分离培养（通用12篇）
分离培养 篇1
驯鹿是一种珍贵的经济动物, 在我国分布范围很小, 仅限于大兴安岭西北坡, 数量稀少, 是我国二级保护动物。驯鹿为半野生状态, 是主要以苔藓、石蕊等木质素含量较低的软纤维植物为主食的反刍动物[1];因此, 驯鹿胃肠道的消化和免疫功能与一般家养的反刍动物相比产生了一些适应性变化, 从而不能适应普通的圈养生活, 圈养的部分驯鹿因消化不良等引起疾病而死亡, 因此有必要对驯鹿的胃肠道生理特点进行深入的了解, 从而建立驯鹿瘤胃上皮细胞的体外培养方法对体外研究驯鹿瘤胃的生理功能有重大意义。
有资料显示, 对于反刍动物瘤胃上皮细胞的培养技术早在1980年就有记录, P.Gálfi等[2]采取胰蛋白酶消化法对牛瘤胃上皮细胞进行分离, 并成功培养了牛的瘤胃上皮细胞。此后, 研究者们在此基础上对反刍动物瘤胃上皮细胞的培养技术进行了多次改进, 但大多局限于牛和绵羊[3], 其他反刍动物瘤胃上皮细胞体外培养的技术鲜有报道, 而对驯鹿瘤胃上皮细胞体外培养的技术未见报道。
本研究以内蒙古呼伦贝尔市敖鲁古雅乡的中国驯鹿为研究对象, 结合牛、羊瘤胃上皮细胞的培养技术对驯鹿的瘤胃上皮细胞进行原代分离及体外培养, 以期为相关的体外研究提供一定的技术支持。
1 材料
1.1 试验动物
驯鹿, 内蒙古自治区呼伦贝尔市某猎民点淘汰的驯鹿。
1.2 主要试剂
细胞培养试剂:M199培养基和胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂 (insulin-transferrin-selenium-X) (ITS) , 购自Gibco公司;胰蛋白酶 (trypsin) 、L-谷氨酰胺、Na HCO3, 购自Sigma公司;胎牛血清 (FBS) , Hyclone公司生产;两性霉素B, 购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
细胞培养用液:磷酸盐缓冲液 (PBS) , M199培养基添加了15%的FBS、2 mmol/L L-谷氨酰胺、2μg/m L ITS、200 IU/m L青霉素及200μg/m L链霉素等。
细胞鉴定试剂:细胞角蛋白一抗 (醛缩酶A, CK19) , 购自Sigma公司;即用型快捷免疫组化MaxVisionTM试剂盒和苏木素体细胞快速染色液, 由福州迈新生物技术有限公司提供。
其余试剂为实验室常规试剂。
2 方法
2.1 驯鹿瘤胃上皮细胞的分离
将取来的瘤胃组织用4℃灭菌生理盐水冲洗去食糜及污染物后, 浸入4℃灭菌PBS溶液 (含500μg/m L青霉素, 250μg/m L链霉素, 0.5μg/m L两性霉素B, 100μg/m L庆大霉素) 中, 带回实验室;钝性分离瘤胃组织的黏膜上皮层和固有层, 并取2~4 cm2的上皮层以上述PBS溶液反复清洗3次, 再用不含抗生素的灭菌PBS溶液浸泡10 min;置入约15 m L 0.25%Trypsin-0.02%EDTA消化液中于37℃水浴中连续振荡消化, 每30 min取其消化液过滤并于显微镜下观察, 同时更换新的消化液, 直至消化液中出现非上皮细胞。将主要包含上皮细胞的消化液用200目的不锈钢细胞滤网过滤收集并用15 m L含有10%血清的培养液终止消化。将混合液转移至离心管, 吹打混匀后1 500 r/min离心10 min;弃去上清液, 加入PBS缓冲溶液后, 充分吹打混匀, 1 500 r/min离心10 min;如此反复洗涤2次, 第2次弃去上清液后, 加入10 m L完全培养液, 充分吹打混匀后, 调整细胞密度至1×105/m L, 并转移至细胞培养瓶中, 于37℃、5%CO2的培养箱中静置培养, 24 h后观察有无染菌, 在显微镜下观察其生长状况。
2.2 驯鹿瘤胃上皮细胞的传代培养
培养基采用M199加15%的FBS, 将细胞分装于25 cm2培养瓶中, 置于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养48~72 h后, 更换培养液, 弃去未贴壁的细胞, 根据细胞生长情况, 每3~4 d全量换液1次。待细胞达到80%~90%融合时, 用0.25%Trypsin-0.02%EDTA消化液消化3~4 min, 显微镜下观察, 如细胞隆起, 胞质回缩变圆、变亮, 加入含有血清的培养液终止消化, 并用移液枪轻轻吹打使之悬浮, 再转移至离心管中离心、洗涤 (方法同原代培养) , 最后转移至细胞培养瓶中, 继续于37℃、5%CO2的培养箱中静置培养。
2.3 驯鹿瘤胃上皮细胞的形态学观察及免疫细胞化学鉴定
在显微镜下对细胞的形态和生长情况进行观察。
根据上皮细胞的标志性中间丝蛋白为细胞角蛋白, 对驯鹿瘤胃上皮细胞的角蛋白进行免疫细胞化学的鉴定。取对数生长的瘤胃上皮细胞用37℃的0.25%Trypsin-0.02%EDTA消化液消化下来, 在6孔细胞培养板中进行常规的盖玻片爬片培养 (3 d) ;取出爬片, 用4%多聚甲醛固定15 min;PBS洗涤3次, 加0.5%Triton作用20 min;PBS洗涤3次, 加3%H2O2孵育15 min;PBS洗涤3次, 加封闭血清孵育20 min;加入一抗, 37℃孵育60 min;PBS冲洗3次, 加入通用型二抗工作液37℃孵育30 min;PBS洗涤3次;DAB显色;自来水冲洗;苏木素核复染, 自来水冲洗;显微镜下观察照像。空白对照用PBS代替一抗。
3 结果
3.1 驯鹿瘤胃上皮细胞的分离结果
瘤胃上皮细胞经0.25%Trypsin-0.02%EDTA消化液消化第4次起在显微镜下可观察到大量上皮细胞分散存在, 直到消化至第6次, 细胞数量开始减少, 且组织变得黏腻。收集后于显微镜下观察, 可见细胞数量多, 单个散在, 大小均一, 具有较好的折光度 (见228页彩图1A) 。调整细胞密度进行培养, 培养的细胞在72 h后有大部分贴壁, 细胞颜色发暗, 呈多角形, 并已开始生长, 呈岛屿状分布;也有未贴壁悬浮的细胞, 细胞折光度好, 体积较小, 形态较圆 (见228页彩图1B) 。96 h后生长迅速, 细胞增殖明显, 可见典型的铺路石状生长, 进入对数生长期 (见228页彩图1C) 。随后的7~9 d, 细胞生长融合成片, 呈单层状生长 (见228页彩图1D) 。
3.2 驯鹿瘤胃上皮细胞的传代培养结果
传1代后的细胞可在12 h内贴壁, 并迅速进入对数期生长增殖, 细胞形态完整, 生长良好 (见228页彩图2A) , 可在3~4 d铺满细胞瓶。传2代后细胞增殖迅速, 但细胞形态发生变化, 大小极不均一, 部分细胞胞体宽大、扁平, 胞浆内出现空泡和黑色颗粒 (见228页彩图2B) , 后期细胞增殖减慢, 甚至生长停滞, 逐渐死亡, 从瓶壁脱落。
3.3 驯鹿瘤胃上皮细胞的形态学及免疫细胞化学鉴定结果
细胞经分离培养48 h后, 可见细胞单个或数个贴壁, 呈扁平多角形, 胞浆丰富, 轮廓清晰。进入对数期后, 细胞呈小岛屿状生长, 各细胞岛屿间可见有细胞连接。7~9 d时, 各细胞岛屿连接成片, 呈铺路石样生长, 是典型的上皮形态 (见228页彩图3A) 。经免疫细胞化学方法的鉴定, 可见细胞胞浆为黄褐色, 即角蛋白CK19染色呈阳性 (见228页彩图3B) , 可判断所培养细胞为上皮细胞。
4 讨论
近年来, 我国驯鹿的数量一直徘徊在千只左右, 内蒙古大兴安岭北部敖鲁古雅民族自治乡的驯鹿是我国唯一的驯鹿种群, 均为鄂温克族所豢养, 呈半野生状态。虽然我国于2003年实行了生态移民, 但移民后的2个月间 (7—9月份) 有200多头驯鹿因消化不良引起疾病死亡, 驯鹿种群数量由搬迁前的800多只下降至不足600只[4]。无奈大部分鄂温克族人又牵着驯鹿返回原始森林过着游牧生活, 不定期地迁居, 是中国最后的狩猎部落。因此, 加强驯鹿圈养的相关科学研究, 不仅能恢复驯鹿种群的数量, 也是结束“中国最后狩猎部落”的有效办法。
P.Gálfi等[2]首次培养牛的瘤胃上皮细胞时采用剪切瘤胃乳头的方法进行分离及培养, 成功建立了牛的瘤胃上皮细胞的体外培养方法;同样类似的方法于第2年成功地培养了绵羊瘤胃上皮细胞[5];F.Stumpff等[6]在前人的培养技术基础上改进了取材方法, 设计并制作了一种模具, 使胰蛋白酶只作用于乳头来分离上皮细胞;沈赞明等[7]在培养奶公牛瘤胃上皮细胞时, 钝性分离瘤胃黏膜上皮与固有层以获得较为纯净的上皮细胞。本试验在总结前人试验的基础上, 采用钝性分离瘤胃黏膜得到上皮层的方法, 对上皮组织整体进行胰蛋白酶消化, 经试验鉴定获得了可扩增培养的瘤胃上皮细胞。本试验方法简便易行, 具有较强的可操作性。
有研究表明, 胃肠道上皮细胞的原代培养已在实践中大量应用。有人指出, 人的胃黏膜上皮细胞是以胶原酶和透明质酸酶对胃黏膜进行处理得到的[8];猪小肠黏膜上皮细胞采用组织块贴壁法能获得活性好的黏膜上皮细胞[9];而周传丽等[10]报道, 利用Ⅺ型胶原酶和Ⅰ型中性蛋白酶的混合液灌注仔猪小肠能消化分离小肠黏膜上皮组织得到形态完整、容易贴壁生长的小肠绒毛细胞团。本试验采用0.25%的胰蛋白酶-0.02%EDTA对驯鹿瘤胃黏膜上皮进行处理, 结果表明, 可以获得大量活性较好的上皮细胞, 易于培养。
反刍动物的瘤胃壁由黏膜、黏膜下层、肌层和浆膜4层构成。瘤胃黏膜表面被覆复层扁平上皮, 其由外至内分为角质层、颗粒层、棘细胞层和基底层[11], 其中角质细胞没有细胞活性, 而基细胞具有很强的分裂增殖能力, 其次为颗粒细胞[2]。分离瘤胃上皮细胞时选择胰酶多次连续振荡消化可获得大量上皮细胞, 但在细胞的游离状态下不能确切区分每一层的细胞。本试验中发现, 角质细胞不贴壁, 不生长, 不影响其他细胞的贴壁和生长, 在换液时会随细胞培养液被弃掉。由本试验结果可以推测, 尽管细胞贴壁生长但由于处于非生理的条件下, 在显微镜下观察均呈典型的上皮样生长, 不体现颗粒细胞、棘细胞或是基细胞的形态特性。
角蛋白存在于上皮细胞胞浆中构成上皮细胞内细胞骨架, 是上皮细胞中特异性的抗原, 具有多种表型。有人对仔猪小肠黏膜上皮细胞[9]和肾小管上皮细胞[12]的CK18进行了鉴定;多曙光等[13]对牛乳腺上皮细胞中的CK5和CK8进行了鉴定;李海甲[14]培养的兔气管黏膜细胞是采用广谱抗角蛋白单克隆抗体进行免疫组织化学染色。本试验在形态鉴定的基础上, 对所培养细胞中的角蛋白CK19进行了免疫细胞化学的染色, 呈阳性反应。
尽管对于瘤胃细胞的原代培养有大量文献佐证, 但未见有关其传代培养的报道。本试验经多次反复尝试与改进, 成功地进行了驯鹿瘤胃上皮细胞的传1代体外培养, 但对于驯鹿瘤胃上皮细胞能否连续传代培养, 是否受培养条件局限, 仍需进一步验证。
J.J.Gildea等[15]分别用传统的方法和三维细胞培养技术培养了人的肾上皮细胞, 结果表明, 用三维细胞培养技术获得的细胞在基因表达、基质分泌及细胞功能活动等方面与传统细胞培养技术获得的细胞有差异, 而与体内细胞的生长情况更为相似, 而且三维细胞培养既能保留体内细胞微环境的物质结构基础, 又能体现细胞培养的直观性及条件可控制性, 所得到的研究结果也更为可靠。由此启示人们, 今后可以从这一方面加以突破。
中国驯鹿瘤胃上皮细胞体外分离培养方法的初步建立为体外研究中国驯鹿瘤胃上皮细胞的生理功能奠定了试验基础。
a.贴壁细胞;b.悬浮细胞。
分离培养 篇2
病原物的分离与培养在植物病害的研究中具有重要意义，分离、培养病原菌的方法是植物病理学研究工作中最常应用的实验技术。一方面，在一个新的病害研究中，通过分离与培养获得病原物的纯培养，完成柯氏法则，以明确该病病原；研究病原物的生物学特性和病害循环（侵染、病程等等）。所谓病原物的分离，即把该病原菌从发病组织上与其他微生物分开；所谓病原物的培养，即将分离的病原菌移到可以让这种病原菌正常生长的营养基质即培养基上，从而获得其纯培养。病原物的分离与培养，需经以以几个步骤: 1.有关器皿的灭菌和消毒； 2.制作培养基； 3.病原菌的分离 4.病原菌的培养。－、灭菌与消毒
灭菌与消毒是两个不同的概念。灭菌则是指杀死一切微生物的营养体和孢子。消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体，在植物病理学实验中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌污染，因此对所用器材、培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌。消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、辐射和使用化学药品等方法。
(一)热力灭菌
热力灭菌分干热灭菌和湿热灭菌两类。
1．干热灭菌
干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质疑固性与其本身的含水量有关。在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高(160～170℃)，时间长1～2 h。但干热灭菌温度不能超过180 ℃，否则包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。干热灭菌使用的仪器是烘箱。
干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，无菌操作时酌试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌。涂布平板用的三角玻棒也可在蘸有乙醇后进行灼烧灭菌。通常所说的干热灭菌是在烘箱内利用高温干燥空气(160～170℃)进行灭菌。此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌。
进行干热灭菌要注意以下问题：物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通；灭菌物品不要接触烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火；在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内停止加温；电烘箱内温度未降到70℃以前，切勿自行打开箱门以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。湿热灭菌
(1)高压蒸汽灭菌 此法是将物品放在密闭的高压蒸汽灭菌锅内，0.1MPa，121℃保持15～30 min进行灭菌。时间的长短可根据灭菌物品种类和数量的不同而有所变化，以达到彻底灭菌。这种灭菌适用于培养基、工作服、橡皮物品等，也可用于玻璃器皿的灭菌。
(2)常压蒸汽灭菌 在不具备高压蒸汽灭菌的情况下：常压蒸汽灭菌是一种常用的灭菌法。对于不宜用高压蒸汽灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等可采用常压蒸汽灭菌。这种灭菌方法可用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行，也可用普通蒸笼进行灭菌。由于常压，其温度不超过100℃，仅能使大多数微生物被杀死，而芽孢细菌却不能在短时间内杀死，因此可采用间歇灭菌以杀死芽孢细菌，达到彻底灭菌的目的。
常压间歇灭菌是将灭菌培养基放人灭菌器内，每天加热100℃，30 min，连续3 d，第一天加热后，其中的营养体被杀死，将培养物取出放室温下18～24 h，使其中的芽孢发育成营养体，第二天再加热100℃，30 min，发育的营养体又被杀死，但可能仍留有芽孢，故再重复一次，使彻底灭菌。
(二)过滤除菌
许多材料例如血清、抗生素及糖溶液等用加热消毒灭菌方法，—均会被热破坏，因此采用过滤除菌的方法。应用最广泛的过滤器有：
(1)蔡氏过滤器 该过滤器是由石棉制成的圆形滤板和一个特制的金属（银或铝）漏斗组成，分上、下两节。过滤时，用螺旋把石棉板紧紧夹在上、下两节滤器之间，然后将溶液臵于滤器中抽滤。每次过滤必须用一张新滤板。根据其孔径大小，滤板分为3种型号：K型最大，作一般澄清用；EK滤孔较小，用来除去一般细菌；EK-S滤孔最小，可阻止大病毒通过。使用时可根据需要选用。
(2)微孔滤膜过滤器 这是一种新型滤器，其滤膜是用醋酸纤维酯和硝酸纤维酯的混合物制成的薄膜。微孔滤膜过滤器是由上下二个分别具有出口和入口连接装臵的塑料盖盒组成。出口处可连接针头，入口处可连接针筒。使用时将滤膜装入两塑料盖盒之间，旋紧盖盒，当溶液从针筒注入滤器时，此滤器将各种微生物阻留在微孔滤膜上面，从而达到除菌的目的。根据待除菌溶液量的多少，可选用不同大小的滤器。此法除菌的最大优点是可以不破坏溶液中各种物质的化学成分。但由于滤量有限，所以一般只适用于实验室中小量溶液的过滤除菌。实验室中用于除菌的微孔滤膜孔径一般为0.22μm，但若要将病毒除掉，则需更小孔径的微孔滤膜。微孔滤膜过滤除菌的主要操作步骤为：
① 组装、灭菌 将0.22μm孔径的滤膜装入清洗干净的塑料滤器中，旋紧。压平，包装灭菌后待用(0.1MPa、121.5℃灭菌：20 min)。连接。将灭菌滤器的入口在无菌条件下，以无菌操作方式连接于装有待滤溶液注射器上，将针头与出口处连接并插入带橡皮塞的无菌试管中。
② 压滤 将注射器中的待滤溶液加压缓缓挤压过滤到无菌试管中。滤毕，将针头拨出。压滤时，用力要适当，不可太猛太快，以免细菌被挤压通过滤膜。
提示: 整个过程应在无菌条件下严格无菌操作以防污染，过滤时应避免各连接处出现渗透现象。
(三)辐射灭菌 紫外线灭菌是用紫外线灯进行的。波长为200～300 nm的紫外线都有杀菌能力，其中以260 nm的杀菌力最强。在波长一定的条件下，紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正比。紫外线杀菌机理主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA的交联，从而抑制了DNA的复制。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成[O]，再使O2氧化生成臭氧(O3)，或使水氧化生成过氧化氢(H2O2)。O3和H2O2有杀菌作用。紫外线穿透力不大，所以只适用于无菌室、接种箱的空气及物体表面的灭菌。
注意事项: 紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，故不能直视紫外线灯光，更不能在紫外线灯光下工作。紫外线灯距照射物以不超过1.2 m为宜。
此外，采用60Co-γ射线灭菌，也已广泛用于不能进行加热灭菌的纸、塑料薄膜，各种积层材料制作的容器以及医用生物敷料皮等的灭菌。γ射线灭菌的最大优点是穿透力强，可在厚包装完好条件下灭菌。
(四)化学药品灭菌
化学药品消毒灭菌法是应用能抑制或杀死微生物的化学制剂进行消毒灭菌的方法。能破坏细菌代谢机能并有致死作用的化学药剂为杀菌剂，如重金属离子等；只是阻抑细菌代谢机能，使细菌不能增殖的化学药剂为抑菌剂，如磺胺类及大多数抗生素等。化学药品对微生物的作用是抑菌还是杀菌以及作用效果还与化学药品浓度的高低、处理微生物的时间长短、微生物的种类以及微生物所处的环境等有关。
植物病理学实验室中常用的化学药品有2％煤酚皂溶液(来苏尔)、0.25％新洁尔灭、0.1％升汞、3％～5％酌甲醛溶液、75％乙醇溶液等。
消毒与灭菌不仅是从事植物病理学和整个生命科学研究必不可少的重要环节和实用技术，而且在医疗卫生、环境保护、食品、生物制品等各方面均具有重要的应用价值。根据不同的使用要求和条件选用合适的消毒灭菌的方法。
二、培养基的制作
1、目的要求
了解培养基的配制原理，掌握培养基的制备方法。
2、基本原理
在植物病理学研究工作中经常要使用各种不同的培养基。培养基是按照生物生长繁殖所需要的各种营养，用人工方法配制而成的营养基质。其中含有碳源、氮源、无机盐、维生素以及水分等。微生物在培养基上生长繁殖还必须在最适pH范围内才能生长得更好，因此，对不同种类的微生物应将培养基调节到一定的pH范围。－般而言，真菌调节到微酸，细菌调节到微碱。
培养基的种类很多，不同的微生物所需要的培养基不同。依物理性状可分为液体的、固体的和半固体的三种。固体培养基是在液体培养基中加入1.5 %～2 %的琼脂，半固体培养基是加入0.2 %～0.5 %的琼脂。琼脂(agar)起凝固作用，一般微生物均不能分解利用。
根据营养物质来源的不同，培养基可分为天然、半合成和合成培养基三类。天然培养基是以自然界原有的有机物为材料经灭菌后制成，如马铃薯、胡萝卜、水果、大麦粒、高粱粒等。半合成培养基中既有一些天然的有机物质，又有一些成分简单或明确的化合物。如常用的马铃薯葡萄糖培养基(PDA)、肉汁胨培养基(NA)等。合成培养基是由一些成分明确的化合物配制而成的，无任何成分不明确的物质，常用于研究微生物的生理生化性状，如查氏(Czapek)培养基等。
根据培养基用途不同，可分为生长繁殖培养基、富集培养基、贮存培养基、选择性培养基和鉴别培养基等。在植物病理学研究中，最常用培养基有马铃薯葡萄糖培养基，主要用于分离培养病原真菌。
在培养基配制完之后，必须经过灭菌，以便彻底杀死其中原有的一切微生物。
3、材料、试剂与仪器 材料 马铃薯。
试剂 葡萄糖、琼脂等。
仪器与用品 高压蒸汽灭菌锅、pH试纸(或酸度计)、试管、铝锅、搅拌棒、三角瓶、烧杯、漏斗、量筒、纱布、棉花、天平等。
4、操作步骤
PDA培养基(马铃薯葡萄糖培养基)马铃薯（去皮）200 g、葡萄糖20 g、琼脂15～20g、蒸馏水1000 ml，自然pH。
在PDA培养基配方中也可用蔗糖代替葡萄糖，这样配制的培养基也称为PSA培养基。(1)称量 称量去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15～20 g。提示：琼脂加入的量取决于琼脂的质量，质量好的15 g就够了，质量差的应适当增加。另外，在夏天气温较高时，适当增加用量。
(2)将马铃薯切成小块，放入锅中，加水1000 ml，煮沸30 min。用纱布滤去马铃薯残渣。
(3)将马铃薯滤液放回锅中，加入琼脂，加热熔化。
提示：在琼脂熔化的过程中，需要用玻璃棒不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。
(4)加入葡萄糖 葡萄糖溶解后，加入适量的水以补充加热过程中损失的水分，定容至1000 ml。
提示：通常在制作培养基的锅内用红蓝铅笔标记出不同体积的刻度，如1 000 ml、2000 ml等，在定容时直接将水加至已标记的刻度即可。
(5)分装 根据不同的实验目的，可将配制的培养基分装于试管内或三角瓶内。分装试管，其量为管高的1／5，灭菌后制成斜面。分装三角瓶的容量以不超过三角瓶容积之一半为宜。
(6)加塞 在管口或瓶口塞上棉塞。棉塞要用未脱脂的经弹松的棉花，棉塞可过滤空气，防止杂菌侵入并可减缓培养基水分的蒸发，故在植物病理学研究工作中普遍使用。
正确的棉塞是形状、划、、松紧与管口或瓶口完全适合，过紧时妨碍空气流通，操作不便；过松则达不到滤菌的目的，且棉塞过小往往容易掉进试管内。正确的棉塞头较大，约有1／3在外，2／3在试管内。分装过程中注意不要使培养基沾染在管(瓶)口上以免浸湿棉塞，引起污染。
(7)包扎 加塞后，将试管用线绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道线绳扎好。用记号笔注明培养基名称、配制日期、组别、制作人等。
(8)灭菌 将上述培养基以0.1MPa，121℃，高压蒸气灭菌20 min。
(9)搁臵斜面 将灭菌的试管培养基竖臵冷至50℃左右(以防斜面上冷凝水太多)，将试管口端搁在玻棒或其他合适高度的器具上，搁臵的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。
培养基经灭菌后，必须放在37℃温箱培养24h，无菌生长者方可使用。
PDA培养基一般不需要调pH。对于要调节pH的培养基，一般用pH试纸测定其pH。如果培养基偏酸或偏碱时，可用l mol／L NaOH或l mol／L HCl溶液进行调节。调节时应逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部过酸或过碱破坏培养基成分。
三、病原菌的分离培养和纯化
1、目的要求
(1)了解分离与纯化微生物的基本原理及方法。
(2)掌握倒平板的方法和组织分离、稀释分离、平板划线分离的基本操作技术。
(3)掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状的方法。
2、基本方法
植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种。最常用的方法是组织分离法，而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。病原细菌的分离方法以划线分离法为最常用，在有些情况下也采用稀释分离法。
为了获得分离菌的纯培养，必须要进行分离菌的纯化，纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法。
3、材料、仪器与用具 3.1 材料
(1)稻瘟病（叶、病节、病穗颈）(Pyricularia oryzae)。(2)柑桔炭疽病（Colletotrichum gloeosporioides）。(3)黄瓜灰霉病（Botrytis cineria）。(4)番茄灰霉病（果）(Botrytis cinerea)。
(5)黄瓜菌核病（果）(Sclerotinia sclerotiorum)。(6)黄瓜细菌性角斑病（叶）(Pseudomonas syringae pv．1achryrnans)。
(7)水稻白叶枯病（叶）(Xanthomonas campestris pv．oryzae)。(8)白菜软腐病（叶）(Erwinia carotovora subspp．carotovora)。
3.2．培养基 PDA培养基；肉膏蛋白脉培养基；加寄主组织煎汁的培养基等。
3.3．仪器与用品 超净工作台、培养箱、培养皿、吸管、吸水纸、三角玻璃棒、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲(针)、接种环(铒)、70％酒精、0.1％升汞、酒精灯、火柴、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉、不锈钢锅等。
4、实验操作
(一)病原真菌的分离
1．组织分离法 其步骤为：
(1)取灭菌培养皿一个，臵于湿纱布上，在皿盖上用玻璃铅笔注明分离日期、材料和分离人的姓名。提示：无菌操作应注意下面几点：工作前将所需的物品都放在超净工作台内；操作前用肥皂洗手，操作时还需用70 ％酒精擦拭双手；无菌操作时，呼吸要轻，不要说话。
（2）用无菌操作法向培养皿中加入25％乳酸1～2滴(可减少细菌污染)，然后将融化而冷至60℃左右的PDA培养基倒人培养皿中，每皿倒10～15 ml，轻轻摇动使之成平面。凝固后即成平板培养基。
提示：加入25％乳酸1～2滴，可减少平板上出现污染细菌菌落。除乳酸外，在培养基中加入适当的抗菌素抑制细菌的生长，也是常用的方法。加青霉素(20μg／m1)可以抑制G+ 细菌生长；加多黏霉素B(5.0μg／ml。)可以抑制G-细菌生长；加链霉素(40μg／ml)或氯霉素(50μg／m1)可以抑制大部分细菌的生长。除了氯霉素可在灭菌前加入外，其他抗菌素都应在灭菌后并冷却到45℃左右(以手背触三角瓶感到烫，但尚可以忍耐为宜)时加入。倒平板过程中只要遵循“稳、轻、快”要领，不必在火焰上方，一般很少污染。(3)取真菌叶斑病的新鲜病叶(或其他分离材料)，选择典型的单个病斑，用剪刀或解剖刀从病斑边缘(病健交界处，)切取小块(每边长3～4 mm)病组织数块。
提示：选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌混入的机会。腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生，因此，一般斑点病害应在临近健组织的部分分离。
（4）将病组织放入70％酒精中浸3～5s后，按无菌操作法将病组织移入0.1％升汞液中分别表面消毒0．5、1、2、3、5 min(也可使用其他表面消毒剂)，如植物组织柔嫩，则表面消毒时间宜短；反之则可长些。然后放入灭菌水中连续漂洗三次，除去残留的消毒剂。
提示：先用70％的酒精浸2～3 s是为了消除寄主表面的气泡，减少表面张力，70％的酒精亦用于表面消毒，处理的时间较短(一般数秒至l min)升汞溶液消毒的时间因材料而异，可自30s至30min不等，一般情况下，需时间3～5 min。
(5)用无菌操作法将病组织移至平板培养基上，每皿内放4～6块。
提示：在将病组织小块移放到平板表面之前，应将其在无菌吸水纸上吸去多余的水，以大大减少病组织附近出现细菌污染。
(6)将培养皿倒臵放入25℃左右恒温箱内培养。一般3～4 d后观察待分离菌生长结果。
(7)若病组织小块上均长出较为一致的菌落，则多半为要分离的病原菌。在无菌条件下，用接种针(铲)自菌落边缘挑取小块移入斜面培养基上，在25 ℃左右恒温箱内培养，数日后，观察菌落生长情况，如无杂菌生长即得该分离病菌纯菌种，便可臵于冰箱中保存。
提示：除根据菌落的一致性初步确定长出的菌落是否目标菌外，还要在显微镜下检查，进一步确定。如果是对未知病原菌的组织分离，则要将长出的菌落分别转出，通过进一步的接种实验明确哪一种为其病原菌。
在组织分离工作中，如果植物材料体积较大且较软(如患灰霉病的番茄果实)，在分离过程中可直接挖取内部患病组织移入平板培养基上，完成分离工作。
2.稀释分离法
(1)取灭菌培养皿三个，平放在湿纱布上，编号，并注明日期、分离材料及分离人姓名。
(2)用灭菌吸管吸取灭菌水，在每一皿中分别注入0.5～1.0 ml。(3)用移植环蘸一滴孢子悬浮液，与第一个培养皿中的灭菌水混合，再从第一个培养皿移三环到第二个培养皿中，混合后再移三环到第三个培养皿中。
(4)将熔化并冷却到45～50℃的培养基，分别倒在三个培养皿中(为防止细菌污染，也可以向每个培养皿中事先加入1～2滴25％乳酸)，摇匀，凝固，要使培养基与稀释的菌液充分混匀。
提示： 倒平板时的培养基温度一定要掌握好，过热易将病原菌烫死而使分离失败，过冷则倒入培养皿中后难以形成平板，不利于分离。
(5)将培养皿翻转后臵恒温箱(25℃)中培养，数日后观察菌落生长情况。
(6)挑菌 将培养后长出较为整齐一致的单个菌落分别挑取，接种到斜面培养基上，臵25℃左右培养。待菌长出后，检查菌是否单纯，若有其他菌混杂，就要再一次进行分离纯化，直到获得纯培养。
(二)病原细菌的分离
病原细菌的分离方法以稀释分离法和划线分离法为最常用。在进行分离之前，首先应对病组织材料进行细菌学初步诊断，即经过镜检确认有喷菌现象以后，才对该病组织作分离工作。稀释分离法是最经典的标准分离法，方法同上述真菌分离。
除去上述稀释分离法以外，较为方便的是划线分离法：(1)预先把熔化好的肉膏蛋白胨培养基倒入培养皿中，凝成平板后，翻转放在30℃恒温箱中2～4 h，使表面无水滴凝结。也可凝成平板后直接使用。(2)将病组织先用0.1％升汞表面消毒0.5～2 min，再用无菌水换洗3次后，放在灭菌培养皿中的灭菌水中，用灭菌玻棒研碎，并让组织碎块在水中浸泡20～60 min，让细菌释放到灭菌水中。
(3)用灭菌的接种铒，(接种环)；蘸取浸泡液在干燥的培养基平板表面划线，尽量不要把平板表面划破。划过第一批线后的接种环应放在火焰上烧灼，冷却后直接在第一批划线的末端向另一方向划线。灭菌后再划第三次线。
提示：划过第一批线后接种铒放在火焰上烧过这一步骤非常重要，这样做可以使第一批线和第二批线上的细菌数量相差很大。
(4)用玻璃铅笔在培养皿上写上分离材料、日期和分离者姓名后，翻转培养皿，放在26～28℃恒温箱中培养。1～3 d后观察有无细菌生长，在哪些地方有单菌落生长出来?其中的优势单菌落应为待分离菌形成的。
(5)仔细挑取病原菌的单菌落，并移植到斜面培养基上。同时，再把单菌落用灭菌水稀释成悬浮液作第二次划线分离，经培养后出现的菌落在形态特征都趋于一致，并与典型描述的特征相一致时，即表明已获得纯培养。最好要经过连续三次单菌落的分离，才能确保纯化。
(三)真菌、细菌培养性状
1．真菌培养性状观察 取已分离，纯化的某种真菌菌种；按前述稀释分离法中(1)～(5)步骤进行，待某培养皿中形成单个菌落后观察。记载以下内容：菌落颜色、菌丛密集及繁茂程度、是否有色素分泌出来而渗透到培养基中、菌落生长速度快慢等。同时要记载培养基种类(成分及pH)和培养温度、光照条件。
2．细菌培养性状观察
(1)仿照上述真菌菌落形成步骤，观察记载以下内容：菌落颜色、菌落边缘形状、菌落表面是光亮还是粗糙或有皱折、、菌落隆起情况、是否有色素分泌到培养基中，菌落生长速度快慢，是否有特殊气味形成等。同时要记载培养基种类(成分及pH)和培养温度、光照条件。
(2)用接种铒(环)蘸细菌菌种后，通过无菌操作在牛肉膏蛋白胨等斜面培养基表面从下向上划一直线，过2～3 d后长出的细菌群体称为菌苔，可仿照观察记载细菌菌落的记载内容，记载菌苔颜色、边缘形状、表面是光亮还是粗糙有皱折、隆起情况、是否有色素分泌到培养基中，是否有特殊气味生成，生长速度快慢等。也要记载培养基种类(成分及pH)和培养温度、光照条件。
分离培养 篇3
关键词：表皮干细胞；细胞分离；细胞培养
中图分类号： Q593. 2 文献标识码： A 文章编号： 1674-0432（2014）-18-17-1
表皮干细胞也可称角质干细胞，不同部位的表皮干细胞分布存在差异，其主要分布于表皮基底层和毛囊外根鞘隆凸部及皮脂腺边缘[1]。表皮干细胞在维持皮肤的自我更新、创伤修复、皮肤肿瘤的发生等方面扮演着重要的角色，因此成功地分离、培养表皮干细胞对临床上创伤修复、皮肤癌的研究起着至关重要的作用[2]。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂及用具
1.1.1实验材料 0～7日龄SD大鼠。
1.1.2实验试剂 中性蛋白酶，胰蛋白酶-EDTA消化液，IV型胶原，DMEM培养液，D-Hanks，KSFM培养液，冻存液，75%酒精。
1.1.3实验用具 剪刀、镊子、尼龙纱网、手术刀、培养瓶、培养皿、冻存管、水浴锅、CO2培养箱、超净工作台，电子显微镜，离心机等。
1.2 实验方法
1.2.1表皮细胞的分离 取0 ～7日龄SD大鼠，脱颈锥处死， 75%酒精清洗，剪取背部皮肤，D-Hanks清洗，将其切割为0.5×1.0厘米的皮肤组织，0.25%中性蛋白酶在4℃处理12～16小时，吸弃上清液，D-Hanks清洗后分离表皮和真皮。表皮剪碎呈糜状，以2.5克/升胰酶+0.2克/升 EDTA消化液在37℃条件下消化5～10分钟，用含小牛血清的DMEM培养液终止消化，吹打至悬液，100目尼龙纱网过滤，1000转/分钟离心5分钟，弃上清液，以培养液重悬制成单细胞悬液。
1.2.2 胶原黏附法选择表皮干细胞 将单细胞悬液以2×105 个/毫升的密度接种在铺被IV型胶原的培养瓶内，37℃、5%CO2培养箱中孵育10～15分钟。吸出细胞悬液，粘附在胶原被膜上的细胞则为表皮干细胞。
1.2.3 表皮干细胞培养 在去除细胞悬液铺被IV型胶原的培养瓶中加入无血清角质形成细胞培养基（KSFM）进行培养，12小时后换液以除去未贴壁的细胞，以后每2天换液一次，光学显微镜下观察细胞生长情况。
2 结果与分析
2.1 原代培养的表皮干细胞
刚刚接种的表皮干细胞，细胞均匀分散呈圆形，核大，胞体小，培养一周（图1）进入增殖期，第12天达到高峰表皮干细胞渐渐伸展形成扁平的多角状，胞质近中央处有圆形核并开始形成小克隆，细胞即连接成片，紧密相靠，相互衔接，呈铺路石状，汇合成片。
2.2 传代培养的表皮干细胞
原代细胞接种24小时后即伸展，相互聚集，粘附在胶原上，呈克隆样生长，细胞聚集在集落中心周围呈辐射状生长，5～6天表皮干细胞增殖能力加强，达到融合铺满培养瓶的瓶底。
3 结语
不同的细胞外基质对细胞的黏附作用不同，表皮干细胞主要通过表达整合素实现其对基底膜的粘附，同时也是干细胞维持其特性的基本条件。IV型胶原作为细胞外基质的主要成分对细胞的粘附、生长、移行等方面起重要作用，表皮干细胞不仅对IV型胶原有较强的粘附性，而且在IV型胶原上能很好的生长，由此进行筛选、培养、纯化表皮干细胞，结果表明，获得的表皮干细胞较纯净，其仍具有较强的分裂增殖能力，于培养后第二天，大量克隆细胞形成，5～6天汇合成片，可以长期传代。该方法操作简便，表皮干细胞生长良好，具有较高的克隆形成率。
无血清培养基及其附加的营养成分在细胞生长与培养液之间提供了较好的平衡体系，有利于表皮干细胞的增殖及其表型的维持，由于培养基中不含血清，没有血清中的各种复杂和不明的成分，排除血清中许多未知因素对干细胞分化的影响，是目前培养表皮干细胞被认可的方法[3]。
参考文献
[1] 孙晓燕，付小兵，孙同柱.表皮干细胞的分离培养和鉴定，中华实验外科杂志[J]，2007，24（2）：163-164.
[2] 王海燕.肺出血·肾炎综合征抗基底膜抗体型.北京人民卫生出版社[M]，1998：912-922.
[3] 刘德伍，陈国安，曹勇，等.人表皮细胞无血清培养的实验研究[J]，1997，13（6）：419-420.
细菌培养与分离项目教学设计案例 篇4
1 项目背景介绍
1.1 细菌培养与分离项目的学习目标
本课程是高职医学检验技术专业课程体系中一门重要的专业基础课程, 学生通过任务训练和技能实践, 获得必要的理论知识和一定的专业技能, 系统构建病原生物与免疫学基础的相关知识及技能体系, 可以为后续专业课程的学习打下坚实的理论基础。
1.2 细菌培养与分离项目的功能定位
细菌接种是医学检验技术专业学生学习病原生物与免疫学基础课程必须掌握的一项基本技能, 也是后续专业课程学习中学生必须掌握的专业技能。
1.3 学生能力基础分析
本项目的教学对象是五年制高职医学检验技术专业二年级的学生, 学生已学习部分专业基础课, 具备一些医学基本技能, 对未来职业岗位有一定的了解, 对于专业课和专业基础课的学习既期望又感到紧张。
1.3.1 学习能力分析
我校招收的医学检验技术专业学生是初中毕业参加中考并达到一定分数线的学生, 学生的形象思维能力较强, 但逻辑推理能力较弱;之前学习了公共基础课程、解剖学和生理学知识, 具备了一定的分析和解决问题的能力, 因此初步具备学习本项目的能力。
1.3.2 职业技能分析
学生已经系统学习了微生物总论的部分内容并掌握了相关技能, 具有完成此项目的理论基础和实践基础。
1.3.3 情感态度分析
学生具备良好的职业道德, 有上进心, 对学习有较强的求知欲, 但尚缺乏学习主动性和持之以恒的学习态度。
1.4 项目实施条件
医学检验实训中心设施齐全, 分区合理, 为学生提供了医院微免室的全真学习环境和实训环境。学校与多家医院保持持续而良好的合作关系, 方便学生进行临床实践、见习, 淮卫迪安医学检测中心更让学生不出校门就获得了临床实践、见习的机会。
2 项目教学实施过程
2.1 学习目标设定
根据高职医学检验技术专业人才培养方案、课程标准及学生学习能力的调研结果, 确定本项目学习目标。
2.1.1 认知目标
(1) 了解培养基物理性状的分类; (2) 掌握培养基制备的流程、注意事项、细菌生长与繁殖的条件; (3) 掌握细菌接种、分离与培养的方法; (4) 掌握细菌接种的操作步骤和注意事项; (5) 掌握细菌的培养方法; (6) 学会观察细菌的生长现象。
2.1.2 能力目标
(1) 通过预习及查阅资料, 培养学生自主学习和解决问题的能力; (2) 通过小组学习, 培养学生与人交流、与人合作的能力; (3) 通过师生互动, 锻炼学生的语言表达能力; (4) 通过实践操作, 锻炼学生的动手能力, 培养学生的无菌意识。
2.1.3 情感目标
(1) 通过自评、互评、师评培养学生主动学习、不断进取的学习态度; (2) 通过本项目, 培养学生实事求是的工作态度和扎实的工作作风; (3) 培养学生的爱伤观念。
2.2 学习任务描述
(1) 资讯:充分利用各种学习资料和信息, 在教师的帮助下为项目储备所需的知识和技能。 (2) 计划:在教师的引导下, 以小组为单位, 制订合理的项目计划, 项目实施过程中小组成员进行必要的分工。 (3) 决策:指导学生进行各项任务的实施, 采用自主探究、讨论、小组合作等多种教学方法充分激发学生的学习兴趣, 完成教学目标, 达到最佳教学效果。 (4) 实施:按照计划进行项目的实施, 以教师为主导、以学生为主体, 并注重学生素质目标的达成。 (5) 检查:教师对学生的操作过程进行检查, 给予必要的指导, 学生对项目成果进行展示, 进行积极、有效的交流。 (6) 评估:通过组内自评、组间互评和教师总评对本次项目教学进行评价、总结。
2.3 学习内容组织 (见表1)
2.4 教学情境创设
为了充分体现“以学生为主”的职业教育理念, 根据能力本位的人才培养目标, 我们创设了以下情景: (1) 全真实训情景:无菌室、无菌台、培养箱等全真情景, 增强了学生的学习兴趣, 提高了学习效率; (2) 小组合作:创设了与人合作、与人交流的工作情境; (3) 角色互换:师生角色互换, 创新了传统的课堂情景。
2.5 教学资源准备 (见表2)
2.6 教学过程实施 (见表3)
2.7 教学设计评价
分离培养 篇5
小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离、培养和鉴定
目的:建立一套可靠的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(AEC Ⅱ)分离、纯化和培养技术, 为进一步研究小鼠支气管肺泡干细胞(BASC)的增殖、分化及其在肺腺癌发生中的作用奠定基础.方法:采用分散酶消化小鼠肺组织块,经免疫黏附法纯化小鼠AEC Ⅱ,并进行原代培养.用SP-C和CCSP免疫荧光染色和透射电镜对所分离的细胞进行鉴定.结果:该方法所获得细胞产量大、纯度高.AEC Ⅱ比例约为(80±2.6)%(n=5),Clara细胞约(6.7±1.2)%(n=5),并能维持培养3～5 d.透射电镜观察AEC Ⅱ,细胞内可见板层小体.结论:该方法是一种可靠的`小鼠AEC Ⅱ的分离、纯化和培养技术,可满足一般的实验要求.
作 者：安江洪 钱莘 敖绪军 卓文磊 陈正堂 AN Jiang-hong QIAN Shen AO Xu-jun ZHUO Wen-lei CHEN Zheng-tang 作者单位：第三军医大学附属新桥医院解放军肿瘤研究所,重庆,400037 刊 名：医学研究生学报 ISTIC英文刊名：JOURNAL OF MEDICAL POSTGRADUATES 年，卷(期)：2008 21(3) 分类号：Q813.1 关键词：肺泡Ⅱ型上皮细胞 原代细胞培养 小鼠支气管肺泡干细胞分离培养 篇6
【关键词】间充质干细胞；脂肪组织；细胞培养；SUI模型
【中图分类号】R691【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2009)10-0125-01
压力性尿失禁(SUI)为女性的常见病和多发病，其发病率约为1 S%-6O%，多发生于老年人，因受经济、宗教、教育程度等因素的影响，其实际发生率比统计发病率更高。SVl的症状严重与否都不自接危及生命，但它给患者的日常上作、生活及社交活动造成一定程度的影响，甚至会严重影响患者的生活质量乃至家庭和睦。
1临床资料
注射疗法是将药物、化学制剂或自体组织等注入后尿道或膀肌颈内口粘膜下，使尿道腔变窄、拉长，延长功能性尿道的长度，提高尿道阻力，起到关闭尿道内口和后尿道的作用，从而达到有效控制排尿的口的。这一治疗方法对尿道内括约肌功能障碍、尿道内压降低同时尿道、膀肌无其他病变等压力性尿失禁患者有较好的效果。注射疗法主要优点在于.以在局部浸润麻醉下进行操作，大多数患者的手术均.IJ.以在门诊进行，适用于老年及不能耐一受大手术的患者。口前注射疗法的研究主要集中在选择不同的注射材料上，理想的注射材料应该在结构上完整，无毒、无免疫原性、无变应原性，近期内不会被分解，能长时间保持其支撑作用。口前使用的材料尚难达到上述要求，因此寻找一种取材方便、生物相容性好、安全无毒、疗效满意的注射材料十分必要。
方法：无菌技术下获取SD大鼠双侧腹股沟区脂肪垫，消化离心，长期培养的方法获取脂肪源性间充质干细胞。倒置相差显微镜观察细胞形态变化，对培养细胞进行免疫细胞化学染色，鉴定其表面分子标志。SD大鼠24只分为3组，实验组（6只），对照组一（3只），对照组二（3只）。分别获取自体ADSCs，实验组进行荧光标记。然后实验组将荧光标记的ADSCs自体移植至尿道周围，对照组移植未并取尿道组织进行HE染色组织学分析。
2结果
原代培养显示培养的脂肪源性间充质干细胞2d左右开始壁,10d-14d左右可达90%融合,基本上为梭形成纤维样细胞形态,免疫细胞化学示 CD29阳性，CD34阴性。阴部神经切断术后10天，除模型组和对照组一各有1只大鼠死亡外，均进行尿流动力学检测，三组手术前后ALLP分别为：对照组一为27.1±5.1和29.1±3.2cmH2O，对照二为29.5±4.9和27.4±72.3,模型组为24.8±3.8和14.7±3.0。模型组手术后ALLP明显降低，且组织学检查亦证明模型组大鼠尿道周围括约肌明显萎缩。
3讨论
本实验将荧光金标记的脂肪源性干细胞自体移植至大鼠的近端尿道周围，行冰冻切片，组织化学染色，荧光显微镜下观察.见荧光标记的细胞呈金黄色:后取组抗体免疫移植部位有较多的Desmin阳性的细胞，棕黄色，部分出现一定的方向性，未见明显炎症细胞浸润，说明己有细胞在局部存活并生长，提示能成为压力性尿失禁注射治疗的一种理想的注射材料，为将来进行细胞移植治疗压力性尿失禁提供了实验依据。
结论：①大鼠脂肪组织中含有丰富的多能干细胞。利用消化离心，长期培养的方法可获取大量的干细胞。②移植后大鼠的ADSCs，可以在尿道周围成活并生长分化。
参考文献
[1]梁月有.诊断女性压力性尿失禁的相关检查[J].新医学.2006,37（10）:687-689.
[2]王萌.尿道周围注射治疗女性压力性尿失禁的研究进展[J].国际泌尿系统杂志,2006,26（6）：798-802.
[3]姚启盛，叶章群，陈从波,等.骨胳肌肌源细胞自体移植在压力性尿失禁治疗中的价值[J].中华泌尿外科杂志，2006，26（12）:841-843.
[4]Strasser H,Marksteiner R,Margreiter E,et al.Stem cell therapy in treatment of urinary incontinence[J].first clinical results.J Urol,2004,171(suppl):130-133
分离培养 篇7
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
从呼和浩特市三联化工厂采集土壤用于菌种分离。
1.1.2 试剂
细菌16S rDNA PCR试剂盒、DNA回收试剂盒、溶菌酶均购自大连宝生物有限公司;其它试剂均为市售分析纯及生化试剂。
1.1.3 仪器
电热恒温培养箱 (上海一恒科技有限公司) , 显微镜 (尼康50i) , 恒温摇床 (上海欣蕊自动化设备有限公司) , 723可见分光光度计 (上海光谱仪器有限公司) , Delta 320 pH计 (梅特勒-托利多仪器有限公司) , PCR仪 (美国ABI公司) 。
1.1.4 培养基
1.1.4.1 9K培养基:
A液: (NH4) 2SO4 3g, MgSO4·7H2O 0.5g, K2HPO4 0.5g, Ca (NO3) 2 0.01g, KCl 0.1g, 水600mL, pH 2.0。121℃灭菌30min。B液:FeSO4·7H2O 44.2g, 水400mL。用6mol/L H2SO4调节pH为2.0, 过滤除菌。接种前, 将A液和B液按3∶2 (V/V) 混合。
1.1.4.2 平板培养基:
以9K培养基为基础, 添加1.8%的水洗琼脂。
1.2 方法
1.2.1 菌株的富集、分离、纯化及筛选
准确称取5 g土样, 接入50 mL新鲜9K培养基中, 28℃、150r/min振荡培养7d, 至菌液呈红棕色。取0.2mL富集培养液, 均匀涂布于平板培养基, 28℃培养10d, 挑取单菌落转接于50mL新鲜9K培养基中, 28℃、150r/min振荡培养7 d。液体培养和平板分离交替进行, 重复3～4次, 直至平板培养菌落形态完全一致。从纯化平板上挑取单菌落, 转接于50mL新鲜9K培养基中, 28℃、150r/min振荡培养72 d, 测定培养液中亚铁氧化率。
1.2.2 Fe2+氧化率的测定
采用重铬酸钾滴定法[1]测定培养液中Fe2+浓度, 按下式计算亚铁氧化率:
亚铁氧化率undefined
V1:未接种空白培养基消耗重铬酸钾的体积;
V2:接种培养基消耗重铬酸钾的体积。
1.2.3 16S rDNA序列分析及系统发育树的构建
1.2.3.1 基因组DNA的提取
参考文献[2]方法对菌体基因组DNA进行提取。
1.2.3.2 PCR扩增
使用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit扩增菌株的16S rDNA序列。正向引物:5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′, 反向引物:5′-CGCCAGGGTTT TCCCAGTCACGAC-3′。PCR反应体系为:总体积50μL, 基因组DNA 2μL, PCR Premix 25μL, 引物各0.5μL, 16S-free H2O 22μL。PCR反应条件为:94℃ 5min;94℃ 1min, 55℃ 1min, 72℃ 1.5min;72℃ 5min。
1.2.3.3 16S rDNA测序、分析及系统发育树的构建
PCR扩增产物使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2.0进行纯化, 由大连宝生物工程有限公司完成测序。将菌株N16的16S rDNA序列输入Genbank中进行序列比对, 将该菌株序列与比对结果中同源性最高的序列一起输入Clustal X 1.83进行全序列比对。利用软件MEGA 3.1分析该序列碱基组成, 并以Kimura-2参数计算遗传距离, 采用Nj邻接法构建系统发育树, 在分支上标记1 000次重复获得的自展检验Bootstrap值。
1.2.4 菌株培养基优化
取5 mL种子液 (亚铁氧化率达80%的培养液) , 转接于装有50 mL培养基的250 mL三角瓶中, 28℃、150 r/min振荡培养36 h, 测定培养液的亚铁氧化率。
1.2.5 菌株培养条件优化
对初始pH、温度、接种量、装液量4个因素进行优化, 分别记为变量X1、X2、X3、X4, 每个因素取3个水平;以亚铁氧化率作为响应值, 记为Y;利用SAS软件中的Box-Behnken设计法设计实验方案[3], 按照实验方案, 在不同培养条件下以最适培养基培养菌株N16, 150r/min振荡培养36h, 测定培养液的亚铁氧化率。
2 结果与分析
2.1 菌株的富集、分离、纯化及筛选
从土样中共分离得到19株细菌, 菌落形态共6种 (见表1) 。分别测定各菌株亚铁氧化能力, 只有N16、ND1和ND3具有亚铁氧化能力, 其中N16亚铁氧化率可达90%。因此对N16进行进一步研究。
注:菌落特征:a:白色, 较大, 边缘不整齐, 与培养基结合不牢固;b:白色, 较大, 边缘整齐, 与培养基结合不牢固;c:黄色, 较小, 边缘整齐, 与培养基结合牢固;d:白色, 较小, 边缘整齐, 与培养基结合不牢固;e:白色, 较小, 边缘整齐, 与培养基结合牢固;f:红褐色, 极小, 边缘整齐, 与培养基结合牢固。
2.2 菌种鉴定
2.2.1 菌株形态及培养特征
菌体呈短杆状, 单生, 能运动, 革兰氏染色呈阴性, 菌体大小约为0.5 μm×1.0 μm。在9K液体培养基中培养, 培养液由浅绿色变为红棕色, 并且混浊, 产生了黄钾铁钒沉淀。在9K固体培养基培养10 d, 平板上形成针尖大小的褐色菌落, 菌落周围有黄色沉淀 (见图1) 。
2.2.2 16S rDNA序列分析及系统发育树的构建
该菌株16S rDNA序列长度为1 450 bp, GenBank登录号为GQ329842。将该序列输入NCBI, 以Blast进行序列同源性比对, 结果显示菌株N16与嗜酸性氧化亚铁硫杆菌属 (Acidithiobacillus ferrooxidans) 的多株细菌具有较高的同源性 (>98%) , 其中与Acidithiobacillus ferrooxidans strain 2、Acidithiobacillus ferrooxidans strain YTW和Acidithiobacillus ferrooxidans strain D2等的相似性为100%, 与标准株Acidithiobacillus ferrooxidans strain ATCC 23270和ATCC 53993的相似性为98%。根据16S rDNA序列构建系统发育树 (图2) , 菌株N16与嗜酸性氧化亚铁硫杆菌属在系统发育树上处于同一分支, 结合其生物学特性, 可以确定菌株N16为嗜酸性氧化亚铁硫杆菌 (Acidithiobacillus ferrooxidans) 。
2.3 菌株培养基优化
2.3.1 FeSO4·7H2O浓度对菌株亚铁氧化率的影响
以9K培养基为基础, 分别添加20g/L、44.2g/L、60g/L、80g/L、100g/L FeSO4·7H2O, 测定亚铁氧化率, 结果见图3。由图可见, FeSO4·7H2O浓度为60g/L时, N16的亚铁氧化率最高, 可达99.8%。
2.3.2 (NH4) 2SO4浓度对菌株亚铁氧化率的影响
以9K培养基为基础, 分别添加0g/L、1g/L、3g/L、5g/L (NH4) 2SO4, 测定亚铁氧化率, 结果见图4。 (NH4) 2SO4浓度为1g/L和3g/L时, N16的亚铁氧化率均为99.6%, 因此 (NH4) 2SO4浓度采用1g/L。同时实验发现在无氮源条件下, 该菌也有一定的亚铁氧化能力, 推测菌株N16可能具有固氮能力。
综上所述, 实验确定菌株N16的最适培养基配方为: (NH4) 2SO4 1g/L, MgSO4·7H2O 0.5g/L, K2HPO4 0.5g/L, KCl 0.1 g/L, Ca (NO3) 2 0.01g/L, FeSO4·7H2O 60g/L。
2.4 菌株培养条件优化
实验对初始pH、温度、接种量、装液量4个因素进行优化, 分别记为变量X1、X2、X3、X4, 各因素水平的取值见表2;以亚铁氧化率作为响应值, 记为Y。实验方案及结果见表3。
通过SAS 统计软件的响应面回归过程对数据进行分析, 建立回归模型为:Y1=80.74333-5.100833*X1+4.448333*X2+24.18833*X3+0.314167*X4-1.985417*X1*X1-6.295*X1*X2+2*X1*X3-1.6525*X1*X4-27.26917*X2*X2-2.9725*X2*X3-0.1375*X2*X4-11.13167*X3*X3-0.2625*X3*X4+ 0.319583*X4*X4。
由表4模型可信度分析可以看出, 复相关系数R2=0.9111, 说明回归方程的拟合度较好。由回归模型可知一次项和平方项, 特别是X3、X2*X2、X3*X3对响应值的影响显著, 但交互项的影响不显著。因此, 可以得出:本实验的4个因素之间的关系不是简单的线性关系, 而是二次关系, 并且各个因素之间的交互作用较小, 在以后的实验中可以不考虑各个因素之间的交互作用。
根据回归方程, 可由SAS软件作出响应面立体图, 见图5～10。由SAS响应面优化图可以看出:培养温度和接种量对亚铁氧化率具有显著影响;pH和装液量对亚铁氧化率也有一定影响, 但并不显著。
由SAS软件分析可知, 该回归模型存在稳定点, Y的最大估计值为94.52, 稳定点 (X1, X2, X3, X4) 为 (-0.41, 0.08, 1.05, -1.11) , 即初始pH 1.8, 温度28℃, 接种量15%, 装液量30mL。实验验证与模型预测值基本一致, 所以确定该条件为最优培养条件。
2.5 菌株N16的培养曲线
采用优化后的最适培养基配方和最佳培养条件, 150r/min振荡培养菌株N16。在培养过程中定时对菌体核酸量、培养液pH值、亚铁氧化率进行测定, 可得图11。由图可见, 菌株培养13h即进入对数生长期, 34h进入稳定期;培养过程中, 培养液的pH值不断下降, 培养结束时降为2.10;菌株进入对数期后, 其亚铁氧化能力明显提高, 培养至28h时, 亚铁氧化率已达到最高值99.78%, 此后基本不再变化。
3 讨论
近几年国内许多学者对氧化亚铁硫杆菌的分离、培养基、培养条件进行了研究[4,5,6,7,8,9,10], 但多为单因素实验或正交实验。另外, 氧化亚铁硫杆菌属严格化能自养微生物, 生长较缓慢。本文分离纯化出一株嗜酸性氧化亚铁硫杆菌N16, 在采用单因子实验对其培养基进行优化的基础上, 采用响应面分析法对其培养条件进行了优化。当培养28h时, 该菌的亚铁氧化率就可达99.78%。菌株N16的生长时间明显短于其它报道中的菌株, 而亚铁氧化能力却达到了非常高的水平, 因此该菌株在烟气脱硫中具有广阔的应用前景, 进一步研究将其应用于烟气脱硫具有重要的理论和实践意义。
参考文献
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[2]张洪勋, 郝春博, 白志辉, 等.一种湿法冶金中嗜酸菌基因组DNA的提取方法[P].中国:CN1990864A, 2007.
[3]欧宏宇, 贾士儒.SAS软件在微生物培养条件优化中的应用[J].天津轻工业学院学报, 2001, (1) :14-17.
[4]李广悦, 刘玉龙, 王永东, 等.一株氧化亚铁硫杆菌菌株的筛选及其生长特性的研究[J].南华大学学报, 2007, 21 (1) :7-10.
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分离培养 篇8
1 材料与方法
1.1 水样采集
2005~2006年选取哈尔滨市地区部分水样64份, 其中地表自然水8份、水源水6份、出厂自来水6份、二次供水10份、公共场所空调冷却塔水34份。以灭菌玻璃瓶采集, 每瓶约500ml, 采样后立即送实验室当日检验。
1.2 水样处理
将水样摇匀后静置15min, 取出5mL置灭菌试管中。对清洁水样直接用0.22μm×47mm微孔滤膜过滤, 混浊水样先经1 000r/min离心1min后去除杂质 (或者先用0.45μm粗滤纸进行过滤) , 再用0.22μm×47mm微孔滤膜过滤, 然后取下滤膜并尽可能剪碎, 并加入5mL原水样试管中充分混合, 在涡漩振荡器上振荡1min;再从中取1ml于小试管中, 加入等量的pH2.0的0.01mol/L盐酸溶液混合, 静置15min进行酸处理, 用0.1mol/L氢氧化钾中和至pH为6.8~7.0 (约0.2ml, 军团菌生长的适宜pH值) 。
1.3 水样检验
无菌取酸处理好的水样0.1ml溶液分别接种于BCYEα (BCYE琼脂基础购自美国OXOID公司) 平板、GVP平板 (在BCYEα琼脂基础上加甘氨酸、万古霉素、多粘菌素B) 、GVPC平板 (在GVP琼脂基础上加放线菌酮) , 用L棒将接种物均匀涂布后, 置5%CO2培养箱中36℃培养3~10天, 挑取可疑菌落作鉴定。
1.4 军团菌鉴定
在GVPC平板上挑选可疑菌落分别划线接种于血平板和BCYE-Cys平板、BCYEα平板, 放置36℃5% CO2 培养, 2天后观察结果。取初步判断为军团菌的菌株进行革兰氏染色涂片镜检、生化实验及血清学分型[2] (LP多价血清Ⅰ、Ⅱ及LP1-LP10型和米克戴德军团菌、博杰曼军团菌单价诊断学清由上海CDC提供) 。
2 结果
2.1 64份水样在三种不同培养基军团菌的检出情况
表1结果表明, BCYE检出率为0, GVPC培养基检出率最高。
2.2 哈尔滨市地区部分水体中军团菌的检出情况
在64份各种水样中, 有10份检出军团菌, 检出率为15.6%。其中地表自然水、水源水、出厂水、二次供水中均未检出军团菌, 只有公共场所空调冷却塔水分离出军团菌10株, 阳性率为29.4%。 (表2)
2.3 军团菌的鉴定
2.3.1 可疑菌落的确认
军团菌的生长特性是生长缓慢, 凡在GVPC平板上72h后生长的, 菌落形态为灰白色或紫色, 圆形稍凸、湿润光滑、呈毛玻璃状, 挑起似牙膏状粘稠, 新鲜生长出的菌落边缘有紫色光泽, 可初步确定为可疑菌落。
2.3.2 菌落的验证
根据军团菌只在含有L-半胱氨酸的培养基中才能生长的特性, 在菌落验证试验中, 凡在血平板和BCYE-Cys (不含L-半胱氨酸) 平板上不生长, 在BCYEα (含L-半胱氨酸) 平板上生长, 且革兰氏染色涂片镜检为G- 杆菌者可初步判断为军团菌。
2.3.3 生化实验和血清学分型
根据军团菌的主要生化特性可鉴别其常见的菌种。将初步判断为军团菌的菌株进行糖发酵、动力、过氧化氢酶、氧化酶、硝酸盐还原、尿素酶、明胶液化和马尿酸水解等生化实验, 鉴定出嗜肺军团菌和米克戴德军团菌两种。采用玻片凝集法进行血清分型, 根据发生凝集情况确定型别。
3 讨论
(1) 本文在水样前处理等方面进行了改进。具体为在水样前处理实验中选用酸处理代替热处理 (50℃加热30min) , 结果显示酸处理后阳性率比热处理高, 主要是因为热处理不能杀死芽胞菌, 导致杂菌在GVPC平板上生长较多而影响了军团菌的生长。
(2) 对军团菌的检测, 培养基选择十分重要。由于环境样品多受杂菌、霉菌污染, 且军团菌培养生长慢, 一般在二天后才开始缓慢生长。经过试验筛选, 结果证明BCYEα平板为基础培养基, 无抑制杂菌、真菌能力, 在军团菌生长前24h~48h内平板就长满杂菌。GVP培养基虽然添加霉素抑制剂——万古霉素, 但抑制真菌能力差, 48h后平板长满真菌, 军团菌则无法检出。在GVP基础上添加放线菌酮, 即GVPC平板能抑制真菌的生长, 军团菌生长较好, 生长的典型菌落明显, 从而筛选出最佳的初筛培养基GVPC, 解决了在军团菌检测方面存在的杂菌、霉菌污染, 军团菌分离难的问题。由于军团菌的生存与相对湿度有密切关系, 相对湿度80%时军团菌的稳定性最好, 且选用5%CO2培养箱培养时间最长为10天。
(3) 对哈尔滨市地区部分水体中军团菌进行了检测, 结果显示, 在地表自然水、水源水、出厂水、二次供水中均未检出军团菌, 在公共场所空调冷却塔水中阳性率为29.4%, 与国外空调冷却水中军团菌检出率在30%~50%[3]的结果相近, 证明本文所采用方法有很好的分离培养效果, 这与黑龙江省以往军团菌检出率明显偏低比较, 是一个明显的进步。本文查阅了2005年以前国内期刊多篇, 未见黑龙江省军团菌的系统检测报道。
(4) 国际标准化组织ISO早已把水源中军团菌的检测作为水质标准细菌检验的一部分[4]。目前, 世界上许多国家的宾馆、饭店都必须具有“军团菌检验合格”的证明。在我国军团病至今还未列入法定传染病中, 这也制约了军团菌检验在我国的开展。更为重要的是人们对该病的认识不足以及军团病诊断检验水平低下, 从而对军团病的发病情况产生错误的估计。哈尔滨市城区空调冷却塔水军团菌的高检出率, 充分说明了军团病暴发流行的可能性日益增大。军团菌是军团病的病原, 经典的军团菌实验室检验方法很烦琐, 费时较长, 这些都限制了军团菌检验的广泛开展, 导致军团菌的检出率低。经过两年多的努力, 初步建立了一套系统的、标准的、可操作性强的军团菌鉴别鉴定方法。该方法对卫生检验部门鉴别鉴定环境及水中军团菌具有参考价值。
参考文献
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[3]Stout JE, Yu VL.Legionellosis.Nengl J Med, 1997;337:682-68.
分离培养 篇9
目前,关于小鼠、大鼠和羊等［3 － 6］AEC Ⅱ的分离和原代培养的研究已有报道,但是在研究中发现,AECⅡ存在原代消化分离率低、因杂细胞多而纯化困难和在体外培养过程中易分化等问题而极大地限制了对AECⅡ的研究。并且极少有关于豚鼠AECⅡ的分离培养的研究报道; 而有研究表明,豚鼠的生理生化机制、病原入侵后的应答、炎性反应及病变过程与人类更为相似。因此,在研究人类相关的呼吸性疾病、肺脏相关疾病及免疫应答反应时利用豚鼠作为供体分离出的AECⅡ,将其作为试验模型更接近人类的反应机制［7 － 9］。因此,以豚鼠为研究对象,采用多酶联合全肺灌注法分离AECⅡ,使用免疫黏附法进行纯化,并通过ROCK抑制剂法进行AECⅡ传代培养来建立豚鼠AECⅡ的分离、纯化和传代培养技术,为进一步以豚鼠AECⅡ为模型来研究肺脏抗病原微生物入侵和肺脏损伤等奠定理论基础。
1 材料
1. 1 试验动物及细胞
Hartley豚鼠,由国家啮齿类实验动物种子中心( 广东省医学动物实验中心) 提供; 3T3 - J2( 小鼠胎儿成纤维细胞系) ,由中国科学院上海细胞所提供。
1. 2 主要试剂
豚鼠Ig G( 参照参考文献[10 - 11]制备) 、碱性磷酸盐缓冲液( PBS缓冲液) 、红细胞裂解液、丝裂霉素C、DNaseⅠ、Y - 27632,DAB免疫组化试剂盒等,由Sigma - Aldrich公司生产; DMEM、F12 培养液,由Gibco公司生产; 胎牛血清,由Hyclone公司生产;SP - C抗体,由Millipore公司生产; HEPES、弹性蛋白酶、链酶蛋白酶、Ⅳ型胶原蛋白酶、胰蛋白酶、两性霉素B、氯霉素等,均由北京全式金生物技术有限公司生产。
1. 3 消化液
DMEM / F12 + Na HCO3+ 25 mmol / L HEPES +4 U / m L弹性蛋白酶1 mg / m L + 0. 1% 链霉蛋白酶+0. 125% 胰蛋白酶+ IV型胶原酶1 g / L + 100 μg / m LDnaseⅠ( p H值为7. 4) 。
1. 4 ROCK培养液( 100 m L)
ROCK培养液( 100 m L) : DMEM 74. 6 m L + F1225 m L + 氢化可的松/ EGF混合液0. 10 m L + 胰岛素0. 10 m L + 两性霉素B 0. 10 m L + 10 mg / m L庆大霉素0. 10 m L + 霍乱毒素1. 72 μL + Y - 27632( Rho激酶抑制剂) 100 μL。
1. 5 器皿( 无菌)
离心管、烧杯、三角瓶、滤纱( 200 目) 、玻璃漏斗、解剖器械、培养皿、注射器、针头、导管,均由宁夏大学西部生物资源保护与利用教育部重点实验室提供。
1. 6 主要仪器设备
培养箱( 型号为380) ,由Thermo公司生产; 倒置显微镜( 型号为IX71) ,由Olympus公司生产。
2 方法
2. 1 豚鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离
2. 1. 1 豚鼠Ig G的制备豚鼠Ig G溶液( 用PBS缓冲液溶解,p H值为9. 3) 按0. 15 ~ 0. 20 mg /cm2覆盖培养皿底部,37 ℃ 孵育3 ~ 4 h,吸出豚鼠Ig G溶液,10 m L PBS缓冲液缓慢冲洗培养皿2 次。
2. 1. 2 豚鼠AEC Ⅱ的分离脱颈法处死豚鼠,剪开皮肤,打开胸腔,剥离心脏血管组织,取出完整肺脏置于37 ℃的PBS缓冲液中清洗3 次; 以PBS缓冲液灌洗肺脏,待肺脏充盈时缓慢吸出灌洗液,重复3 ~5 次,目的是去除肺脏巨噬细胞; 向肺脏中缓慢灌注消化液至肺脏充盈,37 ℃水浴消化40 ~ 50 min; 然后去除气管、支气管,剪碎肺脏,目的是获得最大体积的消化液; 添加含10% FBS的DMEM培养液10 m L,终止消化; 肺脏组织消化液经过200 目滤纱后获得细胞悬液,1 000 r/min离心5 min,弃上清液,沉淀用红细胞裂解液裂解1 min; 1 000 r/min离心5 min,弃上清液,DMEM重悬细胞后,于37 ℃、5% CO2饱和湿度条件下培养1 ~ 2 h,去除易于贴壁的成纤维细胞,重复2 次; 取上清液,1 000 r / min离心5 min,用含10%FBS的DMEM培养基重悬细胞。
2. 2 豚鼠AEC Ⅱ的纯化与培养
2. 2. 1 免疫吸附法纯化细胞将细胞悬液接种到豚鼠Ig G包被的培养皿中培养40 min,培养条件为37 ℃ 、5% CO2,饱和湿度,重复2 次,使没有冲洗干净的巨噬细胞通过黏附去除。 吸取细胞悬液,800 r / min离心5 min,弃上清液,沉淀用含10% FBS的DMEM培养基重悬,以1 × 106/ m L的细胞密度接种于直径为100 mm的培养皿中,37 ℃、5% CO2饱和湿度条件下培养,24 h后换液,此后每2 ~ 3 d换液1 次,在倒置显微镜下观察并照相、记录。
2. 2. 2 ROCK抑制剂技术培养细胞消化P1 代细胞,用F培养基重悬,接种于用10 μg /m L的丝裂霉素C处理的3T3 - J2 细胞上,ROCK培养液,37 ℃、5% CO2饱和湿度条件下培养。
2. 3 免疫细胞化学鉴定
将载玻片置于6 孔培养板内,10% 的多聚赖氨酸浸泡2 h后,晾干载玻片。消化细胞,以1 × 103/ m L接种于盖玻片,37 ℃、5% CO2饱和湿度条件下培养48 h。取出盖玻片,4% 多聚甲醛固定1 h,封闭,加入SP - C一抗( 稀释浓度1∶100) ,按DAB免疫组化试剂盒说明书进行染色,苏木精复染,在倒置显微镜下观察SP - C阳性细胞即AEC Ⅱ。
3 结果与分析
3. 1 细胞的纯化与培养
经豚鼠肺脏灌注消化所获得的细胞悬液通过红细胞裂解液处理后主要存在2 种细胞,直径较大的细胞是巨噬细胞( MC) ,较小的是AECⅡ( 见294 页彩图1A) 。细胞悬液接种在豚鼠Ig G包被的培养皿中可使巨噬细胞较快地黏附于培养皿而AECⅡ游离于细胞悬液中。将纯化后的AECⅡ接种于新的培养皿中培养,培养2 ~ 3 d后可见细胞呈多角形岛状生长( 见294 页彩图1B) 。接种在以3T3 - J2 细胞为饲养层并添加ROCK培养液进行培养,培养第24 小时和第9 天时用倒置显微镜观察,可见细胞呈岛状生长,与作为饲养层的3T3 细胞有明显的形态差异( 见294页彩图1C、图1D) 。
3. 2 免疫细胞化学鉴定
将培养至第3 代时的AECⅡ用特异性标记物SP - C和苏木素染色,细胞浆被染为棕红色的为阳性细胞,即AECⅡ( 见294 页彩图2A) ,苏木素复染时细胞核被染为蓝色( 见294 页彩图2B) ; 而阴性对照组中SP - C染色结果显示细胞浆无着色,即阴性( 见294 页彩图2C) ,苏木素复染后细胞核呈现蓝紫色( 见294 页彩图2D) 。从试验结果可以看出,分离纯化的AECⅡ在传至第3 代时仍保持AECⅡ的性状特性; E为空白对照,即一抗用PBS代替的AECⅡ。
4 讨论
豚鼠作为科学研究的动物模型已有一百多年的历史［1］,近年来研究表明,豚鼠肺脏的生理结构、发育和肺脏疾病发生机制等方面与人类存在较多的相似,如豚鼠对结核分枝杆菌易感,且感染后产生与人类相似的进行性肺结核病变,这使得豚鼠成为抗结核病药物和疫苗筛选与致病机理研究的理想动物模型之一［7］,在人类肺脏疾病相关领域的研究中具有重要的潜在应用价值。另外,肺脏作为先天免疫与获得性免疫的桥梁,在机体抵御外源微生物入侵中发挥着重要的物理屏障和免疫调节作用,而肺脏上皮细胞是继肺泡巨噬细胞之外的一类重要免疫调控细胞［12］。肺脏上皮细胞位于机体与外界环境直接接触的表面,是抵御病原菌入侵的重要防线［13］。肺泡上皮细胞由AECⅠ和AECⅡ组成,AEC Ⅰ主要维持肺泡结构,受到损伤后可由AECⅡ增殖和分化为AECⅠ来修复。AECⅡ具有增殖潜能［14］,并能分泌肺脏表面活性物质,降低肺泡表面张力、防止肺泡萎陷,还参与维持正常肺水转运、机体的氧化代谢及免疫调节,同时还是某些激素的靶细胞［15］。因此,以AECⅡ为模型研究肺脏相关疾病具有一定的理论价值。这就使得以豚鼠为模型,分离AECⅡ来研究肺脏疾病发生与恢复中的免疫调控机制具有重要意义。
而肺脏AECⅡ的分离目前主要有二种方法,即经气管全肺灌注消化法和肺组织块消化法,试验中采用前一种方法。全肺灌注消化使酶溶液可充分接触肺泡组织,提高消化效率并减少细胞损伤。通常消化细胞所用的胰蛋白酶可以分解细胞间连接从而分散细胞,但对细胞的损伤较大,试验选用了弹性蛋白酶、链蛋白酶和胶原蛋白酶。弹性蛋白酶消化结缔组织中的弹性蛋白,并且对细胞的形态、生物学功能等几乎无损伤; 链蛋白酶能够溶解纤维蛋白、黏蛋白等; 胶原蛋白酶仅对细胞基质起消化作用,对细胞本身无影响。在消化过程中,由于酶对细胞的损伤,释放出的DNA与细胞外基质形成复合物能网罗聚集细胞,因此添加Dnase防止细胞聚集。试验中使用这几种酶的组合可在降低酶溶液对细胞损伤的同时缩短消化时间,提高消化分离的效率。
虽然在消化前用PBS缓冲液灌洗了肺脏,但试验中发现消化获得的原代细胞仍然含有大量的肺泡巨噬细胞,这就需要再对分离的AECⅡ进行纯化。常用于AECⅡ的纯化方法有贴壁选择法、差速离心法、密度梯度离心法和流式细胞仪分选法等,但这些方法大多操作复杂、特异性较低、对细胞损伤较大或需要昂贵的仪器。近年研究发现,细胞免疫黏附法是一种较好的AECⅡ纯化方法［16 － 17］。免疫黏附的纯化机制是依据不同细胞膜表面含有不同的免疫活性物质从而对细胞进行纯化。在消化得到的细胞混合液中,巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞等细胞表面有Ig G的Fc受体能与Ig G结合,可快速黏附于包被有Ig G的培养皿底部,而AECⅡ无此受体,不能与之结合,悬浮于溶液中,从而收集悬浮细胞达到提纯的目的［18］。试验用豚鼠Ig G是参考血清中Ig G提取方法分离豚鼠血清获得［10 － 11］。免疫黏附法获得的AECⅡ纯度高且相对简便易行［17］。
许多研究表明［19 － 21］,AECⅡ在体外培养时容易分化,而最新的研究表明［22］,ROCK抑制剂培养法,即以纤维母细胞( 3T3 - J2) 作为饲养层,添加Rho激酶抑制剂( Y - 27632) 的培养环境能够诱导许多组织的上皮细胞在体外无限增殖,而不需要通过其他方法( 如转导外源原癌基因) 就可以保持细胞的增殖活力,且不改变细胞的生物学特性。Rho激酶( Rho as-sociated kinase,ROCK) 是参与细胞有丝分裂黏附和移动、细胞骨架调整、肌肉细胞收缩、肿瘤细胞浸润等一系列细胞生命活动的重要酶［23］。Y - 27632 是最早发现的ROCK抑制剂,可以抑制细胞分化等过程,纤维母细胞可以为上皮细胞提供生长所必须的细胞因子,两者联合使用可以为上皮细胞的体外培养提供与体内相似的环境。因此,可以采用ROCK培养法培养纯化后的AECⅡ细胞。
综上所述,试验建立了豚鼠AECⅡ的分离、纯化及ROCK抑制剂培养法的培养体系,为进一步研究AECⅡ在肺脏功能和疾病发生中的免疫调控机制奠定了基础。
摘要：为了建立豚鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)分离、纯化和ROCK抑制剂培养的方法,进一步以AECⅡ为模型研究其在抗结核分枝杆菌中的免疫调控作用奠定基础,试验利用混合酶溶液全肺灌注法消化、分离含有豚鼠AECⅡ的混合细胞,经过红细胞裂解液处理与免疫黏附法纯化获得AECⅡ。以3T3细胞为饲养层,并添加Rho激酶抑制剂的方法进行AECⅡ的传代培养。结果表明:混合酶溶液灌注消化法能充分消化肺脏上皮细胞,通过Ig G免疫黏附能有效去除巨噬细胞而纯化AECⅡ,并且在3T3细胞饲养层与ROCK抑制剂培养条件下促进了AECⅡ的体外增殖而抑制其分化。
分离培养 篇10
1 材料
1.1 样品来源
马胎衣采集于屠宰场, 置于加冰的泡沫保温箱内, 8 h内运到实验室。
1.2 主要试剂及培养液
DMEM/F12、胎牛血清 (FBS) 、青霉素-链霉素 (100×) 、Insulin-Transferrin-Selenium (ITS, 100×) 、2-巯基乙醇 (55 mmol/L) 、0.25%Trypsin-乙二胺四乙酸 (EDTA) 、Tryp LE, Gibco公司生产;庆大霉素、D-PBS、DMSO, Sigma公司生产;0.4%w/v台盼蓝, 内蒙古农业大学自制。
马羊膜干细胞培养液:DMEM/F12中添加15%FBS、1%青霉素-链霉素、1%ITS、1%NEAA、0.1 mmol/L 2-巯基乙醇。
2 方法
2.1 马羊膜上皮细胞的分离
将从胎盘上分离下来的胎膜用含0.3 mg/m L庆大霉素的生理盐水清洗3次后, 在无菌条件下将羊膜上皮层从绒毛膜上机械剥离下来, 在70%乙醇中浸泡5 s, 再用D-PBS清洗3次。将羊膜剪成约为10 cm2的小块, 称重后准备消化。
2.2 马羊膜上皮细胞的消化
1 m L/g羊膜加入0.25%Trypsin-EDTA或Tryp LE, 混匀后置于37℃的空气摇床中, 100 r/min消化10 min, 弃消化液;羊膜中加入与第1次消化等体积的0.25%Trypsin-EDTA或Tryp LE, 以240 r/min消化30 min, 收集消化液;将羊膜重复第2次消化, 收集消化液。合并2次收集的消化液, 用180μm尼龙网过滤。将消化液置于50 m L离心管中, 1 500 r/min离心5 min, 弃上清液, 用羊膜细胞培养液重悬细胞沉淀。
2.3 马羊膜上皮细胞的培养
将2.5×106个细胞接种到75 cm2培养瓶中, 置于38.5℃、5.0%CO2、95%饱和湿度的CO2培养箱内培养, 每48 h换液1次。当细胞生长到汇合度为90%时进行传代培养;传代时, 用0.25%TrypsinEDTA消化贴壁细胞5 min, 用含10%FBS的DMEM终止消化;离心, 收集细胞沉淀。细胞用于传代研究, 部分细胞转入液氮中长期保存。
2.4 马羊膜上皮细胞的计数和倍增时间测定
将马羊膜上皮细胞以9∶1的比例与0.4%台盼蓝溶液混合, 吸取少许悬液置于血细胞计数板上。在显微镜下计数4个大方格内染成淡蓝色的细胞数和未着色的细胞数。细胞活力 (%) =活细胞数/细胞总数×100%。细胞倍增时间P0代是从接种后计数细胞生长达到汇合度为90%的时间。细胞生长期倍增时间只测定了3代。细胞倍增测定计算方法参照参考文献[11-12]。细胞群体倍增 (PD) =培养时间 (CT) /细胞数量倍增 (CD) , CD=log (汇合后的细胞数/接种时的细胞数) /log2。
2.5 数据的统计分析
不同消化液所获得的马羊膜上皮细胞的倍增时间采用SPSS软件进行生物学统计处理。
3 结果与分析
研究表明, Trypsin-EDTA和Tryp LE均可以用于马羊膜上皮层的消化试验。
3.1 消化液对马羊膜上皮细胞的分离、培养影响情况的分析
试验采用Trypsin-EDTA和Tryp LE作为消化酶成功地从马羊膜中分离获得羊膜上皮细胞, 采用Trypsin-EDTA消化, 平均每克羊膜可获得2.2×106个细胞, 细胞活力为90.2%, 而采用Tryp LE消化, 平均每克羊膜可获得1.9×106个细胞, 细胞活力为94.8%, 更适合从马羊膜层消化、分离上皮细胞, 稳定且对细胞影响较小, 见表1。
注:同列数据肩标小写字母不同表示差异显著 (P<0.05) 。
3.2 消化液对马羊膜上皮细胞的传代培养影响情况的分析
Trypsin-EDTA消化细胞的首次倍增时间为 (1.42±0.24) , 与Tryp LE消化的细胞首次培养倍增时间 (1.05±0.19) 相比显著延长 (P<0.05) , 但在后来的传代培养中, 两者倍增时间差异显著 (P<0.05) , 见图1。这说明Trypsin-EDTA消化、分离马羊膜上皮细胞的能力较强, 但对细胞有一定损伤, 影响细胞后期的生长。
3.3 消化液对马羊膜上皮细胞的传代培养影响情况的对比分析
试验分离所获得的马羊膜上皮细胞在体外培养时其倍增时间约为1.25 d, Trypsin-EDTA消化、分离的细胞在原代和第1代培养的倍增时间要显著长于Tryp LE消化、分离所获得细胞的倍增时间, 而之后两者传代细胞倍增时间逐渐接近, 见图2。
4 讨论
试验旨在探讨不同消化液对于马羊膜上皮细胞层进行消化所产生的不同结果。由于有关马羊膜消化及其培养的研究报道很少, 试验方案主要参考了T.Miki等[6]从人羊膜层消化获得羊膜上皮干细胞的研究过程, 试验过程对于羊膜剥离、消化、培养、冻存与复苏各个环节进行了精准的探索。羊膜剥离是一个机械过程, 但羊膜上残留的血管及其他杂质均会直接影响消化液的消化效率和将来得到细胞溶液的纯度;羊膜消化是否完全也直接影响细胞的活性和得到的羊膜上皮细胞的数量。在羊膜消化过程中, Trypsin-EDTA消化效率高于Tryp LE[13], 但Tryp LE消化结果相对稳定, 对羊膜干细胞以后的生长影响较小, 更适合从马羊膜层分离上皮细胞, 这可能是因为Tryp LE在室温条件下更稳定。虽然Trypsin-EDTA消化效率较高, 得到的细胞数显著高于Tryp LE, 但其消化后得到的细胞活力却较低, 这也说明Trypsin-EDTA消化可能会对马羊膜上皮细胞有损伤, 从而影响细胞的生长。羊膜消化不易采用高浓度的消化酶。
无论是Trypsin-EDTA还是Tryp LE从羊膜上皮层消化、分离获得的羊膜上皮细胞都是一个混合的细胞群, 在体外培养时会出现3种细胞类型, 即上皮样细胞、间充质样细胞和半贴壁圆形细胞。TrypsinEDTA和Tryp LE消化、分离的细胞在体外培养时, 原代和第1代细胞倍增时间差异显著, 之后细胞倍增时间均有所降低, 之后逐渐接近, 这说明消化液对细胞繁殖能力的影响随着传代而逐渐减弱。无论是Trypsin-EDTA还是Tryp LE消化、分离所获得的细胞经过冷冻复苏后第1代细胞的倍增时间较长, 可能是由于冷冻也会对某些细胞造成一些损伤而影响了细胞的繁殖能力。Trypsin-EDTA消化是否会影响马羊膜上皮干细胞的分化还有待于进一步研究。
摘要：为了建立马羊膜上皮细胞 (equine amniotic epithelial cells, e AECs) 的分离、培养方法, 并对其影响因素进行研究, 试验从胎盘剥离羊膜, 采用Trypsin-乙二胺四乙酸 (EDTA) 或Tryp LE消化法分离获得上皮细胞, 然后进行上皮细胞培养传代研究。结果表明:通过0.25%Trypsin-EDTA消化, 每克羊膜平均获得2.2×106个细胞, 其3代传代倍增时间平均为 (1.32±0.21) d;通过0.25%Tryp LE消化, 每克羊膜平均获得1.9×106个细胞, 其3代传代倍增时间平均为 (1.26±0.17) d, 两者间差异显著 (P<0.05) 。Tryp LE消化结果比较稳定, 更适合从马羊膜层消化、分离上皮细胞。
分离培养 篇11
关键词：沉降罐 分离器脱水 高效运行
中图分类号：TE3 文献标识码：B 文章编码：1674-3520（2014）-02-00192-01
一、HXS型油气水三相分离器使用的背景
对油气水混合物的预处理，采油三厂多年来一直采用端点加药、管道破乳、大罐溢流沉降脱水工艺模式。但经过长期的运行发现，大罐溢流沉降脱水具有占地面积大、一次性投资大、油品蒸发损耗大等诸多弊端。2008年吴起油区首次采用HXS型高效油气水三相分离器，它具有脱水效果好、自动化程度高、投资少等特点，保证采出水处理后水质合格，完全达到了国家要求的污水回注指标，并有效降低了原油处理成本。随着油田大规模开发的需要，作为一个集输技师，现就吴起作业区靖四联站三相分离器现场独立计量平稳分离运行的创新方法进行总结，旨在为进一步提高设备管理水平，提升全厂地面工艺水平作出应有的贡献。
二、三相分离器投运的必然性
端点加药——管道破乳——大罐溢流沉降脱水工艺模式，但该模式存在以下问题：
（一）是由于沉降罐投运时间较长，罐内加热盘管长期浸泡在污水中，腐蚀破损严重，维护频繁，影响了联合站的正常运行；
（二）是污水在沉降罐内停留时间长，污水中细菌繁殖较快，加剧了对下游水源的污染和污水处理设备的腐蚀；
（三）是由于沉降罐脱水为开式流程，油气蒸发损耗量较大；
（四）是我厂井区生产的原油中常含有大量伴生气或溶解气，气液混合物进入沉降罐内会对罐内油水混合物进行搅拌，同时油气水不均匀液流对沉降罐冲击，使沉降罐的液流不平稳；
（五）部分油区原油内有毒气体含量较大，气液混合物进入沉降罐内气液分离，气体从沉降罐内排出对储罐、人体的伤害较大。因此为了合理有效的解决这些问题，根据吴起油区低压低渗的特点，以及作业区进入中后期发展阶段，注水强驱技术的大规模应用， 在吴起作业区靖四联应用HXS型油气水三相分离器，成功应用后达到了井区伴生气的回收和原油脱水的目的，为进一步提升全厂地面工艺水平奠定了基础。
三、HXS型三相分离器介绍
HXS型油气水三相分离器主要由筒体、填料、静态搅拌器、自力式压力调节器、浮子液面调节阀、安全阀、压力表、阀门、液位自动采集显示仪等构成。
采用油水界面检测仪检测油水界面，通过电动调节阀控制油水界面高度，实现了油水界面的稳定性和可调性，确保分离器在理想状态下工作，保证了油水分离效果。
吴起作业区靖四联合站内1#、2#、3#HXS3.0*12.4-0.6-Y三相分离器于2008年11月投用，肩负着站内产进原油油气水三相分离任务。上游来液经加热后进入三相分离器处理，两台三相分离器并联运行，平均日处理量约1630m?，属满负荷运行，处理后原油平均含水在0.03%，直接进入净化油罐外输，所脱污水含油在30mg/l以下。
四、HXS型三相分离器脱水工艺的特点
HXS三相分离器脱水工艺模式与传统沉降罐脱水工艺模式相比具有以下优点。
（一）脱水效果好。三相分离器脱水时首先除去了油中大部分气体，减少了气体对液体的扰动，有利于油水分离，提高了脱水质量。原油脱水率一般达99%以上。经一次脱水后的原油可达净化原油标准0.5%以下，重质原油1%以下。
（二）自动化程度高。三相分离器采用了配套检测、控制、记录、报警等仪器仪表，可实现压力、界面和油、水液面自动控制与超限报警，自动计量记录和自控，数据远传等，达到无人值守。
（三）简化了工艺流程。原脱气脱水流程需二段甚至三段四段流程，设备多，流程复杂。而采用高效三相分离器后，用一段流程、一台设备顶替了以前的多段流程和多台设备。其容积负荷为传统脱水设备的6～8倍。
（四）运行费用低。三相分离器体积小，加热所需能耗少，结构紧凑，生产维护方便简单，降低了日常运行费用。
（五）工艺流程密闭。原脱气脱水流程需二段甚至三段四段流程，设备多，流程复杂。而采用高效三相分离器后，用一段流程、一台设备顶替了以前的多段流程和多台设备。采用三相分离器脱水，工艺流程由开式流程变为密闭流程，大大减少了油品的蒸发损耗，降低了站内油气污染，消减了安全隐患。
（六）投资少。HXS三相分离器比相同处理量的沉降罐投资少，占地面积小、施工期短，移动灵活方便，在平地紧缺的黄土高原上优势明显。由于节省了大量的设备、简化了流程和节省了占地，与旧工艺相比，一般能节省投资20%～50%，同时降低了原油净化处理能耗。
五、HXS型三相分离器高效运行所需要的条件
（一）平稳进液，上游连续、平稳输油，保證瞬时进液波动量在设计量的15%以内；（二）高效破乳，加药浓度控制在150～200ppm，效果较好；（三）运行温度，三相分离器要求的运行温度较高，一般在40～50℃间；（四）运行压力，保证操作压力在0.13～0.3MPa之间[1]。
六、常规流程运行弊端及改进方法
运行弊端： （一）每具三相分离器来液分流不均。（二）油品不一，对设备结垢腐蚀损坏严重。（三）目视化不清，靠阀门控制，有可能造成进液紊乱，出液不均匀。
改进方法：（一）三相分离器前端新增流量计，对每具设备的进液量进行监控调整，使其分液均匀，进液平稳，可实现独立计量平稳运行。（二）上游阻垢剂、过滤器等，减少设备结垢腐蚀等现象。（三）对每具设备来液瞬时流量监控更为直观、科学，不用采取人为经验所造成的不准确性。
七、使用效果及评价
滩羊骨髓间充质干细胞分离与培养 篇12
关键词：滩羊,骨髓间充质干细胞,体外分离培养,全骨髓法,差速贴壁法
骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Dtromal Cells,BMSCs)源于中胚层,是骨髓细胞中除造血干细胞之外的细胞部分,具有自我更新及多向分化潜能的干细胞。在特定培养的条件下,BMSCs可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞以及神经细胞等多种类型的组织细胞。BMSCs具有增殖能力强,来源广泛,取材方便、体外培养稳定等优点,已成为组织工程种子细胞的首选[1,2]。目前在小动物上如小鼠、大鼠、兔上研究比较广泛,而在牛羊等大动物的研究上相对较少[3],尤其是在滩羊的研究就更少,因此实验重在探讨宁夏滩羊BMSCs的分离培养,以筛选出适合滩羊BMSCs的培养条件,以期为后续的相关研究提供滩羊BMSCs。
1 实验动物
实验动物来源于宁夏暖泉滩羊种羊场饲养的1岁雄性滩羊。
2 实验方法
2.1 BMSCs的分离、培养及传代
将滩羊麻醉后用16号骨穿针行髂骨穿刺,待进针感觉到有明显的落空感后,用10 m L注射器抽取骨髓5 m L,与含有肝素钠的DMEM培养液等量混匀后1 000 r/min离心5 min,弃上清液;向沉淀中加入DMEM液至15 m L,混匀后沿管壁缓慢加入到含有等量淋巴分离液,1 800 r/min离心15 min,缓慢取出,可见离心管分为清晰的5层:从上而下依次为脂肪层、血小板层、单核细胞层、淋巴细胞分离液及红细胞和巨噬细胞层,其中单核细胞层含有BMSCs[4,5]。
吸取单核细胞层后加入5 m L DMEM,移液枪缓慢吹打混匀,1 500 r/min离心5 min后弃上清液,重复操作3次。向沉淀中加入细胞培养液(含有10%胎牛血清、5%马血清及双抗的低糖DMEM)10 m L,反复吹打制成单细胞悬液,接种到25 cm2培养皿,每瓶加细胞混悬液5 m L,置37℃、5%的CO2、饱和湿度孵箱内进行培养,3 d后首次全量换液,以后每3~4 d半量换液1次。倒置显微镜下观察细胞变化,待80%左右的细胞融合成单层后,用0.25%胰蛋白酶消化传代,获得羊BMSCs。
2.2 BMSCs的冻存与复苏
取第3代处于对数生长期的羊BMSCs,用0.25%胰蛋白酶消化,2 000 r/min离心10 min,弃上清液,加入等量的冻存液(含有胎牛血清的DMSO),吹打均匀,细胞密度为1×108个/m L,每个灭菌冻存管中加入1 m L冻存液,封口膜封存。放入程序降温盒中置-70℃冰箱过夜,然后移入-196℃的液氮中。
取出冻存管后,迅速投入37℃水浴箱中,将融化的细胞悬液移入离心管,加入1 m L完全培养基吹打均匀后,以1 000 r/min离心10 min,弃上清液,加入完全培养基5 m L吹打均匀,接种于直径为25 cm的培养皿中进行常规培养。
2.3 BMSCs的脂肪诱导分化
取生长良好的第3代BMSCs,胰蛋白酶消化后,调整细胞密度2×105个/m L,接种于24孔板中,24 h后加入成脂诱导剂(含有地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤及消炎痛),每3~4 d换液1次,21 d左右观察诱导分化的情况,并油红染色进行鉴定[6]。
3 结果
3.1 BMSCs的形态学特征
刚接种的原代细胞呈圆形,细胞核呈卵圆形,胞体透亮,折光性好,但初次接种的细胞含有较多悬浮细胞,主要为骨髓造血细胞,利用差速贴壁法去除。一般2~3 d后首次换液,除掉大部分悬浮细胞,换液后可见少量贴壁细胞,形态不均一,为梭形或不规则细胞,带有多个长的胞浆突起。7 d换液后悬浮细胞基本去除,BMSCs原代细胞聚集为细胞群落,形态以不规则的多角形为主。2周左右可见多处大片聚集生长的细胞群落,中心细胞为梭形,可见2~3个突起。
原代细胞生长缓慢,一经传代后,生长较快。传代细胞接种后2~4 h即可贴壁,6~10 h左右基本完成贴壁;第2~5天细胞呈梭形或不规则的三角形,也有扁平形且带突起的细胞,胞内可见2~4个核,细胞呈大体均匀分布,但有多个明显的梭形细胞集落呈克隆样生长,7 d左右达到80%融合度,细胞密集单层排列,生长抑制,即可进行传代,未见明显的钙化结节形成。
3.2 BMSCs的冻存和复苏
采用程序降温盒冻存的细胞,死亡较少,滩羊BMSCs复苏后,贴壁较快,但是稍慢于传代的滩羊BMSCs,6~8 d即可达到80%细胞融合度,其形态和活性与传代细胞没有明显差别。
3.3 BMSCs的成脂诱导
21 d诱导培养后,细胞由梭形变为空泡状,与脂肪组织内的脂肪空泡相似,并用油红染色后,脂肪滴呈红色。
4 讨论
BMSCs以其独特的细胞增殖分裂模式、稳定的细胞特性、连续传代培养和冷冻保存后仍保持多向分化潜能等特点,成为组织工程的理想的种子细胞。由于BMSCs数量少,且在体外培养条件下,仅有少数BMSCs能活跃复制。因此,探索体外分离、纯化和体外扩增BMSCs的方法,保持其增殖潜能与多向分化潜能的适宜培养条件,是进一步研究间充质干细胞应用的重要基础。目前,从骨髓中分离和纯化BMSCs的方法主要有:全骨髓细胞接种法,密度梯度离心法(Percoll或Ficoll密度梯度离心法),细胞表面分子标记分选法,免疫磁珠法[7,8,9,10]。
密度梯度离心法分离的细胞纯度较高,但会影响细胞的增殖活力,且操作较繁琐[11]。流式细胞仪、免疫磁珠分离系统等进行分选,可获得高纯度的BM-SCs,但对细胞的活性影响较大,甚至可能导致细胞完全失去活性。相比之下,全骨髓培养法获得细胞贴壁早,没有分离液和长时间的室温操作对细胞的损伤,不会剔除骨髓富含的各种黏附分子和生长因子,但细胞纯度不高,有血细胞混杂,不便于早期观察[4]。