体外诊断试剂临床试验技术指导原则

体外诊断试剂临床试验技术指导原则（共7篇）

体外诊断试剂临床试验技术指导原则 篇1

CFDA关于发布体外诊断试剂临床试验技术指导原则的通告（2014年第16号）

为指导体外诊断试剂的临床试验工作，根据《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5号），国家食品药品监督管理总局组织制定了《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》，现予发布。自2014年10月1日起，原国家食品药品监督管理局发布的《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》（国食药监械〔2007〕240号）废止。

特此通告。

附件：体外诊断试剂临床试验技术指导原则 2014年 体外诊断试剂临床试验技术指导原则

一、概述

体外诊断试剂的临床试验（包括与已上市产品进行的比较研究试验）是指在相应的临床环境中，对体外诊断试剂的临床性能进行的系统性研究。

申请人应在符合要求的临床单位，在满足临床试验最低样本量要求的前提下，根据产品临床预期用途、相关疾病的流行率和统计学要求，制定能够证明其临床性能的临床试验方案，同时最大限度地控制试验误差、提高试验质量并对试验结果进行科学合理的分析。临床试验报告是对临床试验过程、结果的总结，是评价拟上市产品有效性和安全性的重要依据，是产品注册所需的重要文件之一。

本指导原则仅对体外诊断试剂临床试验提出了一般性的要求。由于体外诊断试剂产品具有发展快、专业跨度大、临床预期用途各异的特点，不同临床预期用途产品的临床试验方法及内容不尽相同。申请人应根据产品特点及临床预期用途，制定合理的临床试验方案。国家食品药品监督管理总局也将根据体外诊断试剂发展的需要，适时修订本指导原则。

二、临床试验的基本原则

（一）基本要求

1．临床试验必须符合赫尔辛基宣言的伦理学准则,必须获得临床试验机构伦理委员会的同意。研究者应考虑临床试验用样本，如血液、羊水、胸水、腹水、组织液、胸积液、组织切片、骨髓等的获得或试验结果对受试者的风险性，应提交伦理委员会的审查意见及受试者的知情同意书。对于例外情况，如客观上不可能获得受试者的知情同意或该临床试验对受试者几乎没有风险，可经伦理委员会审查和批准后免于受试者的知情同意。

2．受试者的权益、安全和健康必须高于科学和社会利益。

3．为受试者保密，尊重个人隐私。防止受试者因检测结果而受到歧视或伤害。

4．临床前研究结果支持进行临床试验。

（二）临床试验机构及人员的要求

1.第三类体外诊断试剂申请人应当选定不少于3家（含3家）、第二类体外诊断试剂申请人应当选定不少于2家（含2家）临床试验机构，按照有关规定开展临床试验。

2．体外诊断试剂的临床试验机构应获得国家食品药品监督管理总局资质认可。

3．申请人应根据产品特点及其预期用途，综合不同地区人种、流行病学背景、病原微生物的特性等因素选择临床试验机构。临床试验机构必须具有与试验用体外诊断试剂相适应的专业技术人员及仪器设备，并能够确保该项试验的实施。

4.申请人应当在临床试验前制定文件明确各方的职责分工，与各临床试验机构协商制定统一的临床试验方案，按照临床试验方案组织制定标准操作规程，并组织对参加试验的所有研究者进行临床试验方案和试验用体外诊断试剂使用的培训，以确保临床试验方案和试验用体外诊断试剂操作的一致性，并在临床试验过程中促进各研究者之间的沟通。

5．在临床试验开始前，申请人应与临床试验工作人员进行临床试验的预试验，使其熟悉并掌握该产品所适用的仪器、操作方法、技术性能等，以最大限度地控制试验误差。

6．在临床试验过程中，申请人应考虑吸收流行病学、统计学、临床医学、检验医学等方面专业人员（或知识），以保证临床试验科学、合理地开展。

三、临床试验设计原则

（一）临床试验方案

开展体外诊断试剂临床试验，申请人应当按照试验用体外诊断试剂的类别、风险、预期用途等特性，组织制定科学、合理的临床试验方案。一般应当包括以下内容：

1.一般信息（包括产品信息、临床试验开展的时间和人员等相关信息、申请人相关信息等）； 2.临床试验的背景资料； 3.试验目的； 4.试验设计； 5.评价方法； 6.统计方法；

7.对临床试验方案修正的规定；

8.临床试验涉及的伦理问题和说明、《知情同意书》文本（如有）；

9.数据处理与记录保存;10.其他需要说明的内容。

（二）试验方法

1．新研制体外诊断试剂的临床试验

1.1 对于新研制体外诊断试剂而言，选择适当的受试者，采用试验用体外诊断试剂与诊断该疾病的“金标准”进行盲法同步比较。

对用于早期诊断、疗效监测、预后判断等用途的体外诊断试剂，在进行与“金标准”的比较研究的同时，还必须对受试者进行跟踪研究。研究者应明确受试者的入选标准、随访标准和随访时间。1.2 “金标准”的确定。

“金标准”是指在现有条件下，公认的、可靠的、权威的诊断方法。临床上常用的“金标准”有组织病理学检查、影像学检查、病原体分离培养鉴定、长期随访所得的结论及临床常用的其他确认方法等。

1.3受试者的选择。

受试者应包括两组：一组是用“金标准”确定为有某病的病例组，另一组是经“金标准”确定或有临床证据证实无该病的患者或正常人群，作为对照组。病例组应包括该病种的不同病例，如症状典型和非典型的，病程早、中、晚期的，病情轻、中、重型的，不同性别、不同年龄层次的等，以便能反映该病的全部特征。对照组应包括确定无该病的患者，及易与本病相混淆疾病的病例。1.4同步盲法测试。

经“金标准”确定的病例组与对照组中的受试者样本同步接受试验用体外诊断试剂的检测，将检测结果与“金标准”判定的结果进行比较，计算试验用体外诊断试剂检测结果与“金标准”判断结果符合或差异程度的统计学指标，再根据这些指标对试验用体外诊断试剂进行评价。在试验操作的全过程和判定试验结果时，采用盲法（尽可能用双盲法）是保证临床试验结果真实可靠的关键。

2．“已有同品种批准上市”产品的临床试验

选择已上市产品，采用试验用体外诊断试剂与已上市产品针对临床样本进行比较研究试验，证明试验用体外诊断试剂与已上市产品等效。

2.1 对比试剂的选择。

在采用已上市产品作为对比试剂的前提下，选择目前临床普遍认为质量较好的产品。同时应充分了解所选择产品的技术信息，包括方法学、临床预期用途、主要性能指标、校准品的溯源情况、推荐的阳性判断值或参考区间等，以便对试验结果进行科学的分析。2.2受试者的选择原则同1.3。

2.3对于比较研究试验中测定结果不符的样本，应采用“金标准”或其他合理的方法进行复核，以便对临床试验结果进行分析。如无需复核，应详细说明理由。

3.关于变更申请中涉及的产品临床试验方法

根据变更情况可能对产品性能带来的影响，采用变更后产品与变更前产品或者已上市同类产品进行对比试验，证明变更后产品与对比试验产品等效。

4．关于进口注册产品临床试验方法

对于进口注册产品，由于目标人群种属和地域的改变，可能影响产品的某些主要技术指标和有效性。申请人或临床研究者应考虑不同国家或者地区的流行病学背景、不同病种的特性、不同种属人群所适用的阳性判断值或者参考区间等诸多因素，在中国境内进行具有针对性的临床试验。

（三）临床试验样本量

申请人或临床研究者应根据产品临床预期用途以及与该产品相关疾病的临床发生率确定临床试验的样本量和样本分布，在符合指导原则有关最低样本量要求的前提下，还应符合统计学要求。各临床试验机构样本量和样本分布应相对均衡。

罕见病及用于突发公共卫生事件的体外诊断试剂可酌减样本量，但应说明理由，并满足评价的需要。

1．一般要求

1.1第三类产品：临床试验的总样本数至少为1000例。

1.2第二类产品：临床试验的总样本数至少为200例。

2．特殊要求

2.1采用核酸扩增方法用于病原体检测的体外诊断试剂：临床试验总样本数至少为500例。

2.2与麻醉药品、精神药品、医疗用毒性药品检测相关的体外诊断试剂：临床试验总样本数至少为500例。

2.3 流式细胞仪配套用体外诊断试剂:临床试验总样本数至少为500例。

2.4 免疫组织化学抗体试剂及检测试剂盒:与临床治疗、用药密切相关的标志物及其他具有新的临床意义的全新标记物，临床试验总样本数至少为1000例;临床使用多个指标综合诊治的标志物之一，与辅助诊断、鉴别诊断、病情监测、预后相关的标志物,临床试验总样本数至少为500例。

2.5 用于血型检测相关的体外诊断试剂:临床试验总样本数至少为3000例。

2.6新研制体外诊断试剂产品的临床试验样本量要求同第三类产品。

2.7 变更事项相关的临床试验:涉及产品检测条件优化、增加与原样本类型具有可比性的其他样本类型等变更事项，第三类产品临床试验总样本数至少为200例,第二类产品临床试验总样本数至少为100例,并在至少2家(含2家)临床试验机构开展临床试验；变更抗原、抗体等主要原材料的供应商、阳性判断值或参考区间的变化及增加临床适应症等变更事项，应根据产品具体变更情况，酌情增加临床试验总样本数。

2.8 国家食品药品监督管理总局制定发布的体外诊断试剂指导原则对临床试验例数有规定的，应参照相应指导原则确定样本数。

（四）临床试验方案签章要求

由各承担临床试验的主要研究者（签名）、临床试验机构（签章）、统计学负责人签名及单位盖章、申请人盖章。

四、关于临床试验报告的撰写 临床试验报告应该对试验的整体设计及其关键点给予清晰、完整的阐述，应该对试验实施过程进行条理分明的描述，应该包括必要的基础数据和统计分析方法。

申请人或临床试验牵头单位应对各临床试验机构的报告进行汇总，并完成临床试验总结报告。临床试验报告的格式及内容如下：

（一）首篇

首篇是每份临床试验报告的第一部分，所有临床试验报告均应包含该部分内容。

1．封面标题

包括试验用体外诊断试剂的通用名称、试验开始日期、试验完成日期、主要研究者（签名）、临床试验机构（盖章）、统计学负责人签名及单位盖章、申请人（盖章）、申请人的联系人及联系方式、报告日期、原始资料保存地点。

2．目录

列出整个临床试验报告的内容目录和对应页码。

3．研究摘要

对临床试验情况进行简单的介绍。

4．试验研究人员

列出临床试验主要研究人员的姓名、单位、在研究中的职责及其简历（列于附件中），主要研究人员包括主要研究者及各单位的主要参加人员、统计学负责人、临床试验报告的撰写人。

5．缩略语

临床试验报告中所用的缩略语的全称。

（二）正文内容和报告格式

1．基本内容 1.1引言。

介绍与临床试验产品有关的背景情况：包括（1）被测物的来源、生物及理化性质；（2）临床预期使用目的，所针对的目标适应症人群，目前针对该适应症所采用的临床或实验室诊断方法等；（3）所采用的方法、原理、技术要求等；（4）国内外已批准上市产品的应用现状等。说明申请人和临床试验机构间的合作关系。

1.2 研究目的。

说明本临床试验所要达到的目的。

1.3 试验管理。

对试验管理结构的描述。

管理结构包括主要研究者、主要参加人员、实验室质量控制情况、统计/数据管理情况以及试验中发生的问题及其处理措施等。

1.4 试验设计。

1.4.1 试验总体设计及方案的描述。

试验的总体设计和方案的描述应清晰、简洁，必要时采用图表等直观的方式。试验进行时方案修改的情况和任何方案以外的信息来源也应详细叙述。

1.4.2 试验设计及试验方法选择。试验设计中应包括以下内容：（1）样本量及样本量确定的依据。

（2）样本选择依据、入选标准、排除标准和剔除标准。（3）样本采集、保存、运输方法等。（4）“金标准”或对比试剂的确立。

（5）临床试验用所有产品的名称、规格、来源、批号、效期及保存条件，对比试剂的注册情况。

（6）质量控制方法。对质量控制方法进行简要的阐述。

（7）临床试验数据的统计分析方法。

（8）试验过程中方案的修改。

一般情况下，临床试验方案不宜更改。试验过程中对方案的任何修改均应说明，对更改的时间、理由、更改过程及有无备案进行详细阐述并论证其对整个研究结果评价的影响。1.5 临床试验结果及分析。

1.6 讨论和结论。

2．有关临床试验中特别情况的说明

3．附件

3.1 临床试验中所采用的其他试验方法或其他诊断试剂产品的基本信息，如试验方法、诊断试剂产品来源、产品说明书及注册批准情况。

3.2 临床试验中的所有试验数据，需由临床试验操作者、复核者签字，临床试验机构盖章（封面盖章和骑缝章）。

3.3主要参考文献。

3.4 主要研究者简历。3.5 申请人需要说明的其他情况等。

五、名词解释

试验用体外诊断试剂，是指临床试验中对其安全性、有效性进行确认或者验证的拟申请注册的体外诊断试剂。

临床试验方案，是指有关临床试验的题目、目的、设计、方法学、统计学考虑和组织等文件，通常也包括试验的背景、理论基础。研究者，是指负责在一个临床试验机构中实施临床试验的人，如果在一个临床试验机构中是由一组人员实施试验的，则研究者指的是这个组的负责人，也称主要研究者。

受试者，是指被招募参加临床试验的个人，既可以是临床试验中接受试验用体外诊断试剂检测的人员，也可以是对照人员。知情同意，是指向受试者告知一项试验的各方面情况后，受试者确认自愿参加该项临床试验的过程，必须以签名和注明日期的知情同意书作为证明文件。

知情同意书，是指每位受试者表示自愿参加某一试验的证明性文件。研究者需向受试者说明试验性质、试验目的、可能的受益和风险、可供选用的其他诊疗方法以及符合《赫尔辛基宣言》规定的受试者的权利和义务等，使受试者充分了解后自愿表达其同意参加某项临床试验。

伦理委员会，是指在临床试验机构内由医学专业人员、非医学专业人员组成的独立机构，其职责是对临床试验的科学性和伦理进行审议，具体来说就是对临床试验方案进行审批，对研究人员资格、设施设备以及知情同意的方法等进行审议并提出相关意见，以保证受试者安全、健康和权益得到充分保护。

标准操作规程，是指为有效地实施和完成某一临床试验中每项工作所拟定的标准和详细的书面规程。

体外诊断试剂临床试验技术指导原则 篇2

大会期间，ISO/TC212的5个工作组(WG)分别召开了工作组会议。各工作组会议就负责制修订的国际标准的进展情况、意见处理情况、新工作项目提案、未来工作安排和当前的一些热点问题进行了充分讨论，并完成了工作组报告。

1.WG1工作组（Quality and competence in the medical laboratory医学实验室质量和能力）

该工作组主要讨论的标准包括ISO 22870 Point of Care Testing(POCT)-Requirements for quality and competence《床旁检验-质量和能力的要求》、ISO 15190 Medical laboratories–Requirements for safety《医学实验室-安全要求》、ISO/TS 20658 Medical laboratories–Requirements for collection,transport,receipt and handling of samples《医学实验室–样本收集、运输、接收、处理的要求》、ISO22367 Medical laboratories—Reduction of error through risk management and continual improvement《医学实验室-通过风险管理和持续改进减少误差》等标准。

2.WG2工作组（Reference systems参考测量系统）

该工作组主要讨论的标准为ISO 17511 Traceability of Assigned Values-Calibrators,Controls,Patient Samples《关于定量值的溯源-校准、质控、患者样本》、ISO NP 21151Requirements for International Harmonization Protocols…metrological traceability《国际协议要求…计量溯源》、ISO TS 20914 Measurement Uncertainty(MU)《测量的不确定度》、ISO 15195 Requirements for Reference Measurement Laboratories《参考测量实验室的要求》。

3.WG3工作组（In vitro diagnostic products体外诊断产品）

该工作组主要讨论的标准为ISO NWIP 20916 In vitro diagnostic medical devices—Clinical performance studies using specimens from human subjects–Good study practices《体外诊断医疗设备-人体样本的临床性能研究》。工作组对结构内容做了调整。

4.WG4工作组（Microbiology and molecular diagnostics微生物和分子诊断）

该工作组讨论了5个分子体外诊断检验-检验前过程规范的DIS稿，即送审稿，准备2017年3月作为国际标准定稿表决：20166 Part 1,FFPE tissue–Isolated RNA《石蜡包埋组织-RNA分离》；20166 Part 2,FFPE tissue-Isolated Proteins《石蜡包埋组织-蛋白质分离》；20166 Part 3,FFPE tissue-Isolated DNA《石蜡包埋组织-DNA分离》；20184 Part 1,Frozen tissue–Isolated RNA《冰冻组织-RNA分离》；20184Part 2,Frozen tissue-Isolated proteins《石蜡包埋组织-蛋白质分离》。

讨论了3个分子体外诊断检验-检验前过程规范的CD稿：；20186 Part 1,Blood-Isolated cellular DNA《血液样本-分离细胞DNA》;20186 Part 2,Blood-Isolated Genomic DNA《血液样本-分离基因组DNA》;20186 Part 3,Blood Isolated circulating cell-free DNA《血液样本-分离游离DNA的预处理》。

并对以下标准进行了讨论：ISO 17822-2 In vitro diagnostic test systems––Qualitative nucleic acid-based in vitro examination procedures for detection and identification of microbial pathogens-Part 2:Laboratory quality practice guide《体外诊断检测-核酸定性-基于微生物病原体检测和鉴定的体外检测程序-第2部分-实验室质量实践指南》、ISO21474 Molecular in vitro diagnostic examinations-General requirements to evaluate nucleic acid quality for multiplex molecular testing《分子体外诊断-评价多重核酸检测核酸质量的一般要求》、ISO 20776-1,Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems—Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices《临床实验室检测和体外诊断检测-传染性病原体药敏试验和药敏试验设备的性能评价》。

5.WG5工作组

会议讨论了ISO35001 Laboratory biorisk management system–Requirements《临床试验室生物安全管理系统-要求》，并计划于2017年9月前提交CD稿。

大会最终形成的决议有20余项，其中包括：

·Resolution 439:申请任命Neil Greenberg(US)、Dr.Claude Giroud(France)、Dr.Uwe Oelmueller(Germany)分别继续担任工作组WG2、3、4下一任召集人，任期3年。

·Resolution 440:DTS ISO/20658“Medical laboratory examinations—Requirements for collection,transport,receipt and handling of samples”做出版前的最后一次CIB投票。

·Resolution 441:NWIP-Guidance for POC Tsupervisors and operators提请CIB投票。

·Resolution 443：接受联络组织联络人的工作报告（ISO/TC 212 N507文件）并向他们的工作表示感谢。相关联络组织是ISO/CASCO(Committee on conformity assessment),IEC/TC 66,ISO/TC 34/SC9(Food productsMicrobiology),ISO/TC 150/SC7(Implants for surgery-Tissueengineered medical products),ISO/TC 276(Biotechnology),Asian Harmonization Working Party(AHWP),International Federation of Biomedical Laboratory Science(IFBLS),Biobanking and Bio Molecular resources Research Infrastructure(BBMRI-ERIC),European Federation of Laboratory Medicine(EFLM),International Laboratory Accreditation Cooperation(ILAC),European Commission(EC,formerly IRMM),World Health Organisation(WHO)。

·Resolution444-447：接受ISO 20916、ISO 17822-2保持原有出版架构并向前推进；接受对ISO/NP 21474标题的改动，并作为CD稿供专家审阅。

·Resolution 448：接受工作组4建议准备制定与ISO21474相关的系列标准文件。

·Resolution 449：建议各国对口机构秘书处移除各自全球专家团队中不活跃专家，以提高各工作组的工作能力。

·Resolution 450-451：同意对新工作项目提案ISO/NP21151标题的修改；同意ISO/NP 35001申请为CD稿。

·Resolution 452：同意各工作组的年会工作报告。

·Resolution 453-454：同意ISO20166 1～3,ISO201841～2作为FDIS，于2017年3月提交CIB投票。

·Resolution 456-457:ISO/TC 212的2017年会议和后续会议

体外诊断试剂临床试验技术指导原则 篇3

2009-05-15 09:00 发光免疫分析试剂是指利用特异的抗原抗体反应等生物学原理，利用发光信号的强弱来判断样本中相应抗原或抗体是否存在来进行检测的一类试剂。主要包括化学发光（酶促、非酶促），电化学发光和时间分辨荧光等法。

该指导原则主要适用于利用发光分析技术对蛋白质等被测物质进行检测的第三类试剂生产及质量控制，第二类试剂的生产及质量控制可参考该指导原则执行，国家食品药品监督管理部门将依据科学技术发展的需要，适时组织修订。

一、基本原则

（一）研制、生产用的各种原料、辅料应当制定相应的质量标准，并符合有关法规的要求。

（二）诊断试剂的生产企业应具备相应的专业技术人员、仪器设备以及适宜的生产环境，获得《医疗器械生产许可证》；同时，生产企业应按照《体外诊断试剂生产实施细则（试行）》的要求建立相应的质量管理体系，形成文件和记录，加以实施并保持有效运行；生产企业还应该通过《体外诊断试剂生产企业质量管理体系考核评定标准（试行）》的考核。企业应对试剂的使用范围做出明确规定，并经国家药品监督管理部门批准。

（三）诊断试剂的研制应当按照科学、规范的原则组织研发，各反应条件的选择和确定应符合基本的科学原理。

（四）研制生产过程中所用的材料及工艺，应充分考虑可能涉及的安全性方面的事宜。

（五）试剂生产和质量控制的总体目标：保证产品使用安全，质量稳定，工艺可控，使用有效。

二、原材料质量控制

（一）主要生物原料

与产品质量最密切相关的生物原料主要包括各种天然抗原、重组抗原、单克隆抗体、多克隆抗体以及多肽类、激素类等生物原科。这类原料可用于包被酶标反应板、标记相关酶（辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）、中和反应用抗原或抗体、制备校准品（标准品）等。一般按工艺要求对这类生物原料进行质量检验，以保证其达到规定的质量标准。主要生物原料若为企业自己生产，其工艺必须相对稳定；若购买，其供应商要求相对固定，不能随意变更供应商，如果主要原料（包括工艺）或其供应商有变更，应依据国家相关法规的要求进行变更申请。

主要生物原料的常规检验项目一般包括：

1．外观

肉眼观察，大部分生物原料为澄清均一的液体，不含异物、浑浊或摇不散的沉淀或颗粒；或者为白色粉末，不含其他颜色杂质；特殊生物原料应具备相应外观标准。

2．纯度和分子量

主要经SDS-PAGE 电泳后，利用电泳扫描仪进行分析，也可用其他适宜的方法，如高效液相法等。根据所检测生物原料的分子量选择适宜聚丙烯酰胺凝胶浓度进行电泳。一般每个电泳道加样量为5μg，电泳后的凝胶可用考马斯亮蓝染色或银染法染色。染色后的凝胶用电泳扫描仪分析原料的纯度和分子量，纯度应达到相应的质量标准，分子量大小应在正确的条带位置。

3．蛋白浓度

蛋白浓度可通过Lowry法、280nm 光吸收法、双缩脲方法等进行检测。

4．效价

效价的测定一般根据蛋白含量测定结果，通过倍比稀释法进行。效价应达到规定的要求。

5．功能性实验

功能性实验是指生物原料用于试剂盒实际生产中的情况，一般考查使用该原料的试剂盒的灵敏度、特异性和稳定性等，并比较其与上批次原料的相关性。

（二）生物辅料

生物辅料一般指在生产过程中作为蛋白保护剂用途的一类生物原料、主要包括小牛血清、山羊血清、牛血清白蛋白等。这些生物原料的质量标准应符合2000年版的《中国生物制品主要原辅材料质控标准》规定的标准要求，并且要适合于本企业的生产。

建议作以下检验：

1.牛血清或羊血清

外观：为浅黄色澄清稍粘稠的液体，无溶血或异物

无菌试验：将血清直接37℃度放置7天，放在明亮处观察，不得出现混浊或沉淀。

总蛋白含量：用双缩脲法测定，蛋白含量不小于32mg/ml。

球蛋白含量：取待测血清1ml，采用饱和硫酸铵法进行沉淀，沉淀溶于0.85%NaCl溶液，至1ml，用Lowry方法测定，蛋白含量应≤2mg/ml。

2.牛血清白蛋白：

外观：应为浅黄色、黄色或乳白色的冻干粉末，无吸潮，无结块，无肉眼可见的其它杂质颗粒。

溶解性：将牛血清白蛋白配成10%溶液，在18-26℃时，溶解时间应不大于15分钟。1%牛血清白蛋白水溶液的pH值应为6.5?7.1。

总蛋白含量：用双缩脲方测定，质量标准为≥95％。

总蛋白中的BSA含量：采用硝酸纤维素膜电泳法，其标准为≥95%。

BSA的净含量：总蛋白含量乘总蛋白中的BSA含量，其标准为≥90%。

3.酪蛋白：

酸度应符合生产所需的质量标准。

4．标记用酶

应在产品的质量标准中明示所使用的标记用酶的名称（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等），同时应根据不同生产厂家的检验方法和质量标准进行检验，酶的纯度RZ值（OD403nm/OD280nm）应大于3.0。

对于小牛血清或山羊血清、牛血清白蛋白以及酪蛋白等，还应进行功能性实验，即以其为原料配制一定浓度的稀释液作为样品，进行测定，均不得出现非特异性反应。

生物辅料的供应商同样要求相对固定，不得随意变更供应商。

（三）化学原材料

化学原材料的质量标准，包括外观、一般盐类检测、溶液pH值、重金属检测、溶解情况、干燥失重、炽灼残渣等，均应符合《中国生物制品主要原辅材料质控标准（2000年版）》分析纯级别的要求，并且要适合于本企业的生产。

1．无机类：主要包括有氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氯钠等。

2．有机类：主要包括有吐温20、三羟基氨基甲烷等。

3.特殊化学原料：Eu-DTTA，鲁米诺等。

Eu-DTTA纯度分析与鉴定：要求Eu-DTTA各功能团符合分子结构，纯度在96%以上。

（四）其他原辅料

1．微孔板条

外观：明亮处用肉眼观察板条的外观质量应无划痕、破损、飞边、肮脏、表面光滑。板条与微孔反应条塑料框架应配合合适。

材质：微孔反应板条每孔加200?L增强液，用发光免疫分析仪检测其荧光值，平均本底荧光值≤1500。

吸附能力和精密性：用一定浓度的蛋白包被微孔板条，检测荧光值，CV值结果应符合相关产品的功能性质量标准，一般批内CV≤5％,批间CV≤10％。

2．其他

粘胶纸、铝箔袋、说明书、包装外盒、瓶子和干燥剂等应参照国家食品药品监督管理局颁布的《体外诊断试剂说明书编写指导原则》和《医疗器械说明书、标签和包装标识管理规定》建立相应质量控制标准。

三、试剂盒各组分的生产

发光免疫分析试剂主要组分的生产包括包被反应板、标记物制备、各种溶液的配置、冻干、分包装等步骤；并通过产品的半成品检验和成品检验两个质控过程来保证其质量符合规定。

(一)固相载体的制备（因不同产品使用的包被载体有很大区别，在此以标准96孔微孔反应板为例进行描述）

1．包被板的准备

准备经检验合格的包被板，记录批号、数目、状态标识。

质控项目：尺寸，外观，包装。

2．包被液的配制

配制包被缓冲液，加入包被的抗体或抗原至工作浓度，混合均匀，即成所需的包被液，工作浓度的包被液应在规定时间内使用。

质控项目：包被缓冲液配方，pH值，包被物成份。

3．包被板的包被

包被液按工艺要求加入包被板。记录所包被的包被板数量。

质控项目：包被体积，温度，时间，过程监控。

4．洗板工作液的配制（按各单位工艺要求，可以不洗板）

按配方配制洗板工作液。

质控项目：洗板工作液配方，pH值。

5．封闭液的配制

按配方配制封闭液。

质控项目：封闭液配方，pH值。

6．洗板和封闭

包被完成后，抽去孔内包被液，用洗板工作液洗板后（按各单位工艺要求，可以不洗板），加入封闭液。

质控项目：封闭体积，温度，时间，过程监控。

质检项目：封闭前检验包被均一性。

7．抽干

封闭后的反应板，抽干孔内液体。

质控项目：过程监控。

8．干燥

反应板应按工艺的要求进行干燥。质控项目：温度，湿度，时间，过程监控等。

9．密封包装

将干燥后的反应板用铝箔袋密封包装，内放干燥剂（按各单位工艺要求，可以不放）。

质控项目：密封性能，标示及效期等。

10．反应板（半成品）检验

对装袋密封后的反应板进行抽样检验，外观、板内变异、板间变异。

(二)滴配过程

1．酶结合物的制备（根据各产品实际情况，该步骤可不进行）

采用常规过碘酸钠——乙二醇法将相关的抗体（或抗原）标记辣根过氧化物酶（或其他酶），酶标记后的抗体（或抗原）应加入适当的保护剂保存于低温。

质控项目：标记方法，过程控制。

2．酶结合物的鉴定

(1)功能性实验

将酶结合物用酶稀释液稀释后，用于产品的滴配，其结果应符合相关试剂盒的质量标准。

(2)稳定性

将酶结合物用酶稀释液稀释，进行2-8℃，及热稳定性实验，滴配结果应符合相关试剂盒的质量标准。

3．酶结合物稀释液

按酶结合物稀释液的配方配制，存放在2-8℃保存，并于规定时间内使用。

质控项目：酶结合物稀释液配方，pH值。

4．酶结合物工作浓度的滴配

取酶结合物，用酶结合物稀释液稀释到不同的浓度，用已制备好的反应板进行滴配。测定系列标准品及相应的质控品，确定使体系达到最优的酶结合物工作浓度。

5．酶结合物工作液配制

将所需量酶结合物和酶结合物稀释液按滴配浓度混合均匀。

质检项目：分装前检验，用配套的反应板进行检验，外观、灵敏度、质控品测定值、定量产品应作校准品线性检测。

6．酶结合物工作液的分装

按工艺要求分装酶结合物工作液。

质控项目：分装前确认试剂名称、批号、数量，分装量，封装后密封性。

7．酶结合物工作液（半成品）检验

对分装后的酶结合物工作液进行抽样检验，外观、分装量、灵敏度、校准品剂量-反应曲线线性、质控品测定值。

(三)校准品、阴/阳性对照或质控品的制备

1．稀释液

按稀释液的配方配制，存放在2?8℃或-20℃保存，并于有效期内使用。

质控项目：稀释液配方，pH值。

2．校准品、阴/阳性对照或质控品的配制

校准品、阴/阳性对照或质控品的配制应具有量值溯源性，可参照国家标准品、WHO标准品或其他级别的标准物质进行配制。

质检项目：分装前检验，准确性、剂量－反应曲线线性（定量产品）、质控品测定值。

3．校准品、阴/阳性对照或质控品的分装

按工艺要求分装校准品、阴/阳性对照或质控品。

质控项目：分装前确认试剂名称、批号、数量，分装量。4．校准品、阴/阳性对照或质控品（半成品）检验

对分装后的校准品、阴/阳性对照或质控品进行抽样检验，外观、分装量、准确性、剂量－反应曲线线性（定量产品）、质控品测定值。

(四)化学发光底物的制备

1．底物缓冲液

按底物缓冲液的配方配制，存放在2-8℃保存，并于有效期内使用。

质控项目：底物缓冲液配方，pH值。

2．化学发光底物（氧化剂和发光剂）的配制

分别按氧化剂和发光剂的配方在底物缓冲液中加入相应的氧化剂和发光剂

质控项目：氧化剂和发光剂配方。

质检项目：分装前检验，本底、发光强度。

3．化学发光底物（氧化剂和发光剂）的分装

按工艺要求分装化学发光底物（氧化剂和发光剂）。

质控项目：分装前确认试剂名称、批号、数量，分装量，封装后密封性。

4．化学发光底物（半成品）检验

对分装后的化学发光底物进行抽样检验，外观、分装量、本底、灵敏度、发光强度。

（五）铕标记物的制备

针对不同的标记生物原料，确定不同的标记制备工艺，包括铕-DTTA与标记生物原料的比例，标记温度和标记时间、标记得率的计算标准等。在实际操作过程中要求严格按照SOP进行操作

（六）冻干

各种冻干品都需建立各自的冻干工艺，冻干品外观应该呈现疏松的粉末状固体，具有一定的形状，复溶完全、迅速，呈澄清透明液体。

（七）分装、灯检和贴签

分装量用减重称量法进行测量，把质量换算成体积后进行分装量的控制。灯检是目测检查各组分的色泽、分装量以及是否混浊、有杂质等。

（八）包装

根据试剂盒包装SOP要求及说明书的要求，以流水线操作形式进行包装。包装时应严格检查品名、批号、装量，认真核对各物料数量，并在关盒前进行复核。

四、质量控制

（一）半成品质量控制

1．半成品抽样

检验人员按试剂的批号，根据抽样申请单抽取规定数量的半成品各组分，作号标记、待检。

2．质控品的要求

用于半成品质量控制的质控品包括阴/阳性样品符合率，灵敏度（最低检出量），特异性，检测范围，定量曲线的线性，精密性，稳定性等指标，如具有国家标准品或参考品的产品应使用国家标准品（参考品）或经国家标准品（参考品）标化的企业参考品进行检验。如无国家标准品（参考品），可采用企业参考品，企业参考品的制备应有规范的质量控制程序，以保证产品的安全性、有效性及质量可控，其质量应不低于国家食品药品监督管理局已经批准的同类产品的质量。

3．半成品检验

根据各个试剂盒的企业标准或者制检规程进行半成品的检验，检验指标一般包括准确性、灵敏度、特异性、精密性、相关性等，均应达到相应的质量标准。企业应对每一批试剂的半成品进行稳定性研究。试剂盒各组分应留样，2?8℃定期作稳定性考核，同时作37℃热稳定性试验，试验结果应符合产品的质量标准。

（二）成品质量控制

1．成品抽样

产品包装完成后，质检人员根据试剂的批号、实际包装量、抽样申请单的要求进行抽样，同时填写抽样数量和抽样日期，并且由抽样人签名。抽样数量应包括检验用数量和留样数量。质检人员同时应检查相关原始记录。

每一批试剂的报批批量应至少为10000人份。

2．成品检验

一般使用国家标准品（参考品）对成品进行检验，并达到国家标准品（参考品）的质量要求。若该诊断试剂没有国家标准品（参考品），则使用企业参考品，企业参考品的制备应有规范的质量控制程序，以保证产品的安全性、有效性及质量可控，其质量应不低于国家食品药品监督管理局已经批准的同类产品的质量。

体外诊断试剂临床试验技术指导原则 篇4

角膜塑形用硬性透气接触镜

临床试验指导原则

为进一步规范角膜塑形用硬性透气接触镜（以下简称角膜塑形镜）产品上市前的临床试验，并指导该类产品申请人在申请产品注册时临床试验资料的准备，根据《医疗器械临床试验质量管理规范》，制订本临床试验指导原则。

随着角膜塑形镜产品以及眼科学诊疗技术的发展和相关法规政策、标准制定等情况的变化，本指导原则将会不断地完善和修订。

一、适用范围

结合法规的具体要求，要求其进行完整的上市前临床试验时，适用于本项指导原则。

本指导原则适用于采用塑形方法暂时改变角膜形态，达到暂时性矫正屈光不正为预期目的的硬性透气接触镜产品的临床试验。

特殊设计的角膜塑形镜产品须结合申报产品自身特点另行制定其上市前临床试验方案，原则上不应低于本项指导原则的要求。

二、基本原则

申请人应当按照《医疗器械临床试验质量管理规范》的相关要求设计、实施、监查、记录、总结临床试验结果，并保证临床试验过程规范，结果真实、科学、可靠和可追溯。

三、临床试验方案

（一）临床试验目的及注意事项

角膜塑形镜产品的临床试验目的是评价申报产品是否具有预期的安全性和有效性。在临床试验中推荐使用LogMAR视力表（也称为EDTRS视力表），也可使用标准对数视力表。应采用标准的方法检查视力。如为多中心临床试验，不同的临床试验机构中使用的视力表须一致。同时涉及屈光度检查时，均应以受试者主觉验光值（包括球镜度及柱镜度）为准，客观验光数值（包括球镜度及柱镜度）应记录并作为参考。

（二）临床试验设计

以申请角膜塑形镜上市为目的的临床试验应是前瞻性、随机对照临床试验，临床试验应当在两个或者两个以上医疗器械临床试验机构中进行，如按照同一临床试验方案在3个以上（含3个）临床试验机构实施的临床试验将视为多中心临床试验。对照用医疗器械应选择中国已经批准上市的同类产品，其主要功能原理必须与受试产品一致，配戴方式必须一致，不建议采用历史对照或非平行对照。

（三）临床试验样本量

主要评价指标：30天的产品有效率。有效定义：当裸眼视力及屈光度均达到如下临床评价要求时为“有效”:

1.裸眼视力：裸眼视力应大于等于0.8。

2.残余屈光度：残余屈光度应小于±0.50D。

根据对照用角膜塑形镜的相应指标的循证医学相关资料做出检验假设并计算样本量。同时，样本量的确定与选择的假设检验类型（优效、非劣效、等效性检验）及I、II类错误和具有临床意义的界值（疗效差）有关，同时还应考虑预计排除及临床失访的病例数。

临床试验样本量的确定应当符合临床试验的目的和统计学要求，并且完成所有访视的受试者不应少于本指导原则中规定的最低样本量。目前，角膜塑形镜随机对照试验为与对照产品进行的1:1的不少于100对（200个受试者）的临床试验，要求受试者双眼均入组观察，双眼数据均须纳入统计分析，不推荐单眼患者入组。

（四）临床试验随访时间

不同产品的临床试验随访时间不完全一致，随访时间的确定应该具有医学文献资料支持，要有医学共识。

目前，角膜塑形镜的临床试验随访时间至少为12个月。同时，应当科学设置访视时间点（至少应包含戴镜后1天、1周、2周、30天、3个月、6个月、9个月、12个月）。

（五）临床试验受试者的入选标准及退出标准

临床试验受试者的入选标准应当考虑申报产品的适用范围。入组过程中，应在遵循随机原则的基础上，尽量兼顾组内及组间均衡性，可以包括但不限于：

1.近视度数为4.00D或更低。

2.角膜曲率计及角膜地形图。

3.柱镜度，顺规散光应低于1.75D，逆规散光应低于1.00D；

4.年龄（应为实足年龄）。应分为年龄≤13岁、13岁<年龄<18岁、年龄≥18岁共3组，研究对象应在3组间均衡分布，年龄≤13岁、13岁<年龄<18岁组每组不小于30例。

5.治疗前屈光度应稳定。

6.无角膜屈光手术病史。

7.眼球尤其是角膜应健康。

8.全身状况健康。

9.未使用影响眼球及角膜的药物。

10.女性未妊娠，且近期无妊娠计划。

制定受试者退出标准，统计受试者退出人数及原因。

（六）临床试验的有效性指标

临床试验的有效性指标在每次临床访视中均须如实记录。临床试验的有效性指标包括但不限于：

1.裸眼视力。应至少列出在戴镜后1天、1周、2周、30天、3个月、6个月、9个月、12个月及最终时间点裸眼视力。提供裸眼视力在试验组及对照组的统计学分析结果。

2.屈光度。应至少列出在戴镜后1天、1周、2周、30天、3个月、6个月、9个月、12个月及最终时间点的屈光度。提供屈光度在试验组及对照组的统计学分析结果。

3.角膜地形图。应至少列出在戴镜后1天、1周、2周、30天、3个月、6个月、9个月、12个月及最终时间点的角膜地形图的相关重要参数，提供试验组及对照组的统计学分析结果。

（七）临床试验的安全性指标

临床试验的安全性指标包括但不限于：

1.症状、体征、并发症、不良事件等。推荐在戴镜后1天、1周、2周、30天、3个月、6个月、9个月、12个月及最终时间点列出受试者的症状、体征、并发症、不良事件等，需提供试验组及对照组的统计学分析结果。

2.角膜曲率计及角膜地形图。推荐在戴镜后1天、1周、2周、30天、3个月、6个月、9个月、12个月及最终时间点的列出受试者的角膜曲率计及角膜地形图相关重要参数，需提供试验组及对照组的统计学分析结果。

3.角膜厚度及角膜内皮细胞参数。推荐在基线、研究中和末次访视时测量受试者的角膜厚度及角膜内皮细胞数，应分析试验组及对照组角膜塑形镜对角膜厚度及角膜内皮细胞数的影响。

4.最佳矫正视力。应至少列出在戴镜后1天、1周、2周、30天、3个月、6个月、9个月、12个月及最终时间点的访视时最佳矫正视力和初始最佳矫正视力分析结果，比较试验组及对照组中与初始最佳矫正视力相比最佳矫正视力下降1行、2行、或2行以上的受试者的比率。

5.柱镜度。应至少列出在戴镜后1天、1周、2周、30天、3个月、6个月、9个月、12个月及最终时间点的访视时柱镜度的分析结果，比较试验组及对照组中与初始屈光度相比，柱镜度增加1.00D以下、1.00D至2.00D、2.00D以上受试者的比率。

6.眼内压。推荐在戴镜后基线、研究中和末次访视时测量受试者的眼内压，应分析试验组及对照组角膜塑形镜对眼内压的影响。

7.角膜塑形镜的配适状态。应至少列出在戴镜后1天、1周、2周、30天、3个月、6个月、9个月、12个月及最终时间点的访视时角膜塑形镜的适配状态。

8.记录镜片的破损率、划痕、蛋白沉淀等情况。应至少列出在戴镜后1天、1周、2周、30天、3个月、6个月、9个月、12个月及最终时间点的访视时镜片的破损率、划痕、蛋白沉淀等情况。

（八）统计分析方法

数据分析时应考虑数据的完整性，所有签署知情同意并使用了受试产品的受试者必须纳入最终的统计分析，应提供患者水平（受试者数）及病例水平（受试眼数）的主要疗效指标分析结果。数据的剔除或偏倚数据的处理必须有科学依据和详细说明。

临床试验的数据分析应基于不同的分析集，通常包括全分析集（Full

Analysis

Set，FAS）和符合方案集（Per

Protocol

Set，PPS），研究方案中应明确各分析集的定义。主要评价指标的分析应同时在全分析集和符合方案集上进行，以评价结果的稳定性。全分析集中脱落病例，其主要评价指标缺失值的填补方法应在方案中予以事先说明，并于研究结束后进行灵敏度分析，以评价缺失数据对研究结果稳定性的影响。

临床试验数据的分析应采用国内外公认的经典统计分析方法。临床试验方案应该明确统计检验的类型、检验假设、判定疗效有临床意义的界值等，界值的确定应有依据。

对于主要评价指标，统计结果需采用点估计及相应的95%置信区间进行评价。不能仅将p值作为主要评价指标的评价依据。

（九）临床试验报告和统计分析报告

1.临床试验报告。由临床试验牵头单位根据基于所有入选受试者的总的统计分析报告，出具临床试验报告。各临床试验单位出具临床试验小结。各临床试验单位不需要单独出具分中心统计报告。临床试验报告内容包括：试验目的、试验假设、主要评价指标、评价方法、对照品、入选/排除标准、样本量及计算依据、受试者资料、试验质量控制措施、数据管理及质控措施、试验结果、伴随治疗、不良事件、并发症及其处理、试验结论、适用范围、禁忌症和注意事项、存在问题及改进意见等。

此外，需注意以下问题：

（1）临床试验报告应与临床试验方案保持一致。

（2）明确所有病例是否全部完成随访，所有接受了医疗器械治疗的病例是否均纳入最终的统计分析，失访病例需明确失访原因。

（3）提交疗效评价与安全性评价统计过程中所涉及的原始数据。

（4）报告所有不良事件发生的时间、原因、后果及与试验用器械的关系，对于所采取的处理措施需予以明确。

2.统计分析报告。应将所有中心的数据合并在一起进行统计分析，并出具总的统计分析报告。应对随机对照部分和单组部分数据分别进行统计分析，并出具相应的统计分析报告。为了保证受试者的安全性和数据的完整性，建议采用中央注册或中央随机系统分配治疗。应对所有入选的受试者进行数据管理和质量控制，遇有不清楚的问题时，应通过临床试验的监查员与原始记录核对。统计分析报告应至少包括如下4部分内容：

（1）临床试验完成情况描述：包括临床试验概况（筛选人数、入组人数、完成试验人数、失访/退出/剔除人数等）；

（2）基线描述：应对所有入选受试者（ITT分析集）的基线人口统计学指标、生命体征及其他相关病史指标等进行描述；

（3）疗效/效果评价：应对全分析集和符合方案集分别进行统计分析；

（4）安全性评价时，应对所有入组的受试者进行分析，不能遗漏所有发生的任何不良事件。同时，详细描述每一病例出现的全部不良事件的具体表现、程度、预后及其与研究产品的关系。

四、参考文献：

1.《医疗器械注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第4号）

2.《医疗器械临床试验质量管理规范》（国家食品药品监督管理总局

中华人民共和国国家卫生和计生委员会令第25号）

3.《关于发布医疗器械临床评价技术指导原则的通告》（国家食品药品监督管理总局通告2015年第14号）

4.Guidance

for

Premarket

Submissions

of

Orthokeratology

Rigid

Gas

Permeable

Contact

Lenses.（美国FDA）

5.瞿佳.《视光学理论和方法》人民卫生出版社

2004

6.葛坚.《眼科学》人民卫生出版社

2005

五、起草单位

体外诊断试剂临床试验技术指导原则 篇5

保健食品注册检验机构应按照国家相关规定和标准等要求，根据样品具体情况，合理地进行稳定性试验设计和研究。

一、基本原则

（一）保健食品稳定性试验是指保健食品通过一定程序和方法的试验，考察样品的感官、化学、物理及生物学的变化情况。

（二）通过稳定性试验，考察样品在不同环境条件下（如温度、相对湿度等）的感官、化学、物理及生物学随时间增加其变化程度和规律，从而判断样品包装、贮存条件和保质期内的稳定性。

（三）根据样品特性不同，稳定性试验可采取短期试验、长期试验或加速试验。

1.短期试验：该类样品保质期一般在6个月以内（含6个月），在常温或说明书规定的贮存条件下考察其稳定性。

2.长期试验：该类样品一般保质期为6个月以上，在说明书规定的条件下考察样品稳定性。

3.加速试验：该类样品一般保质期为2年，为缩短考察时间，可在加速条件下进行稳定性试验，在加速条件下考察样品的感官、化学、物理及生物学方面的变化。

二、试验要求

（一）样品分类。

1.普通样品。对贮存条件没有特殊要求的样品，可在常温条件下贮存，如固体类样品（片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂等）；液体类样品（口服液、饮料、酒剂等）。

2.特殊样品。对贮存条件有特殊要求的样品，如益生菌类、鲜蜂王浆类等。

（二）样品批次、取样和用量。应符合现行法规，满足稳定性试验的要求。

（三）样品包装及试验放置条件。稳定性试验的样品所用包装材料、规格和封装条件应与产品质量标准、说明书中的要求一致。

1.普通样品。加速试验应置于温度37±2℃、相对湿度RH75±5%、避免光线直射的条件下贮存3个月。短期试验、长期试验应在说明书规定的储存条件下贮存，贮存时间根据产品质量标准及说明书声称的保质期而定。

2.特殊样品。在说明书规定的贮存条件下贮存。

（四）试验时间。稳定性试验中应设置多个考察时间点，其考察时间点应根据对样品的性质（感官、理化、生物学）了解及其变化的趋势设定。

1.普通样品。长期试验一般考察时间应与样品保质期一致，如保质期定为2年的样品，则应对0、3、6、9、12、18、24个月样品进行检验。0月数据可以使用同批次样品卫生学试验结果。

加速试验一般考察时间为3个月，即对放置0、1、2、3个月样品进行考察。0月数据可以使用同批次样品卫生学试验结果。

2.特殊样品。在说明书规定的贮存条件下进行考察。保质期在3个月之内的，应在贮存0、终月（天）进行检测；保质期大于3个月的，应按每3个月检测一次（包括贮存0、终月）的原则进行考察。

（五）考察指标。应按照产品质量标准规定的方法，对申请人送检样品的卫生学及其与产品质量有关的指标在保质期内的变化情况进行的检测。

（六）检测方法。应按产品质量标准规定的检验方法进行稳定性试验考察指标的检测。

三、结果评价

保健食品稳定性试验结果评价是对试验结果进行系统分析和判断，检测结果应符合产品质量标准规定。

（一）贮存条件的确定。应参照稳定性试验研究结果，并结合保健食品在生产、流通过程中可能遇到的情况，同时参考同类已上市产品的贮存条件，进行综合分析，确定适宜的产品贮存条件。

（二）直接接触保健食品的包装材料、容器等的确定。一般应根据保健食品具体情况，结合稳定性研究结果，确定适宜的包装材料。

（三）保质期的确定。保健食品保质期应根据产品具体情况和稳定性考察结果综合确定。采用短期试

体外诊断试剂临床试验技术指导原则 篇6

1 材料

1.1 药品与试剂

石菖蒲、五倍子、黄芩、黄连、黄柏、菊花、大黄、金银花、秦皮、艾叶、白头翁、白芍、甘草、栀子、诃子、马齿苋、郁金、地榆、石榴皮、土茯苓、木香21种中草药, 均购于常德市某中药店;猪大肠杆菌供试细菌, 2014年6月份从常德市某猪场腹泻猪病料中分离、鉴定并保存;营养肉汤培养基、营养琼脂培养基 (按常规方法制备[3], 高压灭菌, 保存于4℃冰箱中, 备用) , 购自杭州微生物试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

生化培养箱 (型号为LRH-150) 、电热恒温 (鼓风) 干燥箱 (型号为DHG-9240A) , 上海一恒科学仪器有限公司生产;立式压力蒸汽灭菌器 (型号为BXM-30R) , 上海博迅医疗生物仪器股份有限公司生产;电子天平 (型号为BS223S) , 北京赛多利斯仪器系统有限公司生产;粉碎机 (型号为FW100) , 天津市泰斯特仪器有限公司生产;垂直净化工作台 (型号为SP-DJ) , 上海浦东物理光学仪器厂生产;冰箱 (型号为BCD-215KS) , 青岛海尔股份有限公司生产;试管、烧杯、培养皿、移液枪、打孔器等, 均为市售。

2 方法

2.1 中草药组方及复方药液的制备

将21种单味中草药按一定比例组成8组复方。复方1:石菖蒲、五倍子、黄芩、菊花;复方2:石菖蒲、黄芩、大黄、金银花;复方3:大黄、黄芩、秦皮、艾叶;复方4:白头翁、黄连、黄柏、秦皮;复方5:马齿苋、白头翁、黄柏、五倍子、甘草;复方6:郁金、诃子、黄芩、大黄、黄连、栀子、黄柏、白芍;复方7:地榆、石榴皮、土茯苓;复方8:黄连、白头翁、木香、甘草[4]。

采用水煎法制备复方中草药水提液。分别称取粉碎后的中草药复方制剂50 g, 置于500 m L烧杯中, 加入400 m L纯化水, 浸泡1 h后, 强火加热至沸腾, 改用文火煎煮30 min, 4层纱布过滤, 药渣再加入适量纯化水, 按上述方法煎熬过滤除去滤渣, 合并2次滤液, 过滤, 加热浓缩至50 m L, 使药液浓度为1 g/m L。将药液装入100 m L生理盐水瓶中, 高压蒸汽灭菌后, 置于4℃冰箱中保存, 备用。

2.2 试验菌的制备

用接种环挑取临床病猪分离并保存的猪大肠杆菌, 接种到营养肉汤培养基中, 在37℃恒温培养箱中培养24 h, 接种于营养琼脂培养基上, 置37℃恒温培养箱中培养24 h。挑取典型菌落接种于新鲜营养肉汤培养基中, 37℃培养16~18 h。用灭菌纯化水稀释培养液, 使菌种浓度达1×105~1×109cfu/m L, 保存, 备用。

2.3 复方中草药制剂敏感性的测定

采用平板打孔法[5]进行药物敏感性试验。用灭菌移液枪吸取菌液25μL于营养琼脂平板上, 并用玻璃刮铲涂布均匀, 菌液干燥后用孔径6 mm的打孔器均匀打孔, 去除孔内琼脂并用少量琼脂封闭孔底。将复方中草药水提液加入孔中, 以满而不溢为宜, 置于4℃冰箱中1 h后取出, 于37℃恒温箱中培养24 h, 测量抑菌圈直径, 每种药重复3次。判断抑菌效果, 以无抑菌圈为不敏感, 抑菌圈直径小于10 mm为低敏, 10~15 mm为中度敏感, 大于15 mm为高度敏感[6]。

2.4 中草药复方制剂最小抑菌浓度的测定

采用2倍稀释法测定各组复方中草药制剂对猪大肠杆菌的体外最小抑菌浓度 (MIC) 。以复方1水提液为例, 其他操作相同。按无菌操作规程取6个灭菌的试管, 编号, 用移液枪分别加入2 m L营养肉汤培养基, 第1管中加入浓度为1 g/m L的灭菌复方1水提液2 m L, 混匀后吸取2 m L加至第2管中, 依次类推, 直至第5管, 第5管中吸取2 m L混合液弃去, 使之成为1︰2、1︰4、1︰8、1︰16、1︰32的5个浓度梯度, 第6管做阴性对照。然后向各试管中加入25μL的菌液, 混合均匀。置于37℃恒温培养箱培养18~24 h, 观察试管中细菌生长状况, 以浑浊度为指标检测瓶中有无细菌生长。因药物颜色的影响, 无法用肉眼准确观察判断药物的最小抑菌浓度, 需结合平板接种进行判断。将25μL各浓度混合液加入到营养琼脂平板培养皿上, 用玻璃刮铲涂匀, 置于37℃恒温培养箱中培养18~24 h后, 观察并记录各培养皿琼脂平板上的菌落生长状况, 以无菌生长的最低稀释浓度为复方中草药最小抑菌浓度。

3 结果与分析

3.1 复方中草药制剂敏感性测定

在复方中草药制剂浓度为1 g/m L时, 中草药复方3、复方7对猪大肠杆菌呈高度敏感, 抑菌圈直径分别为16 mm和25 mm;复方6呈中度敏感, 抑菌圈直径为13 mm;复方1为低敏, 抑菌圈直径为7 mm;其他复方中草药制剂对猪大肠杆菌不敏感。

3.2 复方中草药制剂最小抑菌浓度测定

注:“-”表示无菌生长;“+”表示有菌生长, 随“+”数增加菌落长势增强。

结果见表1。

由表1可见, 复方3、复方7水提液对猪大肠杆菌体外抑菌效果较好, 最小抑菌浓度为250 mg/m L;复方1、复方6、复方8水提液对猪大肠杆菌抑菌效果次之, 最小抑菌浓度为500 mg/m L;复方5水提液有一定抑菌作用, 其菌落数随药物浓度升高呈降低趋势;复方2、复方4无抑菌作用。

4 讨论与结论

本试验结果表明, 8组复方中草药水提液对临床病猪分离的猪大肠杆菌敏感性及抑菌作用效果不同, 复方3、复方7水提液对猪大肠杆菌体外抑菌效果较好, 复方1、复方6、复方8水提液对猪大肠杆菌抑菌效果次之;复方5水提液抑菌作用效果较差;复方2、复方4无抑菌作用。组方中某些单味中草药单独体外抑菌作用效果较好, 组成复方后效果不明显, 如五倍子水提液单独作用时对猪大肠杆菌体外抑菌效果较好[7], 组方后 (复方5) 抑菌作用不明显;大黄单独作用时对猪大肠杆菌效果不明显[7], 组方后 (复方3) 抑菌效果较好。复方中草药抑菌作用效果与单味中草药抑菌效果存在较大差异, 主要原因是:1) 由于复方中草药成分复杂多样, 组成复方后可能存在药物的协同作用或拮抗作用;2) 因不同中草药有效活性成分提取方法不同, 试验所选用的8组复方均采用混合后水煎法制备水提液, 可能会降低某些成分提取, 影响药物体外抑菌作用效果;3) 高压灭菌、复方制剂的浓度和纯度等其他因素, 对体外抑菌作用效果也可产生一定的影响, 而且复方中草药成分多样, 抑菌机制复杂, 影响因素较多, 有待深入研究。复方中草药体外抑菌作用好的组方在临床应用时由于环境不同, 机体生理机能状况等因素, 使中草药体内外的抑菌效果并不完全一致[8]。因此, 还要进行动物试验将体外抑菌试验效果与机体内部作用结合, 才能为复方中草药制剂的研制开发提供更有力的依据。

中药组方配伍是中医药研究的重点与难点之一, 也是中医辨证论治理论精髓的具体体现[9]。在兽医临床上应用复方中草药制剂治疗畜禽疾病更利于健康生态养殖模式。本试验测得的复方中草药对临床分离猪大肠杆菌的体外抑菌作用结果, 对兽医临床用复方中草药治疗猪大肠杆菌引起的感染起到一定参考价值。

参考文献

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体外诊断试剂优化方案 篇7

本试验采用改良过碘酸钠法将辣根过氧化物酶标记在抗体上[1]，标记完后取上清用Sephedex G200 凝胶层析进行纯化，洗脱液为0.2mol/L pH7.4的PBS，流速为15ml/h，分步收集，每支3ml，以紫外分光光度计测A280吸光度值，以洗脱体积为横坐标，吸光值为纵坐标做图，收集第一峰即为酶标抗体峰。

标记完后用紫外分光光度计在分别在280nm、及403nm处测定酶标记物的A值，计算免疫球蛋白量、摩尔比值、酶结合率以及标记率。1.2 包被用缓冲液及最适包被抗原浓度的优化 1.2.1 包被缓冲液的优化

包被抗原时，为了得到最佳的包被效果，我们采用了碳酸盐缓冲液（50mM ph9.6）、磷酸盐缓冲液（50mM ph7.6）、以及TRIS盐酸缓冲液（50 mM ph7.6）三种缓冲液作为包被液，抗原包被浓度为5ug/ml，及2.5ug/ml,酶标抗体工作浓度为1：400及1：300，用自动酶标仪分析，选择最佳的包被缓冲液系统。同时为了保证缓冲液能够长期保存，我们在包被液中添加了0.01%的硫柳汞作为防腐剂。1.2.2 最适抗原包被浓度的优化

用优化好的包被缓冲液，将包被抗原（ALB）稀释成0.1ug/ml，1.0ug/ml，2.0ug/ml，4.0 ug/ml，6.0 ug/ml，8.0 ug/ml，10.0 ug/ml等六个浓度，包被微孔板，每孔100ul；竞争抗原浓度为4.0 ug/ml，2.0 ug/ml；酶标抗体稀释度为1：300，经孵育、显色、终止后用自动酶标仪分析。显色的强度在一定范围内与包被的抗原量成正比，但随着包被抗原浓度的增加，显色的强度反而降低，我们选择临界包被值作为包被抗原量。1.3 封闭液、洗涤液及保护液的优化 1.3.1 封闭液的优化

采用文献报道的方法进行封闭，其封闭液的组成为：10mM磷酸盐缓冲液含1%的牛血清白蛋白（BSA）。1.3.2 洗涤液的配制

采用文献报道的方法配制洗涤液。1.3.2 酶标板保护液的优化

酶标板经过封闭后在低温下仅能存放2周左右，为了延长固相酶标板上抗原的稳定性，我们增加了一步保护酶标板的程序。在10mM的磷酸盐中加入适量的糖、无关蛋白质、庆大霉素以及二价金属离子，作为酶标板保护剂，在封闭完后加入保护液于4℃冰箱中孵育过夜，同时与未做保护的酶标板进行对照，然后将保护的及未保护的酶标板置于37烘箱中放置15天，考察保护液对酶标板的稳定性的影响。1.4 酶标抗体稀释度的优化

抗原包被浓度为4ug/ml,将酶标抗体做系列稀释：1：100，1：200；1：300；1：400；1：500；1：600；1：1000；经孵育、洗涤后、显色终止后，用自动酶标仪分析，选择A值为1.5左右的酶标抗体稀释度为最适工作浓度。1.5 酶标抗体保护液的优化

低浓度的酶标抗体极容易受到高温、微生物、以及蛋白酶的影响而失活，严重影响产品的货架期，过去通常将酶标抗体冻干保存，然而这样的保存，不仅由于在冻干的过程中会影响酶标抗体的活性，而且在临床应用中颇为不便。适当的缓冲液以及添加无关蛋白质、糖、防腐剂以及一些含氨基的化合物等都会对对酶标抗体的活性起一定的保护作用，因此我们设计了一组保护剂用于保护酶标抗体，与未添加任何糖蛋白的酶标抗体做对照，将经保护的酶标抗体及未保护的酶标抗体置于37℃烘箱中放置6天，考察保护液对酶标抗体的影响。1.6 底物液的优化

常用的作为酶联免疫吸附试剂有OPD和TMB系统，由于OPD有致癌的危险性以及用前需要溶解等诸多缺点，因此我们选用TMB作为底物系统，采用文献报道的方法：取适量的TMB溶解在DMSO中，然后加入适量的超纯水，配制作为底物B液；溶解适量的过氧化氢尿素于100mM磷酸-柠檬酸缓冲液中，配制作为底物A液，用前将底物A液及底物B液等体积混合。

在文献报道的基础上，我们适当调整了TMB的用量以及过氧化氢尿素的用量，并加入了酶促进剂，与文献报道的底物进行比较。实验方案为：将活化的辣根过氧化物酶分别作1：1000；1：10000；1：100000；1：200000；1：400000；1：800000等系列稀释，比较两种不同配方的底物的灵敏度。1.7 标准品及样品稀释液

我们采用10mM的磷酸盐缓冲液内含0.5%的BSA作为标准品及样品的稀释液。1.8 抗原抗体反应时间的优化

抗原抗体反应会随着时间的增加，反应量也增加，但达到一定的时间后，反应即达到平衡，我们取反应10min，20min，30min，40min，50min，60min，70min,90min等8个点进行比较，以确定最佳抗原抗体反应时间。1.9 底物作用时间的优化

在其它条件相同的情况下，我们取5min,10min,15min,20min,25min,30min,35min 40min,50min,60min,80min等11个时间点进行比较，确定最佳的底物作用时间。1.10 剂量反应曲线的建立及曲线拟合方式的确定