体外研究（共12篇）
体外研究 篇1
广义的药物代谢指药物在体内吸收、分布、代谢、排泄等一系列过程[1]。狭义的药物代谢是指药物的生物转化。生物转化后,药物的理化性质发生变化,从而引起其药理和毒理活性的改变。因此,研究药物的生物转化,明确其代谢途径[2],对制定合理的临床用药方案,剂型设计及新药开发工作都具有重要的指导意义。当前,国内外对药物代谢的研究主要集中在代谢产物生成和确定代谢途径。在分子生物学技术推动下,药物代谢酶[3]领域的研究因其对临床药物间相互作用的研究有着积极的推动意义,已得到广泛的重视。
肝脏是药物代谢的重要器官,是机体进行生物转化的主要场所,富含参与药物代谢的一个庞大的依赖细胞色素P450的混合功能氧化酶系统[4],大多数药物的Ⅰ相反应及Ⅱ相反应都依赖于肝脏酶系统而发生。以肝脏为基础的体外代谢模型以其特有的优势在药物代谢研究中得到广泛应用,现概述如下。
1 肝微粒体体外温孵法
肝微粒体法[5]是由制备的肝微粒体辅以氧化还原型辅酶[6],在模拟生理温度及生理环境条件下进行生化反应的体系,制备肝微粒体一般用差速离心法。
肝微粒体体外温孵法和其它的体外肝代谢方法相比较,其酶制备技术简单,代谢过程快,结果重现性好,易大量操作,便于积累代谢样品供结构研究;同时,该方法可用于对药酶的抑制及体外代谢清除等方面的研究,因而在实际工作中应用较为普遍。但肝微粒体体外温孵法同其它体外肝代谢方法相比,在体内情况的一致性方面存在不足,因而其实验结果用于预测体内情况仍需进一步的确证。
2 肝细胞体外温孵法
肝细胞体外温孵法同肝微粒体法相似,即以制备的肝细胞辅以氧化还原型辅酶,在模拟生理温度及生理环境条件下进行生化反应的体系,适于研究蛋白及mRNA水平药物代谢酶诱导及酶活性,在评估药物代谢过程中药物间的相互作用时,该方法得到广泛的应用。但肝细胞制备技术较复杂,目前以胶原酶灌注技术为主[7],且体外肝细胞活性仅能维持4h,不利于储存和反复使用。
3 离体肝灌流法
离体肝灌流法与肝微粒体法、肝细胞体外温孵法相比,一方面保留着完整细胞的天然屏障和营养液的供给,因而能在一段时间内保持肝脏的正常生理活性和生化功能;另一方面,具有离体系统的优点,能够排除其它器官组织的干扰,可控制受试物质的浓度,定量地观察受试物质对肝脏的作用。
Alexandra[8]等利用离体大鼠肝脏一过式灌流方法研究一种新的抗癌药BR(苯甲酰胺核糖核苷)的体外代谢,分别以Wistar大鼠与TR2大鼠进行实验,灌流过程中每隔5min取样1次,监测BR及其代谢物,结果表明,Wistar大鼠灌流液中只有BR及其去氨基产物BR-COOH通过色谱检测出来,而BAD(苯甲酰胺腺嘌呤双核苷酸)未检出TR2大鼠,灌流液的检测结果与Wistar大鼠几乎相同,但在BR与BR-COOH的检出量上,TR2大鼠组低于Wistar大鼠组18%～23%。同时,应用Wistar大鼠分离肝细胞,对不同浓度的BR(0～3mmol/L)进行了温孵实验,通过检测,BAD仍然无法检出。通过对BR的离体肝灌流与肝细胞体外温孵实验结果比较,均发现BAD低于检测限,未检出,这说明BAD这种活性的代谢产物在大鼠肝脏中代谢率很低,BR-COOH为其主要的代谢途径,故可推测,BR在人体的癌症治疗中,主要代谢生成为BR-COOH。当前,离体肝灌流亦应用于对药物的药动学参数进行考察。Christian[9]等运用该方法考察了药物CPT～11在胆汁中的排泄、清除速率及AUC等药动学参数,取得了较好的结果。离体肝灌流法具有器官水平的优势,兼备体外实验和整体动物实验的优点,更适于定量研究药物体外代谢行为和特点,并能解决在其它的体外肝代谢模型和整体动物实验中不能得到满意解决的难点,在药理学和毒理学的研究中已受到广泛的重视,但其对实验设备及技术有一定的要求,一定程度上限制了其应用。
4 器官组织切片法
器官组织切片法也是研究药物代谢及其毒性的有效的体外系统,该法不破坏器官的细胞构成和组织结构,所得结果与体内法相近。在各种器官组织切片中,以肝切片的应用最多。肝切片相对于纯化的P450同工酶、P450混合酶、肝微粒体、游离的肝细胞来说,不仅完整保留了所有肝脏药酶及各种细胞器的活性,而且保留了细胞间的联系及一定的细胞间质,更能反映药物在体内生理情况下的实际代谢过程,且可在较长的孵育时间内保持代谢活性(可达8～24h);其缺点为切片机的使用受限,而且好的切片机价格昂贵。deKanter[10]等利用利多卡因、睾酮及7-乙氧基香豆素为探针药物,进行了器官切片温孵实验,结果表明,该系统具有Ⅰ相及Ⅱ相多相代谢途径,且易于比较不同器官组织的代谢差别,研究发现,不同种属及不同器官间代谢类型及速度不同。
综上所述,常用的肝体外代谢研究方法有肝微粒体体外温孵法、肝细胞体外温孵法、离体肝灌流法[11]及器官组织切片法等,广泛应用于药物的代谢途径、体内代谢清除及药物间相互作用的研究,应根据不同的要求和目的选择应用。体外肝代谢研究可针对先导化合物代谢过快或生成毒性代谢物[12]的特性进行结构改造,以获得安全稳定的候选物,根据候选物的代谢特征(如药酶诱导抑制参与代谢的药酶种类、活性代谢物的生成等)确定药物的开发应用价值,因而具有广阔的应用前景。今后,随着研究的不断深入,药物体外肝代谢[13]的研究将不断完善,进一步发挥其价值。
摘要：对近几年的文献资料进行分析、综合、归纳。介绍肝微粒体体外温孵法、肝细胞体外温孵法、离体肝灌流及器官组织切片法。其中,肝细胞体外温孵法是当今药物体外肝代谢研究的热点,对新药研究与开发及正确指导临床合并用药有着巨大的推动作用,将对其进行重点论述。
关键词：体外肝代谢,肝微粒体,肝细胞,离体肝灌流,组织切片
体外研究 篇2
为了观察兔豆状囊尾蚴的体外发育情况及头节的详细结构,用不同浓度的猪胆汁和兔胆汁对兔豆状尾蚴进行培养,并对培养后的形态进行了观察.结果表明,在不同浓度和不同来源的胆汁、生理盐水中,豆状囊尾蚴的头节翻出率、存活时间各不相同,最快3 min,且随时间延长,翻出率越高.其中以兔胆汁的效果较好.在不同浓度兔胆汁中培养20 min头节翻出率均为100%,而在不同浓度猪胆汁中培养20 min头节翻出率分别为83%、67%、67%、50%、33%.培养后的.豆状囊尾蚴在体外存活时间最长可达36 h.翻出头节的囊尾蚴可清晰看到头节、颈节、原始体节和囊泡四部分.
作 者：张念 赵振升 王帅 潘耀谦 ZHANG Nian ZHAO Zhen-sheng WANG Shuai PAN Yao-qian 作者单位：张念,赵振升,王帅,ZHANG Nian,ZHAO Zhen-sheng,WANG Shuai(河南科技大学动物科技学院,河南洛阳,471003)
潘耀谦,PAN Yao-qian(河南科技学院动物科学学院,河南新乡,453003)
荭草的体外抗肿瘤活性研究 篇3
【摘要】目的：筛选荭草的抗肿瘤活性部位。方法：采用CCK8法观察荭草各提取部位对人肺癌A549细胞、人肝癌HepG2细胞株生长的影响情况。结果：荭草的乙酸乙酯部位对人肺癌A549及肝癌HepG2细胞的生存率降至49.16%及57.44%；正丁醇部位对人肺癌A549及肝癌HepG2细胞的生存率降至39.18%和46.57%，呈现时间-剂量效应关系。结论：荭草对人肺癌A549细胞、人肝癌HepG2细胞增值具有一定的抑制作用，是具有开发前景的抗肿瘤中藥。
【关键词】荭草；CCK8法；体外抗肿瘤；活性部位
【中图分类号】R285.5【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2015）08-0033-02
荭草为蓼科植物红蓼Polygonum orientale L.的干燥地上部分，具祛风除湿、清热解毒、活血、消积止痛之功，用于治疗风湿痹痛、头痛、心胃气痛、小儿疳积等症[1]。其主要成分为黄酮类化合物[2]，且该成分有显著抑制肿瘤细胞增殖的作用[3]。文献报道荭草对一些肿瘤细胞具有抑制作用，红蓼的果实、茎叶也有一定的抗肿瘤作用[4-6]。本研究采用CCK8法，初步探讨了荭草醇提液的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取部位对人肺癌A549细胞、人肝癌HepG2细胞体外活性的抑制情况，为荭草的进一步研究及临床抗肿瘤的开发提供实验依据。
1仪器与材料
1.1仪器酶标仪（美国，Thermo Scientific Multiskan FC）；二氧化碳培养箱（美国，Thermo Fisher）；倒置相差显微镜（德国，徕卡DM500/DM750显微镜）；96孔培养板（美国Corning公司）；电子分析天平（瑞士，梅特勒-托利多公司）；Mill-Q型超纯水机（美国Millipore公司）。
1.2材料 荭草采自天津经济开发区，经天津中医药大学张坚鉴定为荭草Polygonum orientale L.的地上部分；胰蛋白酶、1640高糖培养基、胎牛血清为美国GIBCO公司；CCK8试剂盒为碧云天生物有限公司；其他试剂皆为分析纯；水为由Mili-Q超纯水；人肺癌细胞株A549、人肝癌细胞株HepG2购自中国科学院上海生科院细胞资源中心。
2方法
2.1供试品制备称取荭草100g粉碎至60目，用3倍体积的60%的乙醇回流提取三次，每次1h，合并提取液，减压回收溶剂得浸膏。依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，回收溶剂，减压回收，得石油醚、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取部位。冷冻干燥呈粉末，精密称取不同提取部分干燥粉末，用培养基制成10mg/ml母液，过0.22μm微孔滤器过滤除菌，4℃备用。
2.2细胞培养将细胞接种于含10%胎牛血清100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的1640培养液中，放置37℃、5%CO2培养箱中培养，实验细胞采用对数生长期细胞。
2.3CCK8法检测细胞存活率选用对数生长期的贴壁肿瘤细胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液后，将细胞密度调整为5×104个/ml，每孔接种100μl的细胞悬液于96孔培养板中，置于5%CO2及饱和湿度下的培养箱内37℃培养12 h。每孔加入不同萃取部位药物稀释液，使其终浓度分别为50、100、150μg/ml，每组5个复孔，对照组加入相同体积培养基，置于37℃、5%CO2和饱和湿度下的培养箱内，继续培养12h和24h。终止培养前1h，每孔加入100μl CCK8溶液，混匀，在细胞培养箱继续孵育1h后，于酶标仪上490nm波长处检测各孔的光密度OD值，按试剂盒说明，计算细胞存活率。细胞存活率（%）=D（λ）实验组/D（λ）对照组×100%，则对照组存活率为100%。
2.4数据分析采用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。
3结果
3.1不同浓度对细胞存活率的影响石油醚层对人肺癌A459和人肝癌HepG2细胞存活率均没有影响（P>0.05）。乙酸乙酯部位和正丁醇部位对两种细胞株均具有一定的抑制作用。与石油醚组相比，作用12h、50μg/ml的乙酸乙酯部位药物对肿瘤细胞的存活率无显著性差异。随着乙酸乙酯部位浓度升高至100μg/ml时，对A549细胞和HepG2细胞存活率分别降至70.46%和74.28%，200μg/ml时，两种细胞存活率分别为56.74%和61.32%，与石油醚组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。结果显示，乙酸乙酯部位出现良好的剂量依赖性。正丁醇部位在作用时间12h、浓度为50μg/ml时，A549细胞和HepG2细胞存活率分别为69.17%和78.59%，而200μg/ml正丁醇对两种细胞的存活率影响分别为46.12和52.71%，与石油醚组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。结果显示正丁醇部位对两种细胞株也存在浓度-效应关系。并且相同药物浓度、相同作用时间时，正丁醇部位对于两种细胞比乙酸乙酯更为敏感。
3.2不同时间对细胞生存率影响相同浓度乙酸乙酯部位（100μg/ml）对A549细胞的存活率在12h和24h分别为70.46%和68.45%；HepG2细胞的存活率分别为74.28%和67.41%；正丁醇部位（100μg/ml）对A549细胞处理12h和24h，细胞存活率分别为64.19%和53.46%，而HepG2的影响分别为62.41%和58.43%，由此可见，随着药物作用时间的延长，药物对肿瘤细胞的增殖抑制作用也随之升高。
4讨论
目前罹患癌症的病例呈逐年增长的趋势。癌症是机体与外界环境因素长期相互作用的结果，主要诱因有环境污染及诸如吸烟、不健康饮食、体力活动少等不良的生活方式。我国肺癌及肝癌的发病率较高，死亡率在癌症中也最高。随着中医药现代化研究的深入，中药在治疗癌症方面有了很大的进展。荭草为民间及民族常用中药，文献报道其有一定的抗肿瘤作用[3]。本文通过对荭草不同溶剂萃取物对肺癌A549细胞、肝癌HepG2细胞进行体外活性的筛选，为其抗肿瘤活性研究及临床应用提供实验依据及参考。
本实验通过CCK8法，对荭草醇提液的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取部位对人肺癌A549细胞和人肝癌HepG2细胞进行体外活性的抑制作用进行研究，结果表明乙酸乙酯、正丁醇2个萃取部位对人肺癌A549细胞和人肝癌HepG2细胞均有抑制增殖的作用影响，且正丁醇部位对上述两种肿瘤细胞的增殖影响较大（生存率最低为39.18%和46.57%），比乙酸乙酯部位（最低值为49.16%、57.44%）抑制作用更明显。说明荭草抗肿瘤的活性部位集中在大极性部分。并且，给药剂量与给药时间与肿瘤增殖抑制具有直接关系，随着给药剂量和给药时间的增加，肿瘤细胞生存率降低，达到200μg/ml和24h时的影响最大。荭草的主要化学成分为黄酮类化合物，且黄酮类化合物具有一定的抗肿瘤作用，荭草的抗肿瘤活性是否与黄酮类成分的含量有关仍需进一步的实验研究。
参考文献
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家畜体外受精技术与研究方法 篇4
最初的体外受精技术是手术法采取药物超排的成熟卵子,在人为创造动物体内环境下,完成卵子与精子的受精过程后,培养1～3日,再采用手术法移植到受体子宫内[2]。这种方法在采取卵子方面费用(药物等)很高,且需要花费很多人工。其后,利用内窥镜等方法替代了手术法采取卵子,使体外受精技术在一定程度上得到了改进,但其最大的问题在于家畜对药物超排的反应存在着较大的个体差异,并且其差异具有不可预测性,所以,这种方法在实际畜牧生产中还达不到应用的程度。
现代家畜体外受精技术的特点是以利用屠宰场废弃的卵巢采取未成熟卵。多数哺乳动物卵子的形成在出生前后就完成了,将卵泡中的卵子取出,给以恰当的条件,其细胞核能够进行减数分裂,并发育到可以受精的状态。这种现象与卵泡内发生复杂的激素控制引起成熟不同,因此这种体外培养的成熟叫做“自然成熟”。卵巢中有很多潜在的卵泡,如果将其中的卵子取出进行成熟培养和体外受精,再培养到可以移植阶段的胚胎,则生产胚胎的方式变得极为简捷、生产成本也大为降低[3]。
在体外成熟的卵子具有发育成为幼畜的能力早已得到了证明。其方法为:将体外成熟培养的卵子移植到事先进行了人工受精的家畜的卵管中,使其在卵管内受精并完成了胚胎的初期发育。但是,所谓的体外成熟卵子只是完成了细胞核的成熟,关于细胞质的成熟还存在问题,特别是使用其进行体外受精的情况下,还有完全受精状态参差不齐,发育率低等问题。
在体外受精技术体系当中,成熟培养和体外受精卵子发育的问题非常关键,这涉及两个问题,即成熟培养条件和精子受精能获得条件。20世纪80年代人们采用钙离子载体(ca-ionophoer)处理的前培养法诱导精子获能效果较好,得到较高的受精率和卵裂率(钙离子载体的操作需要在暗室中进行)。现在精子处理方法主要以BO液(Brackett and Oliphant)为基础,使用肝素与黄嘌呤结合诱导精子获能,已经形成了成熟的实用技术[4]。由此不仅解决了关于受精卵方面实验研究所用受精卵的来源问题,还预示着胚胎移植所用胚胎可以低成本地生产、尤其是能够实现专用家畜大量繁育。
体外受精的主要技术操作主要体现在5个方面:卵巢的收取和运输;未受精卵的采取与选择;体外成熟培养;精子的受精能获得处理;培养受精卵达到可以移植阶段的囊胚期。
1 卵巢的采取和运输
卵巢在集中处理母畜的屠宰场收集。屠宰场与实验室之间总是有一段距离,因此,运送卵巢时的生理盐水温度保持在比较接近体温的程度,但实际上也不必特别严格,相差4℃对卵子发育不会产生显著影响,一般控制在33～38℃。为了防止卵巢被污染,浸泡卵巢的生理盐水中应加入青链霉素100～200 g/mL。一般来讲,卵巢离开母体至实验室采取卵子进入培养液中的时间与卵子发育状况关系密切,时间间隔越短发育效果越好。一般卵巢离开母体2～4 h内需要运送到实验室。
2 卵子的采取与选择
2.1 采取卵子
卵巢的表面有许多小卵泡,但并非在每个卵泡中都能够得到卵子。采卵前使用温水清洗卵巢,从卵巢内采取卵子比较常用的方法是注射器抽取和切碎过滤,也有用手术刀切开卵泡用小勺舀出卵泡液的。使用注射器采取卵子的方式不仅卫生,操作起来也特别方便,注射器采取一般使用18号针头。抽取操作看似简单,初次抽取只能获得极少的卵子,需要有一个熟练的过程才能将大部分卵子抽取出来,一般平均每个卵巢能够获得20个左右可用卵,多的可以抽取到40个左右。把小卵泡内的卵子全部抽取出来是高难的技术,另外,如何利用卵巢内发育不同阶段不同的卵子是今后的研究课题。
2.2 卵子的选择
将卵泡液注入培养皿,在立体显微镜下检出带有卵丘的所有卵子,放如培养液中逐个清洗3～5遍后开始成熟培养。采取的卵子有附着卵丘细胞的,也有的只有透明带没有卵丘细胞。卵丘细胞关系到卵子是否具有发育及受精能力,卵丘细胞附着程度、状况也各不相同。根据卵丘细胞附着厚度和紧密程度,可以将卵子分为A、B、C三种类型。卵丘细胞层较厚、附着紧密的为A型卵子;卵丘细胞附着紧密、但是细胞层较薄或者有一部分卵丘细胞已经脱落,称为B型卵子;卵丘细胞较少的称为C型卵子。在实际操作过程当中,可以根据实验所需卵子数量,在立体显微镜下选择卵子。
2.3 体外成熟培养
卵子属于生殖细胞,其发育成熟的过程即为细胞核染色体减数分裂的过程。从卵巢中获得的卵子属于未成熟卵,需要给予一定的条件进行培养使其自然成熟,达到动物排卵前后的状态,才能接受精子完成受精。体内卵子的成熟必须有性腺激素的刺激才能完成,因此体外成熟培养也需要添加FSH雌激素。事实上附着于卵子周围的卵丘细胞也能够释放一定数量的雌激素,所以在不添加FSH的情况下也可能发育成熟。但是,体外受精最关心的是卵子能否进行受精发育成为囊胚,从这方面看,不添加激素的情况下,卵子即使能够发育成熟,受精后也比较难发育到囊胚阶段,其差异非常显著。有人做过实验,只添加犊牛血清不添加FSH,结果卵裂率、分裂8细胞以及囊胚率都显著下降。精子进入卵子完成受精需要穿透卵丘的过程,激素有使卵丘膨化松软、有利于精子穿透的作用。卵子第一级体放出之后,到第二减数分裂中期处于分裂暂时休止状态,此时期正是接受精子的状态。经过12～24 h的培养业已成熟的卵子,再经过受精后进入老化时期(aging)。为了调整受精时期,有人设计在成熟培养后的16 h、20 h、24 h、28 h进行受精操作,对其囊胚率进行探讨,结果发现,24 h和28 h的囊胚率明显低,而20 h的囊胚率非常高,也说明较短时间的成熟培养对体外受精恰到好处。
2.4 精子的获能
为了使精子进入卵子,在体内受精情况下,精子需要在母畜的子宫角停留一段时间,在此期间精子的机能发生了显著变化,完成了精子进入卵子前的准备工作,这种现象称之为精子获能。获能的精子主要表现在发生了顶体反应,具备了进入卵子的能力[5]。诱导精子获能的方法有多种,先期多应用钙离子载体A23187分段处理方法,现在比较通用的方法为黄嘌呤加肝素处理方法[6]。
黄嘌呤加肝素处理方法如下:用添加10 mol黄嘌呤(咖啡因等)调制的BO液清洗精子2次,离心后取上清液,用添加3%NaCL溶液杀死精子,用血球计数板在显微镜下计算精子浓度,根据其浓度分别用黄嘌呤BO液和肝素钠BO液分为2次稀释调整精子浓度达到500～1 000万/mL,即完成了精子获能操作。使用该浓度的精子悬浮液在培养皿中制作10 L液滴,每个液滴中注入10个左右的成熟卵子进行受精培养5～6 h[7]。
卵子受精环境中精子数(或者浓度)非常关键,精子数过少则受精率降低,精子数过多则会造成多精子浸入卵子的比例增加。多精子受精的情况下,受精卵很难发育到囊胚期,少数受精卵能够发育到了囊胚期的,在胚胎移植后也在母畜体内调亡。检查成熟卵受精的方法为将受精卵染色在荧光显微镜下观察,只有一个精子进入卵子的情况为正常受精,成熟卵子内进入2个或2个以上的精子的情况为多精子受精[8]。
2.5 培养受精卵发育到囊胚期阶段
受精培养液也是精子获能处理的培养液,其组成比较单一,在精子浸入卵子后需要更换培养液,一直培养到7～9日龄,检查出发育到囊胚的可以捡出进行鲜胚移植或者冷冻保存。目前胚胎冷冻方法由多种,体外受精胚胎的冷冻方法与超排胚胎的冷冻方法基本相同,采用分段冷冻方法等都取得了较好的效果[9]。在体外受精研究初期,人们是将受精卵移植到家兔的卵管中进行培养的,其后人们发现使用卵子成熟培养的含25 mol HEPES缓冲组织培养液199(TCM199)培养受精卵能够发育到囊胚期,并移植后出生了幼畜。为了达到较高的囊胚率,还需要在培养液中添加血清。根据母畜妊娠的体内环境,也有人曾尝试在培养液中添加乳酸,但是没有取得效果。
在成熟培养和受精过程中,卵子和卵丘细胞一直形影不离,在培养过程中卵丘细胞会自动脱落到培养皿底部进行单层状态增殖,其增殖速度还与培养皿的种类有关。受精后的卵丘细胞与卵子分离开,将受精卵移到新的培养液中,结果发育不到囊胚阶段,而将受精卵移到卵子成熟培养的环境中则能够发育到囊胚阶段,说明了卵丘细胞在卵子的成熟培养和受精卵的发育过程中都起到了关键作用。在成熟培养时,卵丘细胞是附着在具备通透性的卵膜上,而在受精卵培养时,卵丘细胞并不直接与受精卵接触,说明由卵丘细胞而来的扩散物质在发挥作用。这种培养体系目前已经建立,但是对培养系中的有效物质的作用机理尚未明了,也是今后人们关注的研究课题。
3 体外受精家畜(牛)生产展望
利用屠宰场废弃的卵巢通过体外受精技术生产犊牛,无论在奶牛还是在肉牛的生产应用方面都具有重要意义。现在,由卵子的体外培养和体外受精进行胚胎移植获得的个体发育能力方面,已经没有值得怀疑的问题。因此,通过该技术可以根据市场需求定向生产奶牛或者肉牛。例如:屠宰草原红牛母牛的卵巢,实验室内使用优质草原红牛公牛冷冻精液体外受精生产草原红牛胚胎,移植到普通地方黄牛体内而生产草原红牛个体,收集黑白花奶牛的胚胎的情况也是同样效果。如此把屠宰场废弃的卵巢利用起来,将是优质品种母畜的繁殖能力得到了最大发挥,而且利用高性能公畜方面,体外受精技术也能够得心应手。体外受精胚胎成本非常低,在胚胎移植时根据受体的黄体检查,实施双测子宫角输精而使母畜产双胎,这在实际生产中能够产生更大的经济效益。
当前全国各地研究机构都积极开展家畜分子生物学研究,国家也把动物基因领域研究作为“十一五”期间的研究重点。家畜的转基因技术也需要体外受精技术作为基础,因为利用该技术可以为转基因操作提供大量的低成本胚胎。克隆技术的发展也是依靠体外受精技术为基础的,一个胚胎具备大量复制的理论条件,再通过核移植就可以大量复制优秀家畜个体,这在提高家畜生产水平方面具有重大意义。
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体外研究 篇5
硒化壳聚糖的制备及其体外抗氧化活性研究
以壳聚糖为载体制备了硒化壳聚糖,采用紫外光谱和红外光谱对其结构进行了表征,研究了其体外清除自由基的能力,包括对DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟自由基的清除作用和还原能力.结果表明,硒化壳聚糖和壳聚糖对DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟自由基均有一定的清除作用,浓度为5.000 mg・mL-1的.硒化壳聚糖对上述3种自由基的清除率分别为49.58%、78.29%和50.68%.硒化壳聚糖的抗氧化能力要强于壳聚糖,但还原能力与壳聚糖相差不大.
作 者： 作者单位： 刊 名：化学与生物工程 ISTIC英文刊名：CHEMISTRY & BIOENGINEERING 年，卷(期)： 26(9) 分类号：O636.1 关键词：壳聚糖 硒化壳聚糖 结构 自由基 抗氧化活性
抱茎獐牙菜体外抗氧化作用研究 篇6
抱茎獐牙菜（Swertia franchetiana H.Smith）系龙胆科（Gentianaceae）獐牙菜属（Swertia.L）植物，主要分布于青藏高原和云贵高原，是一种一年生草本植物，为常用藏药，藏名“蒂达”，俗称“藏茵陈”，全草入药，具有清热解毒，舒肝利胆之功效，主治各种肝胆疾病[3]。獐牙菜属的植物主要含有环烯醚萜类、三萜类、黄酮类等成分，而黄酮类化合物具有消炎，改善微循环、抑菌、抗肝炎病毒、抗肿瘤等生理功能，该物质具有一定的开发利用价值。本文通过测定抱茎獐牙菜的总黄酮含量，测定其体外对DPPH自由基清除作用，为进一步开发利用抱茎獐牙菜提供一定的理论依据。
材料
原料。抱茎獐牙菜，采于西宁市西山。
仪器。分光光度计（UV-9100）：北京瑞利分析仪器公司；电子天平：上海方瑞仪器有限公司；恒温水浴锅：北京医疗设备总厂。
试剂。①芦丁标准液。用电子天平精确称取芦丁标准品5mg置于10ml容量瓶中，用70%乙醇溶解并定容，摇匀，得到0.5mg/ml的标准溶液。②DPPH母液。准确称取50mgDPPH，用无水乙醇溶解并定容于250ml容量瓶中，DPPH浓度为0.5mmol/l，避光保存。0.2mmol/lDPPH溶液：取0.5mmol/lDPPH母液40ml，用无水乙醇定容至100ml容量瓶。③其它试剂。70%的乙醇，5%亚硝酸钠溶液，10%硝酸铝溶液，5%氢氧化钠溶液，双蒸水，无水乙醇（天津市富宇精细化工有限公司，分析纯）。
方法
芦丁标准曲线的制作。精确吸取芦丁标准溶液0.00ml，0.40ml，0.80ml，1.20ml，1.60ml，2.00ml分别置于10ml容量瓶中，加水至2.4ml，加入5%亚硝酸钠溶液0.4ml，摇匀，放置6分钟；加入10%硝酸铝溶液0.4ml摇匀，放置6分钟；加入5%氢氧化钠溶液4.0ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟。以试剂空白作为参比溶液。用1cm比色皿，在500nm波长处测定吸光度，得到横坐标浓度Y与纵坐标吸光度X的标准曲线。线性回归方程：Y=0.8277X-0.0242（相关系数r=0.9921）
提取物的制备。①醇提物的制备。将干燥的样品在研钵中研碎，精确称取样品5.0g，置于100ml容量瓶中，加入70%乙醇30ml，浸泡24h，封口水浴加热30分钟，用纱布过滤，在70℃下将其浓缩至10ml，浓度为500mg/ml。将浓度为500mg/ml的黄酮提取液稀释10倍，待用。②水提物的制备。称取粉碎后的样品5g加入50ml蒸馏水，沸水浴煎煮1h，用纱布过滤，倾出滤液后重复提取一次，合并2次煎煮的过滤清液，将其浓缩至10ml，得到黄酮提取液浓度为500mg/ml。将浓度为500mg/ml的黄酮提取液稀释10倍，待用。
总黄酮含量的测定。吸取稀释后的黄酮提取液5份各1.00ml置于10ml容量瓶中，加水至2.4ml，加入5%亚硝酸钠溶液0.4ml，搖匀，放置6分钟；加入10%硝酸铝溶液0.4ml摇匀，放置6分钟；加入5%氢氧化钠溶液4.0ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟。测吸光度值，用回归方程计算样品中总黄酮含量。
对DPPH自由基清除率的测定。取植物提取液1ml，0.5mmol/l的DPPH溶液0.25ml先后加入同一具塞试管中，摇匀，在黑暗中37℃放置20分钟，以甲醇为空白在517nm测定其吸光度Ai。取0.25ml0.5mmol/l的DPPH溶液与1ml甲醇混合摇匀，在黑暗中37℃放置20分钟，以甲醇为空白在517nm测定其吸光度Ao。取植物提取液1ml与0.25ml甲醇混合，摇匀，在黑暗中37℃放置20分钟，以甲醇为空白在517nm测定其吸光度Aj。根据下列公式计算出提取液对DPPH的抑制率，即DPPH自由基清除率：K%=[1-（Ai-Aj）/A0]×100%。
数据处理。所得数据用Excel进行数据处理。
结果
总黄酮含量的测定。抱茎獐牙菜不同提取物总黄酮含量测定结果见表1
由表1结果可知，抱茎獐牙菜水提和醇提取物中均有大量黄酮类化合物的存在，而水提取物总黄酮含量显著高于与醇提取物。
对DPPH清除率的测定结果。抱茎獐牙菜不同提取物对DPPH清除率测定结果见表1
由表2可知，抱茎獐牙菜不同提取物对DPPH自由基有明显的清除作用，而水提物比醇提物抗氧化作用好，和表1说明，抱茎獐牙菜中黄酮类化合物含量越高，抗氧化作用越明显。
结论
通过测定抱茎獐牙菜中总黄酮的含量，水提的和醇提的总黄酮含量具有明显的差异。而且水提和醇提的总黄酮的抗氧化活性也有明显的差异。抱茎獐牙菜的药理作用很多，总黄酮含量也较高，其抗氧化作用较好，这种抗氧化作用可以阻止细胞的退化、衰老，也可阻止癌症的发生。黄酮类化合物具有消炎，改善微循环、抑菌、抗肝炎病毒、抗肿瘤等生理功能，还可以抑制炎性生物酶的渗出，可以增进伤口愈合和止痛，该物质具有一定的开发利用价值，从这些可知，对抱茎獐牙菜的抗氧化作用的研究具有广阔的开发前景。
（作者单位：青海省食品检验检测院）
披针叶黄华碱体外细胞毒性的研究 篇7
1 材料
1.1 试剂
黄华碱、四氢脱氧阿艮亭碱, 为笔者自披针叶黄华中分离而得;羟喜树碱 (规格为5 mg) , 黄石李时珍药业集团生产;胎牛血清 (FBS) , 杭州四季青公司生产;Hyq改良型RPMI-1640培养基, 海克隆生物化学制品 (北京) 有限公司生产;DMEM培养基, 青岛蓝雁绿检生物技术有限公司生产;四甲基偶氮噻唑蓝盐 (MTT) 、二甲基亚枫 (DMSO) , Amresco公司产品;胰蛋白酶、青霉素, 华北制药有限责任公司产品;链霉素, Gibco公司产品;96孔细胞培养板, Costar公司产品。
1.2 仪器
酶联免疫检测仪, 中国烟台艾德康生物科技有限公司生产;倒置显微镜, 日本奥林巴斯光学工业株式会社生产;CO2培养箱, 立德泰勀 (上海) 科学仪器有限公司生产;显微照相机, 中国杭州数明科技有限公司生产。
1.3 细胞株
SW480细胞、BHK细胞, 购自中国上海酶联生物科技有限公司。
2 方法
2.1 细胞的培养
SW480细胞使用RPMI-1640培养液培养, BHK细胞使用DMEM培养液培养, 并加入10%胎牛血清、1%抗生素 (青霉素和链霉素各10 000 U/mL) , 于37 ℃、5%CO2、100%湿度条件下培养。每2 d传代培养1次, 使细胞保持在对数生长期。黄华碱、四氢脱氧阿艮亭碱、羟喜树碱3种待测样品分别用DMSO溶解, 并以PBS溶液配制成1 mg/mL储备液, 于-20 ℃保存。测试前再用PBS溶液稀释成终浓度为0.1 mg/mL的待测溶液。用PBS溶液将MTT配成浓度为5 mg/mL的母液, 于4 ℃避光保存[5]。
2.2 细胞体外毒性试验 (MTT法)
2.2.1 原理
MTT可被活细胞内的琥珀酸脱氢酶还原成蓝紫色结晶物甲攒, 而死亡细胞无此功能, 通过测定反应产物甲攒颜色的深浅来反映活细胞数量的变化。蓝紫色结晶物可以溶于DMSO中成为蓝紫色溶液, 溶液颜色深浅与活细胞数量成正比, 可用酶标仪在波长为490 nm处测定OD值, 比较阴性对照组与药物组的OD值得出抑制率[6,7,8]。利用此原理可测定经抗肿瘤药物作用后肿瘤细胞吸光度值的变化, 并计算出肿瘤细胞存活率, 从而推测肿瘤细胞对某种抗肿瘤药物的敏感程度。
2.2.2 药液配制
生物碱均用PBS溶液稀释, 溶液设6个浓度梯度, 黄华碱的6个浓度梯度为0.063, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2 mg/mL, 四氢脱氧阿艮亭碱的6个浓度梯度为0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8 mg/mL, 羟喜树碱的6个浓度梯度为0.031, 0.063, 0.125, 0.25, 0.5, 1 mg/mL, 用无菌过滤器过滤后使用。
2.2.3 试验分组
选取96孔细胞培养板的第1, 2列为空白组, 第3, 4列为阴性对照组, 第5～10列为药物组和阳性对照组。空白组:只加培养基不加SW480细胞或BHK细胞。阴性对照组:加培养基和SW480细胞或BHK细胞, 但不加药物。药物组:加培养基和SW480细胞或BHK细胞, 培养24 h后添加生物碱。阳性对照组:加培养基和SW480细胞或BHK细胞, 培养24 h后添加抗癌药羟喜树碱。
2.2.4 操作
取对数生长期的SW480细胞或BHK细胞用于试验, 在96孔细胞培养板的第1列和第2列每孔加入150 μL DMEM培养基, 第3～10列每孔加入150 μL生长良好的SW480细胞或BHK细胞 (每孔约含2×104 个细胞) , 在37 ℃、5 %CO2和100%湿度条件下培养24 h;第1～4列每孔加入20 μL PBS溶液, 第5～10列每孔加入20 μL不同浓度样品, 每种样品设6组浓度, 每组浓度设8个平行孔, 继续培养48 h;然后每孔加入5 mg/mL 的MTT溶液20 μL继续培养4 h;弃去培养液, 各孔分别加入DMSO 150 μL, 振荡10 min待结晶完全溶解后, 用酶标仪于波长为490 nm处测定OD值[9,10], 并计算细胞生长抑制率。 计算公式:细胞生长抑制率= (阴性对照组OD值的平均值-药物组OD值的平均值) /阴性对照组OD值的平均值×100 %[11,12]。
3 结果与分析
试验采用MTT法测试了3种化合物对BHK细胞、SW480细胞的细胞毒性, 根据酶标仪测出96孔细胞培养板OD值并计算出药物各种浓度对2种细胞的抑制率, 结果见表1。
由表1可知:当黄华碱浓度为2, 1, 0.5 mg/mL时对BHK细胞有抑制作用, 当浓度小于0.5 mg/mL时抑制作用很弱;当黄华碱浓度为2 mg/mL和1 mg/mL时, 对SW480细胞有较好的抑制作用。
四氢脱氧阿艮亭碱各浓度组对BHK细胞均表现一定抑制作用, 当浓度为8 mg/mL和4 mg/mL时对BHK细胞有很强的抑制作用, 细胞生长抑制率分别为53.6 %和36.6 %, 低浓度组对BHK细胞也有一定抑制作用。四氢脱氧阿艮亭碱浓度为8 mg/mL、4 mg/mL、2 mg/mL、1 mg/mL时均对SW480细胞有强抑制作用, 当浓度为1 mg/mL时对SW480细胞仍有27.9 %抑制率, 浓度为8 mg/mL时抑制率高达81.6 %。
羟喜树碱各浓度组对BHK细胞和SW480细胞均有很强抑制作用, 各浓度组对细胞生长抑制率均在20.0%以上, 最高可达52.3%, 抑制率随着药物浓度的增加而升高。
各药物作用后细胞的变化见182页彩图1～4。
4 结论
试验应用MTT法测定了黄华碱、四氢脱氧阿艮亭碱和羟喜树碱对正常BHK细胞和SW480癌细胞的体外细胞毒性作用。结果发现, 四氢脱氧阿艮亭碱表现出较强的抑制癌细胞生长活性, 随着药物剂量的增加, 抑制率也明显升高。羟喜树碱对2种细胞的毒性作用明显, 无论是对BHK细胞还是对SW480细胞在各浓度组均有较好抑制。黄华碱对BHK细胞毒性低, 浓度为2 mg/mL时对SW480细胞抑制率为20.7%, 有一定的抑制效果。
参考文献
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牛体外胚胎生产技术研究进展 篇8
关键词：牛,体外受精,研究进展
体外受精技术 (In vitro fertilizafion.IVF) 包括有卵母细胞的体外成熟、精子获能、体外受精、早期胚胎培养和移植等一系列程序。胚胎体外生产也称体外受精技术, 是继人工授精、胚胎移植技术之后, 家畜繁殖领域的第三次革命。哺乳动物体外受精已有一百余年的历史。早在1878年, 澳大利亚科学家Schenk就用兔进行过实验。目前体外受精胚胎已开始直接在哺乳动物遗传品种改良中得到应用, 同时也是胚胎克隆、转基因动物等研究的主要实验材料。
1 体外受精基本流程
牛体外受精步骤一是卵母细胞的采集, 其中腹腔镜和超声扫描活提取卵泡法是自活体卵巢内获取卵母细胞的常用方法, 取卵数量多, 母畜可持续利用, 但操作方法复杂, 且受条件限制。二是卵母细胞的体外成熟其方法多采用微滴法。三是精子获能, 目前主要运用肝素、咖啡因和钙离子载体诱导获能。四是体外受精和早期胚胎的体外培养等几个步骤。近年来体外胚胎生产技术研究发展逐步完善, 牛体外受精技术已经基本成熟。
2 体外受精研究进展
20世纪70年代以前虽然已经在光镜下进行牛卵子及受精卵的形态学研究。但是直到80年代才取得了牛体外受精的重大突破。自Brackett获得第一头试管牛以来, 日本、美国、英国、丹麦、新西兰、意大利的许多学者都先后致力于牛体外受精的研究, 生产出大量的牛胚胎, 并开始向产业化方向迈进。日本1988年生产试管牛160头。从1989年就开始利用体外受精技术大批量生产肉牛胚胎用于胚胎移植, 以生产日本本地黑牛。到1995年, 日本牛的体外受精技术实施单位达102个, 共移植4642头, 产犊1216头, 囊胚率达30%左右。20世纪末期, 我国牛的体外受精方面有重大突破, 1989年以来, 旭日干等 (1989) 、范必勤 (1989) 、朱裕鼎 (1989) 、卢克焕等 (1990) 、秦鹏春 (1990) 、石德顺 (1992) 等相继获得了试管牛。
随着商业性牛胚胎移植的迅速发展, 牛胚胎的需求量日益增加, 极大地促进了对牛体外受精技术的研究。1986年, CRISTER等和HANADA等分别获得了牛卵母细胞IVM-IVF、异体培养、非手术移植试管犊牛年。Parrish等首次采用精子上游法 (Swim-up) 分离活精子, 大大改进了牛精子体外获能的方法。1987年, 卢克焕等用肝素 (100μg/m L) 处理上浮的牛精子进行精子体外获能, 对体外成熟的牛卵母细胞进行体外受精, 将受精卵移到中间受体绵羊的输卵管内发育, 再移植到19头牛受体牛子宫角, 结果14头牛妊娠。1988年, GOTO等和卢克焕等分别获得牛卵泡卵母细胞IVM-IVF-IVC试管犊牛。1989年, Lu等将38枚IVM-IVF胚胎 (其中2枚为IVC胚胎, 36枚为绵羊异体发育胚胎) 移植给20头受体牛, 结果15头牛妊娠, 其中13头妊娠期满, 产下21头活犊。在我国广西, 石德顺利用IVM-IVF-IVC-FC路线, 生产了大批牛胚胎, 并经过胚胎移植, 获得了200余头试管黄牛犊。在内蒙, 旭日干课题组在澳大利亚和加拿大的胚胎生产基地上, 利用体外受精技术, 生产了近4万枚胚胎, 并在国内进行胚胎移植, 获得了良种试管牛犊350余头。
由于牛的体外受精技术具有很大的商业价值, 其研究的深度、广度和实用化程度不断增加, 主要集中在提高卵母细胞的体外成熟率、体外受精率、体外发育率 (包括卵裂率、桑椹胚发育率和囊胚发育率) 、移植受胎率等几项指标。经过近10年的研究, 人们逐渐揭示影响卵母细胞体外成熟率的各种因素, 并从中探索出提高体外成熟率的途径。在继续探索扩大卵母细胞来源、提高卵母细胞成熟率和体外受精率的同时, 许多学者重点研究了如何提高体外受精胚胎的体外发育率。其中, 我国的卢克焕等在1987~1989年间, 利用绵羊输卵管作为中间受体, 进行了大量的体外受精卵发育研究, 并获得高达60%的桑椹胚-囊胚发育率。花田章等 (1986-1989) 以兔输卵管为中间受体也获得了49%的囊胚发育率。但这种中间受体培养法费用高, 技术过程复杂, 胚胎回收率也较低, 不适合大批量生产牛胚胎。在完全体外培养条件下, 体外成熟卵母细胞的卵裂率最高为91.4% (74/81) ;体外受精卵至桑椹胚和囊胚阶段的发育率为45.1% (60/133) (Yang和Lu1990) 我国广西农业大学卢晟盛 (1994) 利用TCM199+10%OCS与颗粒细胞单层 (GCM) 共培养, 囊胚发育率为47.1%。刘建民等 (1993) 利用输卵管上皮细胞和颗粒细胞两种共培养系统, 桑囊率为66% (85/129) 胚胎最终产值为35% (以受精时卵母细胞数目为基数) 。尽管国内外在试管牛的研究方面做了大量工作, 所采用的培养系统能使90%以上的卵母细胞发育成熟, 80%的卵子完成正常受精和卵裂, 但其中能在体外发育为可供移植的囊胚仅占20%~30%, 而且影响体外生产牛胚胎的因素非常多, 不同实验室、生产厂家的生产条件又很不一致, 导致体外受精卵的卵裂率和囊胚体外发育率结果不稳定, 因而其体外受精的总成功率仍偏低, 一般仅为35%左右。因此, 目前对牛卵母细胞体外成熟、体外受精和受精卵的体外发育培养的系列研究仍然在继续。
3 影响牛体外受精的因素
3.1 卵母细胞的质量及来源
牛体外受精技术所遇到的第一个问题便是卵巢内获得更多质量好的卵母细胞用于IVF。体外受精前 (约6h) 和受精后较短的时间内 (如IVF后20h) , 卵丘细胞的完整性对卵母细胞的受精是有益的。所以筛选卵丘细胞完整、致密的卵母细胞进行体外成熟培养。家畜体内成熟的卵母细胞的数量是有限的, 即使经过超排处理, 每次也不过5~10个, 不能满足实验室内大量生产胚胎的要求。而利用成本低、取材方便的屠宰场废弃的牛卵巢作为卵子来源, 存在没有母牛系谱、生产性能和健康等方面资料记录的缺陷。活体取卵为充分利用有价值的良种母牛的卵母细胞及选择优质的卵子提供了方便, 而且良种母牛还可以继续繁殖, 但操作繁琐。如果能在牛IVF上开发利用腔前卵泡卵母细胞, 就可能从一头牛卵巢中获得上百枚卵子。
3.2 卵母细胞成熟培养
卵巢卵母细胞必须经过体外培养后才能进入成熟阶段, 用于体外受精。哺乳类动物卵巢表面可见卵泡中回收的卵母细胞在体外条件下自发地完成核成熟, 而要使卵母细胞在体外成功地受精并发育至可移植胚胎, 仅有细胞核成熟并释放第一极体是不够的。因为体外核成熟的完成并不保证细胞质的正常成熟。到目前为止, 尽管人们在牛卵母细胞的体外培养方面作了大量工作, 所采用的培养系统能使90%以上的卵母细胞发育成熟, 80%的卵子完成正常受精和卵裂, 但其中能够发育为可供移植的囊胚只占20%~30%, 对目前的成熟培养系统需做进一步的改进和完善。
3.3 体外受精过程及胚胎培养
影响体外受精的因素包括卵母细胞的来源和成熟状态、精子来源和密度、精子的活力、培养基的选择、受精滴的大小、精卵比例、精卵相互作用时间、湿度、温度和气相等方面。
3.3.1 精子的来源
用同样获能处理的冻精、鲜精用于体外受精, 卵子受精率和受精卵发育率, 鲜精高于冻精, 这与冷冻中产生的精子受冻害有关。
3.3.2 体外受精
体外受精中通常选择经几次离心洗涤的精子, 以除去精子在附睾和精清中形成的蛋白质分子的去能外衣以及冷冻稀释液中的其它物质。但反复离心对精子有害, 使大量精子流失。研究证明精子有自动进入培养液和精液建立联系的本能。基于精子的这种自动迁移的能力, 对人类精液研究提出了一种叫“漂浮”的分离精子的方法。该方法应用于哺乳动物的体外受精中, 特别是应用冷冻精液进行体外受精。
3.3.3 精卵比例
受精时精子密度和单位精卵子数, 是影响体外受精效果的重要因素, 动物种类不同而有差异。高浓度的精子与卵子相遇, 若精子获能率不高, 就不会发生多精入卵。但随着卵母细胞成熟时间延长, 多精入卵率随之增高。如何控制精卵相互作用时间是体外受精技术值得探讨的问题。3.3.4不同体外培养系统对胚胎发育的影响在IVF胚胎体外培养的研究中, 采用的培养液主要有两类:复杂的培养液 (TCM-199、IHam’s F10等) 和简单的化学成分明确的培养液 (SOF、CR1等) 。TCM199是最早广泛使用的胚胎的早期基础液, 营养成分复杂全面, 对胚胎发育的影响呈多元性, 在1992年前胚胎的早期培养中使用较少, 主要用于卵细胞的体外培养。
4 牛IVF-ET技术各项技术指标现状及经济效益评估
到目前为止, 体外受精主要在牛和羊的胚胎生产上得到广泛的应用, 因此也称之为胚胎的体外生产。迄今为止, 体外受精在各主要技术环节上的效率基本成熟。
目前人们一般都以牛卵母细胞的体外成熟率、体外受精率、体外发育率 (包括卵裂率、桑椹胚发育率和囊胚发育率) 和移植受胎率等几个指标来对牛IVF技术进行综合评价。一般每头黄牛和奶牛分别可采15枚和20枚卵母细胞, 培养后有90%达到成熟, 可用于体外受精。受精后培养卵子的受精率可达80%经过培养后, 有70%的卵发育至8~16细胞期, 30%的卵子可达到桑椹胚期, 有20%的卵子发育至囊胚期。即从1头黄牛可以得到3枚、1头奶牛可获得4枚囊胚。如果鲜胚移植, 受胎率普遍为50%上下, 即可获得1.5~2头牛犊, 如果冷冻保存IVF胚解冻后生存率为70%, 移植受胎率为40%, 这样以来, 平均从每头牛的遗弃卵巢中至少也可获得一头以上的良种后代。这只是目前的一般水平, 但也有水平较高的。例如日本家畜事业改良团 (1990年) 通过改进技术, 平均从每头牛采到20~30枚卵, 囊胚发生率为20%, 这样平均每头牛可得到4~6枚鲜胚, 移植率达58%, (152/208) , 冻胚移植率也达到52% (31/74) 。按这一比例来计算, 即使冻胚移植, 也能从每头屠宰良种牛获得2~3头IVF小牛。根据以上材料, 我们可以对IVF技术的经济效益做一大略的估算: (1) IVF胚 (囊胚) 生产量, 从一个年屠宰母牛1万头的小型屠宰场取巢, 按每头牛出3枚鲜胚, 一年可生产至少3万枚囊胚。按每枚200元 (30美元) 计, 价值约600万元 (90万美元) 。 (2) IVF小牛生产量:按70%的冻胚生存率和40%的受胎率 (双胚移植) 计算, 3万枚IVF胚可生产良种小牛4000头, 按每头3000元计, 价值可达1200万元 (200万美元) 。从以上估算来看, 比起出售胚胎, 建立受体牛基地, 移植IVF胚的效益更大, 这一点尤其适合我国的国情。胚胎工程学者们正在探索着新的技术途径, 如对供体母牛的活体取卵技术引, 对腔前期或小腔期卵母细胞的体外培养等, 且已取得了显著成效, 相信随着这些技术的日益成熟和完善, 利用体外受精技术将会产生越来越大的经济效。
5 前景展望
牛体外受精的研究和应用无疑将对养牛业的发展以及动物生物工程的进一步深化带来极为深远的影响。近年来, 牛体外受精生产工艺研究已取得了巨大的成绩, 有理由相信, 随着生物技术的发展和对牛卵母细胞成熟、控制机理、胚胎早期培养所需营养促生长因子等方面的深入研究与探讨, 牛体外受精、胚胎生产将会得到进一步完善, 从而为现代生物工程技术和畜牧业生产提供更多的胚胎来源与相关技术。可以预料, 随着科学技术的进一步完善。生产牛体外胚胎将会具有很大的潜力。
目前, 在牛体外受精研究中, 唯有IVF胚胎8细胞以后发育至桑椹、囊胚阶段体外培养的条件尚不完善。IVF胚胎培养48h后出现8~16细胞阶段的发育阻滞现象, 相当数量 (约25以上) 的胚胎发育停滞、退化、死亡。即使体外培养7~8d后, 克服了4~8细胞阻滞而发育到桑、囊阶段, 其质量远不如自然排卵和超排后所获的胚胎。鉴于以上情况, 牛体外受精研究应以提高IVF胚胎质量为主, 同时兼顾提高数量, 其重点应放在改善IVF胚胎体外发育培养系统的研究方面。
参考文献
[1]马学海, 等.牛体外受精胚胎的体外培养研究进展.中国奶牛, 2007, 1:23-25.
[2]黄志坚, 等.牛体外受精技术研究进展[J].福建畜牧兽医, 2002, 10:56-58.
[3]陈芳, 等.制约牛体外胚胎发育力的因素[J].草食家畜, 2001 (, 1) :2-3.
[4]周虚, 等.牛腔前卵泡在体外无血清培养中发育为有腔卵泡[J].中国兽医学报, 2002 (6) :518-519.
[5]黄右军, 等.水牛卵母细胞体外受精和早期胚胎发育的研究[J].中国畜牧杂志, 2002, 38 (4) :25-28.
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紫草提取物体外抗真菌作用研究 篇9
1 实验材料
1.1 药物
紫草提取物 (ZC) :由新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所药剂室提供。提取方法:取100g紫草加10倍量的70%乙醇浸泡24小时, 加热回流提取3次, 每次1小时, 合并提取液, 滤过, 减压浓缩至干燥。阳性对照药特比奈芬 (TERB) :纯度99.82 %, 上海诚优有限公司提供, 批号:20090101。
1.2 实验菌种
红色毛癣菌 (Trichophyton rubrum) 6株、石膏样毛癣菌 (Trichophyton mentagrophytes) 6株、近平滑念珠菌 (Candida parapsilosis) 1株:由新疆医科大学真菌与真菌病研究中心菌种保藏库 (XYZ) 提供。白色念珠菌 (Candida albicans, ATCC 90028) 1株、光滑念珠菌 (Candida glabrata) 2株、热带念珠菌 (Candida tropicalis) 2株:新疆维吾尔自治区中医院皮肤科检验室提供。
1.3 培养基
RPMI-1640培养基:美国Sigma公司;三氮吗啡琳丙磺酸 (MOPS) :美国Sigma公司;马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (PDA) :北京奥博星生物科技有限公司。
2 方法
根据NCCLS推荐的《产孢丝状真菌的液基稀释法抗真菌药物敏感性试验方案》 (M38-A) [2] 测定ZC提取物对18株临床常见真菌的最低抑菌浓度值 (MIC) 。
2.1 抗真菌药物储备液、稀释液的制备
称取ZC粉末204.8 mg, 用1 ml 二甲基亚砜 (DMSO) 溶解, 制成浓度为204800μg·ml-1的储备液, 存于-20 ℃冰箱备用;称取TERB 8 mg, 用1 ml DMSO溶解, 制成浓度为8000 μg·ml-1的储备液。从中吸取1 μl加RPMI-1640培养基499 μl, 使之稀释500倍, 此时TERB储存液浓度为16 μg·ml-1, 存于-20 ℃冰箱备用。
将ZC储备液、TERB储备液, 分别用RPMI-1640培养基倍比稀释成2倍终浓度。ZC的2倍终浓度由高向低依次为:2048、1024、512、256、128、64、32、16、8、4 μg·ml-1;TERB的2倍终浓度由高向低依次为: 16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125μg·ml-1。
2.2 菌接种液的制备
皮肤癣菌:将受试的皮肤癣菌接种于马铃薯培养基 (PDA) 上, 26℃培养7~14天。吸取2 ml无菌的0.85%的NaCl溶液, 冲洗菌落表面的菌丝和孢子, 将含有菌丝和孢子的冲洗液用血细胞计数板记数, 将其浓度调至1×105~5×105 cfu/ml之间, 用RPMI-1640培养基稀释50倍至2倍终浓度。
念珠菌:将受试的念珠菌接种于马铃薯培养基 (PDA) 上, 36 ℃培养48小时。挑取菌落, 加入2 ml无菌的0.85%的NaCl溶液中, 用0.5# McFarland standard 比浊管比浊, 用RPMI-1640液基稀释100倍后再稀释20倍至2倍终浓度。
2.3 接种
将100 μl的2倍终浓度的药液, 由第1孔至第10孔分别由高浓度到低浓度加入无菌96孔细胞培养板中, 第11孔为生长对照孔 (仅加菌悬液100μl和RPMI-1640培养基100μl, 不加药物) , 第12孔为空白对照孔 (真菌、药物都不加, 只加RPMI-1640培养基200μl) 。将调好的菌接种液100μl, 分别加入相应的微孔内, 这将使每一梯度的抗真菌药物和菌接种液 (2倍终浓度) 分别被1:1稀释到终浓度。
2.4 结果的判定
皮肤癣菌, 26 ℃孵育7~14天读结果。念珠菌, 36 ℃孵育48天读结果。读取MIC值时, 应在不搅动的情况下与对照孔按下列标准比较。0:肉眼清晰;1:略模糊 (80%受抑制) ;2:浊度显著减低 (50%受抑制) ;3:浊度轻度减低;4:浊度未减低。本实验药物取1 (略模糊) 或2 (浊度显著减低) 为判定终点。
2.5 质量控制
按照NCCLS方案, 对近平滑念珠菌XYZ 5001进行反复测定, 其两性霉素B的MIC值为0.5~4.0μg·ml-1, 氟康唑的MIC值为1.0~4.0μg·ml-1, 5-氟胞嘧啶的MIC值为0.12~0.5μg·ml-1。每次实验以此菌株为对照, 只有当其MIC值介于其质控范围之内时, 方认为实验操作准确可靠。且只有当生长对照孔生长良好, 空白对照无生长, 其它孔随药物浓度升高, 呈现真菌生长梯度受抑制时, 方证明实验成功。
3 结果 见表1。
4 讨论
文献报道, 紫草中的萘醌具有很强的抗真菌作用, 对念珠菌病有显著的治疗作用[3]。Kenroh S[4]等对紫草萘醌衍生物 (Naphthoquinone Derivatives) 进行了体外抗真菌作用研究, 发现其具有广谱的抗真菌活性, 其中紫草素 (Shikonin) 抗酵母菌的活性强于氟康唑;抗克鲁斯 (氏) 念珠菌、酿酒酵母的MIC为4 μg·ml-1, 分别是氟康唑的4倍和2倍;抗光滑念珠菌的作用与氟康唑相当;去氧紫草素 (Deoxyshikonin) 抗克柔念珠菌和酿酒酵母菌的MIC分别为4 μg·ml-1和2μg·ml-1, 分别是氟康唑的4倍和3倍;乙酰紫草素 (Acetylshikonin) 和羟基异戊酰紫草素 (β-hydroxyisovaleryl shikonin) 的抗真菌活性低于氟康唑, 抗克柔念珠菌的活性高于氟康唑;对于丝状真菌和皮肤毛孢子菌, 萘醌衍生物的抗真菌作用低于氟康唑。本研究采用NCCLS推荐的M38-A方案, 研究了紫草提取物对18株临床常见真菌的体外药物敏感性。结果表明, 紫草乙醇提取物对临床常见真菌具有抑制作用, 且对念珠菌的抗真菌作用强于皮肤癣菌。
参考文献
[1]国家药典委员会.中国药典:一部.北京社学出版社, 2005:238.
[2]National Committee for Clinical Laboratory Standards.Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of filamentous fungi;Approved Standard (M38-A) .USA, 2002:1～29.
[3]佐佐木健郎.紫草成分的抗真菌活性及其对念珠菌性口腔疾患的改善作用.国外医学.中医中药分册, 2004, 26 (5) :310.
诺氟沙星制剂体外抑菌实验研究 篇10
关键词：诺氟沙星,体外研究,制剂
诺氟沙星是一种氟喹诺酮类抗菌药物, 具广谱抗菌作用, 尤其对需氧革兰阴性杆菌的抗菌活性高, 但由于临床滥用药物等因素的影响, 在临床已分离出耐药菌株, 影响抗菌作用。本研究观察体外诺氟沙星酸性制剂、碱性制剂、长效制剂的抗菌效果, 现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、沙门氏杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、福氏痢疾杆菌、产气荚膜杆菌。试验药物选择诺氟沙星 (由北京京丰制药有限公司提供, 国药准字H11020117) , 分别配置成5mg/ml的酸性制剂 (pH值4.5～4.7) 、碱性制剂 (pH值9.5～10.0) 、长效制剂, 置于100℃流通蒸汽灭菌30min。实验仪器采用超净工作台、恒温培养箱、空气浴振荡器、电热手提式压力蒸汽灭菌器, 培养基采用普通营养肉汤、营养琼脂培养基和血清马丁肉汤。
1.2 方法
1.2.1 配制实验菌株菌液
将链球菌接种于血清马丁肉汤, 其他菌株接种于普通营养肉汤中, 均置于恒温培养箱中, 37℃恒温培养24h, 配制实验菌株菌液浓度稀释为107个/ml。
1.2.2 药物最低抑菌浓度 (MIC) 和最低杀菌浓度 (MBC) 测定方法
药液溶液采用二倍连续稀释法, 取10支13×100mm灭菌试验管, 将配制的实验菌株菌液按1:10000倍稀释, 将第1支灭菌试验管加入稀释后的菌液2.0ml, 另9支灭菌试验管加入稀释后的菌液1.0ml, 将第1支试验管加入诺氟沙星制剂原液0.4ml, 摇匀后取1.0ml混合液, 加入第2支试验管, 并留最后1支试验管, 将其他试验管均按上法稀释, 留置的最后的试验管为生长对照。将所有试验管置入恒温培养箱中, 37℃恒温培养24h, 观察结果。
1.3 观察项目
选择环丙沙星作为参照药物, 观察诺氟沙星3种制剂对8种细菌及耐药金黄色葡萄球菌的抑菌效果 (MIC和MBC) 。
1.4 评定标准
药物最高稀释无细菌繁殖的试验管为MIC, 将无细菌繁殖的试验管接种于营养琼脂培养基中, 置于37℃恒温培养48h, 观察结果。营养琼脂培养基平板中无菌生长, 药物诺氟沙星最少的1支试验管为MBC, 将上述试管置于37℃恒温培养48h, 若无细菌生长为最低浓度。将MIC作为细菌对药物的敏感度。
2 结果
诺氟沙星三种制剂与环丙沙星的抑菌 诺氟沙星碱性制剂和长效制剂抑菌作用相似, 均好于酸性制剂 (见表1) 。
注:MIC=最低抑菌浓度, MBC=最低杀菌浓度
3 讨论
诺氟沙星对变形杆菌、链球菌、绿脓杆菌的抑菌作用较弱;对福氏痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌较为敏感, 提示针对这两种菌株, 采用诺氟沙星抗菌效果较好[1]。三种制剂抑菌作用实验结果显示, 碱性制剂和长效制剂抑菌作用相似, 均好于酸性制剂, 其中酸性制剂对金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌抗菌作用较差, 而碱性制剂和长效制剂对除链球菌外的其他菌株有较好的抗菌作用。在抗感染治疗治疗, 选择碱性诺氟沙星制剂有利于治疗除链球菌外的其他菌株感染[2]。
综上所述, 在临床用药中, 改变诺氟沙星制剂的酸碱度, 可能会产生不同的抗菌疗效, 为此应有意识地改变药物pH值, 提高疗效, 降低耐药性。
参考文献
[1]李国成, 吴德坚, 刘春霞, 等.喹诺酮类抗菌药的应用及其耐药性分析[J].岭南急诊医学杂志, 2011, 4 (25) :263.
体外研究 篇11
【关键词】头孢美唑钠 体外降解 稳定性 研究
【中图分类号】R927 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2015）02-0245-01
头孢美唑钠为第二代半合成头孢菌素类抗生素，与其他头孢菌素类抗生素的主要区别为头孢烯母核的7位α-H被甲氧基取代，可能由于甲氧基的立体阻碍作用，增加了对多种β内酰胺酶的稳定性，故对青霉素类和头孢菌素类抗生素的耐药菌株仍有很强的抗菌活性。此外，对厌氧菌，尤其是脆弱类杆菌的作用较其他头孢菌素类强。临床上主要用于敏感菌引起的败血症、呼吸系统、泌尿生殖系统等的感染性疾病。口服吸收效果很差，故临床使用者均为注射剂型.
一材料与方法
1、材料
高效液相色谱仪、检测器、高效液相色谱仪、梯度泵，G1315A二极管阵列检测器，JJ500型电子天平、AB104N型电子天平、紫外可见分光光度示、头孢美唑钠原料、磷酸二氢铵等。
2、方法
2.1检测波长的选择
精密称取头孢美唑钠原料药适量，按照分光光度法测定，在272 nm处有最大吸收。然而相关文献中的测定波长分别为214、 254和272 nm，因此在这3个波长下分别进行有关物质测定。结果表明，用面积归一化法计算，在254 nm下检出的杂质总量较大，杂质个数最多。同时，采用二极管阵列检测器，对样品进行全波长扫描，三维立体图显示在波长约254 nm处，检出杂质个数最多，即8个。因此选择254 nm作为头孢美唑钠有关物质的检测波长。
2、色谱条件
色谱柱为C18柱，采用等度洗脱，流动相为磷酸二氢铵溶液（取磷酸二氢铵5.75 g加水730 mL溶解，加入40%四丁基氢氧化铵4.8 mL，磷酸调节至pH 6）-四氢呋喃-甲醇（734.8： 10 ： 300 ）；检测波长为254 nm；进样量为20μL ；柱温为25℃；流速为0.8mL/min。
3方法的专属性考察
精密称取头孢美唑钠10 mg，置于10 mL量瓶中，加入流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。按USP 32的方法制备破坏样品溶液：精密称取头孢美唑钠原料药10 mg置于10 mL量瓶中，加入0.01molNaOH溶解并稀釋至刻度，水浴95℃加热10 min，取出待冷却后精密量取0.5 mL置于10 mL量瓶中，加入流动相稀释至刻度，摇匀，既得。USP 32指出该破坏溶液出现的降解产物为头孢美唑内酯。
二结果
1、温度对头孢美唑钠稳定性的影响，温度越高，头孢美唑钠的降解速率越大，推算头孢美唑钠在27℃和18℃时的有效期分别为365.2天和719.5天。
2、光照对头孢美唑钠稳定性的影响，按自身对照法计算光照不同时间降解产生的杂质总量，主要成正比例关系，经过相关实验，可以判断出头孢美唑钠在日照和光照的影响下也符合一级动力学降解过程。
3、湿度对头孢美唑钠稳定性的影响，从结果分析，头孢美唑钠的降解与湿度之间并不是简单的线性关系，而是呈现为二次曲线关系，即湿度越小越好。
4、ph值对头孢美唑钠稳定性的影响，从结果分析，头孢美唑钠在PH5-7之间的溶液中相对稳定。
5、离子强度对头孢美唑钠稳定性的影响，从结果分析，头孢美唑钠的杂质总量随着离子强度的增大而增加。
6、在注射用水0.9%氯化钠注射液和5%葡萄糖注射液中的稳定性，头孢美唑钠在水溶液中不稳定，可能是因为分子结构中的两个酰胺键发生断裂，可能发生的水解反应。
三讨论
该实验主要利用的是HPLC方法，利用该方法对头孢美唑钠进行了有效的测定，并且在此基础上，参考了其他文献，进而使得色谱条件得到了良好的调整，使其更加优化。USP32色谱条件方法与其他类型的色谱条件方法具有一定的差异，这种方法出峰时间要早于其他方法，而且呈现出来的峰值也相对较好，并且拖尾现象得到有效的缓解，这样就使得头孢美唑钠与其降解产物能够非常好的分离，十分快速的计算出结果。USP32方法十分简单，而且结果真实可靠，可行性比较高，将其应用在此研究中十分有效。
通常情况下，温度越高，化学反应的速率也就越大，由此可以判断出，当温度升高时，头孢美唑钠研究样品降解速率也会相应的变大，经过大量实验证明发现，当温度达到30℃，并且样品降解10天之后，降解杂质已经达到了3.46%，要高于标准规定，从这一点可以看出，温度对其降解稳定性有着十分重要的影响。经过大量的计算得出，当温度处于18℃时，头孢美唑钠降解稳定性最佳，而且具有长期有效性，接近于720天，从这个角度来说，在贮存头孢美唑钠相关药剂时，最好放在比较阴凉的空间中。
光照与日照时间对头孢美唑钠颜色有着重要的影响，经过研究发现，光照时间越长，其颜色逐渐偏向黄色，这其中的杂质也就越来越多。当照度达到4000-5000Lx时，头孢美唑钠的降解速率与日常生活中正常的光照相比要快，这与日照光源的复杂性具有一定的关系。尽管灯光不能使其快速降解，并且保持稳定性，但是这样会影响其疗效，所以在日常生活中，还是应该将其放在避光的位置上，防止头孢美唑钠出现不良反应。
湿度与头孢美唑钠的外表颜色也有一定的关系，通常情况下，湿度越大，其颜色也会逐渐的变为黄色，此外，因为放置时间越来越长，头孢美唑钠逐渐的呈现出粘稠的状态，并且以胶状物的情况展现，与此同时，杂质总量也越来越多。但是湿度与其降解之间的关系并不简单，经过研究试验证明，两者之间的关系呈现出二项式曲线的形式，这可能主要是由于头孢美唑钠吸湿发泡液化逐渐变为胶状物有直接的关系。经过验证，这种关系符合理论要求，但是从实验数据上看，差距比较大，再加之，这种理论所使用的方程并具备实质上的物理意义，另外，头孢美唑钠在不断放置阶段，其降解机制也存在着差异，因此无法直接的判定湿度与其降解之间的具体关系，需要相关人员再进行深度的研究。
如果头孢美唑钠处于的是强酸或者强碱性的环境，则其分子结构会发生比较大的变化，按照USP32方法来推测，其降解之后产生的产物最大的可能就是头孢美唑内酯。经过研究发现，内酯结构在其中并不稳定，如果遇到碱性或者酸性环境，其会发生相应的变化，研究实验证明，当头孢美唑钠在酸性或者碱性环境中，其PH值超过5，但是低于9时，其降解程度相比稳定，在本试验中选择的是7，在此基础上，对其进行离子强度研究。
试验研究发现，离子强度与头孢美唑钠降解所产生的杂质量有着重要的关系，通常随着前者的增加，后者也会随之增多，因为头孢美唑钠在水中主要是以阴离子的状态存在，因此可以判断出头孢美唑钠降解与阴离子在其降解过程中产生催化效应有一定的关系。
参考文献
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[3] 仁欠. 头孢美唑钠致牙痛一例报告[J]. 青海医药杂志. 2013（03）
云芝多糖的体外抗微生物活性研究 篇12
1 材料
云芝多糖 (CVP) 、SPF雏鸡和SPF受精蛋 (吉林正业生物制品厂提供) 、新城疫Clone-30弱毒苗和鸡新城疫病毒强毒, 均由吉林正业生物制品厂监察室提供。
2 方法
2.1 云芝多糖的体外抗菌作用研究
2.1.1 云芝多糖的制备
用灭菌纯化水配成0.1%0.5%和1%浓度, 用0.45μm微孔滤膜过滤除菌。
2.1.2菌种
金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门杆菌和绿脓杆菌均由吉林正业生物制品厂提供。先将菌种接种在适宜的培养基内, 37℃培养24h, 使菌种复壮, 将复壮的细菌配成浓度为1×106CFU/mL。
2.1.3 培养基
普通琼脂培养基, 按试验室常规方法制备, 冰箱保存。
2.1.4 操作方法
取内径为90mm的灭菌瓶皿若干依次编号, 然后在超净工作台上往瓶皿中加入溶化的营养琼脂20mL, 待琼脂冷却凝固后向每个瓶皿倒入约5mL细菌悬液混匀。待琼脂表面干燥后, 在每个瓶皿中等距离地放置4只牛津杯, 并在每只杯中用加样器加入相应的多糖溶液0.2mL。最后放在37℃的培养箱中培养24h, 用游标卡尺测量抑菌环的直径, 并评定其抑菌效果。
2.2 云芝多糖的体外抗病毒研究
2.2.1 云芝多糖的制备
用灭菌纯化水将云芝多糖配成浓度用微孔滤膜过滤除菌。
2.2.2 鸡胚及处理
参考王世若等的方法进行。选择健康SPF受精蛋, 在孵化器中37℃、50%湿度下孵育, 翻转鸡胚, 2次/d, 至12天胚龄时取鸡胚, 把新城疫病毒及药物接种到尿囊腔中。
2.2.3 对病毒的直接灭活作用
将不同浓度的多糖溶液与病毒等量混合, 37℃作用2h后接种鸡胚, 接种量为0.2mL/胚。
2.2.4 对病毒的治疗作用
先将病毒以0.1mL/胚的剂量接种至鸡胚内, 4h后再以0.1mL/胚接种多糖液。每个处理均接种3个鸡胚, 37℃孵育3d, 4℃过夜后收获尿囊液进行血凝试验, 测定病毒效价。
2.2.5病毒效价测定及判断方法
在塑料板内用生理盐水将尿囊液按1∶2稀释, 再倍比稀释为1∶4, 1∶8, 1∶16, 1∶32, 1∶64, 1∶128, 1∶256和1∶512共8个浓度梯度。每孔加入0.5%的鸡红细胞悬液, 摇匀, 静置45min后观察, 根据血细胞凝集程度的不同进行判断。以“++”为终点, 即观察到红细胞在孔底形成1个环, 四周有小凝集块, 以此为标准测定血凝滴度。设生理盐水对照组, 各组收取的尿囊液均以血凝效价平均值反映病毒在鸡胚中的增殖情况。
3 结果
3.1 不同浓度云芝多糖对4种细菌的抑菌效果 (见表1)
注:直径>6mm表示圈内无细菌生长, 直径<6mm表示圈内有细菌生长。
由表1可见, 云芝多糖在0.1%浓度下对4种细菌均无抑菌作用, 在0.5%浓度下对大肠杆菌具有一定的抑菌作用, 在1%浓度下对大肠杆菌和沙门杆菌具有一定的抑菌作用。
3.2 云芝多糖的体外抗病毒效果 (见表2)
结果判断:多糖试验组血凝效价比病毒对照组高4倍以上时, 说明多糖对病毒增殖有抑制作用。
注:同行数据肩注字母不同表示差异显著 (P<0.05) 。
从表2可以看出, 接种鸡胚所用的病毒对照组血凝效价为1∶384。多糖试验组血凝效价若低于1∶96表明对病毒增殖有抑制作用, 可见在低浓度 (20mg/mL) 下, 云芝多糖对病毒基本无作用。云芝多糖在500mg/mL时对新城疫病毒有一定的抑制作用, 使血凝效价显著降低。
4 讨论
(1) 云芝多糖对某些细菌确有抑制作用, 这与郭志明、施为红的研究结果一致, 他们发现复方和单方云芝在体外对双歧杆菌有显著而稳定的刺激增生效果, 且对常见致病菌有抑制作用, 但作用效果与云芝多糖的浓度和细菌种类有关。邓文龙等的研究表明, 云芝胞内多糖小鼠腹腔连续注射3～4d可明显增强小鼠对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、宋氏痢疾杆菌及绿脓杆菌感染的非特异抵抗力。关于多糖的抑菌机制, 多数人认为可能与多糖的pH值有关, 云芝多糖呈酸性, 不利于细菌的生长。