体外透皮（共6篇）
体外透皮 篇1
与其他给药方式比较, 透皮给药方式具有应激性小、给药方法简单、药物毒副作用小和避免肝脏对药物的首过效应等优点。影响药物经皮渗透过程的因素较多, 而药物中促渗剂的选择和用量是影响其透皮效果的重要因素之一[1]。氮酮是一种新型的经皮吸收促渗剂, 对亲水、亲油药物都有促进作用, 其性质稳定、无毒、无味、无刺激性, 且促透效果好[2]。为了研究中药透皮软膏中有效成分的透皮效果和确定透皮促渗剂氮酮的最适含量, 试验采用体外透皮法, 以高效液相色谱 (HPLC) 法为定量手段研究了不同含量氮酮对咖啡酸的促渗效果[3], 现报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 药品
咖啡酸标准品 (批号为885-200802) , 由中国药品生物制品检定所提供;甲醇为色谱纯, 其余化学试剂均为分析纯;蒲公英、连翘、黄芩、金银花等中药, 均购于哈尔滨市中药材批发市场。
1.1.2 仪器
Waters高效液相色谱仪、RYJ-6A药物透皮扩散仪等。
1.1.3 动物
昆明系清洁级小白鼠, 购于哈尔滨市兽医研究所小动物室。
1.2 方法
1.2.1 中药透皮软膏的制备
根据奶牛乳房炎的发病机理和中药药理学理论, 筛选蒲公英、连翘、黄芩等10味中药组成复方。采用水提醇沉法结合蒸馏法提取中药有效成分之后, 按照乳膏制剂的常规制备方法分别制成含氮酮0.5%、1%、2%、4%、6%的中药透皮软膏[4]。
1.2.2 离体鼠皮的制备
将小白鼠腹部毛剪短后涂抹20%的硫化钠溶液, 24 h后选取皮肤脱毛干净、充血少、无损伤的小白鼠颈椎脱臼处死, 剥离腹部皮肤, 去净皮下脂肪, 用生理盐水洗净, 备用。
1.2.3 体外透皮试验
RYJ-6A药物透皮扩散仪的扩散池内径为1.8 cm, 接受池为6 mL, 试验温度为 (35±1) ℃, 电磁搅拌速度为100 r/min。扩散池一端用离体鼠皮覆盖, 用缝合线扎紧, 使皮肤角质层朝向释放池, 在5个扩散池内分别加入含氮酮0.5%、1%、2%、4%、6%的中药透皮软膏1 g;接受池内加6 mL生理盐水, 使鼠皮与接受池液面接触;分别于加样后0.5, 1, 2, 4小时取样0.5 mL, 用于测定咖啡酸渗透量;每次取样后补加生理盐水0.5 mL。
1.2.4 咖啡酸透皮量的测定
(1) 色谱条件。
色谱仪为Waters高效液相色谱仪, 515泵;固定相为C18柱 (200 mm×2.1 mm, 5 μm) ;紫外检测波长为323 nm;流动相为甲醇-磷酸盐缓冲溶液 (23∶77) ;柱温为40 ℃。
(2) 标准曲线的绘制。
按常规分析法配制系列咖啡酸标准品溶液, 使每亳升溶液中含咖啡酸6.0, 3.0, 1.5, 1.6, 0.15 μg。精密吸取系列咖啡酸标准品溶液10 μL, 从低浓度到高浓度进行HPLC测定, 每个浓度重复进样3次, 以咖啡酸峰面积的平均值和相应的标准浓度为横坐标、纵坐标作线性回归, 根据相关系数估测咖啡酸的线性范围, 并绘制标准曲线。
(3) 精密度试验。
精密吸取6.0, 3.0, 1.5 μg/mL咖啡酸标准品溶液各10 μL进行HPLC测定, 每个样品重复进样5次。计算相对标准差 (RSD) , 根据RSD评价色谱系统的精密度。
(4) 样品的测定。
样品用0.45 μm微孔滤膜过滤后取10 μL进行HPLC测定, 重复测定3次。由于接受池中连续取样并且每次取样后补加新的生理盐水, 样品测定值较真实值小, 因而应用校正公式计算累积渗透量 (Q) [5]。
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式中:Cn为第n个取样点测得的药物浓度, Ci为第i个取样点测得的药物浓度, V为接受池体积, V0为取样体积。
(5) 样品回收率试验。
精密量取1～5号接受池第4小时时接受液1 mL, 分别加入1 mL标准品母液, 按照 (4) 中的方法测定咖啡酸含量, 计算回收率和RSD。
2 结果与分析
2.1 标准曲线的绘制 (见图1)
以咖啡酸的峰面积与相对应的标准浓度作线性回归并绘制标准曲线, 求得回归方程为y=1.178 9×10-6x-0.001, r=0.996 4。结果表明待测样品中咖啡酸浓度在0.15～6.0 μg/mL范围内, HPLC的测定结果显示呈良好的线性关系, 故该标准曲线可以用于定量。
2.2 精密度试验结果 (见表1)
由表1可知, 仪器精密度良好。
2.3 咖啡酸累计透皮量的测定结果 (见表2)
μg
由表2可知, 中药透皮软膏中的主要有效成分咖啡酸可以透过离体小白鼠的皮肤, 透皮量因氮酮的含量不同而存在差异, 对4小时时接受液中咖啡酸的累计透皮量进行最小二乘法拟合, 以x代表氮酮含量, y代表累计透皮量, 可得出如下回归方程:y=0.382 9+20.735 6x-2.579 0x2, 拟合度r=0.96。经分析当x=4.02%时, y趋于最大。因此, 氮酮在中药透皮软膏中的含量应为4%。
2.4 回收率试验结果 (见表3)
由表3可知, 平均回收率为99.15%, 相对标准差为0.38%, 回收率良好, 表明试验方法可行。
3 讨论与小结
离体鼠皮的质量对透皮吸收试验影响较大, 要求鼠皮无伤痕, 并将皮下结缔组织清除干净, 且应新鲜取用。RYJ-6A药物透皮扩散仪是根据Franz扩散池原理改进的扩散池, 在溶液温度动力学、皮肤温度动力学和溶液混合效应方面有明显改进。接受液接受药物的能力主要与药物的溶解度有关, 咖啡酸是水溶性物质, 因此选用生理盐水作为接受液。
由于中药透皮软膏为中药复方制剂, 成分十分复杂, 很难测定所有成分的透皮量, 因此一般以其中某种有效成分的透皮量作为评价透皮效果的指标[6]。体外透皮试验的关键是确定治疗效果与透皮效果相一致的有效成分。中药复方中蒲公英是主药, 占药物含量的30%, 其主要成分是咖啡酸, 也是蒲公英发挥抗菌、抗炎等药效作用的有效成分, 而且金银花中绿原酸、异绿原酸及连翘中连翘酯苷等在煎煮过程中可水解而产生大量的咖啡酸[7,8,9]。因此, 试验通过测定中药透皮软膏中咖啡酸的体外透皮量来验证中药透皮软膏的透皮效果具有代表意义。
Waters高效液相色谱仪的测定结果表明, 中药透皮软膏中咖啡酸能够渗透过小白鼠皮肤, 但渗透量不随着氮酮含量的增加而增加, 最小二乘法拟合发现氮酮含量在4%时渗透效果最好。氮酮是一种新型、低毒、高效透皮吸收促渗剂, 能促进多种药物的透皮吸收。氮酮可渗入皮肤角质层, 增加角质层的含水量, 使角质层水化胀大、膨松, 细胞间隙扩大, 药物在角质层与基质间的分配系数增大;氮酮对生物膜类脂有特异的溶解和破坏作用, 从而使表皮脂质膜对药物的穿透阻力减少[10]。另外, 许多中药成分都有促进渗透的作用[11]。这些都可能是促进中药透皮软膏中有效成分透皮的因素, 但具体机理还有待进一步研究。
参考文献
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[11]孙虎, 王平, 龚彦胜, 等.中药透皮吸收药理研究进展[J].中国现代中药, 2008, 10 (9) :7-10.
体外透皮 篇2
1 材料与方法
1. 1渗透屏障
雄性wistar大鼠200 ~250 g,8只,2012年3月27日购进,7周龄,由中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所动物实验中心提供。将大鼠麻醉后固定四肢,剪去腹部正中线两侧的鼠毛,再用电动剃须刀剃净绒毛后迅速剥皮,小心剔除皮下脂肪及组织,用滤纸擦拭干净,得离体鼠皮作为渗透屏障,放入冰箱( -20℃) 冷冻保存,共16块。
1. 2 药物和试剂
盐酸小檗碱对照品,购自中国药品生物制品检定所,批号:110713-200911。
金黄膏及缺药膏剂,天津市中医药大学第二附属医院制剂室提供。金黄散全方组组成为大黄160 g、黄柏160 g、姜黄160 g、白芷160 g、天花粉320 g、天南星64 g、陈皮64 g、甘草64 g、苍术64 g、厚朴64 g; 缺药方A组,缺姜黄、白芷; 缺药方B组,缺姜黄、白芷、天南星、陈皮、厚朴。
甲醇、乙腈为色谱纯,购自天津市康科德科技有限公司,磷酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠为分析纯。
1. 3 仪器
TK-12B型透皮扩散试验仪( 上海锴凯科技贸易有限公司) ,SSI PC2000型高效液相色谱仪( 美国科学系统公司) ,EZChrom Elite Client/Server色谱工作站。
1. 4 色谱条件
色谱柱: Apollo C18( 4.6 mm×250 mm,5μm) ,流动相: A相为乙腈,B相为0.1%磷酸水,二元梯度洗脱:0 ~5分钟,20 ~40A;5 ~20分钟,40 ~40A,流速1. 0 ml/min,进样量为20μl,检测波长: 346 nm,柱温:30℃。该色谱条件下,理论板数按盐酸小檗碱峰计算不低于150000。
1. 5 对照品溶液
精密称定盐酸小檗碱,加入容量瓶,用乙腈配制成浓度为0.290 mg/ml的溶液,作为储备液。
1. 6 供试液
由体外透皮试验所得接受液,加入梨形蒸馏瓶,分别于70℃水浴减压浓缩至干,精密吸取1 ml乙腈溶解,0.45μm微孔滤膜,作为供试液。
1. 7 渗透扩散装置及实验方法
将鼠皮从冰箱取出,放至室温,在接收池中放入磁力搅拌子,将鼠皮固定于扩散池与接收池之间,真皮面向接收池。试验时,将精密称量的膏剂涂于处理好的鼠皮角质层,注满接收液( 30%乙醇/磷酸盐缓冲溶液,pH =6.8) ,液面恰与皮肤真皮层接触,排除气泡。开动磁力搅拌器和恒温水浴,磁力搅拌转速设定为400 r/min,水浴温度( 37±0. 5) ℃ ,扩散池容积6 ml,扩散面积为2. 92 cm2。于32小时内的3、5、7、9、24、32小时分段取样,补充相应的空白接受液,根据浓度吸取不同体积注入色谱仪,按照上述色谱条件测定小檗碱含量,
1. 8 主要指标
将金黄散全方组、缺药方A组、缺药方B组药膏分别作透皮吸收试验,所加药膏量根据盐酸小檗碱含量确定,保证其基本一致。按1.7项下方法试验,按下式计算不同膏剂不同时间段盐酸小檗碱的单位面积累积透过量Q。其中Q =( Mn +∑Mp) /A,式中Q为t时刻的累积透过量( μg/cm2) ,Mn为第n个取样点测得的药物透过量( μg) ,∑Mp为之前测得的药物透过量之和( μg) ; A( 2.92 cm2) 为皮肤扩散面积。每组平行做3次,求Q的平均值。
1. 9 统计学方法
用Excel统计数据,以经皮累计渗透量Q对时间t进行回归得线性方程,根据方程求出稳态透皮速率J( μg/cm2·h) 和透皮时滞tlag( 小时) 。
2 结果
三组膏剂不同时刻各自平行做3次测量,检测经皮累计渗透量Q,求平均值,结果见表1。然后以经皮累计渗透量Q对t进行回归得线性方程,根据方程求出稳态透皮速率J( μg/cm2·h) 和透皮时滞tlag( 小时) ,见表2。
通过观察三组膏剂的稳态透皮速率J、透皮时滞tlag、32小时内盐酸小檗碱累积透过量Q/32h,可以看出缺药方A组和缺药方B组的稳态透皮速率、透皮时滞、32小时内小檗碱单位面积累积透过量及透过率都较全方高。金黄散全方组的稳态透皮速率及32小时内盐酸小檗碱累积透过量都低于缺姜黄、白芷的缺药方A组,说明姜黄、白芷对小檗碱的皮肤渗透有抑制作用,缺药方A组和缺药方B组的稳态透皮速率及32小时内盐酸小檗碱累积透过量差别不大,有天南星、陈皮、厚朴的缺药方A组的透皮时滞低于缺药方B组,说明天南星、陈皮、厚朴对小檗碱的皮肤渗透有一定促进作用。
3 讨论
金黄膏中的姜黄,辛、苦,温,归肝、脾经,活血行气,通经止痛可用于治疗气滞血瘀痛症和风湿痹痛,其中姜黄素有抗炎作用,对细菌有抑制作用,为臣药; 白芷,辛,温,归肺、胃、大肠经,解表散寒,祛风止痛,通鼻窍,燥湿止带,消肿排脓,可用于治疗风寒感冒,头痛,牙痛,风湿痹痛,鼻渊,带下症,疮痈肿毒,皮肤风湿瘙痒,为臣药; 天南星,苦、辛、温。归肺、肝、脾经,燥湿化痰,祛风解痉,外敷散结消肿止痛,用于治疗湿痰,寒痰证,风痰眩晕,中风,癫痫,破伤风,痈疽肿毒,蛇虫咬伤; 陈皮,辛、苦,温。归脾、肺经,理气健脾,燥湿化痰,用于治疗脾胃气滞证,呕吐,呃逆,湿痰、寒痰咳嗽,胸痹; 厚朴,苦、辛,温。归脾、胃、肺、大肠经,燥湿消痰,下气除满,用于治疗湿阻中焦,脘腹胀满,食积气滞,腹胀便秘,痰饮喘咳,此三药皆辛苦温,辛以散结,苦以燥湿,温以通滞,共为佐药[3]。
姜黄、白芷对小檗碱皮肤渗透的抑制作用实则说明了此药对对金黄膏发挥疗效起到了促进作用。陈实功的如意金黄散的组成用于阳证、热证疮疡,从组方看辛温的药反而味和量都大。中药讲究君臣佐使,使药作为引经药,使药效直达病所,所以分析辛温的姜黄和白芷这一组药为“如意金黄散”的透皮促渗之药[4]。同时根据四气五味理论,姜黄、白芷同为辛温之品,具发散、行气之功,可散邪于表,给邪出路。
对姜黄、白芷药理作用的研究证明具有镇痛、抗炎的作用[5,6],透皮给药而发挥作用。一般的透皮给药系统,是指药物以一定的速率透过皮肤,经毛细血管吸收进入全身血液循环达到有效浓度,产生疗效,起到全身治疗作用。还有一种情况,有些药物与角质层亲和力大或能与角质层发生特异结合,在皮肤内积聚储存,形成“储库效应”,向皮肤深部扩散的比较缓慢。其药理作用在局部发挥的比较明显,在全身的治疗作用不明显。金黄膏应用于临床多年,对于阳证、热证的治疗效果显著。如果小檗碱也有这种可能性,大部分积聚在皮肤,发挥抑菌消炎作用,一小部分透过皮肤向深部扩散,对全身起到治疗作用,恰好与金黄膏的适应症相吻合。因此,实验说明姜黄、白芷对小檗碱的渗透有抑制作用,正是其“储库效应”和散邪于表,给邪出路的体现。
( 单位: μg/cm2)
天南星、陈皮、厚朴对小檗碱皮肤渗透的促进作用,证实了此药对在金黄膏配伍中,用苦寒之品佐以辛温之药以达到温散走窜的促渗作用。合理的配伍,既能达到治病作用又能渗透入内,从局部影响全身的作用,即整体就是其透皮系统。
摘要：目的 通过进行金黄膏中小檗碱体外透皮吸收实验,探讨金黄膏中不同药对配伍[1]对其透皮效果的影响,进一步探讨其影响机制。方法 采用体外经皮渗透法,使用透皮扩散试验仪,选择大鼠腹部皮肤为渗透屏障,以30%乙醇—磷酸盐缓冲溶液(pH=6.8)作为接受液,用高效液相色谱法测定接受液中小檗碱含量。考察全方药组及缺姜黄、白芷组(缺药方A组)和缺姜黄、白芷、天南星、陈皮、厚朴组(缺药方B组)中小檗碱的透皮特性。结果 (1)缺药方A组和缺药方B组的稳态透皮速率、透皮时滞、32小时内小檗碱单位面积累积透过量都较全方高。(2)金黄散全方组的稳态透皮速率及32小时内盐酸小檗碱累积透过量都低于缺姜黄、白芷的缺药方A组,说明姜黄、白芷对小檗碱的皮肤渗透有抑制作用。(3)有天南星、陈皮、厚朴的缺药方A组的小檗碱透过量高,而透皮时滞低于缺药方B组,说明天南星、陈皮、厚朴对小檗碱的皮肤渗透有促进作用。结论 金黄膏中的姜黄、白芷和天南星、陈皮、厚朴这两组药都对金黄膏发挥疗效起到了促进作用。金黄膏中每组药对都各负其责,又相互协同,合理配伍组成一个整体的透皮系统。
体外透皮 篇3
关键词：浙贝母,生物碱,透皮吸收,氮酮
浙贝母的有效成分为多种生物碱,主要为浙贝母碱(verticine)即浙贝甲素(peimine),其分子式为C27H45NO3,分子量为431.6511;去氢浙贝母碱(verticinone)即浙贝乙素(Peiminine),其分子式为C27H43NO3,分子量为429.635 22。浙贝母虽为地道药材,又是国家批准的止咳化痰保健食品,但直至20世纪90年代,人们才对其药理作用进行了较为深入的研究,与大量的化学工作相比,其给药途径单一。据报道,目前只有口服和注射两种给药途径,因此我们认为今后对浙贝母除了行进一步药理作用研究外,还应探讨浙贝母的给药途径,也是开发浙贝母新制剂、实现浙贝母现代化研究所必需的。透皮给药是药剂学研究的热点之一[1],透皮给药系统是药物通过皮肤吸收的一种方法,可避免口服给药所引起的胃肠道副作用及肝脏的首过效应,能较长时间恒定速率给药及维持有效血药浓度,且使用方便,对不能口服患者提供了方便,也避免注射带来的疼痛,可随时中断给药及缓控释等。其中游离的浙贝生物碱属脂溶性, 尚未见其透皮吸收实验研究报道,故本实验选用常用中药浙贝母为主要研究对象,通过大鼠体外皮肤渗透实验,从而为筛选有效中药以现代透皮给药系统的制备方法研制新型制剂奠定基础。
1 仪器与试药
1.1 仪器
RYJ-6B型药物透皮扩散试验仪、KQ5200DB型数控超声波清洗器、UV-1800(PC) 紫外可见分光光度计、日本岛津AUY120电子天平。
1.2 试剂
邻苯二甲酸氢钾试液(精密称取4.084 4g邻苯二甲酸氢钾溶解,溶于100mL容量瓶[1])、NaOH试液(精密称取0.800 0g NaOH溶解,定溶于100mL容量瓶[2])、pH5缓冲液( 精密吸取[2]NaOH溶液47.2mL与[1]混匀得到pH5的缓冲溶液)、溴麝香草酚蓝试液(精密吸取[2]NaOH溶液2.5mL溶解精密称取的0.030 0g溴麝香草酚蓝,然后定容于100mL容量瓶中,得到溴麝香草酚蓝试液)、氯仿(分析纯)、氮酮、硫化钠、生理盐水、乙醚、乌拉坦、95%乙醇(分析纯)、70%乙醇(分析纯)、浙贝母提取物、贝母素乙标准品(深圳药检所)。
1.3 实验动物
广东医学院实验动物中心提供的大鼠。
2 方法与结果
2.1 方法学评价[2,3]
2.1.1 线性关系、定量限
精密称取贝母素乙2.0mg氯仿超声溶解定容于100mL容量瓶中,精密吸取该溶液1、3、 5、7、9mL,分别置于60mL分液漏斗中,加氯仿8mL,pH5缓冲溶液5mL,溴麝香草酚蓝溶液2mL,剧烈振摇,静置5min;氯仿层经干燥滤纸过滤。以氯仿为空白,在412nm波长处测定吸光度。以吸光度值为纵坐标,浓度为横坐标绘制标准曲线,得回归方程为:Y=18.911X+0.051 5,r=0.999 1,贝母素乙氯仿溶液在2.2μg/mL～12μg/mL范围内具有良好的线性关系(数据见表1,曲线见图1) 。
2.1.2 样品含量的测定
精密称取浙贝母提取物0.10g置100mL具塞三角瓶中用氯仿超声30min溶解,滤过,滤液定容于100mL容量瓶中,精密吸取样品液1mL,分别置于60mL分液漏斗中,加氯仿8mL,pH5缓冲溶液5mL,溴麝香草酚兰溶液2mL,剧烈振摇,静置5min,氯仿层经干燥滤纸过滤,以氯仿为空白,在412nm 波长处测定吸光度。据样品的测定实验生物碱的平均吸光度为0.074,据贝母素乙标准品标准曲线的回归方程:Y=18.911X+0.051 5计算,得X值为0.001 190mg/mL,代入公式:生物碱总含量M=X×V1×100,V1=9mL,计算得M=1.071mg,在样品中的百分含量为1.071%(数据见表2)。
2.1.3 加样回收率试验
精密称取对照品1mL,加至0.05g样品中混匀,按“样品测定”项下操作, 得加样回收率RSD(n=6)。据加样回收实验测定的平均吸光度为0.062 8,根据贝母素乙标准品标准曲线的回归方程:Y=18.911X+0.051 5计算,得到的X值为0.000 597 5mg/mL,代入公式:实验中生物碱总含量:M1=X×V1×100,V1=9mL,计算得M1=0.537 8mg,然后根据在试验中加入样品0.050g,据(2.1.2)其生物碱的百分含量为1.071%,计算加入样品的生物碱量是M20.535 5mg,而加入的1mL标准品生物碱测得量:M3=M1-M2,则M3=0.002 3mg,实际的量M4=0.002 2mg,回收率(%)=M3/M4=104.55%(数据见表3)。
2.2 浙贝母提取物在95%与70%乙醇的最大溶解度[7]
分别称取2.0g、1.8g、1.5g、1.2g、1.0g、0.8g、0.5g浙贝母提取物置50mL具塞三角瓶中用95%的乙醇与70%乙醇超声30min溶解,滤过,定容于10mL的容量瓶中,按“样品测定”项下操作, 得到最大溶解度。据表4,①RSD(%)之间的比较,取样量为1.0g时最小,表明在该量时吸光度最稳定;②取样量-吸光度之间的关系,在1.0g时单位取样量的吸光度最大,表明1.0g在溶剂中的溶解度最大,以上表明,该试验应按1.0g样品溶解10mL溶剂的比例制成供试品,根据贝母素乙标准品标准曲线的回归方程:Y=18.911X+0.051 5,该供试品生物碱的浓度C(70%)=0.075 43mg/mL,C(95%)=0.064 16mg/mL(见表4)。
2.3 供试品溶液的配制[6,7]
分别精密称取浙贝母提取物2.50g 4份,分别用相对应的25mL溶剂置于50mL具塞三角瓶中超声30min溶解;制成供试品分为4组:①70%乙醇饱和药物溶液;②70%乙醇饱和药物溶液加入氮酮至2%;③95%乙醇饱和药物溶液;④95%乙醇饱和药物溶液加氮酮至2%,各浓度为0.1g·mL-1,滤过后取续滤液。
2.4 离体鼠皮的制备与保存[6,7]
将健康大鼠用乙醚熏晕后注射乌拉坦麻醉,用质量分数为8%Na2S溶液褪去其背部的毛,然后用组织剪钝性分离,剪去其背部的皮肤,注意不伤及角质层,用蒸馏水反复冲洗,然后将皮肤平铺于玻璃板上,角质层向下,除尽皮下粘膜及脂肪组织,用蒸馏水、生理盐水反复洗至无白色混浊,浸于生理盐水中,4℃冰箱保存备用,1周内用完。
2.5 透皮吸收试验[6,7]
用滤纸吸干皮肤表面液体,将同一大鼠皮剪成大小适宜的6块,分别固定在透皮吸收实验装置的扩散室与接收室之间,角质层面向扩散室, 在接收室中精密注入生理盐水使取样管液面高出皮肤(注意使接受液与皮肤紧密接触),记录加入的液量及给药面积,在接收池底连有取样管,供取样、补充接受液和排气使用。在扩散室内装入浙贝母供试品[(1)制备 ](与皮肤角质层一侧紧密接触,不留空腔),加样平衡30min 开始计时开启电磁恒温搅拌器,温度(37±2)℃,转速:100r/ min 恒速搅拌,分别于2、4、6、8、10、12h 从接收池取样管定量吸取1mL 接收液,同时补加1mL生理盐水并排尽气泡。以空白皮肤为随行对照(不加药物只用溶剂和附加剂的透皮,其他按供试品的操作),将样品液置分液漏斗中,加溴麝香草酚蓝溶液1mL,邻苯二甲酸氢钾缓冲液(pH 5)5mL,精密加5mL氯仿振摇1min,放置使分层,分取氯仿液,再精密加5mL氯仿振摇2min,放置分层,分取氯仿液,合并两次氯仿液,在410nm波长处测定吸收度。将各时间点的吸光度按EI=Ei+ 1/V∑Ei-1[4]计算累积吸收度,贝母素乙标准品标准曲线的回归方程:Y=18.911X+0.051 5,计算得各时间点的累积浓度,据M=C×V,求得各时间点的M,然后根据M-T方程得到参透速度J,参透系数Ps=J/CC被[2.4]所求,然后求出P(数据见表5、表6、表7、表8)。
3 讨论
3.1 指示剂PH的选择
据文献[9]报道,相同pH值的不同类型的缓冲液对结果无影响,但不同pH对结果影响很大。浙贝母生物碱在pH5缓冲溶液条件下,与染料溴麝香草酚蓝形成黄色离子对,能定量被氯仿提出而使水相无颜色,过终点后染料留在水中使之显黄色而指示终点。本试验选用苯二甲酸氢钾缓冲溶液作为缓冲系,在pH5条件下进行两相滴定。
3.2 透皮试验数据的分析
①经相关系数的显著性检验,t均大于t0.01/2,4=4.604,P<0.01,按α=0.05,浙贝母中的生物碱的有透皮吸收作用,其透过量随时间延长而增加,可知累积透皮量与时间在本实验时间范围内呈正相关,但透皮速率及透过量均有限,其透皮吸收符合零级动力学过程;②根据实验数据可知,不同浓度的乙醇溶剂对浙贝母中的生物碱的溶解度不一样,对其的溶解度70%乙醇大于95%[5],试验[2.2]也有所证实,上述数据显示表明,12h的70%乙醇饱和溶液的累积透过量大于95%乙醇饱和溶液,但t’检验t’
4 结论
体外透皮 篇4
1 材料与仪器
本次研究使用阿西美辛产自石家庄制药一厂, 该药物批号为970523, 药物中ACM含量为99.83%;胆固醇产自Sigma公司;卵磷脂产自日本油脂株式会社;卡波姆产自上海化学试剂采购供应站试剂厂;高效液相色谱仪-紫外检测器产自美国Hewlett1100;JC-3探针式超声处理机产自通化市X超声设备厂;ZFQ85A型旋转蒸发仪产自上海亚荣生化仪器厂;本次研究使用离体鼠皮来着Wistar大鼠, 由我市医科大学试验动物部提供。
2 方法
2.1 阿西美辛脂质体凝胶剂制备方法
将ACM称取剂量为0.2g, 卵磷脂剂量为1.6g, 维生素E30mg还有胆固醇0.16g, 将上述药物放置在500m L的烧瓶当中, 将氯仿剂量为100m L加入到烧瓶当中使之溶解, 在50℃水浴当中然后使用旋转蒸发仪对其进行压制, 该步骤之后可以得到薄膜然后将p H 7.4磷酸盐缓冲液剂量共200m L加入到薄膜当中, 进行超声制作, 等到其完全乳化之后就可以将其制备成为脂质体。在得到的脂质体当中加入以下物质, 剂量为0.4g的山梨酸钾、以及剂量为3g的卡波姆, 将其彻底搅拌均匀之后就能够得到ACM脂质体凝胶。
2.2 离体鼠皮透皮试验
本次试验使用鼠皮来自Wistar大鼠, 该离体鼠皮为该大鼠背部皮肤, 该鼠皮脂肪去除干净之后放置在Franz扩散池当中。在鼠皮的正面皮肤将ACM脂质体凝胶及涂抹上去, 剂量为1.0g, 而该鼠皮的背面皮肤则和接受液进行接触。本次研究接受液为等渗磷酸盐缓冲液, 该缓冲液p H指数为7.4, 有效扩散面积是1.6平方米, 而该体积则为20m L。将接受系统防止在温度为37℃的恒温水浴当中并用电磁进行搅拌工作, 转速参数设置为30r/min。分别在以下时间段进行取样, 在 (2、4、12、24) h, 取样剂量为1m L后将相同体积的接受液补充进去, 在24h之后将实验停止。ACM凝胶剂体外透皮扩散实验步骤与上述相同。
2.3 测定方法
2.3.1 标准曲线制备
将干燥的ACM原料经过精密称取剂量为100mg, 在100m L的容量瓶当中放置, 使用甲醇将其溶解并定容, 最终制成的储备液标准如下:1mg/m L。将以上制得的储备液分别抽取出不同剂量, 防止在100m L的容量瓶当中, 分别为 (0.2、0.8、2.0、4.0、6.0) m L, 加入酸值为7.4的磷酸盐缓冲液然后摇晃均匀, 将其制备成剂量在 (2-100) mg/L的一系列溶液, 对其峰面积使用HPLC方法进行测定, 最终得到标准曲线。
2.3.2 精密度测试
分别选择高浓度、中浓度以及低浓度三个不同级别, 在日内的不同时间段以及不同日期进行测定, 对其日内以及日间的误差进行计算。详情请见表1。
2.3.3 ACM在不同介质中回收率测定
2.3.3. 1 凝胶中与原料ACM对照回收率
将原料ACM进行称取, 共3份, 每份均3mg, 然后放置在100m L的容量瓶中, 根据处方的比例放入基质, 然后加入p H 7.4磷酸盐缓冲液, 根据上述分析取得ACM的峰面积, 代入标准曲线得到回收率。
2.3.3. 2 皮肤对照原料ACM回收率
将原料ACM进行称取, 共3份, 每份均3mg, 然后放置在100m L的容量瓶中, 加入p H7.4磷酸盐缓冲液再使用滤纸将水分吸干并称重。皮肤剪碎、研磨直到变成乳糜状将磷酸盐缓冲液0.2m L, 将ACM样品剂量为1m L放入, 振荡时间10s后将2-二氯乙烷加入进去, 剂量为5m L, 振荡5min后再离心20min, 参数设置为8000r/min, 60℃水浴, 将氮气吹干, 根据标准曲线将浓度回收率计算得出, 结果可见表2。
3 结果
皮肤层以及凝胶层中, 24h之内ACM测定结果见表3。
3 讨论
将ACM制备成为脂质体凝胶剂之后, 对患者进行外部用药, 而这样的外部使用方法能够ACM可能引来的不良反应大幅度降低, 而这样的方法能够使得ACM透皮药量还有皮层当中的滞留量得到极大程度的提升[2], 而药物在局部炎症组织当中的浓度也会有所提高, 另一方面使得皮层里面药物的滞留量有所提高最终达到缓释的效果。不但能够有局部治疗, 且全身治疗的效果也非常突出。有研究对该药物的稳定性进行试验测试, 结果表示这种制剂一般在室温低于60℃且没有强烈阳光的条件在, 能够得到稳定的保存[3]。
参考文献
[1]陈丽佳, 吴伟明.5-氟尿嘧啶脂质体凝胶剂的制备和评价[J].海峡药学, 2011, 25 (11) :128.
[2]张爱军, 闫志勇.辣椒素脂质体凝胶剂的制备与释放度的测定[J].西北药学杂志, 2011, 12 (4) :166.
体外透皮 篇5
1 实验材料与方法
1.1 仪器
岛津LC-20高效液相色谱仪(日本);TK-12A型透皮扩散试验仪,7ml立式玻璃扩散池,接口面积:2.32㎝2(上海凯谐科技贸易有限公司)。
1.2 药品与试剂
蛇床子素(中国药品生物制品鉴定所,批号为110822-200405,);活血止痛贴(自制);氮酮(药用,北京嘉德生化有限公司);甲醇为色谱纯;其他试剂均为分析纯。
1.3 动物
SD大鼠,雄性,许可证号:SCXK(粤)2008-0020,广州中医药大学实验动物中心提供。
2 方法
2.1 蛇床子素分析方法的建立[2]
2.1.1 色谱条件色谱柱为Aichrom Reliasil C18(4.6 mmx250mm,5um);流动相为甲醇:水(80:20);流速为1.0ml/min;检测波长为322nm;进样量为10μl;柱温为室温。
2.1.2 线性范围的考察(1)对照品储备溶液的配制精密称取蛇床子素10.5mg于50ml容量瓶中,加无水乙醇溶解并稀释到刻度,制成每1ml含蛇床子素0.210mg的对照品储备溶液。(2)标准曲线的制备精密吸取蛇床子素对照品储备溶液1ml,用无水乙醇稀释定溶至100ml,精密吸取0.2、0.4、1.0、2.0、3.0、5.0ml,分别用无水乙醇稀释定溶至10ml,精密吸取10μl,按照上述色谱条件进行测定。以蛇床子素的浓度(μg/ml)(X)和相应峰面积积分值(Y)进行线性回归,得到蛇床子素的标准曲线方程为Y=36.618 X-0.6098,R=0.9997,表明蛇床子素浓度在0.42~1.05μg/ml之间线性关系良好。
2.1.3 精密度试验取同一蛇床子素照品溶液,重复进样6次,测定峰面积,蛇床子素的RSD为1.23%,表明精密度良好。
2.1.4 稳定性试验取同一样品液在12小时内,每隔2h进样,测定蛇床子素的峰面积,计算RSD为0.76%,表明供试品溶液在12h内稳定。
2.1.5 回收率试验分别已知浓度的样品液中加入一定量的蛇床子素对照品溶液,以0.45um微孔滤膜滤过,去初滤液,取续滤液,测定峰面积,计算含量和回收率。结果平均回收率为99.8%,RSD为1.66%。
2.2 透皮吸收实验
2.2.1 离体皮肤的制备
取雄性体重180~200g SD大鼠,用8%硫化钠在腹部脱毛,24h后脱颈处死后分别取下腹部皮肤,仔细剥离皮下脂肪组织,并用生理盐水反复冲洗,直至无浑浊为止,实验前自然解冻,一周内进行实验。
2.2.2 透皮吸收装置
透皮吸收扩散装置由上下两只筒状玻璃管对合而成,夹于玻璃管间的皮肤将其分成上下两室。上室为扩散室,下室为接受室,在接受室的底部连有一个取样管,供取样、补充接收液和排除气泡用,扩散室和接受室直径1.8cm,渗透面积为2.32cm2,实验中以潜水式多功能电磁搅拌器维持接受室动态环境,实验维持32℃经皮渗透条件。
2.3 透皮吸收实验设计
将活血止痛贴剂剪成适宜大小的圆形,精密称取重量后,黏贴于预先处理好的大鼠离体皮肤,皮肤与贴剂充分接触,中间无气泡、间隙,固定在扩散池上,使角质层面向供给池,真皮层面向扩散池。接收室中注入30%乙醇生理盐水7ml。保持32±0.5℃恒温水浴,磁力搅拌保持约200r/min,预平衡1h,于不同间隔时间:2、4、6、8、10、12、14h分别取样7ml,每次取样后均补加相同体积的新鲜接收液并排除所有气泡。样液以0.45μm的微孔滤膜过滤,精密吸取续滤液10μl,按上述色谱条件测定扩散液中蛇床子素的含量,按以下公式计算各时间点的单位面积累积透过量(Q,μg/cm2)。
式中,Cn:第n个取样点测得的药物浓度(μg/ml);Ci第i(i≤n-1)个取样点测得的药物浓度(μg/ml);A:有效透皮面积(㎝2)。
3 结果
活血止痛贴体外透皮蛇床子素不同时间点所得的单位面积累积透过量Q,详见表1。
以Q-t进行线性回归,考察所得方程对零级动力学方程的拟合度(r),所得直线的斜率J(μg/cm2/h)即为稳态透皮速率常数,将稳态直线推至时间轴,得渗透时滞Tlag,详见表2,以Q-t作图所得的蛇床子素体外透皮动力学曲线见图1。
从表2和图1可知,蛇床子素的Q-t线性关系良好(r﹥0.99),说明蛇床子素在活血止痛贴中的体外透皮行为符合零级动力学,14h内体外透皮速率接近恒速,为长效的经皮给药制剂。
4 讨论与结论
本实验曾考察20%乙醇/生理盐水、30%乙醇/生理盐水、50%乙醇/生理盐水、p H7.4磷酸盐缓冲液(PBS)、30%乙醇/p H7.4 PBS溶液作接受液,结果研究表明30%乙醇/生理盐水溶解度最好,含量最高,所以选用30%乙醇/生理盐水作为接受液。
大鼠脱毛过程中,要把握好脱毛时间,时间太短了,脱毛不尽,时间太长了,损坏了皮肤;取角质层完好的皮肤,仔细剔除皮下脂肪组织,并尽量选取皮肤大小、厚度相似的皮肤,以减少实验误差;实验过程中每次加样时要排尽接受液与皮肤之间的气泡,减少气泡对有效的透皮面积的影响。
由实验结果可知,蛇床子素的透皮速率常比较小,为0.2832μg/cm2/h,根据Ficks第一扩散定律理论可导出药物的稳态流量J与皮肤中的药物浓度梯呈正比,这可能与制剂中蛇床子素含量比较低有关;而且蛇床子素的滞后时间比较大,达到1.15h。因此,为使制剂中的有效成分更快速地渗透皮肤而被吸收,需要更进一步地考察促渗剂比如氮酮、油酸等对活血止痛贴的体外透皮吸收的影响,以期优选出合适的促渗剂,既提高药物的J,又降低滞后时间,更好地发挥药效。
参考文献
[1]庞允,王云彩.中药经皮给药制剂的研究进展[J].中国药房,2002,13(4):240.
体外透皮 篇6
关键词：雷公藤多甙,纳米乳,透皮,体外释药
雷公藤系卫矛科雷公藤属植物, 最早收载于《神农本草经》, 味苦、辛, 性凉, 大毒, 归肝、肾经, 具有祛风除湿、活血通络、消肿止痛、杀虫解毒等功效[1]。雷公藤多甙 (tripterygium polyglycosides, TG) 是雷公藤的根 (去皮) 经粉碎、提取、精制而成, 难溶于水, 具有显著的抗炎和免疫抑制作用, 临床上主要用于治疗类风湿性关节炎、红斑狼疮、慢性肾炎、皮肤病等[2]。但雷公藤多甙对消化系统、生殖系统、造血系统等有较强的毒性, 极大地限制了其临床应用。纳米乳 (nanoemulsion, NE) 又称微乳 (microemulsion, ME) , 是由水相、油相、表面活性剂和助表面活性剂组成的一种透明、粒径在10～100 nm、热力学及动力学稳定的各向同性体系。纳米乳作为新型的药物载体, 可以增强药物的溶解性, 显著提高药物的生物利用度, 促进药物透皮吸收, 提高药效, 降低毒副作用, 从而扩大临床应用[3]。 研究在制备雷公藤多甙纳米乳透皮制剂的基础上, 对其体外释药性能进行了研究, 这为深入研究该新型纳米制剂的药效学及药动学奠定理论基础。
1 材料
1.1 主要仪器
HC-188透皮扩散仪, 天津市正通科技有限公司;UV1102紫外-可见光分光光度计, 上海天美公司;马尔文激光粒度仪, 英国马尔文公司;JEM-1230电子透射显微镜, 日本日立公司。
1.2 主要试剂
聚氧乙烯蓖麻油 (EL-40, 药用级) 、聚氧乙烯氢化蓖麻油 (RH-40, 药用级) , 德国BASF公司;橄榄油 (药用级) , 德国Degussa公司;石蜡油 (分析纯) , 天津南开化工厂;肉豆蔻酸异丙酯 (IPM, 药用级) , 陕西省医药公司;雷公藤多甙原料药:山东鲁南制药公司;雷公藤多甙片 (TP Tablets, 批号为20060117) , 黄石飞云制药有限公司;3, 5-二硝基苯甲酸 (批号为20051128) , 上海化学试剂采购供应五联化工厂;其他试剂均为分析纯。
2 方法
2.1 雷公藤多甙纳米乳的制备及基本理化性质评价
2.1.1 雷公藤多甙纳米乳的制备
用高效液相色谱仪测定雷公藤多甙在4种油 (IPM、棕榈酸异辛酯、石蜡油、橄榄油) 和3种表面活性剂 (RH-40、EL-40、Tween-80/Span-80) 中的溶解度, 根据纳米乳的评价标准[3], 利用序贯设计思想, 采用滴定法绘制伪三元相图, 确定纳米乳的最佳组成, 制备雷公藤多甙纳米乳。
2.1.2 雷公藤多甙纳米乳的基本理化性质评价
肉眼观察雷公藤多甙纳米乳及空白纳米乳的外观。通过透射电子显微镜观察纳米乳的形态[3], 并用马尔文激光粒度分析仪测定其粒径。
2.2 体外释药检测方法的建立
2.2.1 标准曲线的绘制
精密称取雷公藤多甙原料药50 mg, 用95%乙醇定容至5 mL容量瓶中;精密量取上述储备液, 用95%乙醇溶液配制成浓度为20, 30, 50, 80, 120, 160, 200 μg/mL的溶液;取样品液50 μL, 先后加入95%乙醇180 μL、2%3, 5-二硝基苯甲酸10 μL、5%氢氧化钠乙醇溶液10 μL, 于420 nm处测定其吸光度值。绘制吸光度与浓度的线性曲线[4]。
2.2.2 显色稳定性试验
取浓度水平为50, 100, 120 μg/mL的溶液, 在室温下放置不同时间, 分别测定其吸光度值, 考察此显色反应的稳定性。
2.3 试验皮肤的制备
随机选取青年SD大鼠, 用脱毛剂脱掉腹部毛, 尽量不损伤皮肤;24 h后断颈处死大鼠, 钝性剥离皮肤, 用浸生理盐水的脱脂棉球除去皮下脂肪;用纯化水和生理盐水反复冲洗直至液体无浑浊为止, 即得离体鼠皮, 用之前应浸泡于生理盐水中;于冰箱 (4 ℃) 中保存, 备用, 1周内用完。
2.4 经皮扩散试验
透皮扩散仪:池口有效扩散面积为0.785 cm2, 上下两个半池分别为扩散池和接受池, 接受池的容积为5 mL。在接受池和扩散池中间移入制备好的皮肤, 夹紧后接受池中加入生理盐水, 扩散池中加入待试药液1 mL;然后置于 (37.00±0.03) ℃的循环水浴中, 接受池转子搅拌速度为400 r/min, 加入样品后, 分别于0, 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12小时由取样口取1 mL接受液, 同时补充等体积的生理盐水。将不同时间取出的接受液样品用2.2.1的方法进行吸光度的测定, 代入回归方程。
2.5 试验分组
设置雷公藤多甙纳米乳无氮酮组、2%氮酮组、5%氮酮组、雷公藤多甙原料药混悬液组以及雷公藤多甙片在透析袋中模拟胃环境组, 共5组。
模拟雷公藤多甙片释放介质[5]: (1) 人工胃液。取稀盐酸16.4 mL, 加水约800 mL与胃蛋白酶10 g, 摇匀后加水稀释至1 000 mL。 (2) 人工肠液。取KH2PO4 6.8 g, 加水500 mL使其溶解, 用0.1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8, 取胰酶10 g, 加水使其溶解。 将两液混合, 加水稀释至1 000 mL即得。
2.6 数据处理
透皮吸收试验接受液中雷公藤多甙浓度按方程 (1) 校正。公式:
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式中:C是接受液的校正浓度 (μmol/L) , Cn是第n 个取样点接受液样品的实测浓度 (μg/mL) , ΣCi是第n 个取样点前实测浓度之和, V 是接受室体积 (即5 mL) , V0是每次取样的体积 (即1 mL) 。
体外皮肤渗透速率按Fick’s 扩散方程 (2) 计算。
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式中:Jss是稳态渗透速率[μg/ (cm2·h) ], V是接受室体积 (即5 mL) , A是皮肤有效扩散面积 (即1.0 cm2) , c是接受室的校正浓度 (μg / mL) , t是时间 (h) , dc/dt是接受液浓度与时间曲线的直线部分的斜率[6]。
3 结果与分析
3.1 雷公藤多甙纳米乳的制备及基本理化性质评价
根据溶解度和伪三元相图结果, 最终纳米乳配方确定为RH-40、IPM、水, 重量比为27∶3.3∶69.7。按照确定的空白纳米乳的配方, 在油和表面活性剂的混合体系中加入经过研磨的雷公藤多甙原料药, 制备的雷公藤多甙纳米乳呈棕黄色、澄清透明, 流动性良好。
由透射电子显微镜照片可以看出, 纳米乳粒子大多数呈圆球形, 分散性良好, 见图1。马尔文激光粒度分析仪测定制备的雷公藤多甙纳米乳的平均粒径为23.6 nm, 多分散性系数 (PDI) 为0.124, 说明纳米乳粒径的分布范围比较窄, 粒径比较均匀, 见图2。在离心加速试验、光稳定性试验和温度稳定性试验中, 雷公藤纳米乳均未出现分层、絮凝或药物析出现象, 表明其稳定性良好。
3.2 标准曲线的绘制
经回归得标准曲线方程为y=0.002 9x-0.006 9, R2=0.999 1。在20～200 μg/mL范围内线性关系良好。
3.3 显色稳定性考察 (见表1)
由表1可知, 此显色反应在50 min内稳定。
3.4 药物的透皮性能考察 (见表2和图3)
由表2可知, 在纳米乳配方中无氮酮和含2%氮酮时Jss无显著性差异, 而含5%氮酮时Jss是无氮酮配方的67.77%, 雷公藤多甙原料药混悬液组的Jss是无氮酮配方的21.72%, 雷公藤多甙片组的Jss是无氮酮配方的21.39%。
由图3可知, 纳米乳配方在无氮酮或含2%氮酮时的透皮效果优于含5%氮酮时的透皮效果。雷公藤多甙纳米乳的透皮效果要显著强于雷公藤多甙原料药混悬液的透皮效果以及雷公藤多甙片体外模拟胃环境的释放量。
4 讨论
雷公藤多甙经皮纳米乳促进雷公藤多甙的作用可能与以下两方面因素有关:一是纳米乳本身具有促进药物透皮吸收的特点;二是纳米乳的组成成分有促透作用。将纳米乳作为雷公藤多甙经皮给药载体, 是由于纳米乳比许多常用透皮制剂具有更强的促渗作用。
另外, 雷公藤多甙纳米乳的组成成分中包括IPM。IPM本身是一种常用的渗透促进剂, 其作用机制:IPM穿透进入角质层, 可以破坏脂质排列的密实性而增加其流动性。另外, 还可以起到增溶作用, 影响药物在基质与皮肤间的分配, 从而促进药物的透皮吸收[7]。
试验利用自制的大鼠腹部皮肤在透皮仪上考察了雷公藤多甙纳米乳的透皮性能, 并与雷公藤多甙原料药混悬液的透皮效果及雷公藤多甙片的模拟胃环境的透析效果进行了比较。结果发现, 雷公藤多甙纳米乳 (配方中不含氮酮) 的透皮效果远远优于原料药混悬液的透皮效果和雷公藤多甙片的透析效果, 说明雷公藤多甙纳米乳透皮给药的吸收作用很好。
另外, 还通过透皮试验考察了纳米乳配方中添加氮酮对透皮效果的影响。氮酮 (A zone.1-十二烷基氮杂环庚酮-2) 是从20世纪80年代起被人们关注的透皮吸收促进剂, 现已被广泛使用。它对20多种药物的促进透皮作用已有报道。已证明氮酮对药物的透皮促进作用只有在最佳浓度时才发挥最佳的促进作用。通常氮酮浓度的使用范围为1%～6%, 氮酮浓度过高, 对皮肤的刺激性大而且对药物渗透有抑制作用[8]。在制备纳米乳的过程中, 考虑到氮酮对纳米乳形成的影响, 研究发现在纳米乳的配方中添加浓度小于5%的氮酮对纳米乳的形成无显著影响, 当氮酮的浓度高至10%时, 不能形成纳米乳。体外释药研究结果表明, 当配方中不含氮酮时, 透皮效果与氮酮含量为2%时的透皮效果及稳态渗透速率无显著性差异。而当氮酮含量增加至5%时, 透皮效果急剧下降, 稳态渗透速率降至5%时的24.33 μg/ (cm2·h) , 仅是无氮酮配方的32.23%。
参考文献
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