子宫内膜癌干细胞研究

子宫内膜癌干细胞研究（精选10篇）

子宫内膜癌干细胞研究 篇1

子宫内膜癌已成为欧美等发达国家威胁女性生殖健康的首位恶性肿瘤[1],且发病率和死亡率呈逐年上升的趋势。能降低子宫内膜癌的发病率和死亡率的有效方法是 对子宫内 膜癌进行 早期筛查 和诊断。 国内外多个研究证实子宫内膜细胞学检查(ECT)可能成为高危因素人群子宫内膜癌早期筛查和诊断的可行方法[2]。ECT检查获取子宫内膜细胞标本制备成细胞涂片,镜下观察细胞形态学的特点进行分级评价。一直以来,细胞涂片阅片困难是制约ECT检查临床广泛应用的主要原因之一[2]。细胞块技术作为细胞学的重要辅助方法,常用于细针穿刺细胞学、胸腹水细胞学及宫颈液基细胞学的辅助诊断,收集液基细胞学剩余标本制备成细胞块能提供更多的诊断信息,提高液基细胞学诊断准确性[3,4]。随着ECT检查的临床推广,收集液基细胞学剩余标本制备成高质量的细胞块,对提高子宫内膜癌的早期筛查和诊断具有重要意义。现就子宫内膜细胞块制备、细胞块优缺点和诊断局限性、液基细胞学和细胞块联合用于子宫内膜癌筛查和早期诊断中的作用进行讨论。

1子宫内膜细胞块制备

制备高质量蜡 块是进行 准确诊断 的基本前 提。 由于细胞学获取的标本量较少且多为脱落细胞,细胞块制备的主要过程是充分离心标本使其聚集,固定后常规脱水,透明,浸蜡,包埋后切 片行HE染色后观 察。传统细胞块制备主要有直接离心法,试管包埋法以及细胞骨架介质包埋法等。细胞骨架介质有琼脂、 凝血酶、蛋清、细胞胶等[5,6]。

子宫内膜上皮由腺体和间质组成,腺体形态和腺体与间质之间的比例是组织病理学中子宫内膜病变的重要诊断 依据,因此制备 高质量的 子宫内膜 细胞块,关键在于保证离心过程中的速度和离心力不能破坏子宫内膜腺 体形态,还要使破 碎的组织 聚集在一 起,便于阅片观察。通过比较直接离心法、琼脂细胞块和凝血酶细 胞块法,以预凝固 蛋清制备 细胞块最 优。预凝固蛋清沉淀法改进了传统的蛋清细胞块制备法,主要体现在两点:蛋清经0.9%氯化钠液稀释, 预先用70%~80%乙醇凝固,蛋清浓度适宜,乙醇、二甲苯等物质容易穿透;两步离心使子宫内膜标本与蛋清分层,立埋后切片有助于阅片,特别是分层沉淀减少蛋清造成的免疫组织化学背景中非特异性染色。

2子宫内膜细胞块的优点和局限性

2.1子宫内膜细胞块的优点子宫内膜细胞块最显著的优点在于提高液基细胞学的诊断准确性[7]。杨曦等[8]报道,联合3家医院单独使用ECT评估子宫内膜癌及癌前病变的准确性为88.2%,敏感度(Se)为87.3%,特异度(Sp)为88.3%,阳性预测值(PPV)为41.9%,阴性预测值 (NPV)为98.6%。Manini等[9]结合了子宫内膜液基细胞学涂片形态学和剩余标本细胞块中的微组织结构进行评价,其结果与组织病理学相比诊断符合率为93%,诊断不典型增生和子宫内膜癌Se和Sp分别为87%和96%,PPV和NPV分别为92%和90%。Kyroudi等[10]将液基细胞学剩余标本经反向滤过沉淀后制备成细胞块,将良性或萎缩性子宫内膜和 子宫内膜 癌的诊断 准确性分 别提高到96.3%和100%,子宫内膜增生不伴不典型增生和子宫内膜不典型增生的准确性分别提高到96%和95.3%。

无论是子宫内膜还是其他标本细胞免疫组化并未广泛开展,是因为液 基细胞学 提供的涂 片比较有 限,涂片不易长期保存,细胞组化技术不稳定、标本易脱片、不易判读等不利因素难以解决。细胞块经石蜡包埋后类似组织块,可以连续切片永久性保存标本, 为后续的分子 生物学检 查如免疫 组化染色、提取DNA测序、激光捕获 显微切割 等提供足 量的标本。 Di Lorito等[11]研究提取了细胞学与剩余细胞块标本中的DNA进行测序,证实细胞学标本与剩余细胞块中PI3K突变是一致的。

2.2子宫内膜细胞块的局限性子宫内膜细胞块依然还存在一些局限性,首先其收集的是液基细胞学剩余标本,因此标本量少,特别是绝经后女性体内雌激素下降使子宫内膜变薄,获取的标本往往仅能满足液基细胞学制片。由于卵巢去势,子宫内膜失去激素作用,细胞萎缩变小、间质纤维化,液基细胞学涂片中观察的子宫内膜细胞形态单一,如果发生异型性其形态学表现明显,此时即使细胞块制备不成功,液基细胞学涂片即可满足诊断需要;其次相较于液基细胞学制片,子宫内膜细胞 块的制备 过程繁琐,经历脱水、透明、浸蜡等步骤容易造成细胞的丢失。目前,自动化的细胞块制备设备已用于宫颈细胞学,因此,在不久的将来,繁琐的制备过程也可能得到解决。

3液基细胞学和细胞块联合用于子宫内膜癌筛查和早期诊断中的作用

3.1子宫内膜细胞块标本评估与诊断分级在对子宫内膜状态进行正确诊断之前,首先要对细胞块标本中的标本量进行评估。充足的标本量是获得正确诊断的必要前提。细胞块中的标本量与门诊子宫内膜活检术获取的标本量一样比较少,甚至没有子宫内膜组织。研究证实通过对绝经后女性活检标本的评估发现,B超检查提示子宫内膜无局限性病变时,标本中细胞量少是正常的,且漏诊子宫内膜相关病变的机会也很低,这样的观点同样也适用于对细胞块标本量的评估中[12]。

由于子宫内膜细胞块中标本量的局限性,对子宫内膜病变的诊断应更谨慎,采用的术语依然仅分为四级:正常子宫内膜、子宫内膜良性增生、子宫内膜不典型增生和可疑癌,采用的诊断标准参考子宫内膜组织病理学。正常子宫内膜中包括增殖期、分泌期、萎缩状态和月经期,如果细胞块标本量充分,可以根据各期的腺体中上皮细胞形态和间质细胞特点,进行准确地分期。细胞块比液基细胞学可以更容易诊断子宫内膜良性增生中不规则增生、单纯性和复杂性增生, 主要根据细胞块中腺体的形态和腺体与间质比例来诊断。细胞块结合液基细胞学诊断子宫内膜不典型增生和子宫内膜癌可以有效地互补,液基细胞学可以更清楚地显示细胞异型性,细胞块可以提供腺体异型性的表现。

3.2子宫内膜细胞块诊断子宫内膜癌的优越性子宫内膜细胞块可以明显提高液基细胞学中子宫内膜不典型增生和子宫内膜癌的诊断准确度和敏感度,主要表现在两点,其一,细胞块可以用于鉴别液基细胞学中子宫内膜嗜酸性化生和乳头状化生与子宫内膜不典型增生和子宫内膜癌中异型细胞群落;其二,细胞块可以用于鉴别液基细胞学中子宫内膜良性增生和高分化子宫内膜癌。

3.2.1鉴别化生与异型细胞群落一直以来,子宫内膜生理多态性是导致ECT判读困难的主要原因。 子宫内膜化生特征性改变是细胞排列异常和细胞浆改变,细胞不出现异型性,化生可出现在子宫内膜良性增生、功能失调性出血、子宫内膜不典型增生和子宫内膜癌等病变中。液基细胞学涂片中,子宫内膜化生和子宫内膜癌均表现为细胞失去规则的排列,细胞重叠使染色加深,难以观察到细胞形态从而不易判断细胞异型性(见图1A、1B)。制备成细胞块后,子宫内膜化生特别是乳头状化生和嗜酸性化生的形态显而易见(见图1C),与异型细胞鉴别,有助于子宫内膜良性增生与不典型增生和癌的诊断。

3.2.2鉴别良性增生与高分化子宫内膜癌将子宫内膜组织病理学诊断标准应用于细胞块时,细胞块比液基细胞学在鉴别子宫内膜良性增生与不典型增生和Ⅰ型高分化子宫内膜癌的诊断中显示出更明显的优越性。在子宫内膜细胞学中,细胞群落被认为间接反映了腺体的结构,Norimatsu等[13]提出将细胞群落形态特点纳入子宫内膜细胞学诊断标准中,结合细胞异型性可以提高诊断准确性。子宫内膜不典型增生标本中细胞群 落改变和 细胞异型 性不明显 时 (见图2A、2B)难以与子宫内膜良性增生鉴别。因为细胞群落可以是整个腺体,也可能来自腺体的一部分。细胞块保存了腺体的完整形态,能清晰地见到腺体之间及与间质细胞关系和比例,通过对比腺体间的上皮细胞异型性(见图2C)来综合判断。

液基细胞学早期筛查出子宫内膜癌时,除了观察细胞块中腺体和细胞异型性给出更准确的诊断。细胞块行免疫组化染色有助于肿瘤的分类,早期子宫内膜癌的组织学分型,预测恶性肿瘤的预后,为临床早期制定综合的治疗方案提供可靠依据。在子宫内膜癌病例细胞块标本中行P53、PTEN和Ki-67免疫组化染色均取得了良好效果。

综上所述,细胞块在子宫内膜癌筛查和早期诊断中的作用是在液基细胞学与组织病理学之间架起一座桥梁。液基细胞学制备效率高,阴性预测值较好, 液基细胞学涂片用于大规模高危人群的初筛后,收集阳性病例的标本制备成细胞块,可以提高高危因素人群子宫内膜癌的早期诊断和筛查效率。细胞块行免疫组化染色有助于子宫内膜癌的早期诊断和预后判断,为子宫内膜癌患者制定合理的治疗方案提供早期依据。

子宫内膜癌重在预防 篇2

子宫内膜癌的病因尚不明确，其发病的高危因素主要有：

一是与雌激素的长期刺激有关，如不孕、多囊卵巢综合征、卵巢肿瘤等，因体内雌激素水平高，容易患此病。二是与患代谢紊乱性疾病有关，如过度肥胖、高血压病、糖尿病患者子宫内膜癌明显高发。三是与遗传因素有关，约20％子宫内膜癌患者，其近亲有家族肿瘤史。

子宫内膜癌常见的症状是不规则阴道流血或少量阴道分泌物，可伴有疼痛和一种收缩的感觉，最常见的是围绝经期的不规则阴道流血和绝经后的阴道流血；晚期可因癌浸润而引起腹部、腰骶部甚至下肢疼痛；合并感染时可出现阴道排出脓性分泌物，也可伴有贫血、恶病质等全身症状。因此，当出现阴道不规则出血和分泌物时，尤其是绝经后的出血，应提高警惕。

子宫内膜癌的防治关键在于早期发现、早期治疗。对于老年妇女不规则阴道出血或绝经后阴道出血，需到医院做必要的检查，可早期发现子宫内膜癌或癌前病变。一旦发现应及时治疗，治愈率高。

及早预防子宫内膜癌要注意以下几点：

（1） 切莫滥用雌激素，否则不仅不能治病，反而埋下了病因；

（2） 要保持良好的生活习惯，饮食要注意低胆固醇，要保持正常体重；

（3） 重视围绝经期的月经改变，绝经后阴道出血、排液，立刻就医莫迟疑；

子宫内膜癌干细胞研究 篇3

关键词：子宫内膜癌,腹腔细胞学,临床价值

当前临床上治疗子宫内膜癌的方法有好几种[1], 但全面的分期手术治疗为第一位, 手术后根据病理结果再给予相对应的治疗。腹腔细胞学阳性的子宫内膜癌患者的临床意义, 学者们意见还不能完全统一起来。本次回顾性分析研究在我院肿瘤科2007年1月至2008年1月住院的158例子宫内膜癌患者手术治疗的临床病理资料, 研究分析腹腔细胞学阳性的子宫内膜癌患者临床意义和此阳性结果对疾病的预后的影响。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集我院肿瘤科2007年1月至2008年1月住院的158例子宫内膜癌患者手术治疗的临床病理资料, 年龄30～75岁, 均数为32岁, 根据2009年国际妇产科联盟提出的分期标准[2]并结合我院实际对158例患者由重到轻重新进行分期, Ⅳ期10例 (6.3%) 、Ⅲ期22例 (13.9%) , 其中Ⅲa期9例, Ⅲb期1例、Ⅲc期12例, Ⅱ期10例 (6.%) , I期116例 (73.4%) , I a期103例、I b期13例。浸润肌层深度:浸润肌层深度小于一半的患者100例 (63.3%) , 浸润肌层深度大于一半的患者28例 (17.7%) , 浸润肌层深度达全层的患者6例 (3.8%) , 无肌层浸润24例 (15.2%) .被研究的全部患者中, 46例 (14.6%) 有脉管浸润的23例, 占总例数的14.6。

1.2 方法

158例患者手术中抽取腹水或腹腔冲洗液细胞学检查。具体操作如下:手术打开腹腔后有腹水的随即抽取;腹腔没有腹水的患者, 就用生理盐水冲洗盆腹腔后在子宫直肠凹处抽出冲洗液送细胞学检查。经涂片、染色等处理后, 通过有经验的医师镜下观察恶性肿瘤细胞存在者就可定为腹腔细胞学阳性。

1.3 随访

平均对患者的随访时间3年失访的7例, 随访率为95.6%。151例随访期内, 无瘤生存的患者138例, 138例中包括有中间复发经治疗后又缓解的患者, 带瘤生存的5例, 患者死亡的8例。

1.4 统计学方法

采用SPSS 11.5软件, 采用相关分析法进行统计学分析。

2 结果

2.1 腹腔细胞学阳性相关的因素

腹腔液细胞学阳性患者15例, 所占比例为9.5%。腹腔液细胞学阳性与临床病理指标观察, 手术病理分期、脉管浸润、浸肌层深度、子宫外转移等危险因素, 这些都与腹腔液细胞学阳性有关, P<0.05 (除外淋巴结转移P>0.05) 而淋巴结转移与腹腔细胞学阳性无多大相关性, 具体见表1。

3 讨论

过去曾有过腹腔细胞学阳性率在子宫内膜癌中不超11%的报道[3]。本次本院所选患者中阳性率为9.5%, 与过去曾有的报道数字相近。腹腔细胞学阳性与子宫内高危因素的关系:许多学者对于腹腔细胞学阳性与子宫内高危因素间的关系有过不同的报道[4]。本次通过158例患者所得结果显示, 腹腔细胞学阳性与手术病理分期、脉管浸润、浸润肌层深度相关性明显 (P<0.05) 。因此, 子宫内膜癌患者手术有高危因素的, 细胞学检查在手术中就显得尤为重要, 可以减少已发生的盆腹腔播散。

腹腔细胞学阳性同发生子宫外转移之间的有密不可分的关系:这就提醒我们临床如果出现手术中查腹腔细胞学阳性, 那么就有很大的可能患者已存在子宫外转移了。在选择治疗方案时对于这样有可能子宫外转移者就要再次行全面的分期手术。腹腔细胞学阳性与预后的关系:腹腔细胞学阳性对于子宫内膜癌患者是不是预后独立的因素结论众说不一[5]。本次子宫外转移危险冈素从我们研究的病例表明, 同预后相关性明显的有腹腔细胞学阳性、肌层浸润深度、手术病理分期和脉管浸润。

腹腔细胞学阳性同宫外转移危险冈素、子宫内多个高危因素相关联, 而且还能通过以上的高危因素影响患者的预后。因此, 虽然腹腔细胞学阳性不再作为2009年国际妇产科联盟分期的依据, 但腹腔细胞学检查在手术的过程中不可缺少, 它可以作为临床诊断和治疗一项指标。

参考文献

[1]Pecoreili S.Revised FIGO staging for carcinoma of the vulva, Cervixand endomcetrium[J].Int J Gynecol Obstet, 2009, 105 (2) :103-104.

[2]Milosevic MF.The cJinicaI signicanceof malignant peritonealeytology in stage I endometnal carcinom[J].Int J Gynecol Cancer, 2012, 2 (3) :225-235.

[3]Melellan R, Peritoneal cytolgyin endometrial cancera review[J].Obstet Gynecol Surv, 2009, 44 (7) :711-719.

[4]李隆玉.子宫内膜癌卵巢转移危险闲素的探讨[J].中华妇产科杂志, 2008, 43 (6) :352-355.

患了子宫内膜癌能保留子宫吗 篇4

我今年28岁,1个月前被确诊患了子宫内膜癌,医生建议我进行全子宫切除手术。我还没有生育,非常想保留子宫。请问,像我这样的情况还能保留子宫吗?

山西 刘湘

刘湘读者:

子宫内膜癌又叫子宫体癌,是发生于子宫内膜的恶性肿瘤。随着病情的进展,这种肿瘤会逐渐侵袭子宫的肌层。一般来讲,子宫内膜癌绝大多数为腺癌,这种类型的癌症对放射治疗不敏感。所以,大多数此病患者均应进行全子宫切除手术,同时进行放疗、化疗及服药等治疗。子宫内膜癌患者若想保留子宫,必须具备一些特殊条件,这些条件包括:①经做病理检查,其子宫内膜癌为高分化癌。②肿瘤细胞尚未浸润子宫肌层。③患者年龄较轻、未生育过,且愿意配合医生进行长期随访。

对于想保留子宫的此病患者,临床上通常采取以下方法进行治疗:

1.应用大剂量的孕激素进行治疗。治疗此病应用孕激素的剂量相当于避孕所用孕激素剂量的100倍以上。此病患者在治疗三个月后应进行子宫内膜活检。如果检查结果显示病情有所好转,应继续使用上述方法治疗三个月。随后,此病患者可采用助孕措施(如试管婴儿等)进行生育。

2.如果此病患者应用大剂量的孕激素治疗三个月后,其子宫内膜活检的结果显示病情没有变化,则需继续使用上述方法治疗三个月,然后进行第二次子宫内膜活检。若第二次子宫内膜活检的结果显示病情有所好转,则可以继续应用大剂量的孕激素治疗三个月,随后进行第三次子宫内膜活检。此时,若检查结果显示子宫内膜仍没有转化成正常的状态,则应该立即放弃保留子宫的想法,进行全子宫切除手术。若检查结果显示其子宫内膜已经转化为正常,则可采取助孕措施。

3.此病患者在应用孕激素治疗三个月后,若病情继续恶化,应立即放弃保留子宫的想法,实行全子宫切除手术。

子宫内膜癌干细胞研究 篇5

关键词：子宫内膜癌,腹腔细胞学阳性,预后

子宫内膜癌属于女性常见生殖道恶性肿瘤, 晚期患者预后较差[1]。子宫内膜癌常用治疗方法为全面分期手术治疗, 同时术后需根据病情分期展开辅助性针对治疗[2]。过去腹腔细胞学检查结果是手术病理分期的重要依据, 然而自国际妇产联盟 (FIGO) 分期标准出台以后, 许多学者对子宫内膜癌中腹腔细胞学检查应用价值的意见各有不同。为分析腹腔细胞学阳性在子宫内膜癌患者检查中的临床应用价值及其对预后的影响, 作者选取46例子宫内膜癌患者, 对其临床资料进行回顾性分析, 现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取本院于2008年10月~2010年10月收治的子宫内膜癌患者46例, 患者年龄为31~68岁, 平均为 (47.2±3.5) 岁;按照FIGO于2009年制定的分期标准, 患者手术病理分期为Ⅰa期28例, Ⅰb期5例, Ⅱ期4例, Ⅲa期5例, Ⅲb期2例, Ⅲc期2例。肌层浸润情况:24例浸润深度不足50.0%, 20例浸润深度为50.0%及以上, 2例全层浸润。1.2入选与排除标准入选标准:患者为首次发生子宫内膜癌, 手术治疗前均未接受化疗及放疗;术后经专家检测确定是子宫内膜癌。排除标准:将有其他部位浸润癌合并发生者、有严重肝肾疾病者及不愿参与本次研究者排除。

1.3 方法

1.3.1 治疗方法

46例患者中有2例接受子宫全切术、肿瘤细胞减灭术及双侧附件切除术治疗, 8例行次广泛性子宫切除术与双侧附件切除术, 其余36例患者行次广泛性或广泛性子宫切除术、双侧附件切除术与盆腔淋巴清除术治疗。其中多数患者行腹主动脉旁淋巴结切除术或大网膜切除术治疗。

1.3.2 检测方法

所有患者术中均行腹腔或腹水冲洗液细胞学检查:在腹腔手术中对腹水进行收集, 若患者腹内无腹水, 则用200 ml腹腔冲洗液进行冲洗, 并对冲洗后冲洗液进行收集, 展开细胞学检查。在检查中常规离心冲洗液, 以沉渣进行涂片, 行HE染色并利用显微镜进行观察, 当镜检时可见恶性肿瘤细胞, 则为腹腔细胞学阳性。

1.4 统计学方法

利用统计学分析软件SPSS16.0对相关数据展开统计学分析, 对计数数据进行χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 腹腔细胞学检查结果分析

46例子宫内膜癌患者中有5例患者腹腔细胞学检查为阳性, 阳性率为10.87%。有宫外转移危险因素 (大网膜转移、宫颈受累、附件转移) 和子宫内高危因素 (肌层浸润、脉管浸润) 者与无相应危险因素者腹腔细胞学阳性率差异有统计学意义 (P<0.05) 。详细情况见表1。

2.2 腹腔细胞学阳性及阴性患者3年生存率对比

经随访, 5例腹腔细胞学阳性患者3年生存率为80.0% (4/5) , 41例腹腔细胞学阴性患者3年生存率为97.6% (40/41) , 对比可知, 腹腔细胞学阳性患者3年生存率差异有统计学意义 (P<0.05) 。

3讨论

子宫内膜癌是在子宫内膜上发生的上皮性恶性肿瘤, 在绝经后及围绝经期女性间发病率较高, 目前已成为仅低于卵巢癌、宫颈癌的妇科恶性肿瘤。目前子宫内膜癌发病原因尚不明了, 按其生物行为特征及发病机制可分为非雌激素依赖型与雌激素依赖型。

已有临床研究证实, 我国子宫内膜癌患者腹腔细胞学阳性检出率为11%左右, 本次选取的46例患者中腹腔细胞学阳性率为10.9%, 这与相关报道一致。目前子宫内膜癌患者临床常用治疗方法为手术治疗, 而术前危险因素分析与术后腹腔细胞学检查有重要意义, 可促使腹腔中肿瘤细胞残留率降低。Cu等人选取子宫内膜癌患者298例展开分析, 并未发现腹腔细胞学阳性与肌层浸润深度、病理分级及脉管浸润等因素间的相关性。在本次研究发现, 有无宫外转移危险因素和子宫内高危因素者腹腔细胞学阳性率差异有统计学意义, 这揭示宫外转移危险因素 (大网膜转移、宫颈受累、附件转移) 和子宫内高危因素 (肌层浸润、脉管浸润) 与腹腔细胞学阳性间有一定相关性。故而对术前有深肌层浸润、大网膜转移等高危因素患者, 在术中应展开腹腔细胞学检查, 以免将已发生的肿瘤细胞盆腹腔扩散遗漏。通过对比不同腹腔细胞学检查结果患者的3年生存率, 作者发现腹腔细胞学阳性患者3年生存率显著低于阴性患者, 这一结果揭示腹腔细胞学阳性对子宫内膜癌患者预后有重大影响。张贤红[3]通过相关研究发现, 腹腔细胞学阳性这一独立高危因素并不会对患者疾病发展与预后造成直接影响, 而是经对其他相关高危因素发挥一定作用, 从而间接影响到患者疾病发展与预后情况。

综上所述, 子宫内膜癌患者腹腔细胞学阳性和子宫内高危因素及子宫外转移危险因素有关, 对子宫内膜癌患者预后有不利影响。

参考文献

[1]王岚.宫腔镜检查诊断子宫内膜癌的价值及与腹腔冲洗液阳性的关系探讨.实用妇产科杂志, 2012, 28 (5) :394-395.

[2]李静.Ⅲ期子宫内膜癌预后相关因素分析.中华医学杂志, 2009, 89 (3) :198-199.

子宫内膜癌干细胞研究 篇6

1 材料与方法

1.1 细胞培养

Ishikawa和HEC-1A细胞(American Type Culture Collection,ATCC)用含10%胎牛血清、100 U/m L青霉素以及100μg/m L链霉素的DMEM培养基置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。

1.2 MTT法检测细胞增殖率

细胞以6×104个/孔接种置96孔板,应用不同浓度的PNS(50、100、150、200μg/m L)(西安飞达生物公司)分别作用于Ishikawa和HEC-1A细胞24、48、72 h。弃去原培养液,每孔加入MTT(5 g/L)20μL,37℃培养4 h。弃上清,每孔加入150μL二甲基亚砜,振荡10 min使结晶充分溶解,于酶标仪上检测各组细胞吸光度值(A490),细胞增殖率=处理组A490/对照组A490×100%。

1.3 Transwell法检测细胞侵袭

以正常培养的子宫内膜癌细胞为对照,以200μg/m L的PNS处理的细胞为实验组。在Transwell上室聚碳酸酯膜上涂70μL 1 mg/m L的matrigel胶,在37℃下静置60 min使其在微孔滤膜上重组为基底膜。胰酶消化待测细胞,收集细胞悬液后在离心半径为10 cm的离心机中1000 r/min离心5 min。重悬细胞后接种于Transwell上室内,并于下室中加入含20%胎牛血清的DMEM培养液500μL,孵育24 h。随后将滤膜上层的细胞用棉签抹去,用甲醇固定滤膜,Giemsa染色15 min。于200倍光镜下计算迁移到下层的细胞数量。

1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡

将待测细胞以2×105/孔的密度接种置6孔板,消化细胞,离心后弃去上清液收集细胞。PBS洗涤后离心弃上清液收集细胞,每孔加入100μL结合缓冲液缓慢吹打,在悬浮细胞中分别加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI进行染色,摇匀后置于闭光孵育15 min。每管再加入400μL结合缓冲液,于1 h内用流式细胞仪检测。

1.5 RT-PCR检测m RNA表达

Trizol法提取待测细胞的总RNA,紫外分光光度计测定RNA的纯度及浓度,逆转录成c DNA后PCR扩增。取5μL扩增产物行琼脂糖凝胶电泳,自动凝胶成像分析仪分析。实验结果以目的基因灰度值/内参灰度值表示。

1.6 Western blot检测蛋白的表达

细胞用0.05%胰蛋白酶消化后,PBS洗涤3次。加入65μL RIPA细胞蛋白裂解液裂解细胞,随后进行SDS-PAGE蛋白电泳分离蛋白。电转膜后用5%脱脂奶粉在室温下封闭1 h,加入相应蛋白鼠抗一抗(Pierce,Rockford,USA),4℃轻摇过夜。随后加入HRP标记的羊抗鼠二抗,室温孵育1 h。最后用X线胶片曝光分析,结果用Image-Pro Plus处理。蛋白的相对表达量以目的蛋白与内参β-actin的灰度值比值表示。

1.7 统计学方法

采用Graph Pad Prism 5.0进行统计分析,正态分布的计量资料以均数±标准差(±s)表示,多组间均数比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用Bonferroni检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PNS抑制子宫内膜癌细胞Ishikawa和HEC-1A的生长

PNS能显著抑制Ishikawa和HEC-1A细胞的增殖,同一浓度下,随着PNS作用时间的延长细胞的增殖抑制率亦明显升高(P<0.05);并且随着PNS浓度增加,增殖抑制率明显升高(P<0.05)。后续实验采用200μg/m L PNS处理进行。见图1。

A:MTT检测Ishikawa细胞增殖率;B:MTT检测HEC-1A细胞增殖率

2.2 PNS抑制子宫内膜癌细胞Ishikawa和HEC-1A的侵袭

经200μg/m L PNS处理48 h后,Ishikawa和HEC-1A细胞的侵袭显著降低(P<0.05)。见图2。

与control比较,*P<0.05

2.3 PNS诱导子宫内膜癌细胞Ishikawa和HEC-1A的凋亡

PNS处理48 h后,Ishikawa细胞的凋亡率升高至21.0%,HEC-1A的凋亡率升高至20.2%,与control比较,细胞凋亡率均显著升高(P<0.05)。见图3。

2.4 PNS抑制VEGF的m RNA和蛋白表达

分别检测Ishikawa和HEC-1A细胞中VEGF的m RNA和蛋白。与control比较,PNS组的VEGF m R-NA和蛋白表达均显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

与control比较,*P<0.05

2.5 PNS抑制PI3K/AKT信号通路蛋白表达

与control比较,p-AKT的m RNA、蛋白表达水平在PNS组中显著降低(P<0.05),AKT的m RNA、蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。如图5所示,3讨论

现今全球每年新发子宫内膜癌约14万例,死亡人数约4万人/年[11]。中药因其较高的安全性在癌症的治疗中起重要作用[12]。PNS影响女性生殖恶性肿瘤细胞的增殖及凋亡[7,13,14]。但目前关于PNS对子宫内膜癌的作用还未见报道。本研究发现,PNS能显著抑制体外培养的子宫内膜癌Ishikawa和HEC-1A细胞的增殖和侵袭,促进其凋亡,提示PNS对子宫内膜癌可能具有一定治疗作用。

目前中药抗子宫内膜癌的研究主要从抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤侵袭等方面展开。Wang等[7]研究证明PNS对乳腺癌细胞的侵袭和转移能力有抑制作用。Wang等[15]研究表明,PNS可以通过降低结直肠细胞的增殖,诱导细胞凋亡。本研究结果表明,PNS能显著抑制Ishikawa和HEC-1A细胞的增殖,并且其抑制作用具有浓度、时间的依赖性,随着PNS浓度的增加和作用时间的延长,细胞的增殖抑制也明显增高。并且PNS可以有效抑制Ishikawa和HEC-1A细胞的侵袭能力,对细胞的凋亡也有一定促进作用。以上结果表明,PNS能够抑制子宫内膜癌细胞的生长和侵袭,并诱导细胞凋亡,发挥抗肿瘤作用。

A:RT-PCR检测VEGF的m RNA表达;B、C:Western blot检测VEGF的蛋白表达;与control比较,*P<0.05

A:RT-PCR检测PI3K、AKT的m RNA表达;B、C:Western blot检测PI3K和AKT的蛋白表达;与control比较,*P<0.05

近年来大量研究表明,VEGF是作用最强、特异性最高的调控因子,在肿瘤血管生成的各个环节中起到重要作用[16,17]。抑制VEGF可以达到抑制肿瘤血管新生并阻止肿瘤生长转移的目的[18]。已有研究表明PNS可以通过降低VEGF的表达降低动脉粥样硬化的血管新生[16]。本研究结果表明在PNS处理Ishikawa和HEC-1A细胞中,VEGF的表达显著下降,提示PNS可能通过抑制VEGF影响子宫内膜癌细胞的增殖、迁移和凋亡。

PI3K/AKT信号通路是细胞内重要的信号转到通路之一,其异常激活与妇科肿瘤的发生、发展和转移等密切相关[19]。研究表明VEGF可以通过激活PI3K/AKT信号通路促进子宫内膜癌细胞的增生及转移[20]。本研究结果发现PNS处理抑制PI3K/AKT信号通路在的Ishikawa和HEC-1A中的表达,与VEGF的表达趋势一致,说明PNS可能通过抑制子宫内膜癌细胞VEGF的表达,遏制PI3K/AKT信号通路激活。

子宫内膜癌干细胞研究 篇7

关键词：子宫内膜厚度,子宫内膜癌,超声

子宫内膜癌又称子宫体癌,主要发病人群以绝经期和更年期的妇女居多,糖尿病、少产、未婚、肥胖伴原发性高血压等也是子宫内膜癌的高发人群。子宫内膜癌的临床症状表现通常是排液增多、阴道出血不规则等,目前的治疗方法主要是进行手术治疗,并配合孕酮抗雌激素药物治疗、化学治疗、放射治疗等进行联合诊治[1、2]。对子宫内膜癌的治疗关键在于早期的及时发现,因此,尽早诊断子宫内膜癌十分重要。笔者分析自2010年10月-2012年10月,医院体检的364例绝经期妇女阴道超声检查结果。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机选择自2010年10月-2012年10月间医院体检的364例绝经期妇女临床B型超声检查病例资料进行回顾性分析。年龄47~68(56.86±5.48)岁;其临床症状大部分表现为经期不规律、月经过多、阴道出血不规则等。

1.2 方法

采用美国生产的GE LOGIQ-500彩超诊断仪进行绝经期妇女的子宫内膜检查,探头频率9~11MHz。患者检查前排空膀胱,并在膀胱截石位阴道内置入B型超声探头进行多角度扫查,探头要紧贴在阴道穹窿及宫颈部位,其观察的内容主要包括子宫附件的形态、大小、占位病变情况以及子宫内膜的厚度、光滑程度、肌层浸润情况等[3]。

1.3 观察标准[4]

1.3.1 子宫内膜正常:主要是子宫内分泌期内膜、增殖期内膜、破碎内膜、萎缩期内膜的情况正常。

1.3.2 子宫内膜炎:主要是子宫内膜出现不同部分、不同程度的炎症。

1.3.3 子宫内膜增生:主要是子宫内膜出现息肉、简单型增生(囊腺性增生)或者复杂性增生(腺瘤性增生)等病变。

1.3.4 子宫内膜癌:主要是子宫内膜出现癌变,如小细胞癌、腺癌、未分化癌或者透明细胞癌等。

1.4 统计学方法

利用SPSS 16.0软件包进行数据分析,计量资料以±s表示,采用t检验,计数资料以率(%)表示,采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

364例绝经期妇女均经B型超声检查,子宫内膜癌患者的内膜厚度明显高于其他病症患者以及正常妇女的子宫内膜厚度,RI值患者例数≤0.4明显高于其他患者,差异均有统计学意义(P<0.05);B型超声图像显示子宫内膜癌患者的均匀程度同其他被检查妇女比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

注:与正常、内膜炎、内膜增生比较,*P<0.05

3 讨论

子宫内膜癌多出现在绝经期妇女群体中,是妇科疾病中第3大致死性病症。早期临床症状,多以异常性阴道出血和阴道排液为主。目前子宫内膜癌的发病原因还没有确切、统一的定义,因此,对它的治疗主要取决于早期的发现、确诊和治疗。经过本次调查分析显示,当患者的子宫内膜增厚时,其子宫内膜癌的确诊率也就越高,因此,利用B型超声检查患者子宫内膜的厚度,能够有效的在早期对子宫内膜癌做出较为正确的判定。

参考文献

[1] 叶建红,周坚红.子宫内膜厚度在绝经后妇女子宫内膜癌中的诊断价值[J].肿瘤学杂志,2011,6(9):475-476.

[2] 李慧林,边静,李秀丽.绝经后子宫内膜厚度与子宫内膜癌相关性分析[J].基层医学论坛,2012,12(1):77-78.

[3] 迪丽努尔·买买提明.经阴道超声在绝经后子宫内膜病变中的诊断价值[J].新疆医科大学学报,2012,10(7):1430-1434.

早期子宫内膜癌最佳手术方式研究 篇8

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取本院2008年1月-2012年1月期间收治的确诊为患有I~II期子宫内膜癌的178例患者。患者年龄24~68岁,平均年龄(38.26±4.18)岁,且178例患者都符合早期子宫内膜癌的纳入标准:都为手术治疗的患者;术前及术后的病理组织学检查诊断结果明确;属于子宫内膜癌I~II期患者;术后的随访可靠。按照国际-FIGO制定的分期标准对患者进行分期,其中I期患者共136例,Ia期48例,Ib期64例,Ic期24例;II期患者42例。

1.2 治疗方法

1.2.1 术式1

即施行全子宫切除术,严格按照操作流程以及操作规范进行手术[7]。对于某些有强烈保留子宫,并且随诊条件较好的患者保留部分或者一侧卵巢,50例采用术式1的患者中共有5名患者保留卵巢,保留右侧附件的患者2名,保留左侧附件的患者3名。

1.2.2 术式2

即广泛性或次广泛性子宫切除术,扩大子宫的切除范围。广泛性的子宫切除就是在术式1基础上对输尿管隧道进行解剖,切除圆韧带和阔韧带、对骨盆漏斗韧带进行高位结扎、切除主韧带和宫骶韧至少2 cm。次广泛性的子宫切除则是在术式1基础上切除1~3 cm阴道壁。术中的剖腹过程都和术式1相同。

1.2.3 术式3

施行术式1或术式2,并且在同期施行盆腔淋巴结的切除术。淋巴的切除有两种手术方式,一种是淋巴结取样,选择性的切除部分淋巴结或前哨淋巴结;二是根治性的切除,就是施行盆腔淋巴结的清扫术。178例患者采取的手术方式情况见表1。

1.3 统计学处理

采用SPSS 16.0软件对数据进行统计学分析,计量资料以表示,采用t检验,计数资料采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

3 种手术方式相比,术式1所需的手术时间最短,术中出血量最少,并发症的发生率也最低,与术式2、术式3比较差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。对于Ia期的患者行术式1、术式2、术式3在生存率方面比较差异无统计学差异(P>0.05);对于Ib期的患者,术式2、术式3和术式1相比,在5年生存率上明显要高,而术式2和术式3比较差异无统计学意义(P>0.05);对于Ic期和II期的患者,术式3的3年以及5年的生存率都最高,详见表3。

3 讨论

根据本次研究结果表明,对于Ia期的子宫内膜癌患者,3种不同的手术方式对于3年生存率以及5年的生存率比较差异没有统计学意义(P>0.05),但是采用扩大手术方式的患者在手术之后并发症的发生率升高。因此,对于Ia期子宫内膜癌患者的最佳手术方式为全子宫切除术[8]。对于Ib期的子宫内膜癌患者,在5年生存率方面,术式1和术式2比较差异有统计学意义,但是术式2和术式3比较差异没有统计学意义,说明扩大子宫的切除范围对于此期患者术后生存率的提高是有意义的,但是对于具有淋巴转移等高危因素的患者,应该视手术中的情况决定是否实行淋巴结清扫[9]。对于Ic~II期的子宫内膜癌患者,3种方式之间的差异都有统计学意义,因此对于此期的患者扩大手术范围是更加有必要的[10]。综上所述,对于子宫内膜癌患者应根据临床的分期,选择合适的手术方式,这是保证手术的治疗效果以及患者预后的关键。

参考文献

[1]黄水文,李孟达,黄鹤.I期子宫内膜癌不同术式疗效的研究[J].中华妇产科杂志,2004,39(3):156-158.

[2]Kong A,Simera I,Collingwood M,et al.Adjuvant radiotherapy for stage I endometrial cancer:systematic review and meta-analysis[J].Ann Oncol,2007,18(10):1595-1604.

[3]Randall M E,Filiaci V L,Muss H,et al.Randomized PhaseⅢtial of whole-abdominal irradiation versus doxorubicin and cisplatin chemotherapy in advanced endometrial carcinoma:A Gynecologic On cology Group Study[J].J Clin Oncol,2006,24(1):36-44.

[4]Homesley H D,Filiaci V,Gibbons S K,et al.A randomized PhaseⅢtril in advanced endometrial carcinoma of surgery and volume directed radiation followed by cisplatin and doxorubicin with or without paclitaxel:A Gynecologic Oncology Group[J].Gynecol Oncol,2009,112(3):543-552.

[5]田芬.具有高位因素的早期子宫内膜癌患者化疗预后分析[J].河北医药,2009,31(15):1930-1931.

[6]Huang E Y,Madireddi M Y,Gopalkrishnan R V,et al.Genomic structure,chromosomal localization and expression profile of a novel melanoma differentiation associated(mda-7).gene with cancer specific growth suppressing and apoptosis inducing proper-tie[J].Oncogene,2001,20(11):7051-7063.

[7]Susumu N,Sagae S,Udagawa Y,et al.Randomized phaseⅢtril of pelvic radiotherapy versus cisplatin-based combined chemotherapy in patients with intermediate-and high-risk endometrial cancer:a Japanese Gynecologic Oncology Group study[J].Gynecol Oncol,2008,108(18):226-233.

[8]彭芝兰.子宫内膜癌290例临床分期与手术病理分期的比较[J].中华妇产科杂志,1997,32(8):597-600.

[9]王华英,陈云.早期子宫内膜癌手术后辅助治疗的研究进展[J].中华妇产科杂志,2009,44(3):224.

子宫内膜癌46例临床诊治分析 篇9

【摘要】　子宫内膜癌是发生于子宫内膜的一组上皮恶性肿瘤，其中以源于子宫内膜腺体的腺癌最常见；是女性生殖道三大恶病理类型性肿瘤之一，占女性全身恶性肿瘤的7%，占女性生殖道恶性肿瘤的20%—30%[1]。其发病率呈逐渐上升趋势，多见于绝经后婦女，你年轻妇女亦不少见。病因尚不清楚，发病类型有雌激素依赖型和非雌激素依赖型两种；前者的患者常年轻，伴有高血压、糖尿病、肥胖以及不孕等，肿瘤分化较好，预后好；后者多见于老年体瘦妇女，肿瘤分化差，预后不良。病理类型可分为内膜样腺癌、腺癌伴鳞状上皮化生、浆液性腺癌及透明细胞癌四种，其中以内膜样腺癌最多见，占80%—90%。 目的：探讨子宫内膜癌的临床诊断、治疗手段以及疗效，总结早期诊断经验及提高治疗水平。 方法：将2007年6月—2008年6月我院收入的46例子宫内膜癌患者根据病情制定合理正确的治疗方案，治疗后随访3年，记录临床资料并作回顾性分析。 结果：10例在第1年内复发；12例在第2年复发；3例第3年复发；21例随访结束时仍正常。 结论：随访发现子宫内膜癌的预后受多种因素影响，经过积极合理正确的临床治疗，能够提高延长患者的生命。

【关键词】　子宫内膜癌；诊断；手术治疗；放疗；化疗1　临床资料1.1　一般资料

本组46例患者，年龄32—58岁，平均45岁。32—40岁13例；41—45岁10例；46—50岁16例；51—58岁7例。合并高血压者2例，糖尿病者3例，肥胖者5例，不孕者4例。其中原位癌3例，浸润癌43例；内膜样腺癌36例，其中按分化程度G1 14例、G2 16例、G3 6例；腺癌伴鳞状上皮化生3例；浆液性腺癌4例例；透明细胞癌3例。FIGO临床分期中原位癌3例，ⅠＡ期1例，ⅠＢ期2例，ⅠC期7例，ⅡＡ期9例，ⅡＢ期13例，ⅢA期6例，ⅢB其2例，ⅢC期2例，Ⅳ期1例。1.2　临床表现

子宫内膜癌早期无明显症状，随着病情进展出现阴道流血及排液、疼痛等。46例患者中阴道流血41例，特点是绝经后出血，量不多；未绝经者经量增多、经期延长或月经紊乱；阴道排液27例，表现为阴道分泌物多，多是血性或浆液性，并发感染者是脓血样，恶臭；下腹疼痛者9例；患者晚期表现出消瘦、贫血、恶病质等症状。早期妇科检查无异常；晚期子宫增大、稍软，癌组织自宫口脱出，质脆且易出血。一旦发生宫腔积脓，子宫明显增大、极软及触痛。肿瘤浸润时，可扪及不规则结节状块物。2　诊断

需根据病史、临床表现以及相关辅助检查。对于围绝经期的妇女，出现月经紊乱或绝经后阴道流血以及存在子宫内膜癌发病高危因素者[1]，应该密切随诊。分段诊刮是最常用且最有价值的确诊方法，可鉴别宫颈管和子宫内膜腺癌。宫腔镜检查可直视宫腔，若有病灶，能直接观察大小、部位、形态，并取活检，可以减少漏诊。必要时还可做细胞学检查、CT、MRI以及测定CA125，有子宫外癌肿播散者CA125明显增高。

在诊断的同时还应该考虑鉴别诊断，需要与绝经过渡期阴道流血、子宫黏膜下肌瘤或者内膜息肉、萎缩性阴道炎、宫颈管癌、子宫肉瘤等鉴别，避免造成误诊。3　临床治疗

对于原发性子宫内膜癌，首选手术治疗并根据手术病理分期及高危因素确定术后辅助治疗方案；复发性子宫内膜癌的治疗手段包括放疗、手术、化疗、内分泌治疗等[2]。3.1　手术治疗 I 期患者行筋膜外子宫全切及双侧附件切除术，必要时需行盆腔及腹主动脉旁淋巴结切除或取样。II期患者行改良根治性子宫切除及双侧附件切除术、盆腔及腹主动脉旁淋巴结切除术。Ⅲ期和Ⅳ期患者则需要进行肿瘤细胞减灭术。3.2　放疗 分为腔内照射及体外照射。需要单纯放疗的患者，腔内照射总剂量45—50Gy，体外照射总剂量40—45Gy。术后放疗是最主要的术后辅助治疗手段，对于淋巴结转移、肌层浸润及残留病灶者，术后给予放疗。3.3　化疗 主要用于晚期、复发癌、术后有复发高危因素的患者。子宫乳头状浆液性癌术后化疗应作为常规。常用化疗药物有顺铂、紫杉醇、环磷酰胺及氟尿嘧啶等，制定合理方案进行化疗，如第1日，紫杉醇135mg/m2，>24h静滴；第2日腹腔注射顺铂50—100mg/m2；第8日腹腔注射紫杉醇60mg/m2。3.4　孕激素 适用于晚期或复发癌不能手术，子宫内膜不典型增生或极早期年轻者需保留生育功能者。可口服醋酸甲羟孕酮200-400mg/d，或者肌注己酸孕酮500mg/次，每周2次。4、结果 10例在第1年内复发，占21.74%；12例在第2年复发，占26.09%；3例第3年复发，占6.52%；21例随访结束时仍正常，占45.65%。5　讨论分析

子宫内膜癌是女性生殖系统的三大恶性肿瘤之一，由于子宫内膜癌早期无症状及体征，不易被发现，因此，子宫内膜癌应该积极开展普查、筛检工作，以期提高检出率，挽救患者生命。随着病情发展，对于阴道流血、阴道排液者，应该引起足够重视，进行病理检查及相关鉴别诊断以确认是否为子宫内膜癌。子宫内膜癌早期可直接蔓延，波及输卵管、宫颈管及阴道等；最主要转移途径为淋巴转移；晚期患者可出现血行转移至全身各器官如肺、肝及骨骼等受累。

子宫内膜癌干细胞研究 篇10

Beclin1是一种与自噬相关的抑癌基因, 位于人染色体17q21上, 在卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌中该部位均存在缺失。有研究提示Beclin1的表达缺失导致自噬活性的减弱从而促进肿瘤的发生, 故Beclin1在雌激素依赖性肿瘤子宫内膜癌的发生发展中起着重要的作用。因此, 本研究旨在构建Beclin1真核表达载体pc DNA3.1-Beclin1, 建立稳定表达Beclin1的细胞株, 探讨Beclin1在子宫内膜癌细胞增殖中的影响, 以期对子宫内膜癌基因治疗提供科学的依据, 对内膜癌的发生发展关系的研究能进一步深入奠定实验基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料

高效真核表达载体pc DNA3.1质粒购自Oligoengine公司;G418和Lipofectamine2000购自Invivogen公司;BglⅡ、Eco RI、HindⅢ、T4DNA链接酶、Taq DNA聚合酶和DL2000DNA分子量标记购自北京天根生物有限公司;琼脂凝胶回收试剂盒、质粒提取纯化试剂盒、RNA抽提及逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR) 试剂盒购自Fermentas公司, 兔抗人Beclin1多克隆抗体购自大连宝生物公司, 所有DNA序列均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成;人子宫内膜癌细胞HEC-1-B购自中国医学科学院上海细胞库, 实验涉及各种酶类为NEB产品, 嘌呤霉素为sigma产品, 胎牛血清 (FBS) 购自杭州四季青生物制品公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计和子宫内膜细胞Beclin1基因扩增

在NCBI数据库中查找Beclin1的m RNA全序列, 基因编号NM003766;根据其c DNA全长序列, 参照国际流行标准, 利用Invivogen公司的在线软件进行设计, 选取编码区两侧的碱基合成相应的引物。上游引物序列 (上游) 5′-ATCCTGGACCGTGTCACCATACAGT-3′, (下游) 5′-GTTGAGCTGAGTGTCCAGCTGT-3′, 分别含有Eco RI、HindⅢ酶切点位, 目的片段为326 bp。按T/A克隆操作规范, 参照Trizol试剂盒说明书提取人子宫内膜癌细胞株HEC总RNA, 利用蛋白核酸分析仪测定RNA纯度及浓度, 通过1%琼脂糖电泳鉴定RNA完整性;取300 ng总RNA, 根据RT-PCR试剂盒说明进行逆转录合成Beclin1DNA;PCR反应条件为:94℃预变性5 min、55℃退火1.5 min、72℃延伸0.5min, 共30个循环, 最后72℃再延伸6 min终止。取PCR最终产物进行1%琼脂糖凝胶电泳, 切取326 bp目的片段凝胶, 利用试剂盒回收纯化目的片段。

1.2.2 构建Beclin1表达质粒

经Eco RI、HindⅢ双酶切后, 再将插入片段定向插入真核载体pc DNA3.1的相应位点;连接产物转化DH5α感受态细胞, 挑选单菌落, 利用T/A法重组克隆提取质粒, 用Eco RI、HindⅢ双切酶鉴定, 阳性克隆命名为pc DNA3.1-Beclin1。为检测目的基因是否正确插入载体以及有无基因突变的产生, 阳性克隆送上海生物有限公司测序, 将测序结果通过blast比对, 完全正确的质粒命名为pc DNA3.1-Beclin1.

1.2.3 质粒转染HEC细胞

设立实验组 (转染pc DNA3.1-Beclin1) 、空质粒对照组 (转染pc DNA3.1空载体) 、空白对照组 (脂质体组) , 体外传代培养HEC细胞, 采用含10%小牛血清的DMEM培养基, 将细胞稀释为3×105/m L接种于6孔板, 细胞密度到70%时, 利用脂质介导法转染pc DNA3.1-Beclin1重组质粒;转染后5 h换完全培养基继续培养24 h。Western blot法测定HEC中Beclin1的含量, 按试剂盒说明书操作, 利用图像分析系统对相应分子量目的条带进行定性分析。

1.2.4 MTT法检测转染细胞活性

在转染后24、48和72 h每孔加入MTT溶液 (5 mg.rn L-1用PBS配制, p H=7.4) 20μL, 继续孵育4 h, 终止培养, 小心吸弃孔内培养上清液, 每孔加入150μL二甲基亚砜 (DMSO) , 置摇床上低速振荡10 min, 使结晶物充分溶解;在酶联免疫检测仪490 nm波长处, 测量各孔的吸光值, 重复6次, 记录结果, 绘制细胞生长曲线。

1.3 统计学处理

用统计学软件SPSS 13.0对数据进行统计学分析, Western blot法测量结果采用重复测量方差分析 (ANOVA) ;计量资料用 (±s) 表示, 比较采用t检验, 计数资料采用x2检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Beclin1基因扩增

T/A克隆PCR扩增, 从人子宫内膜癌HEC细胞提取, 经鉴定其纯度和完整性均较好, PCR扩增产物电泳得到约326 bp的特异条带, 与预期扩增片段大小相符, 见图1。

2.2 重组载体鉴定结果

将构建的pc DNA3.1-Beclin1重组质粒进行测序鉴定, 测序结果与设计一致, 见图2。

注:M:DNA分子量标记;1-2:pc DNA3.1-Beclin1

2.3 转染HEC细胞中pc DNA3.1-Beclin1表达测定

分别提取转染组、空载体组及对照组HEC细胞总蛋白, Western blot检测发现转染组条带明显增粗, 提示有外源的Beclin1高表达, 见图3。用荧光显微镜观察, 发现在转染数小时后即可见到部分细胞表达Beclin1, 在4 h之内表达Beclin1的HEC细胞数量逐渐增多, 在48 h达到高峰, 其pc DNA3.1-Beclin1转染细胞内出现大量明亮的绿色荧光, 阴性对照组 (空载体组) 荧光表达百分率约为4.8%, 转染组荧光表达百分率约为72.0%, 瞬时转染效率70.0%, 可以满足实验需要, 见图4。

2.4 MTT检测转染HEC细胞增殖状态

MTT结果显示, pc DNA3.1-Belin1转染组与阴性对照组 (脂质体组) 及pc DNA3.1空载体组间HEB细胞相比吸光度值差异均有统计学意义 (P<0.05) ;阴性对照组织 (脂质体组) 与空载体对照组HEC细胞相比, 吸光度值差异无统计学意义 (P>0.05) , 见表1。描绘细胞曲线显示转染pc DNA3.1-Beclin1载体的子宫内膜癌HEC细胞生长有明显抑制, 实验组织HEC细胞增殖明显低于对照组。

*与pc DNA3.1-Beclin1组比较, P<0.05

注:左侧为阴性对照组;右侧为实验组

3 讨论

Beclin1位于人类染色体17q21上, 大约有150 kb, 最初是由学者在致死性Sindbis病毒性脑炎的研究中被发现的, 被认为是一种双等位抑癌基因 (hapliinsufficient tumor suppressor) , 其杂合性缺失是细胞发生恶性转化的原因之一[3]。据研究, 自噬基因通过自噬作用、抑制基因空突变、促进细胞凋亡、抑制血管构建而抑制肿瘤的发生。据报道75%的人类卵巢癌、50%乳腺癌和40%的前列腺癌细胞存在Beclin1单等位基因缺失突变, 其表达量不同程度下降[4,5,6]。王赞宏等[7]通过研究发现, 自噬基因Beclin1抑制人宫颈癌He La细胞的生长, 降低其致瘤活性, 抑制肿瘤细胞的恶性增殖, 诱导自噬和凋亡, 抑制肿瘤的生长。

子宫内膜癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一, 发病率呈明显上升和年轻化趋势。有关子宫内膜癌的发病机制仍不完全清楚, 目前认为多基因、多阶段的癌基因或抑癌基因突变构成其发生和发展的分子基础。针对子宫内膜癌的Beclin1基因研究目前较为少见, 浙江医科大学附属妇产科医院赵剑虹等[8]通过免疫组化的研究方法发现, Beclin1蛋白在正常子宫内膜组织、良性增殖的子宫内膜、子宫内膜癌组织中表达率逐渐下降且呈显著差异性, Beclin1蛋白表达程度与子宫内膜癌细胞分化、组织学类型相关, 而与手术病理分期和肌层浸润深度无关。本课题组通过免疫组化实验证实:Beclin1蛋白在正常子宫内膜组织、良性增殖的子宫内膜、子宫内膜癌组织中表达率下降, 呈显著差异性, 与赵剑虹等[8]实验结果相一致。为更好的研究Beclin1蛋白表达程度只与子宫内膜癌发生发展的关系, 笔者设计研究方案, 用RT-PCR、T/A成功克隆扩增出Beclin1基因, 成功构建了Beclin1的真核表达载体pc DNA3.1-Beclin1, MTT法检测结果显示, 转染外源性Beclin1基因后, 实验组HEC细胞生长速率较其他两组明显减慢。Western blot法测定HEC中Beclin1的含量, 在酶联免疫检测仪测量并纪录结果、绘制细胞生长曲线显示, 当自噬基因Beclin1表达水平升高后, 凋亡的细胞明显上升;提示Beclin1基因可通过自噬调控, 进而影响子宫内膜癌的发生发展及临床预后, 以Bcelin1基因为治疗靶点, 可为子宫内膜癌的治疗提供广阔的视角。

综上所述, 结合本研究, Beclin1的表达程度与许多肿瘤的发生发展过程相关[9]。因此, 根据肿瘤发生的不同时期, 调节Beclin1的表达, 对于制定肿瘤的预防和治疗方案极为重要, 在子宫内膜癌的治疗中, 基于Beclin1的靶向治疗可成为一种新的探讨方向, 全面阐明Beclin1的功能、机制及其调控网络, 必将有助于理解子宫内膜癌的发生、发展规律, 并有效指导子宫内膜癌的临床诊治。

参考文献

[1]程秋蓉, 马玲, 罗雪梅, 等.子宫内膜癌ER、PR的表达及其临床意义[J].中国实用医药杂志, 2008, 15 (1) :1-2.

[2]Zou L B, Zhang R J, Tan Y J, et al.Identification of estrogen response element in the aquaporin-2 gene that mediates estrogen-induced cell migration and invasion in human endometrial carcinoma[J].J Clin Endocrinol Metab, 2011, 96 (9) :1399-1408.

[3]Yue Z, Jin S, Yang C, et al.Beclin1, an autophagy gene essential for early embryonic development, is a haplo-insufficient tumor suppressor[J].Proceedings of the National Academy of Sciences, 2003, 100 (25) :5077-5082.

[4]Tangir J, Muto M G, Bercowitze R S, et al.A400 kb novel deletion unit centromeric to the BRCAI gene in sporadic epithelial ovarian cancer[J].Oncogene, 1996, 12 (4) :735-740.

[5]Gao X, Zacharek A, Salkowski A, et al.Loss of heterozygosity of the BRCAI and other loci on chromosome 17q in human prostate cancer[J].Cancer Res, 1995, 55 (19) :1002-1005.

[6]Cuervo A M, Dice J F, Knecht E, et al.A receptor for the se1ective uptake and degradation of proteins by lysosomes[J].Science, 1996, 273 (26) :501-503.

[7]王赞宏, 李莉, 彭芝兰, 等.自噬基因Beclin1对宫颈癌HeLa细胞生长影响的体内外研究[J].中华肿瘤学杂志, 2011, 33 (11) :804-809.

[8]赵剑虹, 万小云, 谢幸, 等.Beclin1、PTEN在子宫内膜癌组织中的表达[J].癌症杂志, 2006, 25 (6) :753-757.