的扩散。
4结论
复方恩诺沙星可溶性粉对大肠杆菌1555、大肠杆菌216、大肠杆菌1515、绿脓杆菌2087、金黄色葡萄菌547、鸡巴氏杆菌458、猪巴氏杆菌437、链球菌608敏感,对沙门氏菌cvcc533不敏感。
复方恩诺沙星可溶性粉对畜禽主要致病菌的最小抑菌浓度(MIC)为0.0279~3.575μg/ml,最小杀菌浓度为(MBC)为0.055~7.11μg/ml。
参考文献
[1]熊焰,李德生,张和民,等,中国兽医科技[J].1999,29(3):35-36.
[2]刘运德,楼永良.微生物学检验[M].人民卫生出版社,2003.
[3]曹澎泽.兽医微生物学及免疫学技术[M].北京农业大学出版社,1992.
[4]石岩,梅世昌.医学动物试验实用手册[M].中国农业出版社,2002.
[5]任家琰,马海利.动物病原微生物[M].中国农业出版社,2001.
[6]叶顺章,张有才.现代性传播疾病实验诊断技术[M].广东科技出版社,1999.
[7]戴自英.实用抗菌药物学[M].上海科学技术出版社,1992.
[8]王秀茹.预防医学微生物及检验技术[M].人民卫生出版社,2002.
[9]周庭银,赵虎.临床微生物学诊断与图解[M].上海科学技术出版社,2001.
5种常见中草药提取液的抑菌试验 篇7
1 材料与方法
1.1 菌株与培养基
鸡大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌种、普通营养肉汤、普通营养琼脂培养基、大肠杆菌和沙门氏菌微量生化反应管均由吉林农业科技学院生物制药教研室提供。
1.2 中草药
蒲公英、草、马齿苋、败酱草、巴天酸模等根和地上茎叶部分, 2012年4~6月份采自吉林农业科技学院左家自然保护区天然林里, 无农药和化肥污染, 40℃左右通风干燥后, 用万能粉碎机粉碎备用。
1.3 中草药提取
分别将上述中药材置于37℃温箱烘干至易于研磨为止, 准确称取50g中药材于250m L蒸馏水中混匀, 浸泡4h, 用微火加热煮沸30min, 收集煎液, 用无菌滤纸过滤, 继续加水250m L, 同法煎制, 30min后收集。将两次煎液收集合并, 应用加热的方法将药液浓缩至最终质量浓度为1g/m L。
1.4 细菌的培养与稀释
将鸡大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌, 分别接种普通肉汤、普通琼脂培养基35℃孵育24h, 进行菌落形态观察并进行生化反应再次鉴定后备用。菌液浓度的配制方法为, 挑取菌落用2~3m L无菌生理盐水校正至0.5麦氏比浊单位, 使其含菌量为1~1.5×108cfu/L左右。
1.5 MIC的测定
将中草药提取液灭菌处理后, 用无菌的生理盐水将提取液分别稀释为0.9、0.8、0.7、0.6…0.01g/m L。用灭菌的5mm圆形干燥滤纸片饱和浸透不同稀释度的药液, 做好标记, 每个滴度做3个重复, 每个重复做3个琼脂平板, 同时设提取液、生理盐水、培养基、细菌等空白对照, 无菌操作将制备好的浸药滤纸片贴附制备好的已接菌的琼脂平板上, 35℃孵育24h, 室温放置48h后, 观察上述不同中草药提取物的MIC结果。
2 结果
空白对照与药液对照无任何细菌生长, 说明培养基及药液无污染。根部、茎叶部及其等量提取液配伍的抑菌活性效果见表1。部提取液抑菌效果高于茎叶部提取液效果10倍左右。五种中草药的抑菌效果由高到低的顺序是马齿苋、草、蒲公英、巴天酸模、败酱草, 其中对鸡大肠杆菌的抑菌效果高于对鸡沙门氏菌的抑菌效果, 但提取物的抑菌浓度均很低。根部、茎叶部提取液等量配伍的抑菌活性均高于单一中草药的根部与茎叶部提取液抑菌效果10倍左右, 证明联合配伍抑菌效果更好。
表1五种中草药提取液及其配伍的抑菌效果
3 讨论
蒲公英具有调节机体的免疫功能及非特异性抗菌作用, 能增进机体新陈代谢, 促进蛋白质和酶的合成, 从而促进动物生长、提高繁殖力和生产性能, 防治疾病, 提高饲料利用率。草生长旺盛, 富含营养, 既可以作为饲料, 提高饲喂动物的生长发育, 又可以药用, 有清热解毒、抗菌消炎、利尿消肿之功效。马齿苋可食用部分茎、叶中含有多种蛋白质、糖类、矿物质等营养成分, 马齿觅对痢疾杆菌、伤寒杆菌、大肠杆菌等肠道细菌有抑制作用。败酱草是一种常用的传统中药, 具有清热解毒、消肿排脓、活血祛痪的功效, 临床中常用于治疗肠痈、肺痛、燥热便秘、痢疾、肠炎、肝炎、结膜炎等症。巴天酸模为较常用草药, 以根入药, 性味苦、酸、寒。有清热解毒、活血止血、通便杀虫之功效, 用于治疗多种皮肤病、出血症及各种炎症。
通过抑菌试验表明:蒲公英、草、马齿苋、败酱草、巴天酸模五种中草药都含有抑菌的活性成分。这些植物的茎叶作为饲料添加剂不仅具有调节动物肠道菌群菌群平衡的作用, 而且具有补充各种营养要素的作用。在畜禽配合饲料广泛应用之前, 这些植物茎叶是主要的饲料。由于化肥和农药的大量使用, 工厂、矿山的三废排放等环境严重污染, 导致大量的药食两用的中草药濒临灭绝, 保护、开发、利用周围环境中的药食两用植物是重要的课题。
参考文献
[1]陆霄鹤, 等.马齿苋及鱼腥草水提取液体外抑菌实验[J].抗感染药学, 2010, 7 (1) :33-34.
[2]褚衍亮, 等.草多糖的超声提取及抑菌活性研究[J].时珍国医国药, 2010, 21 (2) :342-344.
[3]刘东梅, 等.黄芩, 黄连, 乌梅, 金银花, 败酱草对产Amp Cβ-内酰胺酶细菌的体外抑菌作用[J].河北中医, 2008, 30 (6) :654-655.
[4]万永红, 等.八种中草药抑菌试验报告[J].生物学杂志, 1999, 16 (2) :31-32.
抑菌试验 篇8
1 材料
1.1 中药复方
中药复方宫炎净 (由益母草、当归、川芎、桃仁、五灵脂、甘草等组成) , 购自石河子市医药公司。
1.2 菌株
大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门杆菌和链球菌, 均为标准菌株, 购自美国模式菌种收集中心 (ATCC) 。
1.3 培养基
LB培养液、普通营养琼脂、血清肉汤培养基、营养琼脂培养基等, 均按照常规方法配制[5]。
1.4 主要试剂与仪器
超净工作台, 苏州净化设备公司生产;电热恒温培养箱, 上海博迅实业有限公司医疗设备厂生产;高压灭菌锅、微量移液枪、接种环、土霉素注射液 (批号为130411) , 上海公谊兽药厂生产。
2 方法
2.1 中药复方宫炎净注射液的制备
参照参考文献[6-8]中的方法制备中药复方宫炎净注射液。取中药复方宫炎净, 用75%乙醇浸泡24 h后装柱, 以2 m L/s的速度渗漉48 h;收集渗漉液, 用旋转蒸发器浓缩至相当于原药1 g/m L;得提取液后, 加入2.0%吐温80, 搅拌均匀, 4℃静置24 h;取出, 以0.45μm微孔滤膜过滤得滤液;经检测为棕红色澄清液体, p H值为6.4, 生物碱含量为1.287%;最后分装, 每瓶10 m L, 封口, 121℃高压蒸气灭菌20 min即得。
2.2 抑菌试验
按照常规方法配制普通营养琼脂, 高压灭菌后倒入平板中。取分离的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门杆菌和链球菌单菌株试管培养液10μL, 均匀涂于平板表面 (其中链球菌接种于血清肉汤培养基) 。采用琼脂平板扩散法[9,10], 用直径为5 mm的无菌打孔器在每个平板上均匀打3个孔, 挑出孔内琼脂, 加热封底后注入中药复方宫炎净注射液, 已刚刚注满为准, 37℃培养18~24 h后测定抑菌圈直径。以无中药复方宫炎净注射液的平板作为空白对照;选用临床常用的土霉素注射液作为阳性对照。每种细菌挑选2株, 重复3次, 结果以平均数表示。
2.3 最小抑菌浓度 (MIC) 的测定
参照参考文献[11]中的方法测定MIC。按照常规方法配制普通营养琼脂, 高压灭菌后备用。取中药复方宫炎净注射液1 m L与1 m L营养琼脂液混合, 之后取出1 m L混合液再与1 m L营养琼脂液混合, 依此倍比稀释成含中药复方宫炎净注射液的梯度为1∶2, 1∶4, 1∶8, 1∶16, 取各菌株液10μL均匀涂于各平板表面, 37℃培养18~24 h后观察结果。
2.4 判断标准
抑菌效果的判定标准均按照《药理实验方法学》[12]标准, 抑菌圈直径≥20.0 mm为极度敏感, ≥15.0~<20.0 mm为高度敏感, ≥10.0~<15.0 mm为中度敏感, <10.0 mm为低度敏感。
3 结果与分析
3.1 抑菌试验 (结果见表1)
由表1可知, 中药复方宫炎净注射液具有较强的抑菌作用, 其中对沙门杆菌作用最强, 其次为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌, 因此中药复方宫炎净注射液对大肠杆菌、沙门杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌为高度敏感。土霉素注射液的抑菌效果最好, 空白对照组平板中长满各种细菌菌落。
3.2 MIC的测定 (结果见表2)
注:+表示呈阳性, 有细菌生长;-表示呈阴性, 抑菌效果明显。
由表2可知:中药复方宫炎净注射液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门杆菌的MIC为1∶8, 即0.160 9 mg/m L;而对链球菌的MIC为1∶4, 即0.321 8 mg/m L。
4 讨论
本试验结果表明, 中药复方宫炎净注射液对大肠杆菌、沙门杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌高度敏感, 对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门杆菌的MIC为0.160 9 mg/m L, 而对链球菌的MIC为0.321 8 mg/m L。中药复方宫炎净注射液具有较强的抑菌作用, 这与李正国等[13]对此中药复方散剂的研究结果一致, 将该复方散剂制成注射液后, 其抑菌效果更为显著。因此, 中药复方宫炎净注射液可用于临床治疗奶牛子宫内膜炎。
奶牛子宫内膜炎主要是由病原微生物如大肠杆菌、沙门杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌等引起的子宫黏膜炎症, 一般使用抗生素进行治疗。随着抗生素的广泛使用, 细菌对多数抗生素产生了耐药性[14,15], 而中药低残留、无耐药性, 且中药复方宫炎净注射液对大肠杆菌、沙门杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌高度敏感, 故用中药复方宫炎净注射液治疗奶牛子宫内膜炎具有广阔的应用前景。
抑菌试验 篇9
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料来源。
2008年7月, 辽宁省营口市鲅鱼圈开发区某鸡场送检疑似大肠杆菌病死鸡若干只, 死亡时间不超过12 h。
1.1.2 主要试剂及仪器。
伊红美兰琼脂:由北京奥博星生物技术有限责任公司提供;糖发酵试验用各种糖:购自中国医药 (集团) 沈阳有限公司生化试剂分公司;药敏纸片:购自上海伊华医学科技有限公司;普通琼脂、普通肉汤、血液琼脂平板、糖发酵管参照参考文献[2]方法配制。
1.2 方法
1.2.1 细菌分离培养。
在临床中采集具有典型大肠杆菌病理变化的鸡心血、肝, 无菌接种在普通琼脂平板及普通肉汤中, 37℃培养24h, 选取表面光滑、边缘整齐、表面灰白半透明菌落接种在伊红美兰培养基上, 于37℃鉴别培养24h后, 选取典型菌落进行纯培养。取各菌株的纯培养物分别进行生化特性鉴定。
1.2.2 细菌形态学观察。
无菌取病死鸡心血、肝, 涂片, 瑞氏染色、革兰氏染色, 镜检。取在伊红美兰培养基上培养18h的新鲜菌落进行革兰氏染色, 镜检。
1.2.3 生化试验。
糖发酵及生化反应按常规进行。
1.2.4 溶血性试验。
无菌采取绵羊红细胞, 用玻璃珠脱纤, 溶化琼脂培养基, 待琼脂冷却至45℃左右时, 按琼脂的10%加入脱纤血, 轻轻摇晃, 使血液混合均匀, 制成血液琼脂平板。将待检大肠杆菌分别划线接种于血液琼脂平板上, 37℃中培养24 h后, 观察结果。
1.2.5 动物试验。
(1) 菌液制备:细菌接种于普通肉汤中, 37℃培养18 h, 4℃冰箱保存备用。 (2) 致病性:从市场购10日龄AA肉鸡, 饲养1周, 确保健康。随机分为A、B两组, 每组5只, A组为试验组, B组为对照组, A组颈部皮下注射0.2 mL肉汤菌液, B组腹腔接种0.2 mL灭菌生理盐水。隔离饲养、观察。
1.2.6 药敏试验。
将待检菌株的肉汤培养物用无菌生理盐水稀释10倍后, 每个琼脂平板接种0.1 mL, 用曲玻棒均匀涂布后, 将不同的药敏片相隔4.5～5 cm贴在琼脂平板表面, 置37℃培养18 h后, 测定抑菌环的直径, 结果判定依据《纸片法抗菌药物敏感试验操作标准 (第四版) 》。
2 结果
2.1 细菌分离培养
分离株在普通琼脂平板上37℃培养24 h后, 生长良好, 呈中等大小、边缘整齐、表面光滑微凸, 灰白色半透明的菌落。在伊红美兰平板上, 形成中等大小, 边缘整齐, 有金属光泽的黑色菌落。
2.2 细菌形态学观察
病死鸡心血、肝及伊红美兰培养物涂片染色镜检后, 均可见有两端钝圆的革兰氏阴性小杆菌。多数散在, 少数有2～3个相连。
2.3 生化试验结果
糖发酵试验结果显示分离菌均能发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、木糖、果糖、鼠李糖、山梨醇及阿拉伯胶糖, 均不发酵蔗糖、卫矛醇、肌醇。各菌株吲哚试验和M.R试验阳性、VP试验阴性, 根据试验结果判定, 所分离的3株菌均为大肠杆菌。 (见表1)
注:糖发酵试验:⊕表示产酸产气;+表示产酸;-表示不发酵
2.4 溶血性试验
试验结果表明, 在血液琼脂平板上, 所分离的3个菌株菌落周围均形成宽约3 mm透明的溶血环, 判定为β溶血。
2.5 致病性试验
2.5.1 在肉汤中生长特性。
大肠杆菌在肉汤中37℃培养18 h后, 呈现均匀混浊, 管壁与液面有菌膜, 底部有粘性沉淀。
2.5.2 致病性。
A组肉仔鸡1只接种后第3 d死亡, 其余4只第4 d全部死亡, B组肉仔鸡全部健活。剖检死亡鸡发现其肝脏肿大、质脆、有坏死灶, 表面被覆一层黄白色纤维素性渗出物;肺充血淤血, 其中2只鸡肺部有坏死灶;脾脏肿大;十二指肠有出血性肠炎变化;盲肠扁桃体出血肿胀。
采取病死鸡心血、肝、脾接种到普通肉汤及伊红美兰培养基上, 均有细菌生长。该菌培养特性及革兰氏染色特性与接种菌一致, 肉汤培养物作生化试验, 生化特性与接种菌完全相同, 表明此菌与接种细菌为同种细菌。
2.6 药敏试验结果
药敏试验结果判定方法参照《纸片法抗菌药物敏感试验操作标准 (第四版) 》, 表明该菌对复达欣、先锋Ⅵ、菌必治、庆大霉素敏感, 对氧哌嗪青霉素、呋喃妥因、氧氟沙星中度敏感, 而卡那霉素、氟哌酸、链霉素、头孢呋肟、红霉素、氨苄青霉素、环丙沙星对它没有抑制作用。
3 讨论
3.1大肠杆菌是夏季肉鸡生产危害较大的传染病, 从本菌分离鸡场看, 其发病的主要诱因是饲养管理不当, 通风不良, 以及连日阴雨造成的地面潮湿。提示防控本病的关键是加强饲养管理, 日常提供优质全价饲料;严格卫生防疫制度, 在夏季注意防暑, 补充维生素和电解质, 创造良好的饲养条件。
3.2鸡场在发病前, 技术人员曾长期应用环丙沙星、氟哌酸、红霉素等药物作为预防肠道疾病的药物添加在饲料中, 造成分离菌对多种药物的抗药性。因此在用药物治疗大肠杆菌病的时候, 应根据药敏试验结果, 选择敏感药物交替按疗程服用, 以期达到较好的治疗效果[4]。
3.3由于各地优势血清型存在差异, 有效而通用的菌苗尚未出现[5], 在本地区本病的预防仍处于空白阶段。从本试验可以看出, 所分离菌的具有溶血性及较强致病性, 若应用本菌制备大肠杆菌自家苗灭活苗, 用于本场大肠杆菌病的预防, 将会收到较好的预防效果。
参考文献
[1]甘孟侯.禽病学[M].北京:中国农业出版社.1999.167~168.
[2]韩文瑜, 何昭阳, 邓玉斌.病原细菌检验技术[M].长春:吉林科学技术出版社.1992, 41~50, 80.
[3]甘孟侯, 李文刚, 陈洪科.禽病诊断与防治[M].北京:中国农业出版社, 1996, 120.
[4]王双山, 张敬礼, 刘庆昌, 等.肉鸡大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验[J].河南农业科学, 2003 (6) :43245.
抑菌试验 篇10
1 材料
1. 1 主要仪器
紫外分光光度计( 型号为752) ,上海奥析科学仪器有限公司生产; 旋转蒸发器( 型号为ZFA84 - Ⅰ) 、循环水式多用真空泵( 型号为SHB - Ⅲ) ,郑州长城科工贸有限公司生产; 索氏脂肪浸提器( 型号为ST310) ,苏州安创仪器有限公司生产; 数显不锈钢电热培养箱( 型号为HPX - 9272MBE) 、立式压力蒸汽灭菌器( 型号为BXM - 30R) 、超净工作台( 型号为SW - CJ - 2FD) ,上海博迅实业有限公司生产; 气浴恒温振荡器( 型号为ZD - 85) ,江苏金坛市医疗仪器厂生产。
1. 2 试剂与中草药
无水乙醇、丙酮、乙醚、葡萄糖、蒽酮、浓硫酸、牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、磷酸氢二钾等,塔里木大学设备科化学试剂库提供。
马齿苋、骆驼刺、红柳、蒲公英、肉苁蓉、花粉、罗布麻、枸杞、黄芪、苦荬菜、石榴皮、芦根,塔里木盆地采集。
2 方法
2. 1 蒽酮- 硫酸比色法测定中草药多糖含量
2.1.1多糖的提取与纯化
分别取12 种中草药干品4. 0 g水煎煮3 次( 1. 5,1. 0,0. 5 h) ,过滤,静置12 h后取上清液,减压浓缩至10 m L,浓缩液以无水乙醇调至浓度为75% ,搅拌,5 ~ 10 ℃静置24 h,沉淀物分别以无水乙醇、丙酮、乙醚回流洗涤,不同中草药洗涤时间不同,一般情况下洗涤1 ~ 2 h,得多糖粉末,于60 ℃烘干,密封备用[1,2,3]。
2.1.2多糖液的制备
精密称取60 ℃ 干燥至恒重的12 种多糖各10 mg,加入少量纯化水溶解定容至100 m L容量瓶中[4,5]。
2.1.3蒽酮溶液的配制
称取蒽酮0. 2 g,加浓硫酸100 m L,混合摇匀即得( 现配现用) 。
2.1.4标准液的配制
精密称取105 ℃ 干燥至恒重的葡萄糖0. 1 g,以纯化水溶解,定容至100 m L容量瓶中,质量浓度为1 mg /m L,绘制标准曲线。
2.1.5多糖的测定与计算
分别量取各样品液1 m L,置具塞试管中,加纯化水1 m L,蒽酮溶液4 m L,于波长623 nm处测定吸光度。
2. 2 多糖抑菌试验
2.2.1培养基的制备
1) 选择直径6 mm的圆形滤纸片作为药敏片,药敏片浓度分别为50,100 μg /片,灭菌后烘干密封,于4 ℃ 冰箱中保存,备用[6]; 2) 采用麦氏比浊管法制备菌液和标准比浊管; 3) 采用贴纸片法测量抑菌圈的直径( mm) ,判定敏感程度。判定标准: 直径小于10 mm为耐药,10 ~ 15 mm为中度敏感,> 15 mm为高度敏感,> 20 mm为极敏感。
3 结果与分析
结果见表1。
从表1 可以看出,塔里木盆地12 种中草药多糖含量有明显的差异,多糖含量较高的是肉苁蓉、罗布麻、蒲公英等,多糖含量较少的是苦荬菜、骆驼刺、马齿苋等。12 种中草药多糖对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌大多为中度敏感或耐药,说明12 种中草药一般为中度抑菌药,在机体内并非直接抑菌,而是表现出多种生物活性,其机理有待于进一歩研究。
从表1 还可以看出,中草药多糖含量越高,其抑菌圈越大,说明多糖含量的多少是影响抑菌效果的主要因素,但也有例外,如石榴皮中多糖含量不高,而抑菌圈相对较大,这可能是石榴皮中除多糖以外,还有其他化学成分在协同多糖起抑菌的作用。
试验发现,加入蒽酮试剂的操作方法是影响显色结果的主要因素,本试验采用“悬空垂直加入蒽酮试剂立即摇匀”的操作方法,能得到稳定的显色结果。蒽酮试剂在加入过程中,反应时间、温度要严格控制,充分混匀,否则会影响试验结果。
4结论
本试验结果表明,塔里木盆地12 种中草药多糖含量最高的是肉苁蓉,其次为罗布麻,可用作植物多糖的提取; 12 种中草药对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果达到中度敏感的是石榴皮、罗布麻,可作为抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的饲料添加剂替代抗生素; 12 种中草药多糖的含量不一定与抑菌相关。
参考文献
[1]吴翠云,汪河滨,李万福,等.黑果枸杞叶片中多糖提取工艺研究[J].食品研究与开发杂志,2009,30(12):1-5.
[2]汪河滨,白红进,王金磊.超声-微波协同萃取法提取黑果枸杞多糖的研究[J].西北农业学报,2007,16(1):157-158,175.
[3]段景峰,王彦霞,李小媛,等.阿拉尔地区五个红枣品种多糖含量差异及其抗氧化活性的研究[J].新疆农业科学,2014,51(5):831-838.
[4]赵小亮,白红进,吴翠云,等.超声-微波协同萃取法提取杜梨果实多糖[J].时珍国医国药杂志,2007,18(9):2151-2152.
[5]白红进,赵小亮,蒋卉.新疆刺山柑多糖的提取及含量测定[J].食品研究与开发杂志,2007(3):120-122.