大鼠子宫蜕膜基质细胞的体外培养试验

大鼠子宫蜕膜基质细胞的体外培养试验（共2篇）

大鼠子宫蜕膜基质细胞的体外培养试验 篇1

人绒毛外细胞滋养层细胞与蜕膜基质细胞共培养模型的建立

目的模拟体内环境,建立可保持绒毛外细胞滋养层细胞(EVCT)与蜕膜基质细胞(DSC)生物学特性的共培养细胞模型,应用于研究滋养细胞的侵袭行为.方法利用胰酶消化和BSA、Percoll梯度沉降,收集纯化人早孕绒毛组织的EVCT和DSC,分别放入Transwell的上下小室,观察该模型下细胞形态变化及侵袭特性,免疫组化、免疫荧光染色检测细胞的纯度.结果免疫组化显示EVCT的细胞角蛋白7阳性表达的细胞数占95%以上,阳性表达转化生长因子β2的细胞数占95%以上,DSC泌乳素阳性表达的.细胞数也超过95%,证实共培养系统中EVCT和DSC纯度均在95%以上,且生物学特性得以维持.上室中的EVCT保持了其侵袭能力,在Matrigel包被的滤膜上EVCT的侵袭指数为3.22±0.04.结论适当的培养方法可获得高纯度的EVCT和DSC,并使其维持特有的生物学活性,成功地建立了共培养系统模型,便于研究滋养细胞侵袭和胚胎着床的机制.

作 者：秦立S 陈士岭 张曦倩 王炎秋 QIN Li-yun CHEN Shi-ling ZHANG Xi-qian WANG Yan-qiu 作者单位：南方医科大学南方医院妇产科生殖医学中心,广东,广州,510515刊 名：南方医科大学学报 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF SOUTHERN MEDICAL UNIVERSITY年，卷(期)：200626(7)分类号：Q492.5关键词：绒毛外细胞滋养层细胞 蜕膜基质细胞 共培养 侵袭 Transwell

大鼠子宫蜕膜基质细胞的体外培养试验 篇2

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

清洁级1月龄SD (Sprague-Dawley) 雄性大鼠, 体重60～80克 (由兰州大学医学实验中心提供) 。

1.1.2 主要试剂

达氏修正依氏培养基 (Dulbecco’S modified Eagle’S Medium, DMEM, Gibco公司) , Ⅱ型胶原酶 (Collagenase typeⅡ, Sigma公司) , 胰蛋白酶 (上海细胞生物学研究所) , 胎牛血清 (杭州四季青生物制剂公司) , 抗-Fas抗体 (e Bioscience公司) , 血管内皮细胞生长因子 (VEGF, eBioscience公司) , 氯胺-T试剂盒 (南京建成生物制剂公司) , 二甲基亚甲蓝 (DMB, Sigma公司) 。

1.1.3 主要仪器

超净工作台 (上海市净化设备厂) , 细胞培养箱 (Heraeus公司) , 倒置相差显微镜 (Olympus公司) , 721分光光度仪 (Reder公司) , 流式细胞仪 (Beckman公司) 。

1.2 实验方法

1.2.1 建立大鼠椎间盘细胞培养体系及分组

清洁级1月龄SD雄性大鼠, 氯胺酮腹腔注射过度麻醉致死;取出整个腰椎, 沿上下椎骨缘取下椎间盘。Hanks液清洗椎间盘纤维环组织3次, 剪碎至1mm×1mm×1mm大小, 加0.25%的胰蛋白酶溶液, 37℃下搅拌消化15min;置离心机内, 离心 (1 000r/min, 5min) , 去上清液;加入0.02%Ⅱ型胶原酶, 37℃下搅拌消化2h;然后200目滤网过滤, 离心 (1 000r/min, 5min) , 去除上清液;加入含20%胎牛血清的培养液清洗, 离心 (1 000r/min, 5min) ;去除上清液, 重复3次;吹打细胞, 镜下记数, 按2×104/ml密度种植于底面积为25mm×25mm的培养瓶中, 加入适量含20%胎牛血清的DMEM培养液;将培养瓶置于CO2浓度为5%的37℃细胞培养箱中培养, 用倒置相差显微镜观察细胞贴壁及生长情况。每2～3d更换培养液。原代细胞形成单层后, 进行传代。将Ⅱ代细胞以2×104/ml密度接种于六孔培养板内, 细胞贴壁融合生长至80%后, 换无血清培养液, 继续孵育24h, 去上清液, 加入含1%胎牛血清DMEM配制的抗-Fas抗体 (浓度为0.25μg/ml) , 继续培养12 h后, 去上清液, 每6孔为一组, 对照组加入含1%胎牛血清DMEM, 各实验组分别加入含1%胎牛血清DMEM配制的不同浓度 (10, 100, 1 000μg/L) 的VEGF, 再孵育48h, 然后收集细胞进行观察。

1.2.2 透射电镜观察细胞超微结构

将细胞刮下, 离心 (3 000r/min, 10min) , 倾去上清液, 用琼脂预包埋法制样, 2.5%戊二醛前固定, 2%锇酸后固定, 按常规漂洗、脱水、渗透、环氧树脂包埋、超薄切片、铅盐染色, 使用透射电镜观察细胞超微结构。

1.2.3 流式细胞仪-PI标记法检测细胞凋亡率

使用胰酶消化各组细胞, 离心 (1 000 r/min, 5 min) , 洗涤, 加入1ml PBS, 吹打;加入-4℃无水乙醇1ml, 用流式细胞仪检测细胞凋亡的百分率, 组间进行比较。

1.2.4 氯胺T法检测羟脯氨酸含量

根据羟脯氨酸在氧化剂作用下所产生的氧化产物与二甲氨基苯甲醛反应呈现紫红色的深浅来检测羟脯氨酸含量。取培养上清液0.5 ml, 按说明书操作, 结果以μg/L表示。

1.2.5 DMB比色法检测蛋白多糖含量

将细胞培养液移入5ml试管中, 每孔分别加入DMB溶液 (32mg/L) 1 ml, 反应5min后, 以525 nm波长于分光光度仪上比色, 读取光密度值。分别取1ml不同质量浓度 (5～30μg/L) 的硫酸软骨素标准溶液, 加入1ml二甲基亚蓝 (DMB) 显色剂, 混匀, 反应5min后, 于525 nm波长处比色, 测定吸光度, 做出蛋白多糖含量标准曲线。将待测的光密度值与标准曲线对比, 即可求出蛋白多糖含量。

1.3 统计学分析

数据以表示, 采用SPSS 10.0统计软件对各组间细胞凋亡率、基质含量进行t检验;对不同浓度血管内皮细胞生长因子组间基质含量进行单因素方差分析;对不同浓度血管内皮细胞生长因子及基质含量进行Spearman相关分析, P<0.01为有显著性差异。

2 结果

2.1 椎间盘细胞形态学观察

在倒置相差显微镜下连续观察, 正常大鼠椎间盘细胞72h后95%以上的细胞贴壁, 可清晰分辨出以下2种细胞:呈梭形或多角形的软骨细胞或软骨样细胞, 胞质内见分泌颗粒, 胞核圆或椭圆;呈梭形或多角形、核圆的纤维样细胞, 排列规则, 生长良好 (见图1-A) 。诱导凋亡组细胞生长缓慢, 形态不规则, 胞核固缩, 空泡形成 (见图1-B) 。与正常组比较, VEGF (100μg/L) 组椎间盘细胞生长较快, 形态介于正常组与诱导凋亡组之间 (见图1-C) 。

2.2 透射电镜观察

正常大鼠椎间盘细胞外形规则, 核膜完整, 染色质均匀, 细胞器清晰可辨 (见图2-A) 。诱导凋亡组细胞外形不规则, 核膜皱缩、内陷, 染色质离散且靠近核膜, 核内出现透明区;细胞质浓缩, 细胞器少且不可辨认, 并有较多空泡结构, 凋亡小体形成 (见图2-B) 。

2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡情况

不同浓度VEGF (10, 100, l 000μg/L) 椎间盘细胞凋亡率分别为 (87.62±11.06) %、 (53.30±9.23) %, (16.75±4.21) %, 与正常组 (96.47±12.44) %比较均有显著性差异 (P<0.01) ;说明10, 100, 1 000μg/LVEGF可抑制椎间盘细胞凋亡。

2.4 细胞培养液中羟脯氨酸和蛋白多糖的含量

将体积分数为0.01的胎牛血清作为对照组, 方差分析检验, 不同浓度VEGF组硫酸软骨素含量、羟脯氨酸含量与对照组比较有显著性差异 (P<0.01) 。随着VEGF浓度的增加, 羟脯氨酸、蛋白多糖含量含量明显增加, VEGF与两者呈正相关 (ra=0.972, P<0.01;rb=0.907 P<0.01) (见表1) 。

注:与对照组比较, *P<0.01

3 讨论

自1991年, Tompson[2]用细胞培养的方法观察一些细胞因子对椎间盘细胞增殖和对细胞外基质代谢的影响, 从而把细胞因子的研究扩展到椎间盘领域以来, 随着分子生物学的不断发展和国内外众多学者的多年努力, 现已认识到细胞因子在椎间盘退变过程中起着重要作用。这为临床进一步治疗腰椎间盘突出症提供了新途径。

血管内皮细胞生长因子 (VEGF) 是一高度特异的血管内皮细胞有丝分裂素, 具有双重功能, 既增加微血管通透性, 促进血浆纤维蛋白外渗, 为血管形成过程中多种细胞迁移提供一个纤维网络, 又通过与内皮细胞上2个特殊受体flt和flk/KDR结合, 直接刺激内皮细胞的分裂、游走和增殖, 从而促进血管形成[3]。

腰椎间盘退行性变是腰椎间盘突出症的主要要诱因。Ariga K等[4]的研究认为, 细胞凋亡的增加是椎间盘退变发生和发展的重要因素。Kohyama等[5]报道突出椎间盘组织中, 细胞凋亡率高达61.3±24.5%[正常 (15.5±6.8) %]。金明熙等[6]研究表明, 在退变椎间盘组织中, Fas Apo-1蛋白的高表达, 可能介导了椎间盘细胞的超常细胞凋亡;Park等[7]使用免疫组化的方法对突出腰椎间盘组织表达FasL的细胞进行了研究, 结果提示Fas-FasL体系是突出椎间盘组织细胞凋亡的一个因素, 椎间盘突出后, 椎间盘组织细胞通过自分泌和旁分泌FasL的机制导致细胞凋亡。本实验应用抗-Fas抗体诱导体外培养的大鼠椎间盘细胞凋亡, 建立退变椎间盘细胞模型, 以不同浓度血管内皮细胞生长因子对大鼠椎间盘细胞凋亡的影响进行研究, 通过形态学观察和细胞凋亡率的检测, 结果证明血管内皮细胞生长因子可以抑制体外培养的大鼠椎间盘细胞凋亡。

椎间盘由细胞和细胞外基质 (extracellular matrix, ECM) 组成, ECM主要由胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白多糖和糖蛋白等不溶性结构成分以及一些与基质代谢相关的蛋白酶和细胞因子组成, 胶原和蛋白多糖 (proteoglycan, PG) 是细胞外基质的主要组成成分。当椎间盘发生退变时, Ⅰ型胶原的含量逐渐增加, Ⅱ型胶原的含量减少[8]。构成椎间盘的蛋白多糖含量随年龄增长而逐渐减少, 其涵水能力下降, 椎间盘高度和负重能力发生改变, 影响了椎间盘的生物力学功能, 蛋白多糖的减少与椎间盘的退变程度呈正比[9,10]。蛋白多糖含量和成分改变被认为是椎间盘退变最早出现的生化改变之一, 并可直接导致椎间盘生物力学性能的改变。VEGF是中胚层组织的有丝分裂源, 在软骨组织中其细胞增殖活性明显强于细胞外基质合成活性, 能够维持细胞表型、提高35S-硫酸盐结合率[11], 有促进软骨细胞合成Ⅱ型胶原的作用。Lettice等[12]将木瓜凝乳蛋白酶注射到成年犬椎间盘内, 制作椎盘退变模型, 然后使用皮下埋植泵注入FGF和EGF, 12周后与注射生理盐水组相比, 实验组椎间盘高度和大体形态有不同程度的恢复, 蛋白多糖含量增加, 通过DNA含量测定发现细胞成分有大量增殖。因此认为活体中损伤的椎间盘能够对一些生长因子发生反应, 发生明显的椎间盘退变的逆转。本实验中, 随着VEGF浓度的增加, 细胞培养液中羟脯氨酸、蛋白多糖含量含量明显增加, 证实了VEGF可以促进椎间盘细胞基质中胶原及蛋白多糖的合成。

VEGF是一种重要的生长因子, 可以抑制体外培养的椎间盘细胞凋亡, 对椎间盘细胞基质中胶原及蛋白多糖的合成具有促进作用。此外, VEGF具有很强的成血管性, 可诱导血管内皮细胞分裂, 形成毛细血管, 正是由于VEGF的这种成血管特性, 近来它又被认为可能与突出椎间盘组织的自发性重吸收有关[13]。如何利用VEGF防治椎间盘退行性病变有待于进一步研究。