植物源抑菌（共5篇）
植物源抑菌 篇1
经济的发展给人们的生活带来很大的变化, 如今追求绿色生活、绿色食品已经是一种普遍现象, 食品防腐添加剂的安全性也逐渐受到大家的重视。食品防腐剂的主要作用是抑制细菌繁殖, 是改善因时间搁置造成的食品变质腐坏问题的一种添加剂。食品防腐剂主要有三类, 一种是化学防腐剂, 一种是天然防腐剂, 一种是复合型的防腐剂, 但是目前使用频率较高的仍是化学类防腐剂, 化学防腐剂具有强烈的副作用, 中毒、畸形、诱癌等, 极其不符合现代人的绿色饮食观念, 是以无毒、高效的天然性防腐剂成为人们关注的重点, 同时也成为日后防腐剂领域的主要使用及研究类型。如今在使用的各种天然性食品防腐剂中, 又可以分为植物源性、动物源性和微生物源性等几类。植物领域中有许多具有抗菌作用的种类, 如葱、姜、蒜类, 苹果类, 竹叶、芦荟、银杏、荸荠类等, 都具有良好的抑菌成分;而动物方面也具有很多抑菌品种, 如鱼、虾、蟹、鱼精、牡蛎等;在微生物领域常见的抑菌因素主要有乳酸菌、纳他霉素、米曲霉、酵母菌等多种。笔者选择其中五类植物源性天然食品防腐剂进行了研究, 现将报告分析如下。
1 中草药提取物类
中草药类提取物品种繁多, 材料丰富。我国医学专家对大量的中草药进行了研究分析, 发现了一百余种以上抗菌效果显著的草药, 而其效果最为显著的则是黄连, 其他的还有大黄、大青叶、艾叶、鱼腥草、银杏叶、黄柏、玄参、蒲公英等多种。在各类植物研究中, 又以草药的提取液成分检测最为不易。但是经过众多专家的研究, 中草药类提取物灭菌作用研究还是具有了长足的进步。如银杏叶的提取物醇-水, 能够有效杀灭革兰氏菌, 对其阴、阳性菌均具有非常显著的抑制作用。又如连翘中抑菌成分最为明显的乙醇成分, 在对食品的实验检测中确实证明了其显著的抑菌作用。中草药类提取物的抑菌提取物性质主要是酯、醛、酚、酮等几个类型, 其抑菌性能乃是提取物中的小分子有机化合物, 对微生物细胞菌组织具有非常明显的干扰、溶破作用, 从而将其杀死或者抑制。中草药提取物之间还存在一种特殊的性能, 即良好的协调增效作用, 很多学者对这一现象进行了实践研究, 均证明了其功效, 且当配伍类草药成分搭配时, 不仅能增强抑菌效果, 还可以扩大抑菌范围。
2 香辛料提取物类
香辛料一直作为调味剂的身份出现在大家的视野, 可是近年来有学者以其提炼出的有效成分作为防腐剂使用, 发现效果也是非常显著的。比较常用的香辛料类植物有芸香科、樟科、禾本科、菊科、桃金娘科等几类, 主要有九里香属类、樟属类、芸香草类、蒿属类、柠檬桉类等, 但是香辛料类防腐剂只有几十种左右, 开发种类并不多。香辛料类提取物中最重要的抑菌成分是香精油, 即果实、种子、树皮、根的提取物成分;其它抗菌成分还有丁香酚、百里酚、茴香脑、香草醛、肉桂醛等。在研究中, 学者发现其抗菌能力能够透过细胞组织直接侵入菌体对进行破坏和抑制, 而精油中的成分还可以将生物膜的稳定性进行抑制, 干扰酶促反应。香辛料提取物之间同样存在着显著的协效作用。将肉桂醛与香草醛结合, 即能够极大地增强二者的防腐作用。
3 芦荟提取物类
芦荟的种类繁多, 构成繁复, 经研究发现芦荟提取物中抗菌效果最重要的成分是芦荟素A、芦荟酊以及芦荟汁, 尤其是芦荟汁的抑菌作用, 对大肠杆菌、变形杆菌、葡萄球菌等几个菌种均具有明显作用。有研究分析, 芦荟在121℃内的抗菌作用都是非常明确的, 而在121℃高温后, 其抑菌性能也非常显著, 证明芦荟的抗菌效果稳定性能也非常好。
4 荸荠皮提取物类
荸荠即马蹄, 是一种非常好的果蔬植物, 药食兼具, 而马蹄皮提取物即是从马蹄材料加工时的废弃物品提取。曾莹在试验中发现, 马蹄皮提取物在抑菌种类成分测定中, 具有较为明显的抗菌效果。将提取制剂添加于豆奶、酱油、熟肉等食品中时, 能够明显延长食物的保质期。而与常用的化学防腐剂相比, 其马蹄皮抑菌效果也具有明显优势。而且在高温性能测定中, 马蹄皮提取物的稳定性也非常好, 即使121℃高温处理, 其效果仍很明显。
5 竹叶提取物类
竹叶提取物的种类比较繁多, 其提取物中的有机酸和酚类活性物使其防腐效果尤为显著。吴京平对多种竹叶类提取物的效果进行了报道, 证明对细菌、霉菌的抑制作用明显。竹叶类提取物的特别之处是在中性条件下即可发挥抑菌作用, 而且经过高温处理后, 抑菌作用还会明显增强。
6 结论
食品添加剂的发展随着人们对生活质量要求的提高, 会逐渐演化至绿色、天然、营养方面, 如今防腐剂虽然还是以化学类居多, 但是植物源性天然类防腐剂将会逐渐取代其地位。虽然天然防腐剂还存在一定的缺陷性, 但是无毒、稳定性强、抗菌效果好, 且使用面积广, 安全性高, 诸多优势将会使其成为防腐剂研究中的重点。随着科技的进步, 天然植物防腐剂会慢慢取代化学防腐剂, 植物源性防腐剂有着良好的发展前景。
参考文献
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[3]曾莹, 姚晓玲.天然食品防腐剂荸荠皮提取物在食品中的抗菌效果研究[J].中国食品添加剂, 2005 (4) :59-61.
植物源抑菌 篇2
1材料与方法
1.1材料
供试植物源杀菌剂为苦参、中草药和黑农一号;培养基采用马铃薯葡萄糖培养基(PDA)[3](1 000 mL):去皮马玲薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂20 g,pH自然;供试菌种为青霉菌(Penicillium duclauxi),从被污染的试管苗培养基分离纯化获得。
1.2 方法
1.2.1 污染青霉菌的分离 从被青霉菌污染的马铃薯组培苗中分离到污染霉菌,进行划线分离,挑取单菌落,接种到斜面PDA培养基上,于28℃恒温培养7 d左右后,接种到平面培养基上培养,长满平皿后备用。
1.2.2 制PDA抗性培养基 吸取20 mL药液与100 mL培养基趁热用力摇匀,倒入培养皿中,每皿约15 mL,制得抗性培养基。
1.2.3 污染青霉菌的鉴定 用PDA培养基在28℃条件下培养3 d。比较各菌株的群体形态特征和个体形态特征,进行初步鉴定[4]。继续培养至15 d后,进一步鉴定。
1.2.4 抑菌试验方法 将苦参、中草药和黑农一号分别配制成不同浓度梯度的药液,对照为不加植物源杀菌剂的培养基,经高温高压灭菌后,准确量取一定量的药液加入到热的培养基中(保持50℃,一般以1 mL药液加入到9 mL培养基为宜),混合均匀后倒入直径为9 cm的培养皿内冷凝即带药培养基(或对照)。
在无菌条件下,用灭过菌的直径为2 cm的不锈钢打孔器在培养好的菌落外缘切下带菌培养基柱——菌饼。接种针将菌饼反面(有菌丝的一面向下和培养基贴合)移植到带药培养基上,一个培养皿接2个菌饼,每种浓度重复3次。置于25℃温箱内,5 d后检查。
1.2.5 数据处理方法 对获得数据进行处理,用SAS9.0进行数据分析[5]。
根据菌落直径求抑制生长的百分率,其计算公式[6]为:
菌落直径/cm=2次直径平均数
生长直径=菌落的平均直径-菌饼直径
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2 结果与分析
2.1 镜检鉴定结果
对分离纯化的菌株镜检,初步鉴定青霉菌。主要的形态特征是菌丝为有隔菌丝,菌丝被分隔成多个细胞,有非常明确的分生孢子梗,分生孢子成串。
由表1可以看出, 3种植物源杀菌剂对青霉菌的菌丝生长都有一定的抑制作用。苦参各处理浓度与对照均呈极显著差异,在浓度0.2%时,菌落直径极显著低于对照和其它处理。中草药处理浓度与对照均呈极显著差异。黑农一号各处理的菌落直径与对照均呈极显著差异,且黑农一号各处理菌落直径随着浓度的增加菌落直径逐渐减小,黑农一号在浓度为2.0%时,菌落直径最小。
注:表中数据均为培养5 d后3次重复的平均值。
Note:The data were average of three times after cultured 5 days.
由表1还可看出,对照为不加抑菌剂的培养基,青霉菌的存活率100.0%。苦参和中草药对青霉菌都有一定的抑制作用,但效果不明显,其中苦参在0.2%浓度时的抑菌率较高,为83.0%。黑农一号浓度为2.0%时,对青霉菌菌丝的抑制率为100.0%,且随着植物源杀菌剂黑农一号浓度的升高,抑菌作用加强。
3 结论与讨论
试验结果表明,黑农一号植物源杀菌剂的抑菌效果最好,在浓度为2.0%时,抑菌率达100.0%,它是根据中药配伍理论,从多种中草药中提取的具有杀菌、抗菌的大分子活性物质成分,具有广谱性的抑菌作用。苦参的抑菌效果次之,抑菌率高达83.0%。目前,还没有植物源杀菌剂抑制青霉菌的相关报道。在该试验中,植物源杀菌剂对组织培养中出现的真菌(青霉菌)具有不同的抑制作用。但随着化学农药带来的环境污染问题、有害生物抗药性问题的产生,植物源农药的开发日益引起重视,在生产中应用植物源杀菌剂不仅避免了化学农药带来的一系列问题,而且安全、有效和持久,已经发展成为植病防治中十分重要且日益得到重视的有效措施之一。
参考文献
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[5]唐启义,冯明光.实用统计分析及其DPS数据处理系统[M].北京:科学出版社,2002.
植物源抑菌 篇3
1.1 材料
(1) 试验菌株。8株猪大肠杆菌 (E.coil) 分离自大肠菌感染的猪体, 8株猪链球菌株分离自感染的病猪, 均来源于河南省内猪场, 由河南农业大学牧医工程学院传染病实验室自行分离保存。
(2) 试剂和药物。抗菌肽和牛肉膏 (生化试剂) 购自北京奥星生物技术有限公司, 批号20070720;蛋白胨 (生化试剂) 购自北京奥星生物技术有限公司, 批号20081102;氯化钠 (分析纯) 购自天津北方天医化学试剂厂, 批号20080924;磷酸氢二钾 (分析纯) 购自上海恒信化学试剂有限公司, 批号20080602。
(3) 仪器。电热温恒温培养箱:HG303-4南京实验仪器厂制造;净化工作台:SW-CT-1C苏净集团安泰公司生产;手提式不锈钢蒸汽消毒器:YX280B上海三申医疗器械有限公司;双目生物显微镜:CX21日本奥林巴斯。
1.2 方法
(1) 菌种的复苏和纯化。将实验室保存猪源大肠杆菌的甘油菌种划线接种营养琼脂平板培养基, 猪链球菌接种于血平板, 37℃培养24小时, 挑取单个菌落, 涂片染色镜检, 观察细菌的大小和形态, 选取典型菌体进行试验。
(2) 细菌接种量的确定。用普通肉汤培养基将抗菌肽原液倍比稀释为1/10倍~1/2560倍9个浓度, 加入灭菌试管中。两种细菌每组随机选取4株, 用生理盐水将猪源大肠杆菌和猪链球菌以镜检计数方式配成1×107cfu·m L、1×106cfu·m L、1×105cfu·m L、1×104cfu·m L4种浓度的细菌悬液, 分别接种于含不同药物梯度的普通肉汤培养基中。另做不含药物的培养基, 接种菌悬液, 作为生长菌的空白对照。于37℃培养24小时观察各菌株的生长情况, 以未有细菌生长的最小药物浓度为MIC。
(3) 试管稀释法对最小抑菌浓度 (MIC) 的确定。取抗菌肽原液0.2m L以相应的普通肉汤培养基倍比稀释成1/10倍、1/20倍、1/40倍、1/80倍、1/160倍、1/320倍、1/640倍、1/1280倍和1/2560倍9个浓度移入小试管, 两种细菌每组随机选取4株, 用生理盐水将大肠杆菌和猪链球菌菌株分别以镜检计数法方式配成1×105cfu·m L的菌悬液, 分别在不同的药物梯度试管中加入20m L菌液, 另做不含药物的培养基接种菌悬液, 作为生长菌的空白对照。样品于37℃培养, 36h观察细菌生长情况, 分别测定菌种的MIC。
2 结果
2.1 细菌接种量的确定
由表l看出, 在相同培养条件下, 抗菌肽的最小抑菌浓度随细菌浓度的增加而不断提高, 在细菌浓度范围为1×104cfu·m L和1×l05cfu·m L之间为规则上升, 之后MIC的变化不规则。为了获得较好的数值并获得较一致的试验结果, 本试验将菌株接种浓度确定为1×105cfu·m L进行抑菌试验。
2.2 最小抑菌浓度 (MIC) 的测定
采用普通肉汤培养基倍比稀释法, 结果测得抗菌肽对大肠杆菌的最小抑菌浓度和对猪链球菌的抑菌作用。抗菌肽对大肠杆菌的MIC为原液的1/160~1/80倍之间。抗菌肽对猪链球菌的MIC明显小于大肠杆菌的MIC为1/1280~1/640倍之间, 只表明抗菌肽对猪链球球菌的体外抑菌效果明显优于大肠杆菌。从表2看出, 抗菌肽对猪源的大肠杆菌和猪链球球菌的抑菌作用有较大差异, 对大肠杆菌的MIC较高, 为原液的1/160~1/80倍之间, 而对猪链球球菌的MIC较低, 为1/1280~1/640倍之间。
3 讨论
3.1 关于抗菌肽对猪源大肠杆菌和猪链球菌最小抑菌浓度 (MIC)
培养温度和培养时间相同时, 抗菌肽对大肠杆菌和猪链球菌的MIC与接种细菌的浓度和培养时间相关, 试验时应选择适当菌量, 本试验在预试验中通过测定不同细菌浓度对抗菌肽最小抑菌浓度的影响。抗菌肽对猪源大肠杆菌和猪链球菌的抑制作用有较大的差异, 究及原因可能与大肠杆菌属于革兰氏阴性菌, 链球菌属于革兰氏阳性菌有关, 两种细菌的细胞壁结构有较大的差异, 因此对抗菌肽的耐受性不同。
3.2 关于抗菌肽在动物生产中的应用
不同来源和不同种类的抗菌肽抗菌特征具有相似性, 即具有广谱抗菌活性, 同时对肿瘤细胞也有杀伤作用。研究者发现抗菌肽可促进动物生长, 提高动物抗病能力, 不易产生耐药性。此外, 结合基因工程技术培育转基因动物也是动物养殖的一种新途径。Yarus用显微注射法将牛气管AMP基因转入小鼠, 转基鼠成功地表达了牛气管AMP, 鼠乳中的牛气管AMP对大肠杆菌具有抗菌活性。可见抗菌肽转基因动物具有明显增强抗病原微生物的能力, 这在动物养殖中具有重要的现实意义。同时昆虫抗菌肽被认为最具有发展前景的绿色饲料添加剂。抗生素饲料添加剂的使用严重破坏了动物肠道的微生物平衡, 并且容易在动物体内残留, 使生态环境中的细菌在与动物接触中产生耐药性, 严重影响畜产品的品质和人类的健康, 进而影响整个生态环境。
植物源抑菌 篇4
关键词：盐酸沃尼妙林,体外抑菌,两倍稀释法,最低抑菌浓度
沃尼妙林 (Valnemulin) 是新一代截短侧耳素类半合成抗生素, 与泰妙菌素同属一类药物, 是动物专用抗生素;主要用于防治猪、牛、羊及家禽的支原体病和革兰氏阳性菌感染。该药抗菌谱广, 抗菌活性强, 对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、霉形体和螺旋体等敏感, 对链球菌、放线杆菌、巴氏杆菌、关节炎霉形体、猪痢疾密螺旋体及结肠菌毛样螺旋体等都具有良好的抗菌活性[1]。沃尼妙林是第一个全欧洲批准的兽用药物预混剂, 最近在国内被批准可用于防治猪的霉形体感染及细菌性疾病。目前, 有关沃尼妙林在体外抑菌试验研究的报道较少。本试验旨在探讨沃尼妙林在体外对畜禽常见几种致病性细菌的抑制效果, 为临床应用沃尼妙林并制定给药方案提供依据。
1 材料与方法
1.1 材 料
1) 菌株。
副猪嗜血杆菌 (CTCC 253) 、猪链球菌 (CVCC 556) 、巴氏杆菌 (C 48-3) 由武汉工业学院动物科学与营养工程学院赠送;金黄色葡萄球菌 (S.aureus) 1株 (九江株) 、猪链球菌 (SS) 2株 (南阳株、信阳株) 、猪巴氏杆菌 (PM) 2株 (九江株、漯河株) 、副猪嗜血杆菌 (HPS) 3株 (南阳株、信阳株、黄陂株) 均为野生菌, 系经过鉴定的临床分离株, 由华中农业大学动物医学院预防兽医系赠供。
2) 药品。
盐酸沃尼妙林, 由湖北龙翔药业有限公司生产, 批号为10060001-A, 含量为97.6%。无菌条件下, 按实际含量折算, 配制成400 μg/mL的储备液, 稀释至50 μg/mL的使用液。分装后, 于-20 ℃冷冻保存。
3) 培养基。
犊牛血清购自杭州四季青材料有限公司;胰蛋白大豆琼脂 (TryptiesoyAgar, TSA) 、胰蛋白大豆肉汤 (TryptieSoyBroth, TSB) 均购自Difco公司;辅酶I (烟酰胺腺嘌呤二核苷酸, NAD) 购自中国医药 (集团) 上海化学试剂公司。
1.2 方 法
1) 菌液制备。
将副猪嗜血杆菌先接种到TSA琼脂培养基上, 经37 ℃复壮24 h后, 分离典型、单个菌落, 转种于TSB肉汤培养基中增菌, 37 ℃孵育16～18 h, 作为试验用菌液;然后稀释至0.5号麦氏标准浊度管;再用灭菌生理盐水按1∶1 000的比例进行稀释, 稀释至约1.5×105 CFU的试验浓度, 待用。猪链球菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌均按以上方法操作。
2) 最低抑菌浓度测定。
盐酸沃尼妙林最低抑菌浓度 (MIC) 测定:采用两倍稀释法进行, 于无菌96孔板1～12孔均加入45 μL的TSB肉汤;将50 μg/mL的替米考星加入第1孔, 依次倍比稀释至第11孔, 再于第11孔取混合液45 μL舍弃;再于第12孔加45 μL培养基作为空白对照, 其他各孔均加入45 μL约1.5×105 CFU的副猪嗜血杆菌试验用菌液;每个浓度做4个重复。使1～11孔最终药液浓度依次为12.5 000、6.2 500、3.1 250、1.5 600、0.7 800、0.3 900、0.2 000、0.1 000、0.0 500、0.0 250、0.0 125 μg/mL, 混匀, 密封, 置37 ℃生化培养箱中培养18～24 h后观察结果。其他药物进行同样的操作。
结果判定:在衬有黑底板的光线下观察, 细菌生长时小孔内培养液呈弥散状浑浊或U形底部有圆形或丝网状沉淀, 无细菌生长孔的最低药物浓度即为该药物的MIC。耐药结果的判定参照2007年美国临床实验室标准委员会 (CLSI) 制定的标准[2]。
2 结果与分析
盐酸沃尼妙林对受试4株副猪嗜血杆菌、3株链球菌、1株金黄色葡萄球菌、3株巴氏杆菌的体外抑菌试验结果, 分别见表1～3。
由表1可见, 盐酸沃尼妙林对副猪嗜血杆菌标准株的MIC为0.025 μg/mL, 对临床分离的副猪嗜血杆菌也有很好的抑菌效果, 对信阳株不敏感。
由表2可见, 盐酸沃尼妙林对链球菌标准株的MIC为0.025 μg/mL、对临床分离株的MIC均小于0.200 μg/mL, 显示出极好的的抑菌效果。对临床分离的金黄色葡萄球菌的MIC为12.500 μg/mL, 抑菌效果较差。
由表3可见, 盐酸沃尼妙林对巴氏杆菌标准菌的MIC为0.025 μg/mL、对临床分离株的MIC均为0.050 μg/mL, 也显示出极好的抑菌效果。
3 讨 论
沃尼妙林的作用机制是在核糖体水平上抑制细菌蛋白质的合成, 高浓度时也可抑制RNA的合成;主要作用是抑菌, 高浓度时也可杀菌[3]。抗菌谱广, 对多种细菌 (如关节炎霉形体、金黄色葡萄球菌、放线杆菌等) 有良好的抑菌活性, 其MIC值为0.0 005～0.0 500 μg/mL。
Hannan等[4]测定了沃尼妙林对猪肺炎支原体 (野株) 、猪滑液支原体、牛支原体、鸡毒支原体的体外抑菌浓度。结果表明, 沃尼妙林对猪肺炎支原体的MIC为0.00 050 μg/mL, 对猪滑液支原体的MIC为0.00 010～0.00 025 μg/mL, 体外抑菌活性分别为泰妙灵的100倍 (0.05 000 μg/mL) 和20～25倍 (0.05 000～0.10 000 μg/mL) 、恩诺沙星的20倍 (0.01 000 μg/mL) 和400～500倍 (0.05 000～0.10 000 μg/mL) 。
Jordan等[5]分别用沃尼妙林、泰妙菌素、恩诺沙星、泰乐菌素及林可霉素测定鸡败血支原体的MIC, 其中沃尼妙林对其体外抑菌活性最强, MIC低于0.008 μg/mL。Karlsson等[6]在澳大利亚分离了76株短螺旋体野株, 抑菌试验表明, 沃尼妙林0.05 μg/mL对32%菌株敏感, 而泰秒菌素0.05 μg/mL仅对2%菌株敏感;其90%抑菌浓度 (MIC90) 是泰妙菌素的2倍, 克林霉素的16倍, 林可霉素的62倍, 恩诺沙星、泰乐菌素的256倍, 差异极显著 (P<0.01) 。
本研究中沃尼妙林对副猪嗜血杆菌、链球菌、巴氏杆菌标准菌株的MIC均为0.025 μg/mL, 明显低于猪口服盐酸沃尼妙林后血药峰浓度1.670 μg/mL[7], 呈现较好的抑菌效果。在临床中, 该药可用于治疗由上述对沃尼妙林敏感的病原引起的疾病。
参考文献
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植物源抑菌 篇5
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1化学试剂和培养基三氯异氰脲酸由山东滕州银丰化工有限公司提供,经检测有效氯含量为77. 82% ; 新洁尔灭消毒液购自国药集团化学试剂有限公司,经检测苯扎溴铵质量浓度为9. 8 g·L- 1; 有效氯含量和苯扎溴铵含量检测参考消毒技术规 范 ( 2002年版)[15]。用作中和剂的硫代硫酸钠、卵磷脂和吐温80均购自国药集团化学试剂有限公司。2216E固体培养基、胰蛋白胨大豆肉汤培养基( tryptic Soy Broth,TSB) 营养肉汤和M-H肉汤购于青岛海博生物技术有限公司。
1. 1. 2主要仪器移液枪均为德国Eppendorf公司产品; 恒温培养箱为Sanyo MIR-254; 恒温冷冻摇床为Thermo Fisher Max Q5000; 圆底96孔板购自南通市清茂实验器材有限公司。
1. 1. 3菌株弧菌共198株为笔者 实验室2012年 ~ 2013年分离自福建、浙江、海南、上 海和江苏沿海海水养殖患病动物和养殖环境,经鉴定分别 为副溶血 弧菌 ( V. parahaemolyticus) 87株、溶藻弧菌( V. alginolyticus) 46株、哈维氏弧菌 ( V. harveyi) 33株、创伤弧菌( V. vulnificus) 19株和其他种类弧菌13株; 其中副溶血弧菌FJ244菌株和FJ246菌株均分离于患病凡纳滨对虾( Litopenaeus vannamei) ,经回归感染试验确认具有致病性。
1. 2 方法
1. 2. 1菌悬液的制备取甘油保存的弧菌菌株于胰蛋白胨大豆肉汤培养基营养肉汤中,在28℃恒温培养箱中培养16 ~ 20 h,得到新鲜的菌液培养物。试验时根据0. 5麦氏比浊度用灭菌生理盐水稀释为杀菌试验所用菌悬液浓度为5×106~ 5×107cfu·m L- 1。
1. 2. 2 MIC试验试验采用圆底96孔板微量稀释法,每孔分别依次加入不同浓度( 以有效氯或苯扎溴铵有效成分计) 的三氯异氰脲酸或苯扎溴铵溶液100μL( 对照组加等量的灭菌生理盐水) 和M-H肉汤,之后加入等量的上述菌悬液,于恒温培养箱28℃培养16 ~ 20 h。结果采用肉眼观察,以无菌生长的最低药物溶液的浓度为MIC。每个试验做2个平行。
1. 2. 3悬液定量杀菌试验试验前将各浓度消毒剂和菌悬液置于( 20±2) ℃下水浴10 min,杀菌试验也在此温度水浴下进行。取0. 5 m L菌悬液加入到含有4. 5 m L消毒剂试管中( 对照为等量灭菌生理盐水) ,使菌药混合液中的含菌量为105~ 106 cfu·m L- 1,混合均匀。菌药相互作用后,在10 s ~ 60 min分别在各个预定时间取出0. 5 m L混合液加入到4. 5 m L的中和剂中,中和作用10 min,取0. 2 m L于2216E固体培养基上进行细菌菌落计数; 每个试验3个重复[16],计算消毒剂对细菌的杀菌率。中和剂的选择参考慈九正等[17]和廖骏等[18], 并经过试验验证确定; 试验时中和剂的浓度根据不同浓度的消毒剂做相应的稀释。杀菌率计算公式为: 杀菌率( % ) = 100× ( 对照组细菌数 - 试验组细菌数) /对照组细菌数。
2 结果
2. 1 2 种消毒剂对弧菌的 MIC
三氯异氰脲酸和苯扎溴铵2种消毒剂对198株弧菌的MIC试验的统计结果分别见表1和表2。三氯异氰脲酸对弧菌的MIC主要分布在124. 5 mg·L- 1、249. 0 mg·L- 1和498. 0 mg·L- 1,占所检测菌株总数的75. 8% ( 150 /198) ; 苯扎溴铵对弧菌的MIC主要分布在40 mg·L- 1、80 mg·L- 1和160 mg·L- 1,占所检测菌株总数的92. 9% ( 184 /198) 。三氯异氰脲酸的MIC分布明显高于苯扎溴铵。表3为2株( FJ244和FJ246菌株) 对凡纳滨对虾具有致病性的副溶血弧菌的MIC,可以看出消毒剂对不同菌株间的MIC不同。
mg·L- 1
2. 2 2种消毒剂对弧菌的杀菌效果
为了进一步观察消毒剂对弧菌的杀菌效果,选择了对凡纳滨对虾具有致病性的副溶血弧菌FJ244和FJ246菌株进行杀菌率试验,考察消毒剂浓度为MIC时及低于MIC下的杀菌效果与时间的关系。
三氯异氰脲酸对FJ244、FJ246菌株的杀菌效果分别见表4和表5,表中仅列出部分作用时间的检测结果。三氯异氰脲酸质量浓度以MIC的倍比稀释浓度进行递减,分别为31. 13 mg·L- 1、15. 56 mg·L- 1、7. 78 mg·L- 1和3. 89 mg·L- 1,随着三氯异氰脲酸质量浓度降低,达到100% 杀灭弧菌的作用时间延长; 然而,在三氯异氰脲酸质量浓度为3. 89 mg·L- 1,即使延长作用时间也未能完全杀灭弧菌,在表中没有列出此浓度下的数据。除MIC浓度高于FJ244外,三氯异氰脲酸对FJ246杀菌效果的变化趋势与FJ244相似,随着药物质量浓度的降低,杀灭弧菌的作用时间延长,在质量浓度为7. 78 mg·L- 1时即不能起到完全杀灭弧菌的作用。即三氯异氰脲酸对菌株FJ244和FJ246的MIC分别为7. 78 mg·L- 1和15. 56 mg·L- 1。
苯扎溴铵对菌株FJ244和菌株FJ246的杀菌效果分别见表6和表7。同样以低于MIC的倍比稀释浓度进行杀菌效果试验,随着苯扎溴铵浓度降低, 杀灭弧菌的作用时间延长; 对于FJ244和FJ246菌株,苯扎溴铵质量浓度分别为10 mg·L- 1和5 mg·L- 1时即不能起到完全杀灭弧菌的作用。即苯扎溴铵对菌株FJ244和FJ246的MBC分别为20 mg·L- 1 和10 mg·L- 1。然而,苯扎溴铵杀灭2株副溶血弧菌的速率明显不同,杀灭菌株FJ246的时间显著长于菌株FJ244。
3 讨论
为了预防和控制水产养殖动物的传染性疾病, 消毒在整个养殖生产周期中起着重要的作用,从清塘、水质调控到水产动物的疾病预防都是不可缺少的。弧菌是海水养殖重要的病原菌,几乎可以使所有海水养殖动物感染致病。在养殖生产中常常使用消毒剂预防和控制海水养殖环境中的弧菌等潜在的病原微生物[19,20]。笔者研究中三氯异氰脲酸和苯扎溴铵对临 床分离弧 菌的MIC最高分别 达到498. 00 mg·L- 1和160 mg·L- 1,最低为15. 56 mg·L- 1和10 mg·L- 1。三氯异氰脲酸和苯扎溴铵2种消毒剂对198株水产动物源弧菌的抑菌效果存在着显著的菌株间差异,且大部分菌株的MIC均较高, 说明养殖环境中相当比例的弧菌菌株对这2种消毒剂产生了抗性,且不同菌株间的抗性差异较大。
与抗菌药物耐药性的产生相似,细菌多次接触消毒剂会导致消毒剂的MIC或MBC升高,从而对消毒剂产生耐受性或抗性[9]。关于细菌的消毒剂抗性问题,医学临床上的研究非常广泛,王玉月等[21]临床分离的190株铜绿假单胞菌对戊二醛和三氯异氰脲酸的MIC为32 ~ 128μg·m L- 1,表现为不同程度的抗性; 50株多重耐药铜绿假单胞菌对苯扎溴铵的MIC为8 ~ 32μg·m L-1[22]。畜禽动物源细菌中,104株猪源大肠杆菌有20株细菌对苯扎溴铵的MIC高达113. 88μg·m L- 1,15株细菌对癸甲溴铵的MIC高达164μg·m L-1[23]。如果暂不考虑细菌种类的差别,此研究中的弧菌对三氯异氰脲酸和苯扎溴铵产生了明显抗性,可能与水产养殖中三氯异氰脲酸和苯扎溴铵等消毒剂长时间、低剂量的使用存在着一定的关系。研究表明,长时间、低剂量的使用消毒剂可诱导细菌抗性增强。王延东[24]研究发现23株多耐药铜绿假单胞菌经过连续10代诱导对新洁尔灭、戊二醛和碘伏的平均MIC分别从35. 3μg·m L- 1升高到146. 7μg·m L- 1、0. 032 4μg·m L- 1升高到0. 136μg·m L- 1和312μg·m L- 1升高到597. 8μg·m L- 1; 国外学者研究发现耐氯酚铜绿假单胞菌经低于MIC的氯酚连续诱导10代,MIC从36 mg·L- 1升高到80 mg·L- 1[25]。
笔者研究20℃三氯异氰脲酸和苯扎溴铵对海水源副溶血弧菌菌株FJ244和FJ246的MBC分别为7. 78 mg·L- 1、15. 56 mg·L- 1和20. 00 mg·L- 1、10. 00 mg·L- 1。这与郝贵杰等[26]的研究结果存在差异,28℃三氯异氰脲酸对海水源哈维氏弧菌GYC1108-1的MIC和MBC分别为0. 125 mg·L- 1和0. 125 ~ 0. 250 mg·L- 1,这可能是弧菌种类、菌液浓度、试验温度、试验时间不同所致。中国国标渔药规定,三氯异氰脲酸使用剂量为1 L水体用0. 090 ~ 0. 135 mg( 以有效成分计,苯扎溴铵使用剂量为每1 L水体用0. 10 ~ 0. 15 mg) ,该使用剂量低于文章的MIC和有效杀菌浓度,更远远低于医学消毒剂推荐使用浓度。因此,在水产养殖中应该认识到低于有效作用浓度的消毒剂使用剂量更容易诱导细菌产生抗性,并且当细菌对消毒剂产生抗性后会降低消毒剂的作用效果。