体外释药

体外释药（共6篇）

体外释药 篇1

黄藤素是从防己科植物黄藤的干燥茎中提取得到的生物碱, 其有效化学成分为盐酸巴马汀 (C21H22NO4HCl) 。黄藤素通过嵌到DNA双螺旋的AT碱基对中发挥抗细菌、真菌、疟原虫和肿瘤的作用, 常用于泌尿生殖道、呼吸道和消化道感染的治疗。黄藤素略溶于水, 整个胃肠道对其吸收较差 (吸收速率小于10%) , 严重影响临床应用效果。而纳米粒作为新的药物载体具有提高生物利用率、调节释药速率和靶向性等优点, 已成为近年来研究的热点。笔者先用乳化聚合法制备黄藤素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒 (F-PBCA-NP) , 然后再用膜透析法考察其体外释药规律, 为黄藤素纳米粒制剂的研究和应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂

氰基丙烯酸正丁酯 (BCA, 批号061103) , 北京瞬康医用胶有限公司;黄藤素原料药 (含量>95%) , 云南玉溪万方天然药物有限公司;黄藤素片 (国药准字Z20063500) , 云南金柯药业有限公司;右旋糖酐D-70, 瑞士Amersham公司;泊洛沙姆F-68, 上海七叶树贸易有限公司;Na2S2O5 (分析纯) , 天津市登峰化学试剂厂;磷酸盐缓冲液, 自制;其他试剂均为分析纯。

1.1.2 主要器材

EB-280型电子天平, 日本Shimadzu公司;78HW-1型恒温磁力搅拌器, 杭州仪表电机厂;HH-6型数显恒温水浴锅, 国华电器有限公司;Optima L -100XP超速离心机, 美国Beckman公司;UV-2102PCS型紫外分光光度计, 尤尼柯仪器有限公司;2000HSA型激光粒度分析仪, 英国Mavlern公司;H-600型透射电子显微镜, 日本日立公司;透析膜 (截留相对分子质量12～14) , 美国联合碳化公司。

1.2 方法

1.2.1 F-PBCA-NP的制备

精确称取黄藤素0.1 g加到20 mL纯化水中, 在30 ℃恒温水浴中加热溶解并配成A液;准确称取表面活性剂右旋糖酐D-70 0.2 g分散到20 mL纯化水中, 加热溶解, 冷却后再加入表面活性剂泊洛沙姆F-68 0.2 g, 加纯化水至80 mL配成B液;分别用0.1 mol/L盐酸调A液和B液的pH值至2.0;在搅拌条件下将0.2 g BCA缓慢滴入B液中, 搅拌20 min后再将A液逐步加入;在电磁搅拌器上搅拌7 h, 加入0.2 g附加剂Na2S2O5, 继续搅拌3 h后用1 mol/L氢氧化钠溶液调pH值至5.0;用孔径为0.45 μm的微孔滤膜抽滤, 即得F-PBCA-NP溶液。

1.2.2 F-PBCA-NP的质量评价

外观形态及粒径。加纯化水对F-PBCA-NP溶液进行适当分散, 取1～2滴置于覆有支持膜的铜网上停留2～3 min;滴入2%磷钨酸溶液, 染色2～3 min, 自然干燥, 在透射电镜下观察纳米粒的形态。另取适量F-PBCA-NP溶液加去离子水稀释至适当浓度, 用激光粒度分析仪测定粒径。

包封率和载药量。先将F-PBCA-NP溶液低温超速离心 (4 ℃, 25 000 r/min离心150 min) , 再用紫外分光光度计在273 nm处测定上清液中黄藤素的含量, 按下式计算黄藤素纳米粒的包封率和载药量。包封率 (ER) =[ (W1-W2) /W1]×100%;载药量 (DL) =[ (W1-W2) /WBAC]×100%。式中:W1为投药量, W2为上清液中的药量, WBAC为高速离心后烘干至恒重的BCA量。

1.2.3 单因素试验初选的制备条件

在不同条件下[即表面活性剂 (泊洛沙姆F-68、右旋糖酐D-70、泊洛沙姆F-68+右旋糖酐D-70) 、pH值 (2.0, 2.5, 3.0) 、温度 (10, 25, 40 ℃) 、搅拌速度 (400, 800, 1 200 r/min) 、附加剂 (KCl、NaCl、Na2S2O5) ]制备F-PBCA-NP, 用透射电镜观察纳米粒形态、用激光粒度分析仪测定粒径和用超速离心机离心后测定载药量, 以此进行纳米粒质量的评价。

1.2.4 正交设计试验优化的制备条件

在单因素试验结果的基础上, 采用正交设计对影响纳米粒形态、粒径、载药量和包封率的因素进行优选, 确定制备黄藤素纳米粒的最佳条件。即以黄藤素浓度 (A) 、BCA用量 (B) 、右旋糖酐D-70+泊洛沙姆F-68 (1∶1) 用量 (C) 为试验因素, 各取3个水平, 采用L9 (34) 正交设计安排试验 (具体见表1) 。对各次试验结果进行综合评分, 形态分 (X1) :由3人观察各自的透射电镜照片, 以分散性好、圆整、均匀而不粘连者为佳;粒度分 (X2) :undefined为平均粒径, Sd为样本偏差) ;包封率分 (X3) :实测包封率×10;载药量分 (X4) :实测载药量×10;总分 (X) :X=X1+X2+X3+X4。

注:A为黄藤素浓度, B为BCA用量, C为右旋糖酐D-70+泊洛沙姆F-68 (1∶1) 用量, R为极差;括号内的数值为相应因素的用量, 单位是mg·mL-1。

1.2.5 体外释药试验制备条件

取黄藤素片剂和黄藤素纳米粒溶液, 用磷酸盐缓冲液 (PBS) 适当稀释后加到经预处理的透析袋内, 扎紧袋口置于装有50 mL PBS的溶出杯中;在37.0±0.5 ℃、200 r/min条件下恒速搅拌, 在0, 0.17, 0.33, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12小时各取样1 mL待测 (同时补加同体积的PBS) ;将取样液稀释后用紫外分光光度计测定其吸收度, 计算累积释放百分率Ft (%) , 以Ft (%) 对t作图, 绘制累积释放曲线;用Zero-releasing方程、First-releasing方程、Higuchi方程、Ritger-peppas方程、Weibull方程和Hixon-crowell方程进行曲线拟合。根据拟合曲线的相关系数 (R2) 和AIC (Akike’s information criterion) 确定释放模型。

2 结果

2.1 单因素试验初选制备条件的确定结果

不同的表面活性剂对纳米粒形态及粒径的影响不同, 右旋糖酐D-70+泊洛沙姆F-68 (1∶1) 要比单独使用右旋糖酐D-70和泊洛沙姆F-68得到的纳米粒成球性好、粒径小、分布窄;pH值对粒径的影响较大, 温度和搅拌速度影响不大, pH值2.5、温度25 ℃、搅拌速度800 r/min的条件即可满足此次试验对纳米粒的要求;用Na2S2O5作为附加剂制得的纳米粒载药量明显高于用KCl和NaCl。

2.2 正交设计试验优化制备条件的确定结果

根据正交试验结果 (表1) , R确定的主次因素顺序为C>B>A。其中A因素:K1>K2>K3;B因素:K2>K1>K3;C因素:K3>K1>K2, 因此确定A1B2C3为最佳处方。故制备黄藤素纳米粒的最佳条件为黄藤素1.5 mg/mL, BCA 2.0 mg/mL, 右旋糖酐D-70+泊洛沙姆F-68 (1∶1) 4.0 mg/mL 。按优化条件制备的黄藤素纳米粒形态圆整, 表面光滑, 大小均匀, 纳米粒之间无粘连 (见图1) ;平均粒径为64 nm, 载药量为50.9%, 包封率为67.8%。

2.3 体外释药试验的结果 (见图2)

由图2可知:黄藤素片剂的释药速率出现明显的阶段性变化, 即先缓再快后平稳;黄藤素纳米粒的释放曲线可分为突释阶段和缓释阶段, 突释阶段纳米粒释药量为22%, 缓释阶段纳米粒释药持续时间最长, 释药稳定增长, 释药量>65%。

对两种剂型的累积释放百分率Ft分别进行曲线拟合, 根据AIC愈小和R2值越大其模型拟合效果愈佳的原则, 得出它们的最佳拟合曲线分别如下:黄藤素片剂释药曲线符合First-releasing方程, 即y=-0.089 3x-0.098 4;黄藤素纳米粒释药曲线符合Weibull方程, 即y=0.356 9x-0.220 1。故黄藤素纳米粒的体外释药具有双相动力学特征。具体见表2。

3 讨论

3.1 纳米粒的制备

在F-PBCA-NP的制备过程中, 表面活性剂影响载体BCA在反应介质中的分散程度;BCA的聚合以H2O中的OH-作为引发剂, 故控制介质pH值是制备纳米粒成败的关键;温度和搅拌速度对纳米粒的成球性和粒径无明显影响;附加剂可以改变纳米粒表面的电荷性质进而影响药物的吸附, 这些条件在单因素初选中很容易确定。表面活性剂不仅影响纳米粒的质量参数, 还对成球后的纳米粒有稳定作用;药物与BCA的比率影响纳米粒的载药量和包封率, 故处方优化中以这3个因素为重点。乳化剂泊洛沙姆F-68和右旋糖酐D-70单独使用时, 纳米粒的球形不规则且粒径分布较宽, 原因可能在于泊洛沙姆F-68+右旋糖酐D-70的亲水亲油平衡值 (HLB) 更利于单体BCA在介质中的分散, 其用量与纳米粒的粒径呈负相关, 但当用量达到一定程度后, 粒径的变化不明显, 并且整个纳米粒体系的载药量下降, 故表面活性剂的用量一般控制在3%左右。药物和BCA由于受水溶性的限制, 用量一般都小于1%, 增大药物与BCA的比率会使载药量提高而包封率下降, 反之则载药量下降而包封率提高, 因此两者的比例要适中。由于药物的理化性质有差异, 会使其与其他药物的制备条件不尽相同, 因此要通过试验寻找适合本药物的制备方法。

3.2 体外释药

体外释药试验结果表明, 黄藤素片剂由于受辅料溶蚀的限制, 释药速率出现明显的阶段性变化, 血药浓度波动大;黄藤素纳米粒符合双相动力学释药规律, 即释药初段为快速释药相, 吸附在纳米粒表面的药物快速扩散进入介质, 产生突释现象;后段为缓释相, BCA经水或酶的分解成为体内代谢产物, 使药物缓慢释放出来。故黄藤素纳米粒的突释效应可使药物迅速起效, 快速控制症状;缓释效应可使血药浓度维持较长的时间。

以纳米粒为载体的兽药, 通过改善体内吸收过程, 即载药纳米粒在体内的吸收依赖于载体的理化特性而与药物无关;缓慢释放效应即载药纳米粒的缓释阶段可达50 h, 如果进行NPs表面修饰其半衰期会增加若干数量级。此外, 纳米粒的高度分散性增大了药物与肠壁的有效接触面积, 也可促进难溶性药物的小肠吸收量, 提高生物利用率。纳米药物的上述作用会使畜牧养殖业中抗生素添加剂和兽医临床中抗菌药的用量大幅度减少;降低畜禽产品中的药物残留量, 提高其安全性;延缓畜禽感染中细菌耐药性的产生, 利于疾病的治疗。

体外释药 篇2

1 实验

1.1 试剂

壳聚糖(DD=85%,Mη=470000,Tokoto公司,日本),PHB(Mη=430000,天津天露公司,经乙醇清洗、氯仿溶解、甲醇沉降精制),冰醋酸,氯仿,三聚磷酸钠(TPP)(西安试剂厂,使用前未再精制), Aspirin(自制,熔点105～106℃)。

1.2 CTS/TPP/Aspirin药物缓释微粒(CPA)的制备

用2%(质量分数)醋酸溶液溶解壳聚糖,去离子水配制TPP溶液,乙醇溶解Aspirin。在设定pH值下(NaOH溶液调节)用注射器将TPP溶液加入到混合了Aspirin的CTS溶液中,持续搅拌,固定总体积为50mL,改变CTS和TPP溶液的加入量确定体系中原料的初始质量浓度比(C(CTS)/C(TPP))。交联反应30min后,离心分离,将离心管底部的白色胶状体用去离子水清洗2遍,冷冻干燥,得白色CPA粉末,称重(mc)。

1.3 壳聚糖/PHB药物缓释微包囊(CPAB)的制备

在3mL去离子水中超声分散适量CPA,与50mL的PHB氯仿溶液(ψ=1%)混合,加入适量Span-80,密封电磁搅拌0.5h,充分乳化,接真空泵于室温下减压挥发除溶剂氯仿,所得微粒用无水乙醇洗涤脱去乳化剂,冷冻干燥得CPAB样品。

1.4 CPA和CPAB的表征

化学组成:红外分光光度计(IR prestige-21),KBr压片,分辨率4cm-1,扫描速率40次/min。粒径分布:激光粒度分析仪(LS32型),去离子水分散(ω≈0.01%,obscuration 8%～12%,PIDS 40%～50%)。表面形貌:XZ-650型扫描电子显微镜(日本Hitachi),甲醇分散,喷金,加速电压15kV。

1.5 CPA和CPAB包封率和载药率的测定

紫外分光光度计检测:0.10mol/L的盐酸溶液作参比,Aspirin质量浓度范围CA=(5～50)×10-6g/L,λ=280nm,标准线性回归方程:A=0.00664CA+0.004μg/mL,R=0.9999。准确称取0.01g CPA和CPAB于100mL盐酸(6mol/L)中,电磁搅拌至微球完全崩解(CPAB适当加热)。对照标准曲线确定Aspirin浓度C1,根据式(1)和式(2)计算各次所制备微粒的载药率和包封率。

载药率=C1×0.01×100% (1)

包封率=(微粒中药物总量/投入总药量)×100%/mA

=(载药率×mC)/mA×100% (2)

式中:mC为不同条件下制备的CPA和CPAB的质量,mA为样品制备条件下Aspirin的投入量。

1.6 CPA和CPAB的体外释药评价

各称取0.1g的CPA和CPAB于透析袋(截留分子量8000)中,置于pH值为7.4和2.8的1000mL PBS缓冲液中,密封防挥发,水浴恒温振荡,温度(37±0.5)℃,转速100r/min。在设定的时间取5.0mL溶液测吸光度A,对比标准曲线得缓释液中Aspirin的浓度C,按式(3)计算样品在不同时间的累积释药率,并同时补充相等体积缓冲液于烧杯中。

累积释药率=(C×1000)/(0.1×载药率)×100% (3)

2 结果与讨论

2.1 CPA的化学组成

图1为CTS、CTS-TPP、CPA的红外谱图。

与TPP交联后CTS的-NH2吸收(1600cm-1)分别向酰胺Ⅰ带(1654cm-1)和酰胺Ⅱ带(1554cm-1)分化,且3400cm-1处吸收减弱,说明CTS和TPP的交联部位以CTS的氨基为主。CPA谱图上新增苯环特征吸收(2500cm-1、800cm-1、3100cm-1)和酯基吸收(1680～1750cm-1),甲基(2880cm-1)吸收增加,说明CPA中负载了一定量的Aspirin。

2.2 阿斯匹林初始浓度CA对载药率和包封率的影响

图2为pH=4.5、初始质量浓度C(CTS)∶C(TPP)=6∶4时(简记为C6T4),Aspirin的初始质量浓度CA在3.0～6.0mg/mL之间,CPA载药率和包封率的变化,可以看出CA与载药率和包封率不呈线性,高浓度的Aspirin与CTS-TPP共沉聚的机会较大,但在CTS-TPP的结构和组成基本稳定时,药物的负载会达到饱和,继续增大药物浓度反而会造成包封率下降。用载药率为27.5% 的CPA制备的微包囊CPAB,其载药率下降为18.5%,原因是囊材中增加了PHB,而且在包覆过程中CPA微粒经溶剂机械冲击破坏,也会造成CPA外表面药物流失。但相对于溶剂抽提和常压搅拌挥发,减压蒸发溶剂法对载药率的影响最小。

2.3 CPAB的载药率和粒径分布

图3和图4 显示了2.2节所述条件下LS32激光粒度仪测定的CPA(C6T4)和CPAB的粒径分布。

CPA的粒径分布在50~200μm之间且不稳定,可能与样品。

2.4 CPAB的形貌特征

图5为CPAB微包囊的SEM图,可以看出CPAB的表面存在一些分布不均匀的空隙,这些空隙的产生可能与CPAB形成过程中乳液搅拌分散、溶剂挥发和清洗表面活性剂等操作造成聚酯包覆的外表出现不连续分布有关,但正是这些空隙形成了CPAB的初始释药行为,同时也给介质对载药微包囊进行溶胀、溶解、降解等行为提供了条件。

2.5 CPA和CPAB的释药行为

胡容峰等[8,9,10,11,12]认为壳聚糖载药的缓释机理包括表面药物的溶解与扩散突释、药物-壳聚糖静电吸附解离、壳聚糖吸水膨胀及药物通过胶状粘稠层向外扩散等3个步骤,相互衔接,顺次进行。图6为 CPA微粒在不同酸度时的释药行为。可以看出,2种介质中,CPA释放初期均存在一定程度的突释,这是由于Aspirin在CPA中的附载除了共沉聚还存在表面吸附。释药过程中首先是微粒表面吸附的药物分子在环境介质作用下从表面脱落释放。但CPA的药物突释在酸性条件下更加明显,2h内药物释放率达60%,最终释药率为78%。这是由于酸会加速CTS-TPP聚电解质离解而导致药物释放加快。而中性条件下,CPA可保持6h内释药率不足40%,说明在中性介质中CPA尚具备一定的控释作用。

从图7所示的CPAB累计释药曲线中可以看出,CPAB在酸性下释药速率同样高于中性条件,但没有产生类似CPA的突释现象。CPAB有一层疏水性聚酯PHB外层,使之在环境中能保持一定的稳定性,中性时最终累积释药率不足50%,说明CPAB在中性条件下具有长效缓释作用。CPAB在酸性下6h时的释药率不足30%,后期释放速度略快,24h后最高释药率达60%,48h后累积释药率达65%。由SEM图可知CPAB聚酯外层的不均匀空隙造成了CPAB的初期释药。酸性条件会加速聚酯水解破坏外表层,促使微包囊内部的CTS-TPP崩解。因此,CPAB虽然表现出酸性条件下较中性时快的现象,但仍有良好的缓释行为,可经受胃液侵蚀,有望作为口服经胃肠给药制剂的制备模式。

3 结论

(1)通过实验确定,以初始质量浓度为C(CTS)=6.0mg/mL,C(TPP)=4.0mg/mL(C6T4),pH=4.5,室温,搅拌速度300r/min,Aspirin的初始质量浓度4.0mg/mL作为CPA载药微粒的制备条件,可得到粒径分布在50～200μm的CPA微粒。乳液法中经减压溶剂挥发制备了PHB包覆的CPAB微包囊,粒径检测显示集中于50～100nm附近。

(2)CPA在酸性介质中初期有明显突释现象,这是由于有共沉聚和表面吸附等同时存在于载药过程,但CPA在中性条件下比较稳定,尚具备一定的控释能力。

(3)CPA经聚酯PHB外包覆形成了载药微包囊CPAB后,载药率有所下降。但CPAB在酸中具有较强的稳定性,明显改善了CPA的初期突释现象,释药稳定且缓释曲线平稳,可以适用于口服给药制剂,能耐受胃液的侵蚀。具有潜在的医药应用价值。

摘要：用疏水性聚酯PHB外包覆壳聚糖-三聚磷酸钠-阿斯匹林药物缓释体(CPA)制备了壳聚糖/PHB复合缓释微包囊(CPAB),以克服CPA遇酸不稳定的释药特点。用傅立叶红外分光光度计、激光粒度仪、扫描电镜表征了CPAB的组成、粒径及表面形貌。结果显示,CPAB粒径在50～100nm和载药率18.5%时,表面有不均匀的空隙。体外释药评价证实CPAB能有效解决CPA在酸性下的不稳定性,具有长效缓释作用。

关键词：壳聚糖,三聚磷酸钠,聚羟基丁酸酯,药物缓释,微包囊

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体外释药 篇3

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1100系列高效液相色谱仪 (美国安捷伦公司) , 低温超速离心机GL-20G-Ⅱ (上海安亭科技仪器厂) , 旋转蒸发仪RE-2000B (上海亚荣生化仪器厂) , 医用超声波清洗器KQ-3200e (昆山市超声仪器有限公司) , BS224S电子天平 (北京赛多利斯仪器系统有限公司) , 透析袋 (美国BIO-SHARP公司, MW8000-14000) 。

1.2 试剂

蛇鳞草采自中山市五桂山, 由广东药学院田素英教授鉴定为金星蕨科植物三羽新月蕨 (Prpnephrium triphyllum (Sw.) Holtt) 的干燥全草;大黄购自广东省中山市中智药业公司;三羽新月蕨苷A (triphyllin A) 对照品 (由中山市中医院提供, 从蛇鳞草中分离纯化得到, 结构由波谱分析鉴定, 纯度大于98%) ;大黄素对照品, 购自中国食品药品检定研究院, 批号:110756-200110;蛇鳞草-大黄提取物 (自制, 采用95%醇提取, 浓缩为1g·mL-1, 备用) 。

硬脂酸 (分析纯, 天津市大茂化学试剂厂) ;大豆卵磷脂 (武汉胜天宇生物技术有限公司) ;吐温-80 (化学纯, 广州医药站化学试剂公司) ;乙腈、甲醇为色谱纯;水为屈臣氏蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 SH-SLN制备

采用薄膜超声法[6]制备, 称取处方量的硬脂酸和卵磷脂置于圆底烧瓶, 加入适量无水乙醇, 50℃水浴加热溶解, 精密加入药液, 超声5min, 在60℃恒温条件下减压回收溶剂成膜附壁, 另取适量1%吐温-80置于成膜的圆底烧瓶, 旋转将膜洗下, 超声处理50min, 过0.80μm滤膜, 除去大颗粒物质及无法包封的杂质, 可得蛇鳞草-大黄SLN混悬液。

2.2 SH-SLN含药量的测定

采用HPLC法测定指标成分triphyllin A和大黄素含量。色谱条件:色谱柱为Dikma Diamonsil (2) C18 (250mm×4.6mm, 5μm) , 流动相为乙腈 (A) -0.1%甲酸水溶液 (B) -水 (C) , 梯度洗脱, 0~35min:15%A→75%A;25%B→25%B;60%C→0%C;流速1.0mL·min-1, 柱温30℃, 检测波长226nm, 进样量为20μL。理论塔板数按triphyllin A峰面积和大黄素峰面积计算, 应不低于3 000。定时吸取溶出介质, 过0.45μm滤膜, 取续滤液进高效液相测定峰面积, 测定累积释放率Q (%) 。

2.3 SH-SLN体外释药实验

2.3.1 释放介质的选择

模拟体内条件, 以去离子水、生理盐水或磷酸缓冲盐作为释放介质, 但指标成分triphyllin A和大黄素极性具有一定差异, 因此以生理盐水加不同浓度无水乙醇作为溶出介质:pH7.4生理盐水、pH7.4生理盐水+0.05%吐温、pH7.4生理盐水+20%无水乙醇、pH7.4生理盐水+40%无水乙醇。结果显示:triphyllin A和大黄素在pH7.4生理盐水+40%无水乙醇介质中溶解度最大, 药物溶出效果较好, 符合漏槽原理, 故选择该释放介质。

2.3.2 释放介质稳定性考察

精密吸取0.1mL的triphyllin A和大黄素混合对照品溶液 (triphyllin A浓度为0.100 0mg·mL-1、大黄素浓度为0.152 0mg·mL-1) 溶于pH7.4生理盐水+40%无水乙醇, 置于100mL容量瓶, 定容至刻度, 37℃恒温水浴, 50r/min恒温搅拌, 分别在12h、24h、48h定时取样1mL, 测定在0~48h的峰面积变化。triphyllin A和大黄素RSD值分别为1.15%、1.06% (n=3) , 表明指标成分在该释放介质的稳定性较好。

2.3.3 体外释药曲线绘制

精密量取“2.1”项制备的SH-SLN混悬液10mL于预处理的透析袋 (截留量为8 000~14 000) , 两端密封, 置于100mL烧杯, 加入“2.3.1”项筛选的最佳释放介质50mL, 加入磁力搅拌子, 烧杯盖好密封膜, 置于恒温 (37±1) ℃磁力搅拌器, 以100r/min的转速旋转, 分别于0.5、1、2、4、6、10、12、14、16、18、24、48h不同时间点定时精密量取释放液2mL (同时补加2mL的释放介质) , 过0.45μm滤膜, 取续滤液进样采用高效液相色谱仪测定释放液中指标成分的含量, 计算各自累积释放百分率。同时, 精密吸取150μL的蛇鳞草-大黄药液 (SH-YY) 于50mL释放介质中, 同法测定SH-YY在0.5、1、2、4、6、10、12、14、16、18、24、48h时间点释放液中指标成分的含量, 计算各自累积释放百分率。见图1。

2.3.4 体外释药数据处理

分别以零级方程、一级动力学方程、Weibull方程、Ritger-Peppas方程对SH-SLN和SH-YY中triphyllin A和大黄素体外释药数据进行曲线拟合, 比较相关系数, 找出最佳拟合方程, 其中R2越接近1表明拟合效果越好。两成分均与一级动力学方程、Weibull方程拟合效果较好。见表1、表2。

3 讨论

所制备的SH-SLN在初期释药速度较快, 有突释现象, 其中triphyllin A由于极性相对于大黄素较大, 因此可能更多吸附于固体脂质纳米粒表面, 较易游离或释放, 突释现象较明显;而大黄素更多包载于内部, 释放速度相对较慢, 因此在最初的1h内, triphyllin A累积释放量达14.7%, 而大黄素仅9.6%。此外, 在释放的48h内, triphyllin A累积释放量达90.1%, 大黄素达85.3%, 但两种成分在后期 (10~48h) 的释放速度相对较慢, 可能是因为吸附于表面或游离的药物已释放完, 药物要透过固体脂质纳米粒进行扩散较困难, 因此释药曲线相对平缓。

根据数据拟合处理, 两成分均与一级动力学方程、Weibull方程拟合效果较好, 可知道所制备的SH-SLN药物在释出过程需通过纳米级的骨架材料, 因此具备了一定的缓释特征[7,8], 可达到长时间释药, 作用于疼痛部位, 持续缓解疼痛, 且在皮肤上有一定的药物滞留量, 而在动物体内的作用效果, 需进一步做药效学的评价验证。

摘要：目的:考察蛇鳞草-大黄固体脂质纳米粒 (SH-SLN) 的体外释药规律。方法:采用动态透析释药法考察SH-SLN的体外释药特性, 并采用高效液相色谱法测定不同时间点有效成分的含量, 计算累积释药量, 进行释药曲线拟合, 分析释药规律。结果:SH-SLN中triphyllinA在最初释药1h内累积释药率达14.7%, 大黄素为9.6%, 有突释现象, 释药曲线均符合Weibull方程。结论:与SH-YY比较, SHSLN能够明显延缓药物释放时间, 有一定的缓释作用。

关键词：蛇鳞草,大黄,固体脂质纳米粒,体外释药,动态透析技术

参考文献

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[2]周岁锋, 缪英年, 钟希文.蛇黄散凝胶剂治疗虫咬皮炎临床观察[J].中国中医急症, 2013, 22 (12) :2116-2117.

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[4]汪亚飞, 钟希文, 梅全喜, 等.正交试验优选蛇黄凝胶提取工艺[J].中国实验方剂学杂志, 2013, 19 (24) :39-42.

[5]张洪, 成蓓, 詹新安.联苯双酯固体脂质纳米粒的体外释药特性评析[J].广东药学院学报, 2009, 25 (1) :15-17.

[6]刘红梅, 褚惠媛, 崔金霞, 等.薄膜-超声分散法制备β-榄香烯固体脂质纳米粒[J].中草药, 2008, 39 (2) :193-195.

[7]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.北京:中国医药科技出版社, 2010, 附录XIX D:202.

体外释药 篇4

关键词：雷公藤多甙,纳米乳,透皮,体外释药

雷公藤系卫矛科雷公藤属植物, 最早收载于《神农本草经》, 味苦、辛, 性凉, 大毒, 归肝、肾经, 具有祛风除湿、活血通络、消肿止痛、杀虫解毒等功效[1]。雷公藤多甙 (tripterygium polyglycosides, TG) 是雷公藤的根 (去皮) 经粉碎、提取、精制而成, 难溶于水, 具有显著的抗炎和免疫抑制作用, 临床上主要用于治疗类风湿性关节炎、红斑狼疮、慢性肾炎、皮肤病等[2]。但雷公藤多甙对消化系统、生殖系统、造血系统等有较强的毒性, 极大地限制了其临床应用。纳米乳 (nanoemulsion, NE) 又称微乳 (microemulsion, ME) , 是由水相、油相、表面活性剂和助表面活性剂组成的一种透明、粒径在10～100 nm、热力学及动力学稳定的各向同性体系。纳米乳作为新型的药物载体, 可以增强药物的溶解性, 显著提高药物的生物利用度, 促进药物透皮吸收, 提高药效, 降低毒副作用, 从而扩大临床应用[3]。 研究在制备雷公藤多甙纳米乳透皮制剂的基础上, 对其体外释药性能进行了研究, 这为深入研究该新型纳米制剂的药效学及药动学奠定理论基础。

1 材料

1.1 主要仪器

HC-188透皮扩散仪, 天津市正通科技有限公司;UV1102紫外-可见光分光光度计, 上海天美公司;马尔文激光粒度仪, 英国马尔文公司;JEM-1230电子透射显微镜, 日本日立公司。

1.2 主要试剂

聚氧乙烯蓖麻油 (EL-40, 药用级) 、聚氧乙烯氢化蓖麻油 (RH-40, 药用级) , 德国BASF公司;橄榄油 (药用级) , 德国Degussa公司;石蜡油 (分析纯) , 天津南开化工厂;肉豆蔻酸异丙酯 (IPM, 药用级) , 陕西省医药公司;雷公藤多甙原料药:山东鲁南制药公司;雷公藤多甙片 (TP Tablets, 批号为20060117) , 黄石飞云制药有限公司;3, 5-二硝基苯甲酸 (批号为20051128) , 上海化学试剂采购供应五联化工厂;其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 雷公藤多甙纳米乳的制备及基本理化性质评价

2.1.1 雷公藤多甙纳米乳的制备

用高效液相色谱仪测定雷公藤多甙在4种油 (IPM、棕榈酸异辛酯、石蜡油、橄榄油) 和3种表面活性剂 (RH-40、EL-40、Tween-80/Span-80) 中的溶解度, 根据纳米乳的评价标准[3], 利用序贯设计思想, 采用滴定法绘制伪三元相图, 确定纳米乳的最佳组成, 制备雷公藤多甙纳米乳。

2.1.2 雷公藤多甙纳米乳的基本理化性质评价

肉眼观察雷公藤多甙纳米乳及空白纳米乳的外观。通过透射电子显微镜观察纳米乳的形态[3], 并用马尔文激光粒度分析仪测定其粒径。

2.2 体外释药检测方法的建立

2.2.1 标准曲线的绘制

精密称取雷公藤多甙原料药50 mg, 用95%乙醇定容至5 mL容量瓶中;精密量取上述储备液, 用95%乙醇溶液配制成浓度为20, 30, 50, 80, 120, 160, 200 μg/mL的溶液;取样品液50 μL, 先后加入95%乙醇180 μL、2%3, 5-二硝基苯甲酸10 μL、5%氢氧化钠乙醇溶液10 μL, 于420 nm处测定其吸光度值。绘制吸光度与浓度的线性曲线[4]。

2.2.2 显色稳定性试验

取浓度水平为50, 100, 120 μg/mL的溶液, 在室温下放置不同时间, 分别测定其吸光度值, 考察此显色反应的稳定性。

2.3 试验皮肤的制备

随机选取青年SD大鼠, 用脱毛剂脱掉腹部毛, 尽量不损伤皮肤;24 h后断颈处死大鼠, 钝性剥离皮肤, 用浸生理盐水的脱脂棉球除去皮下脂肪;用纯化水和生理盐水反复冲洗直至液体无浑浊为止, 即得离体鼠皮, 用之前应浸泡于生理盐水中;于冰箱 (4 ℃) 中保存, 备用, 1周内用完。

2.4 经皮扩散试验

透皮扩散仪:池口有效扩散面积为0.785 cm2, 上下两个半池分别为扩散池和接受池, 接受池的容积为5 mL。在接受池和扩散池中间移入制备好的皮肤, 夹紧后接受池中加入生理盐水, 扩散池中加入待试药液1 mL;然后置于 (37.00±0.03) ℃的循环水浴中, 接受池转子搅拌速度为400 r/min, 加入样品后, 分别于0, 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12小时由取样口取1 mL接受液, 同时补充等体积的生理盐水。将不同时间取出的接受液样品用2.2.1的方法进行吸光度的测定, 代入回归方程。

2.5 试验分组

设置雷公藤多甙纳米乳无氮酮组、2%氮酮组、5%氮酮组、雷公藤多甙原料药混悬液组以及雷公藤多甙片在透析袋中模拟胃环境组, 共5组。

模拟雷公藤多甙片释放介质[5]: (1) 人工胃液。取稀盐酸16.4 mL, 加水约800 mL与胃蛋白酶10 g, 摇匀后加水稀释至1 000 mL。 (2) 人工肠液。取KH2PO4 6.8 g, 加水500 mL使其溶解, 用0.1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8, 取胰酶10 g, 加水使其溶解。 将两液混合, 加水稀释至1 000 mL即得。

2.6 数据处理

透皮吸收试验接受液中雷公藤多甙浓度按方程 (1) 校正。公式:

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式中:C是接受液的校正浓度 (μmol/L) , Cn是第n 个取样点接受液样品的实测浓度 (μg/mL) , ΣCi是第n 个取样点前实测浓度之和, V 是接受室体积 (即5 mL) , V0是每次取样的体积 (即1 mL) 。

体外皮肤渗透速率按Fick’s 扩散方程 (2) 计算。

undefined

式中:Jss是稳态渗透速率[μg/ (cm2·h) ], V是接受室体积 (即5 mL) , A是皮肤有效扩散面积 (即1.0 cm2) , c是接受室的校正浓度 (μg / mL) , t是时间 (h) , dc/dt是接受液浓度与时间曲线的直线部分的斜率[6]。

3 结果与分析

3.1 雷公藤多甙纳米乳的制备及基本理化性质评价

根据溶解度和伪三元相图结果, 最终纳米乳配方确定为RH-40、IPM、水, 重量比为27∶3.3∶69.7。按照确定的空白纳米乳的配方, 在油和表面活性剂的混合体系中加入经过研磨的雷公藤多甙原料药, 制备的雷公藤多甙纳米乳呈棕黄色、澄清透明, 流动性良好。

由透射电子显微镜照片可以看出, 纳米乳粒子大多数呈圆球形, 分散性良好, 见图1。马尔文激光粒度分析仪测定制备的雷公藤多甙纳米乳的平均粒径为23.6 nm, 多分散性系数 (PDI) 为0.124, 说明纳米乳粒径的分布范围比较窄, 粒径比较均匀, 见图2。在离心加速试验、光稳定性试验和温度稳定性试验中, 雷公藤纳米乳均未出现分层、絮凝或药物析出现象, 表明其稳定性良好。

3.2 标准曲线的绘制

经回归得标准曲线方程为y=0.002 9x-0.006 9, R2=0.999 1。在20～200 μg/mL范围内线性关系良好。

3.3 显色稳定性考察 (见表1)

由表1可知, 此显色反应在50 min内稳定。

3.4 药物的透皮性能考察 (见表2和图3)

由表2可知, 在纳米乳配方中无氮酮和含2%氮酮时Jss无显著性差异, 而含5%氮酮时Jss是无氮酮配方的67.77%, 雷公藤多甙原料药混悬液组的Jss是无氮酮配方的21.72%, 雷公藤多甙片组的Jss是无氮酮配方的21.39%。

由图3可知, 纳米乳配方在无氮酮或含2%氮酮时的透皮效果优于含5%氮酮时的透皮效果。雷公藤多甙纳米乳的透皮效果要显著强于雷公藤多甙原料药混悬液的透皮效果以及雷公藤多甙片体外模拟胃环境的释放量。

4 讨论

雷公藤多甙经皮纳米乳促进雷公藤多甙的作用可能与以下两方面因素有关:一是纳米乳本身具有促进药物透皮吸收的特点;二是纳米乳的组成成分有促透作用。将纳米乳作为雷公藤多甙经皮给药载体, 是由于纳米乳比许多常用透皮制剂具有更强的促渗作用。

另外, 雷公藤多甙纳米乳的组成成分中包括IPM。IPM本身是一种常用的渗透促进剂, 其作用机制:IPM穿透进入角质层, 可以破坏脂质排列的密实性而增加其流动性。另外, 还可以起到增溶作用, 影响药物在基质与皮肤间的分配, 从而促进药物的透皮吸收[7]。

试验利用自制的大鼠腹部皮肤在透皮仪上考察了雷公藤多甙纳米乳的透皮性能, 并与雷公藤多甙原料药混悬液的透皮效果及雷公藤多甙片的模拟胃环境的透析效果进行了比较。结果发现, 雷公藤多甙纳米乳 (配方中不含氮酮) 的透皮效果远远优于原料药混悬液的透皮效果和雷公藤多甙片的透析效果, 说明雷公藤多甙纳米乳透皮给药的吸收作用很好。

另外, 还通过透皮试验考察了纳米乳配方中添加氮酮对透皮效果的影响。氮酮 (A zone.1-十二烷基氮杂环庚酮-2) 是从20世纪80年代起被人们关注的透皮吸收促进剂, 现已被广泛使用。它对20多种药物的促进透皮作用已有报道。已证明氮酮对药物的透皮促进作用只有在最佳浓度时才发挥最佳的促进作用。通常氮酮浓度的使用范围为1%～6%, 氮酮浓度过高, 对皮肤的刺激性大而且对药物渗透有抑制作用[8]。在制备纳米乳的过程中, 考虑到氮酮对纳米乳形成的影响, 研究发现在纳米乳的配方中添加浓度小于5%的氮酮对纳米乳的形成无显著影响, 当氮酮的浓度高至10%时, 不能形成纳米乳。体外释药研究结果表明, 当配方中不含氮酮时, 透皮效果与氮酮含量为2%时的透皮效果及稳态渗透速率无显著性差异。而当氮酮含量增加至5%时, 透皮效果急剧下降, 稳态渗透速率降至5%时的24.33 μg/ (cm2·h) , 仅是无氮酮配方的32.23%。

参考文献

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[7]朱盛山.药物新剂型[M].北京:化学工业出版社, 2003.

体外释药 篇5

1 材料与仪器

5-FU (纯度>99.9%, 沈阳药大药业有限公司) ;5-FU对照品 (中国药品生物制品检定所) ;N-琥珀酰壳聚糖 (Mw:3.5×105Da;DS:0.33, 本实验室合成) ;其它溶剂和试剂均为色谱纯或分析纯。

LC-10AD高效液相色谱仪 (日本岛津株式会社) ;SPD-10A型紫外检测器 (日本岛津株式会社) ZDR6-B型药物溶出度仪 (上海黄海药检仪器厂) ;SHA-B恒温振荡器 (常州国华电器有限公司) 。

2 方法与结果

2.1 5-FU-Suc-Chi/NPs的制备及体外释药方法

采用乳化溶剂挥发法制备5-FU-Suc-Chi/NPs纳米粒[2]。采用恒温振荡法[2]考察5-FU注射液和5-FU-Suc-Chi/NPs溶液体外释药行为。5-FU含量采用HPLC法测定, 由标准曲线计算药物浓度及累积释放率。结果见表1。5-FU注射液释药速度较快, 1h基本释药完毕。5-FU-SucChi/NPs在释药的初始阶段, 出现突释, 1h药物释放达到45%, 24h达到67%, 随后持续缓慢释放一直到第4天。5-FU-Suc-Chi/NPs, 5-FU注射液两者之间的体外释药存在显著差异 (P<0.05) , 说明5-FU-Suc-Chi/NPs有明显的体外缓释作用。

2.2 药物体外释药模型的拟合

采用常用药物释放模型, 零级动力学方程、一级动力学方程、Higuchi动力学方程、Sweilbull方程及双指数双相动力学方程对5-FU注射液及5-FU-Suc-Chi/NPs溶液释药数据进行拟合, 结果见表1。

结果表明, 5-FU注射液的释放符合一级动力学方程, 5-FU-Suc-Chi/NPs的释放较符合双指数双相动力学模型。

3 讨论

从整个释放过程可以看出5-FU-Suc-Chi/NPs对5-FU起到缓释、控释作用, 并能维持长时间稳态浓度, 更好地发挥药物治疗效率。本实验采用的药物释放模型中, Higuchi模型用于与Fick扩散定理的药物释放过程的拟合, Sweibull模型是一个概率分布模型, 其它模型为动力学模型[3]。

参考文献

[1]Kato Y, Onishi H, Machida Y, et al.Evaluation of N-succinyl-chitosan as a systemic long-circulating polymer[J].Biomaterials, 2000, 21:1579-1585

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体外释药 篇6

聚乳酸纳米微球作为一种新型药物载体,具有良好的生物相容性、可降解性和安全性,其制备出来的载药微球可使药物缓慢平稳地释放[6,7]。但随着研究的深入,仅由单一聚合物制成的高分子微球对于水溶性药物的包封率低下、药物释放难以控制以及药物突释效应明显等原因而使其应用受限[8]。此外,尽管单独应用BMP-2 时可以观察到新骨形成,但如果将SDF-1和BMP-2 联合应用,效果会更好[9,10]。

本研究以聚乳酸为内核,壳聚糖为外壳,制备双层微球作为药物载体,外层和内层分别搭载SDF-1 和rhBMP-2 两种蛋白,通过正交试验优化制备工艺,制备粒径较小的缓释纳米微球,研究其体外释药性能,为下一步在钛种植体表面构建新型功能性涂层奠定实验基础。

1 材料与方法

1. 1 材料

聚( L-乳酸) ( Mw 50 000) ,低相对分子质量壳聚糖,聚乙烯醇( Sigma-Aldrich公司,美国) ,重组人骨形态发生蛋白2,基质细胞衍生因子1( Pepro Tech公司,美国) ,rh BMP-2 试剂盒,SDF-1 试剂盒( Raybio公司,美国) ; 其余化学试剂均为国产分析纯。

仪器: 超声波细胞粉碎仪( 宁波新芝) ,冷冻干燥机( 北京博医康) ,激光衍射粒度分析仪( Malvern Instruments) ,扫描电镜( 日本日立) ,透射电镜( 美国FEI) 。

1. 2 方法

1.2.1载rh BMP-2聚乳酸纳米微球的制备

采用乳化- 溶剂挥发法制备内层载rh BMP-2 聚乳酸微球。超声作用下,按设计浓度及投药比将聚乳酸溶于二氯甲烷,即为内层油相; 将1. 5 μg rh BMP-2 和0. 2 g聚乙烯醇溶于20 ml蒸馏水中作为内层水相。25 ℃ 下,按比例将内层油相逐滴滴加到内层水相中,超声乳化得到油水乳液,500 r/min磁力搅拌24 h,除尽CH2Cl2。微球经固化后,离心收集微球,洗涤后冷冻干燥得白色微球粉末。

1.2.2双层载药微球的制备

以聚乳酸纳米微球溶液为基础,乳化- 溶剂挥发法制备双层微球。超声作用下,将1 μg SDF-1 溶于10 ml聚乳酸纳米微球溶液中,即为外层油相; 将20 mg壳聚糖溶于10 ml 2% 乙酸溶液中,即为外层水相。25 ℃ 下,按比例将外层油相逐滴滴加到外层水相中,超声乳化。将得到的油水乳液500 r/min磁力搅拌12 h,除尽乙酸。洗涤过程同载rh BMP-2 聚乳酸纳米微球,经冷冻干燥后得到白色微球粉末。

1.2.3正交试验设计

设定固定乳化温度25 ℃ 和聚乙烯醇浓度( 内层水相溶度) 1% ,选取影响纳米微球性质较为显著的有机相中聚乳酸浓度( A) 、油水相比例( B) 、投药比( rh BMP-2 与聚乳酸重量比) ( C) 和乳化时间( D) 4 个因素,每因素考察3 个水平,采用L9( 3) 的正交试验设计表( 表1) ,以平均粒径、跨距、载药量、包封率为指标,优选出最佳制备工艺条件。

同样,对于外层微球,以壳聚糖质量( E) 、内外液比例( F) 、投药量( G) 及乳化时间( H) 4 个因素设计正交试验( 表2) ,以平均粒径、跨距、载药量、包封率为指标,优选出最佳制备工艺条件。

光学显微镜下观察150 粒微球,采用DP Controller软件测量微球的直径,计算平均粒径和跨距,公式如下: 跨距= ( D90-D10) /D50 其中D10、D90、D50 分别指有10% 、90% 、50% 的微球粒径小于该值所示的粒径。

1.2.4粒径、表面形态和内部结构分析

动态光散射法测定纳米微球的粒径,扫描电子显微镜观察微球的表面形态,透射电子显微镜观察微球的内部结构。

1.2.5包封率和载药量检测

精密称取一定量的双层载药纳米微球,溶于2% 的乙酸水溶液,充分溶解外层壳聚糖,离心去除乙酸后,用ELISA法测定外层中SDF-1 含量。同样精密称取一定量的双层载药纳米微球,用2% 的乙酸水溶液充分溶解外层壳聚糖后,12 000 r / min离心10 min后取沉淀溶于乙腈,充分溶解内层聚乳酸,再12 000 r/min离心10 min后取沉淀加入10 ml蒸馏水超声处理,用ELISA法测定所得水溶液中rh BMP-2 含量。纳米微球的载药量和包封率公式如下:

载药量( % ) = 微球中药物含量/微球的总质量( ng /mg) × 100%

包封率( % ) = 微球中药物含量/加入药物的质量× 100%

1.2.6体外释药

将60 mg微球粉末溶于5 ml PBS,置于透析袋中( 截留相对分子质量100 000) ,将透析袋放入盛有缓冲液的锥形瓶中,恒温振荡( 37 ℃,50r / min) ,于设定时间取上清液500 μl,并补充等体积的PBS缓冲液,ELISA法检测上清液中SDF-1 和rh BMP-2 的量,计算累计释药百分数。

1.2.7统计学处理

应用SPSS 21. 0 软件进行统计分析,剂量数据资料以± s表示,组内各时点间比较采用重复测量数据的单因素方差分析,P < 0. 05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2. 1载rh BMP-2 / SDF-1 的聚乳酸/ 壳聚糖纳米微球的制备工艺结果

双层载药纳米微球的质量可通过其粒径( S1) 、跨距( S2) 、包封率( S3) 、载药量( S4) 等指标的加权求和值来衡量。

由实验结果分析表明( 表3 ~ 4) ,影响内层微球质量的因素影响顺序从大到小依次为: 有机相浓度、乳化时间、投药量、油水相比例,最佳实验方案为A2-D2-C3-B2,即有机相中聚乳酸浓度为7. 5% ,油水相比例为1∶20,投药量为1. 5 μg,乳化时间为200 s。影响双层微球质量的因素影响顺序从大到小依次为: 壳聚糖含量、投药量、内外液比例、乳化时间,最佳实验方案为E2-G2-F3-H3,即添加壳聚糖质量为20 mg,内外液比例为2∶3,投药量为1. 0 μg,乳化时间为300 s。

2. 2 优选后重现性的考察

按正交试验结果得出的最佳制备工艺条件,即内层有机相中聚乳酸浓度为7. 5% ,油水相比例1∶20,投药量为1. 5 μg,乳化时间为200 s,外层壳聚糖质量20 mg,内外液比例为2 ∶ 3,投药量1. 0 μg,乳化时间300 s,重复实验3 次,结果得到微球的平均粒径为( 542. 33 ± 14. 38) nm,分散也比较均匀,基本呈正态分布( 图1) 。

2. 3 表面形态及内部结构

表面形态如图2 所示,微球外形圆整,表面光滑,分散均匀,球间无粘连。内部结构如图3 所示,微球分为明显而均匀的内、外2 层,外层较薄。微球呈内外分层结构,内层影像密度较高,为双层微球的核,而外层微球影像密度较低,呈较薄的幔状结构,为双层微球的壳。

图2双层微球(扫描电镜,×100 000)Fig 2 Double-layer nanoparticle(SEM,×100 000)

图3双层微球(透射电镜,×87 000)Fig 3 Double-layer nanoparticle(TEM,×87 000)

2. 4 包封率和载药量

按上述方法计算双层纳米微球对SDF-1 的包封率为75. 58% ,载药量为24. 67 ng /mg; 对rh BMP-2 的包封率为82. 41% ,载药量为22. 63 ng /mg。

2. 5 体外释药

双层纳米微球中的SDF-1 和rh BMP-2 均有良好的缓释效果。如图4 ~ 5 所示,第一天药物释放量最大,主要为吸附在纳米微球表面的药物解吸附所致; 随着微球逐渐裂解,其中的药物也逐渐释放出来,至第30 天时,累计释放的SDF-1 和rh BMP-2 分别91. 01%和72. 85% 。

3 讨论

本研究采用“乳化-溶剂挥发法”制备双层载药纳米微球,具有工艺较为简单且实用等特点[11]。在单因素考察及预实验的基础上,为获得最佳制备工艺参数,采用L9( 34) 的正交试验设计,考察了有机相浓度、油水相比例、投药比及乳化时间对内层微球质量的影响,并考察了壳聚糖质量、内外液比例、投药量及乳化时间对外层微球质量的影响,得到了重现性较好的最佳工艺参数。由实验结果可知,在内层微球中,有机相浓度、投药量以及乳化时间均对包封率和载药量有较大影响; 而在外层微球中,壳聚糖质量、投药量以及内外液比例对包封率的影响较大。本实验为控制微球粒径,在内、外液制备过程中均采用超声波细胞粉碎仪进行乳化,乳化时间越长,微球粒径分布越均匀,且不容易发生明显粘连和聚集。鉴于包封率和载药量决定了微球的给药效率[12],由实验结果可以看出,投药量对内、外层微球的载药量和包封率均有较大影响,适当提高用药量有利于提高包封率和载药量。通过正交试验得到的最佳制备参数为: 内层有机相中聚乳酸浓度为7. 5% ,油水相比例1 ∶ 20,投药量为1. 5 μg,乳化时间为200 s; 外层壳聚糖质量20 mg,内外液比例为2∶3,投药量1. 0 μg,乳化时间300 s。重复实验3 次,微球粒径、跨距、载药量及包封率波动均不显著,说明微球制备工艺的重现性较好。

微球粒径是纳米微球质量评估的重要指标之一[13]。应用于骨缺损修复的微粒既有微米级也有纳米级[14],粒径越小,包封率和载药量也越高,同时其副反应也越小[15]。本研究中,内层的聚乳酸纳米微球的平均粒径为( 319. 61 ± 10. 17) nm,而双层纳米微球的平均粒径为( 542. 33 ± 14. 38) nm。由于是用于种植体表面改性,不需要进入血液到达作用部位; 并且一般要求进入血液循环的微球粒径通常在200 nm以下,如果微球进入血液,则难以在骨缺损区周围局部达到预期的诱导成骨效果,因此不需要将微球粒径制备到200 nm以下。本实验所制备的微球能够有效附着在种植体表面,很难进入血液中,对于应用在口腔种植体表面的纳米粒子而言,较为理想。

在扫描电子显微镜视野下可见,微球外形圆整,表面较为光滑,不易发生相互粘连。在透射电子显微镜视野下可见,微球呈现内外分层结构,内层影像密度较高,为双层微球的核,而外层微球影像密度较低,呈较薄的幔状结构,为双层微球的壳,正交试验表明,增加外层壳聚糖的量能够提高SDF-1 的载药量。

在进行体外释药实验时,本研究采用的ELISA法与紫外分光光度法等方法相比具有更加灵敏且精确的特点。从双层微球中SDF-1 的释放曲线可以看出,在体外释放的初期,SDF-1 的浓度增加较快,主要原因可能为以下2 个方面: 一是微球表面附着的SDF-1 直接游离到溶液中,继而穿过透析袋顺应浓度梯度游离到缓冲液中; 二是微球的外层相对较薄,在缓冲液中的弱酸性作用下,初期溶解较快,而后透析袋中的酸一部分与壳聚糖反应,一部分逸散到透析袋外,从而使得透析袋中的酸浓度不断降低,对于壳聚糖的溶解作用也越来越弱。在微球的制备过程中,一部分rh BMP-2 也会附着在内层聚乳酸微球的表面,并在制备外层的过程中成为外层的一部分,所以在体外释放的初期也能观察到rh BMP-2 的突释现象,这种突释现象可以通过适当延长乳化时间来改善。