细胞分离培养

细胞分离培养（精选10篇）

细胞分离培养 篇1

驯鹿是一种珍贵的经济动物, 在我国分布范围很小, 仅限于大兴安岭西北坡, 数量稀少, 是我国二级保护动物。驯鹿为半野生状态, 是主要以苔藓、石蕊等木质素含量较低的软纤维植物为主食的反刍动物[1];因此, 驯鹿胃肠道的消化和免疫功能与一般家养的反刍动物相比产生了一些适应性变化, 从而不能适应普通的圈养生活, 圈养的部分驯鹿因消化不良等引起疾病而死亡, 因此有必要对驯鹿的胃肠道生理特点进行深入的了解, 从而建立驯鹿瘤胃上皮细胞的体外培养方法对体外研究驯鹿瘤胃的生理功能有重大意义。

有资料显示, 对于反刍动物瘤胃上皮细胞的培养技术早在1980年就有记录, P.Gálfi等[2]采取胰蛋白酶消化法对牛瘤胃上皮细胞进行分离, 并成功培养了牛的瘤胃上皮细胞。此后, 研究者们在此基础上对反刍动物瘤胃上皮细胞的培养技术进行了多次改进, 但大多局限于牛和绵羊[3], 其他反刍动物瘤胃上皮细胞体外培养的技术鲜有报道, 而对驯鹿瘤胃上皮细胞体外培养的技术未见报道。

本研究以内蒙古呼伦贝尔市敖鲁古雅乡的中国驯鹿为研究对象, 结合牛、羊瘤胃上皮细胞的培养技术对驯鹿的瘤胃上皮细胞进行原代分离及体外培养, 以期为相关的体外研究提供一定的技术支持。

1 材料

1.1 试验动物

驯鹿, 内蒙古自治区呼伦贝尔市某猎民点淘汰的驯鹿。

1.2 主要试剂

细胞培养试剂:M199培养基和胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂 (insulin-transferrin-selenium-X) (ITS) , 购自Gibco公司;胰蛋白酶 (trypsin) 、L-谷氨酰胺、Na HCO3, 购自Sigma公司;胎牛血清 (FBS) , Hyclone公司生产;两性霉素B, 购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

细胞培养用液:磷酸盐缓冲液 (PBS) , M199培养基添加了15%的FBS、2 mmol/L L-谷氨酰胺、2μg/m L ITS、200 IU/m L青霉素及200μg/m L链霉素等。

细胞鉴定试剂:细胞角蛋白一抗 (醛缩酶A, CK19) , 购自Sigma公司;即用型快捷免疫组化MaxVisionTM试剂盒和苏木素体细胞快速染色液, 由福州迈新生物技术有限公司提供。

其余试剂为实验室常规试剂。

2 方法

2.1 驯鹿瘤胃上皮细胞的分离

将取来的瘤胃组织用4℃灭菌生理盐水冲洗去食糜及污染物后, 浸入4℃灭菌PBS溶液 (含500μg/m L青霉素, 250μg/m L链霉素, 0.5μg/m L两性霉素B, 100μg/m L庆大霉素) 中, 带回实验室;钝性分离瘤胃组织的黏膜上皮层和固有层, 并取2~4 cm2的上皮层以上述PBS溶液反复清洗3次, 再用不含抗生素的灭菌PBS溶液浸泡10 min;置入约15 m L 0.25%Trypsin-0.02%EDTA消化液中于37℃水浴中连续振荡消化, 每30 min取其消化液过滤并于显微镜下观察, 同时更换新的消化液, 直至消化液中出现非上皮细胞。将主要包含上皮细胞的消化液用200目的不锈钢细胞滤网过滤收集并用15 m L含有10%血清的培养液终止消化。将混合液转移至离心管, 吹打混匀后1 500 r/min离心10 min;弃去上清液, 加入PBS缓冲溶液后, 充分吹打混匀, 1 500 r/min离心10 min;如此反复洗涤2次, 第2次弃去上清液后, 加入10 m L完全培养液, 充分吹打混匀后, 调整细胞密度至1×105/m L, 并转移至细胞培养瓶中, 于37℃、5%CO2的培养箱中静置培养, 24 h后观察有无染菌, 在显微镜下观察其生长状况。

2.2 驯鹿瘤胃上皮细胞的传代培养

培养基采用M199加15%的FBS, 将细胞分装于25 cm2培养瓶中, 置于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养48~72 h后, 更换培养液, 弃去未贴壁的细胞, 根据细胞生长情况, 每3~4 d全量换液1次。待细胞达到80%~90%融合时, 用0.25%Trypsin-0.02%EDTA消化液消化3~4 min, 显微镜下观察, 如细胞隆起, 胞质回缩变圆、变亮, 加入含有血清的培养液终止消化, 并用移液枪轻轻吹打使之悬浮, 再转移至离心管中离心、洗涤 (方法同原代培养) , 最后转移至细胞培养瓶中, 继续于37℃、5%CO2的培养箱中静置培养。

2.3 驯鹿瘤胃上皮细胞的形态学观察及免疫细胞化学鉴定

在显微镜下对细胞的形态和生长情况进行观察。

根据上皮细胞的标志性中间丝蛋白为细胞角蛋白, 对驯鹿瘤胃上皮细胞的角蛋白进行免疫细胞化学的鉴定。取对数生长的瘤胃上皮细胞用37℃的0.25%Trypsin-0.02%EDTA消化液消化下来, 在6孔细胞培养板中进行常规的盖玻片爬片培养 (3 d) ;取出爬片, 用4%多聚甲醛固定15 min;PBS洗涤3次, 加0.5%Triton作用20 min;PBS洗涤3次, 加3%H2O2孵育15 min;PBS洗涤3次, 加封闭血清孵育20 min;加入一抗, 37℃孵育60 min;PBS冲洗3次, 加入通用型二抗工作液37℃孵育30 min;PBS洗涤3次;DAB显色;自来水冲洗;苏木素核复染, 自来水冲洗;显微镜下观察照像。空白对照用PBS代替一抗。

3 结果

3.1 驯鹿瘤胃上皮细胞的分离结果

瘤胃上皮细胞经0.25%Trypsin-0.02%EDTA消化液消化第4次起在显微镜下可观察到大量上皮细胞分散存在, 直到消化至第6次, 细胞数量开始减少, 且组织变得黏腻。收集后于显微镜下观察, 可见细胞数量多, 单个散在, 大小均一, 具有较好的折光度 (见228页彩图1A) 。调整细胞密度进行培养, 培养的细胞在72 h后有大部分贴壁, 细胞颜色发暗, 呈多角形, 并已开始生长, 呈岛屿状分布;也有未贴壁悬浮的细胞, 细胞折光度好, 体积较小, 形态较圆 (见228页彩图1B) 。96 h后生长迅速, 细胞增殖明显, 可见典型的铺路石状生长, 进入对数生长期 (见228页彩图1C) 。随后的7~9 d, 细胞生长融合成片, 呈单层状生长 (见228页彩图1D) 。

3.2 驯鹿瘤胃上皮细胞的传代培养结果

传1代后的细胞可在12 h内贴壁, 并迅速进入对数期生长增殖, 细胞形态完整, 生长良好 (见228页彩图2A) , 可在3~4 d铺满细胞瓶。传2代后细胞增殖迅速, 但细胞形态发生变化, 大小极不均一, 部分细胞胞体宽大、扁平, 胞浆内出现空泡和黑色颗粒 (见228页彩图2B) , 后期细胞增殖减慢, 甚至生长停滞, 逐渐死亡, 从瓶壁脱落。

3.3 驯鹿瘤胃上皮细胞的形态学及免疫细胞化学鉴定结果

细胞经分离培养48 h后, 可见细胞单个或数个贴壁, 呈扁平多角形, 胞浆丰富, 轮廓清晰。进入对数期后, 细胞呈小岛屿状生长, 各细胞岛屿间可见有细胞连接。7~9 d时, 各细胞岛屿连接成片, 呈铺路石样生长, 是典型的上皮形态 (见228页彩图3A) 。经免疫细胞化学方法的鉴定, 可见细胞胞浆为黄褐色, 即角蛋白CK19染色呈阳性 (见228页彩图3B) , 可判断所培养细胞为上皮细胞。

4 讨论

近年来, 我国驯鹿的数量一直徘徊在千只左右, 内蒙古大兴安岭北部敖鲁古雅民族自治乡的驯鹿是我国唯一的驯鹿种群, 均为鄂温克族所豢养, 呈半野生状态。虽然我国于2003年实行了生态移民, 但移民后的2个月间 (7—9月份) 有200多头驯鹿因消化不良引起疾病死亡, 驯鹿种群数量由搬迁前的800多只下降至不足600只[4]。无奈大部分鄂温克族人又牵着驯鹿返回原始森林过着游牧生活, 不定期地迁居, 是中国最后的狩猎部落。因此, 加强驯鹿圈养的相关科学研究, 不仅能恢复驯鹿种群的数量, 也是结束“中国最后狩猎部落”的有效办法。

P.Gálfi等[2]首次培养牛的瘤胃上皮细胞时采用剪切瘤胃乳头的方法进行分离及培养, 成功建立了牛的瘤胃上皮细胞的体外培养方法;同样类似的方法于第2年成功地培养了绵羊瘤胃上皮细胞[5];F.Stumpff等[6]在前人的培养技术基础上改进了取材方法, 设计并制作了一种模具, 使胰蛋白酶只作用于乳头来分离上皮细胞;沈赞明等[7]在培养奶公牛瘤胃上皮细胞时, 钝性分离瘤胃黏膜上皮与固有层以获得较为纯净的上皮细胞。本试验在总结前人试验的基础上, 采用钝性分离瘤胃黏膜得到上皮层的方法, 对上皮组织整体进行胰蛋白酶消化, 经试验鉴定获得了可扩增培养的瘤胃上皮细胞。本试验方法简便易行, 具有较强的可操作性。

有研究表明, 胃肠道上皮细胞的原代培养已在实践中大量应用。有人指出, 人的胃黏膜上皮细胞是以胶原酶和透明质酸酶对胃黏膜进行处理得到的[8];猪小肠黏膜上皮细胞采用组织块贴壁法能获得活性好的黏膜上皮细胞[9];而周传丽等[10]报道, 利用Ⅺ型胶原酶和Ⅰ型中性蛋白酶的混合液灌注仔猪小肠能消化分离小肠黏膜上皮组织得到形态完整、容易贴壁生长的小肠绒毛细胞团。本试验采用0.25%的胰蛋白酶-0.02%EDTA对驯鹿瘤胃黏膜上皮进行处理, 结果表明, 可以获得大量活性较好的上皮细胞, 易于培养。

反刍动物的瘤胃壁由黏膜、黏膜下层、肌层和浆膜4层构成。瘤胃黏膜表面被覆复层扁平上皮, 其由外至内分为角质层、颗粒层、棘细胞层和基底层[11], 其中角质细胞没有细胞活性, 而基细胞具有很强的分裂增殖能力, 其次为颗粒细胞[2]。分离瘤胃上皮细胞时选择胰酶多次连续振荡消化可获得大量上皮细胞, 但在细胞的游离状态下不能确切区分每一层的细胞。本试验中发现, 角质细胞不贴壁, 不生长, 不影响其他细胞的贴壁和生长, 在换液时会随细胞培养液被弃掉。由本试验结果可以推测, 尽管细胞贴壁生长但由于处于非生理的条件下, 在显微镜下观察均呈典型的上皮样生长, 不体现颗粒细胞、棘细胞或是基细胞的形态特性。

角蛋白存在于上皮细胞胞浆中构成上皮细胞内细胞骨架, 是上皮细胞中特异性的抗原, 具有多种表型。有人对仔猪小肠黏膜上皮细胞[9]和肾小管上皮细胞[12]的CK18进行了鉴定;多曙光等[13]对牛乳腺上皮细胞中的CK5和CK8进行了鉴定;李海甲[14]培养的兔气管黏膜细胞是采用广谱抗角蛋白单克隆抗体进行免疫组织化学染色。本试验在形态鉴定的基础上, 对所培养细胞中的角蛋白CK19进行了免疫细胞化学的染色, 呈阳性反应。

尽管对于瘤胃细胞的原代培养有大量文献佐证, 但未见有关其传代培养的报道。本试验经多次反复尝试与改进, 成功地进行了驯鹿瘤胃上皮细胞的传1代体外培养, 但对于驯鹿瘤胃上皮细胞能否连续传代培养, 是否受培养条件局限, 仍需进一步验证。

J.J.Gildea等[15]分别用传统的方法和三维细胞培养技术培养了人的肾上皮细胞, 结果表明, 用三维细胞培养技术获得的细胞在基因表达、基质分泌及细胞功能活动等方面与传统细胞培养技术获得的细胞有差异, 而与体内细胞的生长情况更为相似, 而且三维细胞培养既能保留体内细胞微环境的物质结构基础, 又能体现细胞培养的直观性及条件可控制性, 所得到的研究结果也更为可靠。由此启示人们, 今后可以从这一方面加以突破。

中国驯鹿瘤胃上皮细胞体外分离培养方法的初步建立为体外研究中国驯鹿瘤胃上皮细胞的生理功能奠定了试验基础。

a.贴壁细胞;b.悬浮细胞。

细胞分离培养 篇2

昆明白小鼠胚胎干细胞分离与体外培养

为探索昆明白小鼠胚胎干细胞建系方法,将受孕4.5天的`昆明白小鼠囊胚用免疫手术法去除滋胚层,然后将内细胞团(ICM)接种于胎鼠成纤维细胞饲养层上培养,形成的胚胎干细胞样集落用胰蛋白酶-EDTA消化法传代,培养后进行相差显微镜观察及碱性磷酸酶染色.结果饲养层上生长的ICM细胞呈典型的ES样细胞集落,传至第8代碱性磷酸酶染色呈强阳性.实验表明免疫手术法适用于昆明白小鼠ES细胞建系,获得的细胞集落具有ES细胞的主要生物学性状.

作 者：李煜 梁琳 王振飞 贾瑞贞 戴宝贞 李瑶 Yu Li Lin Liang Zhen-Fei Wang Rui-Zhen Jia Bao-Zhen Dai Yao Li  作者单位：内蒙古大学哺乳动物生殖生物学与生物技术教育部重点实验室,呼和浩特,010021 刊 名：细胞生物学杂志  ISTIC英文刊名：CHINESE JOURNAL OF CELL BIOLOGY 年，卷(期)： 29(6) 分类号：Q2 关键词：小鼠   胚胎干细胞   免疫手术   内细胞团  

细胞分离培养 篇3

【关键词】间充质干细胞；脂肪组织；细胞培养；SUI模型

【中图分类号】R691【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2009)10-0125-01

压力性尿失禁(SUI)为女性的常见病和多发病，其发病率约为1 S%-6O%，多发生于老年人，因受经济、宗教、教育程度等因素的影响，其实际发生率比统计发病率更高。SVl的症状严重与否都不自接危及生命，但它给患者的日常上作、生活及社交活动造成一定程度的影响，甚至会严重影响患者的生活质量乃至家庭和睦。

1临床资料

注射疗法是将药物、化学制剂或自体组织等注入后尿道或膀肌颈内口粘膜下，使尿道腔变窄、拉长，延长功能性尿道的长度，提高尿道阻力，起到关闭尿道内口和后尿道的作用，从而达到有效控制排尿的口的。这一治疗方法对尿道内括约肌功能障碍、尿道内压降低同时尿道、膀肌无其他病变等压力性尿失禁患者有较好的效果。注射疗法主要优点在于.以在局部浸润麻醉下进行操作，大多数患者的手术均.IJ.以在门诊进行，适用于老年及不能耐一受大手术的患者。口前注射疗法的研究主要集中在选择不同的注射材料上，理想的注射材料应该在结构上完整，无毒、无免疫原性、无变应原性，近期内不会被分解，能长时间保持其支撑作用。口前使用的材料尚难达到上述要求，因此寻找一种取材方便、生物相容性好、安全无毒、疗效满意的注射材料十分必要。

方法：无菌技术下获取SD大鼠双侧腹股沟区脂肪垫，消化离心，长期培养的方法获取脂肪源性间充质干细胞。倒置相差显微镜观察细胞形态变化，对培养细胞进行免疫细胞化学染色，鉴定其表面分子标志。SD大鼠24只分为3组，实验组（6只），对照组一（3只），对照组二（3只）。分别获取自体ADSCs，实验组进行荧光标记。然后实验组将荧光标记的ADSCs自体移植至尿道周围，对照组移植未并取尿道组织进行HE染色组织学分析。

2结果

原代培养显示培养的脂肪源性间充质干细胞2d左右开始壁,10d-14d左右可达90%融合,基本上为梭形成纤维样细胞形态,免疫细胞化学示 CD29阳性，CD34阴性。阴部神经切断术后10天，除模型组和对照组一各有1只大鼠死亡外，均进行尿流动力学检测，三组手术前后ALLP分别为：对照组一为27.1±5.1和29.1±3.2cmH₂O，对照二为29.5±4.9和27.4±72.3,模型组为24.8±3.8和14.7±3.0。模型组手术后ALLP明显降低，且组织学检查亦证明模型组大鼠尿道周围括约肌明显萎缩。

3讨论

本实验将荧光金标记的脂肪源性干细胞自体移植至大鼠的近端尿道周围，行冰冻切片，组织化学染色，荧光显微镜下观察.见荧光标记的细胞呈金黄色:后取组抗体免疫移植部位有较多的Desmin阳性的细胞，棕黄色，部分出现一定的方向性，未见明显炎症细胞浸润，说明己有细胞在局部存活并生长，提示能成为压力性尿失禁注射治疗的一种理想的注射材料，为将来进行细胞移植治疗压力性尿失禁提供了实验依据。

结论：①大鼠脂肪组织中含有丰富的多能干细胞。利用消化离心，长期培养的方法可获取大量的干细胞。②移植后大鼠的ADSCs，可以在尿道周围成活并生长分化。

参考文献

[1]梁月有.诊断女性压力性尿失禁的相关检查[J].新医学.2006,37（10）:687-689.

[2]王萌.尿道周围注射治疗女性压力性尿失禁的研究进展[J].国际泌尿系统杂志,2006,26（6）：798-802.

[3]姚启盛，叶章群，陈从波,等.骨胳肌肌源细胞自体移植在压力性尿失禁治疗中的价值[J].中华泌尿外科杂志，2006，26（12）:841-843.

[4]Strasser H,Marksteiner R,Margreiter E,et al.Stem cell therapy in treatment of urinary incontinence[J].first clinical results.J Urol,2004,171(suppl):130-133

细胞分离培养 篇4

关键词：支持细胞,体外培养,小鼠,分离,纯化

支持细胞(sertoli cell,SC)也称足细胞,是由早期发育的胚胎生殖嵴细胞分化而成,与精原细胞一起构成睾丸曲细精管。睾丸支持细胞是柱状的大型细胞,其基底部接在曲细精管基底膜上,另一端突向曲细精管腔形成树枝状的突起[1,2]。在光镜下观察时,支持细胞呈不规则的三角形或多边形,核仁明显。电镜下观察时,支持细胞呈不规则三角形或多边形,侧面和腔面有许多不规则凹陷。胞质内有许多微丝和微管,相邻睾丸支持细胞侧面近基部的胞膜形成紧密连接。在精子的形成过程中,卵泡刺激素(FSH)与支持细胞膜上的FSH受体结合,激活腺嘌呤核苷酸环化酶,产生磷酸腺苷(cAMP),后者再激活磷酸化酶,使m RNA活化,产生雄激素结合蛋白(ABP),ABP与睾酮结合,维持曲细精管内睾酮的浓度,造成生精细胞分化成熟的环境。

多年来,支持细胞的功能被认为是生精细胞的支架,为生精细胞提供必需的营养物质,可分泌缪勒管抑制物(MIS)、ABP以及多种生长因子(如TGF-α、TGF-β、b-FGF、EGF-α、EGF-β、IGF-1等),也对精原细胞的体外分化培养起着至关重要的作用[3,4]。因此,支持细胞体外培养是进行生殖细胞培养研究的基础,目前已有多种支持细胞体外培养方法,并已建立永生支持细胞株。

另外,由于支持细胞表达并分泌自杀相关因子配体(FasL),从而被用于睾丸以外的部位,为移植的细胞提供免疫豁免的环境,为糖尿病和帕金森病的治疗开辟了广阔的前景;此外,支持细胞在体外可促进神经元以及胰岛细胞的存活及功能的发挥。近期还有人报道了支持细胞用于体细胞克隆的可能性。所有这些均说明支持细胞的功能非常广泛,应用前景广大,其具体的作用机制以及更广泛的应用有待于人们去进一步开发。

1 材料

F12/DMEM培养基,Gibco公司生产;胎牛血清(FBS)、胶原酶Ⅳ、胰蛋白酶和透明质酸酶、油红O、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES),Sigma公司生产;青霉素、链霉素,哈药集团制药总厂生产;谷氨酰胺,Merk公司生产。

生物安全柜,HFD公司生产;CO2培养箱,Termo公司生产;低温高速离心机,Eppendorf公司生产;倒置显微镜,Nikon公司生产;电子分析天平,沈阳龙腾电子有限公司生产;超低温冰箱,NBS公司生产;超纯水制备机,PALL公司生产;低温冰箱,SANYO公司生产;4℃冰箱,海尔集团生产;磁力搅拌器,杭州仪表电机厂生产;数显恒温水浴锅、培养皿、解剖用眼科剪刀、眼科直头镊子、眼科弯头镊子、显微镊子、200目钢筛、离心管(2 m L、15 m L、50 m L)和移液枪及枪头,江苏常熟医疗机械厂生产。

16～22日龄睾丸发育良好的雄性昆明小白鼠10只,由西安交通大学医学院实验动物中心提供。

2 方法

2.1 小鼠睾丸细胞悬液的制备及支持细胞的分离

取16～22日龄雄性昆明小白鼠10只,采用颈椎脱臼法处死,在无菌条件下,切开阴囊取出睾丸,去除睾丸白膜和血管,暴露生精小管,用D-Hank’s液反复冲洗;用吸管轻轻吹打以吹散精曲小管,再用小剪刀将生精小管剪成1～4 mm长的碎块;加入10倍于组织体积的1 mg/m L胶原酶溶液,于37℃、5%CO2条件下孵育15 min(期间晃动数次);1 000 r/min离心5 min;弃去上清液,加入0.25%胰蛋白酶和1.5 mg/m L的透明质酸酶溶液作用15 min;加入适量的血清终止消化,用200目钢筛过滤悬液,收集滤液,以1 000 r/min离心5 min;弃去上清液,用D-Hank’s液洗涤2～3遍,然后用F12/DMEM洗涤2次。

2.2 支持细胞的纯化

将分离的细胞悬液用Tris-HCl溶液(0.05 mol/L,pH值为7.4)低渗处理(3～5 min)以除去混杂的其他睾丸细胞;利用睾丸支持细胞贴壁而生殖细胞不贴壁的性质,培养24 h弃去悬浮于培养液中的杂细胞。纯化后,活细胞含量和支持细胞的纯度可进一步提高。

2.3 支持细胞的培养及其生长曲线的绘制

将分离得到的细胞在倒置显微镜下用细胞计数板进行计数,并采用台盼蓝染色判断睾丸支持细胞的活性,重新加入含10%胎牛血清的F12/DMEM培养液调整细胞密度为(3～3.5)×106/m L,培养24 h;弃去培养液,进行细胞计数;加少量20 mmol/L Tris-HCl液,低渗处理细胞3～5 min;再用Hank平衡盐溶液(HB-SS)冲洗2次,去除大部分生精细胞,加入含10%胎牛血清的F12/DMEM培养液,重新调整细胞密度,置于37℃、5%CO2、100%湿度条件下培养[5]。

取传至第3代刚好铺满瓶底、生长旺盛的睾丸支持细胞,用D-Hank’s液清洗后,用0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化2～3 min;用培养液中和,吹打成单个细胞,调整细胞浓度为3×104/m L,接种在24孔细胞培养板中,每孔接种1 m L,于37℃、5%CO2、100%湿度条件下培养,每24 h消化收集细胞,用血细胞计数板计细胞数,每次计3孔,每孔计2次,取平均值,连续计数8 d,每天1次。绘制细胞生长曲线。

2.4 支持细胞的形态、结构和生长增殖情况

2.4.1 H.E.染色

用0.25%的胰酶对汇合度达到80%的原代支持细胞进行消化并洗涤,然后将其接种在培养皿中,且放入经多聚赖氨酸包被的盖玻片,继续在培养箱中培养以制作细胞爬片;将贴有支持细胞的爬片用37℃、无Ca2+、Mg2+离子的PBS漂洗3次,每次20～60 s;浸入95%的乙醇中固定15 min;用上述PBS洗2次,每次1 min;将盖玻片浸入苏木精染液中5～10 min;用去离子水洗涤,浸入稀盐酸乙醇溶液中数秒钟;用去离子水洗涤,浸入淡氨水中3～5 min;用自来水洗涤干净,浸入伊红染液中5～10 min;用去离子水洗涤,通过70%、80%、90%乙醇各1次,95%乙醇2次,100%乙醇3次,每次1 min;通过二甲苯3次,每次1 min;用中性树胶封片,观察细胞和细胞核形态。

2.4.2 油红O染色

将贴有支持细胞的爬片用10%的中性甲醛固定12～15 h;再用70%乙醇洗涤数次后,加入0.5%的油红O,室温下染色10 min;弃去染液,经过70%乙醇洗涤后,用去离子水洗涤干净,苏木素复染2 min;用中性树胶封片,观察细胞和细胞核形态。

3 结果与分析

3.1 台盼蓝染色活率鉴定

细胞活率=[1-染色细胞数/细胞总数]×100%=1-13/181=92.81%。混合细胞台盼蓝染色结果见180页彩图1。

3.2 支持细胞的生长曲线(见图2)

由图2可以看出,睾丸支持细胞在培养至第2天时进入对数生长期,细胞增殖旺盛,至第6天时进入平台期,增殖速度开始减慢,但培养至第7天仍没见到凋亡的细胞。

3.3 支持细胞生长状况的观察

支持细胞贴壁性良好,接种后游离时间很短,一般4 h以后细胞开始发生极化,伸出突起,胞质拉长。体外培养10 h后完全贴壁,随即进入增殖期。培养24 h后弃去培养基,并经过Tris-HCl低渗处理后,可见胞体较大,呈长柱状贴壁生长,有的出现2个或多个突起,折光性较强。培养48 h后,可见睾丸支持细胞体积增大,呈不规则形,胞核清晰可见,位于胞体的中央或稍偏位。随着培养时间的延长,睾丸支持细胞的折光性降低,增殖减慢,细胞的连接非常紧密。各个培养阶段的支持细胞见180页彩图3～6。

3.4 H.E.染色

睾丸支持细胞呈长柱状或不规则的多边形,有3～4个突起,胞质铺展很大,被染成红色。细胞核为1个或多个,呈圆形或卵圆形,被染成淡蓝色或蓝紫色(见180页彩图7)。

3.5 油红O染色

睾丸支持细胞经油红O染色后,显微镜下观察可见胞质中有大小不一的圆形或卵圆形的空泡状结构,被染成红色或桔红色,这些空泡状结构是脂质小滴,存在于细胞的两极或核的周围(见180页彩图8)。

4 讨论与结论

4.1 对小鼠日龄的选择

由于睾丸支持细胞在睾丸中所占比例很低,因此分离的纯度常受到生精细胞及间质细胞的影响。胚胎鼠睾丸中生精细胞较少或不存在,但睾丸支持细胞产量亦较低;成年鼠睾丸中含有大量的生精细胞,所得睾丸支持细胞纯度较低。故试验选取16～22日龄的幼鼠,其睾丸均未下降到腹腔,曲细精管的生精上皮内主要有支持细胞和精原细胞两类细胞。这样既保证了产量,也提高了细胞的纯度。

4.2 睾丸支持细胞悬液的制备方法

适当的分离程序及消化分离方法对制备良好单细胞悬液非常重要。16～22日龄小白鼠的睾丸主要由支持细胞与各级生精细胞组成生精上皮,其中支持细胞基部位于由多层细胞及非细胞成分组成的固有膜上,故采用胶原酶和胰蛋白酶进行联合消化[6,7]。取出睾丸之后,先用显微镊子仔细去除脂肪垫及睾丸白膜,然后将睾丸组织剪碎,反复离心冲洗以去除血细胞,进行胰胶原酶消化时,将睾丸间质消散后,静置沉淀或低速离心,去除掉大部分间质组织及管周肌样细胞;再进行胰蛋白酶和透明质酸酶消化,去除基底膜部分并使曲细精管内细胞充分散开,释放出睾丸支持细胞和精原细胞,消化后的细胞组织液用200目滤网过滤,进一步去除筋膜,以去除大部分成纤维细胞,提高睾丸支持细胞的纯度。国外相关的文献报道和笔者的试验结果表明,这种多步骤消化过程能有效地分离到纯度较高的曲细精管段并获得较高产量的单细胞悬液,减少酶对细胞的损伤,同时确保去除大部分间质成分、管周肌样细胞。

4.3 细胞悬液的低渗处理

通过对前人方法的改进,试验在分离细胞过程中将分离的细胞悬液用0.05 mol/L的Tris-HCl低渗处理,以去除混杂的部分精原细胞和间质细胞,然后利用培养时睾丸支持细胞贴壁而生殖细胞不贴壁的特性,培养至24小时弃去悬浮于培养液中的杂细胞。通过该方法纯化后,平均每个睾丸可获得2×106个细胞,活细胞占总数的95%以上,睾丸支持细胞的纯度可达90%。与以往学者在39℃条件下培养48 h以去除精原细胞、纯化睾丸支持细胞的方法相比,明显降低了高温对细胞的损害,提高了睾丸支持细胞的纯度和活率。

4.4 睾丸支持细胞的形态、结构和生长、增殖

睾丸支持细胞分离培养至第3天时体积增大,膜状铺在培养皿底壁上,相互间连接呈网状。随着培养时间的延长(培养5～6 d后),睾丸支持细胞融合成片,折光性减弱。但睾丸支持细胞在体外培养时活性很强,培养至2周时,细胞仍存活良好,经H.E.染色、光镜下观察可见睾丸支持细胞呈宽大的柱状或不规则状,有多个粗大的突起,细胞核呈圆形或卵圆形,核膜上有小凹。睾丸支持细胞经油红O染色后,显微镜下观察可见胞质中散在有圆形、卵圆形、大小不一的空泡状结构。这些空泡状结构是脂质小滴,被染成红色或桔红色,聚集于睾丸支持细胞的两极或散布于核的四周。鉴定结果表明,含有红色或橘红色空泡状结构的细胞为睾丸支持细胞。

4.5 睾丸间质细胞与支持细胞的相互作用

间质细胞能够在促黄体生成素(LH)的作用下合成和分泌雄激素,而支持细胞能够在FSH的作用下使间质细胞产生的雄激素发生芳香化反应;雄激素又可促进支持细胞产生ABP并影响其他代谢功能。支持细胞的分泌产物可以通过旁分泌途径调节间质细胞的功能。研究表明,间质细胞的主要功能是合成和分泌雄激素,即一类含19个碳原子的类固醇激素,主要有睾酮、雄烯二酮等。支持细胞对生殖细胞具有支持和营养作用,同时还可形成睾丸内微环境、构成血睾屏障、吞噬细胞残体、调节精子的发生、产生类固醇类物质及分泌100余种不同的蛋白质以调节生殖功能。研究已证实支持细胞维持着睾丸组织的免疫豁免。总之,支持细胞通过分泌雄激素和一些含氮类细胞因子间接或直接地作用于间质细胞,在支持细胞与间质细胞之间形成短环式结构,以优化间质细胞的雄激素生成过程。间质细胞产生的睾酮对支持细胞的分泌功能起促进作用;间质细胞还产生非类固醇性调节物质对支持细胞的分泌功能具有抑制或者促进作用[8]。

参考文献

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细胞分离培养 篇5

关键词：真海鞘；化学成分；结构鉴定；人肝癌细胞HepG2

真海鞘（Halocynthia roretzi Drasche）主要分布于日本的海男鹿半岛以北的海域及韩国的东海岸和南海岸[1]。真海鞘可食部分含有丰富的营养成分，味道鲜美，深受人们的欢迎。李春艳等研究了真海鞘的营养价值，发现其可食部分除了含有丰富的氨基酸及矿物质以外，还含有丰富的必需不饱和脂肪酸[2]。近年来，辽宁和山东进行了真海鞘的引进和养殖，目前已经形成一定的规模化养殖[3]。真海鞘体外是呈橙红色具有很多乳头状突起的被囊（壳），是不可食部分，目前大多被当成废物废弃[1]。

海洋生物生活环境与陆生生物的生活环境不同。海洋生物生活环境往往更加极端，如高盐、高压环境，它们为了适应这样的生活环境，往往产生一些特殊结构的代谢中间产物。海洋生物所含有的特殊结构的代谢中间产物往往又成为潜在的药源生物活性物质。对真海鞘壳化学成分的研究未见报道。本研究中，对真海鞘壳化学成分分离及其浸膏抗肿瘤活性进行了研究，旨在为真海鞘壳的开发利用提供基础数据。

1材料和方法

1.1材料

真海鞘（Halocynthia roretzi Drasche）2013年10月于山东省威海市荣成寻山集团采购；人肝癌细胞HepG2来自中国科学院上海细胞库；D101大孔吸附树脂柱购于天津市海光化工有限公司；硅胶（20～300mesh，10～40 μm）及薄层层析硅胶（Silica gel for Thin-layer Chromatography，HG/ T2354-92）购于青岛海洋化工有限公司；Sephadex LH-20葡聚糖凝胶购于Sigma公司；CCK-8检测试剂盒（Dojindo，CK04）来自株式会社同仁化学研究所；其他试剂为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1真海鞘壳浸膏的制备真海鞘壳（湿重21 kg）洗去泥沙，剪成约2 cm×2 cm的小块，置于圆底烧瓶中，加入3倍量的75% EtOH，加热回流提取2 h，提取3次，制成浸膏并称重，放入冰箱中冷冻保藏备用。

依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇对提取到的浸膏进行3次萃取，浓缩，分别得到石油醚萃取部分（9 g）、乙酸乙酯萃取部分（13 g）和正丁醇萃取部分（16 g）。

1.2.2真海鞘壳化学成分的分离将石油醚萃取部分9 g溶于适量的石油醚中，在石油醚溶液中加入15 g的300～400目硅胶并搅拌均匀，挥发溶剂使样品充分吸附。用100 g 300～400目硅胶进行湿法装柱（2.5×70 cm），先用石油醚平衡，将混有石油醚萃取部分硅胶加入到柱的上层，用石油醚：乙酸乙酯（100∶1-100∶100）的洗脱液进行梯度洗脱，每个比例进行5个柱体积的洗脱，分别收集洗脱液（每组分约600 mL）。通过薄层层析法跟踪检测每个组分，并通过显色结果合并浓缩各组分，共得到8个组分，记为a、b、c、d、e、f、g和h组分（根据极性从小到大标记），a组分为化合物1（41 mg），对b组分进行重结晶，得化合物2 （120 mg）。

将正丁醇萃取部分16 g溶于适量的乙酸乙酯中，并向其中加入24 g的300～400目硅胶并搅拌均匀，挥发溶剂使样品充分吸附。用160 g 300～400目硅胶进行湿法装柱（3×100 cm），先用乙酸乙酯平衡，将混有正丁醇萃取部分硅胶加入到柱的上层，用乙酸乙酯：甲醇（100∶1-100∶100）的洗脱液进行梯度洗脱，每个比例进行5个柱体积的洗脱，分别收集洗脱液（每组分约600 mL）。通过薄层层析法跟踪检测每个组分，并通过显色结果合并浓缩各组分，共得到9个组分，记为a、b、c、d、e、f、g、h和j组分（根据极性从小到大标记），对c组分进行制备薄层色谱层析，对刮板洗脱浓缩得到的组分进行重结晶，得化合物3（10.5 mg）。

1.2.3结构鉴定核磁共振光谱（NMR）在Bruker Avance DRX 500核磁共振仪（500/125 MHz）上进行，以四甲基硅烷（TMS）作内标。

1.2.4真海鞘壳浸膏总甾体含量的测定按照田丽冉等的方法利用香草醛-硫酸溶液真海鞘壳浸膏进行总甾体含量的测定[4]。

1.2.5体外抗肿瘤活性测定称取真海鞘壳浸膏 40 mg ，用20 mL乙醇溶解配制成浓度为2 mg/mL的药液备用。

将HepG2细胞悬液接种于96孔培养板中（3×103个细胞/孔），于37 ℃ 5%CO2 培养箱培养，加药之前在显微镜下对细胞进行观察。将药液加入96孔培养板中，终浓度分别为2 μg/mL、20 μg/mL及200 μg/mL，共同孵育2 h、6 h、12 h、36 h，然后在显微镜下对细胞进行观察。同时，每孔加入10 μL CCK-8，混匀后培养箱中孵育3 h，测定450 nm处的吸光值。

1.2.6数据处理实验数据以平均值±标准差表示，采用SPSS13.0统计软件作单因素方差分析。

2结果与分析

2.1真海鞘壳浸膏的制备及化学成分的分离

利用75%EtOH浸提所获得的真海鞘壳浸膏亲水性较大，其含水量为5.12%，其总甾体含量为14.13%。对真海鞘壳浸膏石油醚萃取部分进一步分离，得化合物1和化合物2。

化合物1为白色似油状物。13C NMR （126 MHz，CDCl3） δ107.31（s），114.11（s），139.26（s），39.44 （s），37.44 （s），37.17 （s），34.73 （s），33.89 （dd，J= 67.3，50.3 Hz），33.27 （s），32.82 （s），3200 （s），30.11 （m），29.78 （d，J= 5.1 Hz），29.74 （d，J= 5.1 Hz），29.44 （s），29.03 （m），27.16 （s），26.77 （s），24.54 （s），23.24 （s），22.73（m），19.77（m），14.20 （d，J= 7.8 Hz），11.46 （s），1092 （s），7.56 （s），1.06 （s）。以上波谱数据并结合维普数据库查询，确定化合物1为Diethyl 24-[（Z）-3-methy-1-hexenyl]-heptatetracontanedioate，分子式为C56H112O40（图1）[5]。

图1化合物1

化合物2为白色针状固体，易溶于丙酮，可溶于甲醇及乙醇。醋酸酐-浓硫酸反应呈阳性，表明为甾体类化合物。13C NMR数据及维普数据库查询，与胆甾醇标准品一致，可以确定化合物2为胆甾醇 （Cholesterol），分子式为C27H46O。

对真海鞘壳浸膏正丁醇萃取部分进一步分离，得化合物3。化合物3为白色固体粉末，易溶于甲醇。1H NMR （600 MHz，DMSO-d6）数据如下： δ8.13 （s，1H），8.35 （s，1H），7.35 （s，1H），7.35 （s，1H），5.87 （d，1H，6.2 Hz），4.61 （dd，1H，6.0，11.4 Hz），4.14 （q，1H，3.3 Hz），3.96 （dd，1H，3.3，6.6 Hz），3.65 （dt，1H，12.0，4.0 Hz），3.56 （m，1H），5.45 （d，1H，7.0 Hz），5.18 （d，1H，5.2 Hz），5.44 （m，1H）。13C NMR （150 Mz，DMSO-d6） 数据如下： δ156.3，1563，149.2，152.5（C-3，C-4，C-6，C-7），119.5，140.6（V-1，C-5，C-6，C-8），149.2，88.09（C-2’，C-3’，C-4，C-7，C-8），73.8 （C-1’），71.0（C-1’，C-4’），86.0，62.1（C-1’，C-3’）。以上波谱数据并结合维普数据库查询，确定化合物3为生物碱6-（2，，3，-dihydroxy-4，-hydroxymethyl-tetrahydro-furan-1，-yl）cyclopentadiene[c]pyrrole-1，3-diol，分子式为C12H13NO6（图2）[6]。

图2化合物32.2抑制人肝癌细胞HepG2生长活性测定

不同浓度的真海鞘壳总浸膏与HepG2细胞共同培养，不同培养时间后进行CCK-8检测，结果如图3。由图3可以看出，HepG2细胞在无药物添加的时候，随着培养时间延长，HepG2细胞以一定的速率增殖。当真海鞘壳总浸膏浓度为2 μg/mL时，随着培养时间延长到36 h时，培养液吸光度值下降，表明HepG2细胞增殖受到一定抑制。随着真海鞘壳总浸膏浓度增加，HepG2细胞增殖抑制效果逐渐增加。当真海鞘壳总浸膏浓度增大到为200 μg/mL时，HepG2细胞增殖受到明显抑制。

图3HepG2细胞与不同浓度真海鞘壳

总浸膏共同培养的CCK-8检测结果

真海鞘壳总浸膏与HepG2细胞共同培养后，对HepG2细胞进行形态学观察。对照组细胞边界清楚，折光度好，胞质饱满（图4A）。真海鞘壳总浸膏与HepG2细胞共同培养后的细胞有破损现象，细质内充满圆形、透明的颗粒，显示有较多脂滴（图4B）[7-8]。

A 对照组细胞；B 真海鞘壳总浸膏与HepG2细胞共同培养后的细胞

图4显微镜下HepG2细胞形态（20×）

3讨论

对真海鞘壳75%（体积分数）的乙醇浸膏中石油醚萃取部分进一步分离，得到2个化合物，分别为Diethyl 24-[（Z）-3-methy-1-hexenyl]-heptatetracontanedioate（化合物1）和胆甾醇（化合物2）。对真海鞘壳浸膏正丁醇萃取部分进一步分离，得化合物6-（2，，3，-dihydroxy-4，-hydroxymethyl-tetrahydro-furan-1，-yl）cyclopentadiene[c]pyrrole-1，3-diol（化合物3）。化合物1首次发现于从中国南海西沙群岛永胜岛附近海域里生长的海绵中[5]。化合物3首次发现于板栗中[6]。在真海鞘壳中发现化合物1与化合物3是首次报道。

CCK-8法是一种优于MTT法的检测细胞增殖活性的方法，具有操作简单、灵敏度高、准确性和重复性好的特点[9]。在本研究中，使用CCK-8法对真海鞘壳总浸膏与HepG2细胞共同培养后的细胞进行计数。结果发现，真海鞘壳总浸膏对HepG2细胞具有显著抑制作用，且有剂量依赖性。真海鞘壳总浸膏中含有多种化学成分，其中比较多的化学成分有总甾体化合物，达到14.13%，这提示我们进一步研究，可以获得潜在的具有抑制HepG2细胞的化学成分。

对真海鞘中活性物质的研究报道不多。Shirakata等从真海鞘体壁中分离出29 kDa蛋白质]。Harada-Azumi等从真海鞘血淋巴中分离出一种分子量为28 kDa的Ca2+依赖型的N-乙酰-半乳糖酰胺（N-acetyl-galactosamine）特异性的凝集素[11]。日本与韩国的研究者在真海鞘内发现了甘氨酸甜菜碱、龙虾肌碱、葫芦巴碱、氧化三甲胺、三甲胺等化学成分[2]。在真海鞘中不断发现的新化学成分，丰富了真海鞘活性物质的数据，为利用真海鞘提供了更多的可能性。

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Isolation of constituents in Halocynthia roretzi Drasche sell and

inhibitory activity of extracts from H.roretzi against HepG2 cells

ZHAI Xingyue1，HOU Xiuxiu2，TONG Changqing2，DU Ying3，LI Wei2

（1.Nutrition Department，The Second Hospital of Dalian Medical University，Dalian 116023，China；

2.College of Food Science and Engineering，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China；

3.Dalian Center for Disease Control and Prevention，Dalian 116021，China）

Abstract：Three compounds were isolated from Halocynthia roretzi Drasche shell by column chromatography on silica gel and thin layer chromatography.Their structures were identified by spectroscopic analysis and physical-chemistry properties.The inhibition on HepG2 cells of all extracts from H.roretzi sell were evaluated by CCK-8 assay.The results showed that three compounds were obtained and identified as Diethyl 24-[（Z）-3-methy-1-hexenyl]-heptatetracontanedioate （compound 1），cholesterol （compound 2） and 6-（2’，3’-dihydroxy-4’-hydroxymethyl-tetrahydro-furan-1’-yl）cyclopentadiene[c]pyrrole-1，3-diol （compound 3）.All extracts from H.roretzi sell using 75% EtOH exhibited the potent inhibitory activities against HepG2 cells.The extracts could be considered as potential anticancer candidate for further study.

细胞分离培养 篇6

1 材料

1.1 样品来源

马胎衣采集于屠宰场, 置于加冰的泡沫保温箱内, 8 h内运到实验室。

1.2 主要试剂及培养液

DMEM/F12、胎牛血清 (FBS) 、青霉素-链霉素 (100×) 、Insulin-Transferrin-Selenium (ITS, 100×) 、2-巯基乙醇 (55 mmol/L) 、0.25%Trypsin-乙二胺四乙酸 (EDTA) 、Tryp LE, Gibco公司生产;庆大霉素、D-PBS、DMSO, Sigma公司生产;0.4%w/v台盼蓝, 内蒙古农业大学自制。

马羊膜干细胞培养液:DMEM/F12中添加15%FBS、1%青霉素-链霉素、1%ITS、1%NEAA、0.1 mmol/L 2-巯基乙醇。

2 方法

2.1 马羊膜上皮细胞的分离

将从胎盘上分离下来的胎膜用含0.3 mg/m L庆大霉素的生理盐水清洗3次后, 在无菌条件下将羊膜上皮层从绒毛膜上机械剥离下来, 在70%乙醇中浸泡5 s, 再用D-PBS清洗3次。将羊膜剪成约为10 cm2的小块, 称重后准备消化。

2.2 马羊膜上皮细胞的消化

1 m L/g羊膜加入0.25%Trypsin-EDTA或Tryp LE, 混匀后置于37℃的空气摇床中, 100 r/min消化10 min, 弃消化液;羊膜中加入与第1次消化等体积的0.25%Trypsin-EDTA或Tryp LE, 以240 r/min消化30 min, 收集消化液;将羊膜重复第2次消化, 收集消化液。合并2次收集的消化液, 用180μm尼龙网过滤。将消化液置于50 m L离心管中, 1 500 r/min离心5 min, 弃上清液, 用羊膜细胞培养液重悬细胞沉淀。

2.3 马羊膜上皮细胞的培养

将2.5×106个细胞接种到75 cm2培养瓶中, 置于38.5℃、5.0%CO2、95%饱和湿度的CO2培养箱内培养, 每48 h换液1次。当细胞生长到汇合度为90%时进行传代培养;传代时, 用0.25%TrypsinEDTA消化贴壁细胞5 min, 用含10%FBS的DMEM终止消化;离心, 收集细胞沉淀。细胞用于传代研究, 部分细胞转入液氮中长期保存。

2.4 马羊膜上皮细胞的计数和倍增时间测定

将马羊膜上皮细胞以9∶1的比例与0.4%台盼蓝溶液混合, 吸取少许悬液置于血细胞计数板上。在显微镜下计数4个大方格内染成淡蓝色的细胞数和未着色的细胞数。细胞活力 (%) =活细胞数/细胞总数×100%。细胞倍增时间P0代是从接种后计数细胞生长达到汇合度为90%的时间。细胞生长期倍增时间只测定了3代。细胞倍增测定计算方法参照参考文献[11-12]。细胞群体倍增 (PD) =培养时间 (CT) /细胞数量倍增 (CD) , CD=log (汇合后的细胞数/接种时的细胞数) /log2。

2.5 数据的统计分析

不同消化液所获得的马羊膜上皮细胞的倍增时间采用SPSS软件进行生物学统计处理。

3 结果与分析

研究表明, Trypsin-EDTA和Tryp LE均可以用于马羊膜上皮层的消化试验。

3.1 消化液对马羊膜上皮细胞的分离、培养影响情况的分析

试验采用Trypsin-EDTA和Tryp LE作为消化酶成功地从马羊膜中分离获得羊膜上皮细胞, 采用Trypsin-EDTA消化, 平均每克羊膜可获得2.2×106个细胞, 细胞活力为90.2%, 而采用Tryp LE消化, 平均每克羊膜可获得1.9×106个细胞, 细胞活力为94.8%, 更适合从马羊膜层消化、分离上皮细胞, 稳定且对细胞影响较小, 见表1。

注:同列数据肩标小写字母不同表示差异显著 (P<0.05) 。

3.2 消化液对马羊膜上皮细胞的传代培养影响情况的分析

Trypsin-EDTA消化细胞的首次倍增时间为 (1.42±0.24) , 与Tryp LE消化的细胞首次培养倍增时间 (1.05±0.19) 相比显著延长 (P<0.05) , 但在后来的传代培养中, 两者倍增时间差异显著 (P<0.05) , 见图1。这说明Trypsin-EDTA消化、分离马羊膜上皮细胞的能力较强, 但对细胞有一定损伤, 影响细胞后期的生长。

3.3 消化液对马羊膜上皮细胞的传代培养影响情况的对比分析

试验分离所获得的马羊膜上皮细胞在体外培养时其倍增时间约为1.25 d, Trypsin-EDTA消化、分离的细胞在原代和第1代培养的倍增时间要显著长于Tryp LE消化、分离所获得细胞的倍增时间, 而之后两者传代细胞倍增时间逐渐接近, 见图2。

4 讨论

试验旨在探讨不同消化液对于马羊膜上皮细胞层进行消化所产生的不同结果。由于有关马羊膜消化及其培养的研究报道很少, 试验方案主要参考了T.Miki等[6]从人羊膜层消化获得羊膜上皮干细胞的研究过程, 试验过程对于羊膜剥离、消化、培养、冻存与复苏各个环节进行了精准的探索。羊膜剥离是一个机械过程, 但羊膜上残留的血管及其他杂质均会直接影响消化液的消化效率和将来得到细胞溶液的纯度;羊膜消化是否完全也直接影响细胞的活性和得到的羊膜上皮细胞的数量。在羊膜消化过程中, Trypsin-EDTA消化效率高于Tryp LE[13], 但Tryp LE消化结果相对稳定, 对羊膜干细胞以后的生长影响较小, 更适合从马羊膜层分离上皮细胞, 这可能是因为Tryp LE在室温条件下更稳定。虽然Trypsin-EDTA消化效率较高, 得到的细胞数显著高于Tryp LE, 但其消化后得到的细胞活力却较低, 这也说明Trypsin-EDTA消化可能会对马羊膜上皮细胞有损伤, 从而影响细胞的生长。羊膜消化不易采用高浓度的消化酶。

无论是Trypsin-EDTA还是Tryp LE从羊膜上皮层消化、分离获得的羊膜上皮细胞都是一个混合的细胞群, 在体外培养时会出现3种细胞类型, 即上皮样细胞、间充质样细胞和半贴壁圆形细胞。TrypsinEDTA和Tryp LE消化、分离的细胞在体外培养时, 原代和第1代细胞倍增时间差异显著, 之后细胞倍增时间均有所降低, 之后逐渐接近, 这说明消化液对细胞繁殖能力的影响随着传代而逐渐减弱。无论是Trypsin-EDTA还是Tryp LE消化、分离所获得的细胞经过冷冻复苏后第1代细胞的倍增时间较长, 可能是由于冷冻也会对某些细胞造成一些损伤而影响了细胞的繁殖能力。Trypsin-EDTA消化是否会影响马羊膜上皮干细胞的分化还有待于进一步研究。

摘要：为了建立马羊膜上皮细胞 (equine amniotic epithelial cells, e AECs) 的分离、培养方法, 并对其影响因素进行研究, 试验从胎盘剥离羊膜, 采用Trypsin-乙二胺四乙酸 (EDTA) 或Tryp LE消化法分离获得上皮细胞, 然后进行上皮细胞培养传代研究。结果表明:通过0.25%Trypsin-EDTA消化, 每克羊膜平均获得2.2×106个细胞, 其3代传代倍增时间平均为 (1.32±0.21) d;通过0.25%Tryp LE消化, 每克羊膜平均获得1.9×106个细胞, 其3代传代倍增时间平均为 (1.26±0.17) d, 两者间差异显著 (P<0.05) 。Tryp LE消化结果比较稳定, 更适合从马羊膜层消化、分离上皮细胞。

细胞分离培养 篇7

不同细胞类型转基因供核体细胞的克隆动物相继产生,充分表明不同分化类型的体细胞在卵母细胞胞质的作用下均有完全重建而重新发育成新个体的潜能。但如何简便、快速、高效地制备丰富的转基因核供体细胞是成功获得转基因动物的关键技术之一[3]。目前,由于胎儿成纤维细胞具有取材方便、生长快、分化程度相对较低、体外传代次数相对较高、转基因效率高等特点成为用于生产转基因克隆动物的首选体细胞系。由胎儿成纤维细胞提供核供体相继产生了转基因克隆绵羊[4]、山羊[5]、牛[6]以及基因定点修饰的绵羊[7]和猪[8]。

研究通过组织块贴壁培养的方法分离培养草原红牛胎儿成纤维细胞,并设计性别特异性引物对其进行体外培养,以获得用于转基因克隆牛制作的核供体转基因细胞,为高效率、低成本制作转基因克隆牛奠定基础。

1 材料与方法

1.1 胎儿组织的获取与处理

草原红牛胎儿来自吉林省农业科学院畜牧科学分院草原红牛保种场。具体胎儿获取方法:将妊娠40 d母牛电击屠宰,迅速剖腹摘取怀孕子宫,为防止污染,将胎儿与子宫一同置于装有37 ℃生理盐水的保温瓶中带回实验室。用手术剪在PBS液中剥除胎膜,将分离的牛胎儿用含500 IU/mL 青霉素、500 mg/mL 链霉素的PBS 液冲洗3 遍后,移入无菌操作台处理。

1.2 组织块的贴壁培养

胎儿成纤维细胞的分离培养参照李扬的组织块贴壁法进行,并稍作改动。简要方法:首先用手术剪去除胎儿头、四肢、内脏,保留躯干,将胎儿躯干部用手术刀切成1～3 mm3的小块,用含10%胎牛血清的DMEM完全培养液冲洗2遍,分别接种于含完全培养液的直径为35 mm细胞培养皿中,然后将培养液吸干,放入培养箱中培养5 h,使组织块充分贴壁,待贴壁完全后,小心加入完全培养液,置于38.5 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养。

1.3 成纤维细胞的纯化及传代培养

待细胞铺满培养瓶底后,采用胶原酶消化法将上皮细胞和成纤维细胞分开,具体做法:吸出瓶内的培养液,用无菌PBS液清洗2遍后加入0.5 mg/mL的胶原酶,使消化液浸没细胞,将培养瓶放在倒置显微镜下观察,发现成纤维细胞变圆、部分脱落时,立即加入2 mL含血清的培养基终止消化;用弯头吸管轻轻吹打成纤维细胞生长区域,再用少量培养基漂洗1次;然后将消化液吸出,转移至新的培养瓶中加入适量培养基继续培养,于38.5 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。

1.4 细胞生长曲线的测定

将传至第3代的牛胎儿成纤维细胞用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液消化,调整细胞浓度为5×104个/mL,接种于24孔细胞培养板中,每孔接种0.5 mL,置38.5 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养,每隔24 h消化收集细胞,用血细胞计数板计数3个孔的细胞数,每孔计数2次,取平均值,最后绘制生长曲线。在细胞接种及计数过程中用台盼蓝染色法去除死细胞干扰。

1.5 血液和细胞基因组的提取

选取雌雄各5头成年草原红牛,颈静脉采集血液样品,加ACD抗凝。草原红牛胚胎成纤维细胞及血液基因组的提取采用酚氯仿法提取(方法详见《分子克隆》第3版),用0.8%琼脂糖电泳检测基因完整性及纯度,-20 ℃冷冻保存。

1.6 牛性别特异性引物的设计与合成

选取牛性别特异性基因SRY(登录号为EU581861)及内参基因GAPDH(登录号为NC_007303),采用引物设计软件Oligo 6.0设计基因特异性引物。SRY基因引物序列为SRY U 5′-AAGTTTGCCTTATGGATT-3′,SRY D 5′-GAAGTAATATGCGGTGTA-3′;GAPDH基因引物序列为GAPDH U 5′-ATTCTGGCAAAGTGGACATCG-3′,GAPDH D 5′-ACATACTCAGCACCAGCATCAC-3′。 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.7 性别鉴定引物的特异性检验

以已知性别成年草原红牛外周血基因组为模板,采用基因组PCR方法对试验中设计的性别鉴定引物进行特异性检验。PCR 反应体系(25 μL):10×PCR Buffer 1.5 μL,上、下游引物(10 pmol/L)各1 μL,Taq DNA聚合酶(2.5 U/L)1 μL,DNA 模板(50～100 ng/L)1 μL,dNTP(10 mmol/L)1 μL,加ddH2O 至25 μL。反应条件:95 ℃预变性4 min;95 ℃变性40 s,62 ℃退火40 s,72 ℃延伸40 s,共35个循环;72 ℃延伸10 min ;4 ℃保存。取产物用1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测性别鉴定引物的特异性。试验中设置水空白对照以排除体系污染。

1.8 草原红牛胎儿成纤维细胞的性别鉴定

在完成性别鉴定引物特异性的前提下,对本研究中分离培养的草原红牛胚胎成纤维细胞进行基因组PCR扩增,用琼脂糖凝胶电泳检测以确定其性别。具体基因组PCR反应程序参见1.7。

2 结果

2.1 草原红牛胎儿成纤维细胞的分离培养及生长特征

胎儿组织块经贴壁培养48 h后可见单细胞游离出来,呈辐射状向外贴壁生长。培养1周后贴壁细胞逐渐增多,多数围绕组织块周围生长。随着培养时间的推移,组织块周围可见大量成纤维细胞包绕,其间有上皮样细胞共生(见图1A)。9～10 d后成纤维细胞生长旺盛,成纤维细胞呈梭形或不规则三角形、放射状或漩涡状走行(见图1B)。培养2周左右,组织块移出的单层细胞汇合,细胞铺满瓶底,可进行消化传代。

2.2 草原红牛胎儿成纤维细胞的生长规律

胎儿成纤维细胞传至第3代时,以5.0×104个/mL的浓度接种24孔细胞培养板,细胞于7～8 d长满。于不同时间点测定细胞数并绘制生长曲线,见图2。

从图2可以看出,胎儿成纤维细胞生长曲线基本呈现S型,分别代表潜伏期、指数增生期和停滞期,0～4 d为潜伏期,5～9 d为指数增生期,培养至第10天进入生长停滞期。

2.3 性别鉴定引物的特异性检验结果

提取已知性别草原红牛血液基因组(雌雄各5头),利用所设计的牛性别鉴定SRY基因引物,以GAPDH基因特异性引物为对照,采用基因组PCR方法对性别鉴定SRY引物进行特异性检验,结果(见图3)发现:在完全没有进行PCR条件摸索的情况下,性别特异性SRY引物能够特异性地扩增出雄性草原红牛SRY基因片段(见图3 第1～5泳道),而以雌性草原红牛为模板则完全不能扩增出任何片段(见图3 第6～10泳道);内参基因GAPDH引物无论在雌性还是雄性草原红牛中均能很好地扩增出特异性片段。说明基因组质量良好,不影响引物的扩增。同时以水作为空白对照不存在任何扩增产物,说明扩增体系不存在污染现象。

1～5.雄性草原红牛血液基因组扩增产物; 6～10.雌性 草原红牛血液基因组扩增产物;11.水空白对照组。

2.4 草原红牛胎儿成纤维细胞的性别鉴定结果

本研究在验证SRY性别鉴定引物特异性的基础上,对已分离的草原红牛胚胎成纤维细胞利用SRY引物采用基因组PCR方法进行性别鉴定,结果见图4。表明已分离培养的胚胎成纤维细胞为雄性。

3 讨论

1.100 bp DNA Ladder;2.草原红牛胚胎 成纤维细胞SRY基因PCR结果;3.雌性草原红牛SRY 基因PCR对照; 4.雄性草原红牛SRY基因PCR对照。

动物成纤维细胞分离培养主要采用两种方法,一种是组织块贴壁培养法;另一种是胰酶消化分离单细胞接种培养法。通常情况下,组织块贴壁培养法长出细胞比分离单细胞培养法需要较长的时间,但操作相对简单方便,目前多用此法培养动物成纤维细胞[9,10]。本研究同样采用此方法成功分离出草原红牛胚胎成纤维细胞。

在转基因克隆动物的研究过程中,成纤维细胞活力及纯度严重影响转基因细胞的制备及体细胞核移植操作,与转基因克隆动物的获得息息相关。尽管胚胎早期细胞的分化程度不高,但早期分离培养的胚胎成纤维细胞依然多为上皮细胞和成纤维细胞的混合物。上皮细胞由表皮生发层细胞分裂、增殖而来,是源于外胚层的细胞;成纤维样细胞是由真皮层细胞分裂、增殖而来,源于中胚层。两者具有完全不同的细胞特征及生长特性。在体外培养过程中,可以利用这些生长特性进行成纤维细胞的分离、纯化,常规方法是利用上皮细胞与成纤维细胞的贴壁能力及对胰酶消化反应时间差不同进行初步分离纯化[11],也可以针对上皮细胞及成纤维细胞的不同生长区域进行人为刮除。本研究采用细胞时间差酶消化法分离纯化胚胎成纤维细胞,经过反复几轮的分离纯化达到比较理想的效果。

细胞分离培养 篇8

关键词：内皮克隆形成细胞,诱导培养,细胞鉴定

内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是内皮细胞的前体细胞,在维持血管内皮环境稳定中扮演着重要的角色[1]。根据不同EPCs克隆形态、出现时间先后和细胞增殖潜力,体外培养的外周血MNCs可相继分化出早期和晚期EPCs[2]。内皮克隆形成细胞(endothelial colony-forming cells,ECFCs)是近年来发现的一种晚期EPCs亚群[3],因具有更强的增殖能力及血管形成能力,是理想的移植种子细胞。本研究旨在建立一种操作简便、且能获得数量较多的ECFCs培养方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人脐静脉血采自暨南大学附属第一医院产科健康足月顺产产妇,经产妇及家属同意;EGM-2MV培养基(Clonetics公司);Matrigel胶(BD公司);人淋巴细胞分离液LymphoprepTM(AXIS-SHIELD公司);胎牛血清(Hyclone公司);小鼠抗人CD14-FITC、CD45-PCS单克隆抗体(BD Pharmingen公司);兔抗人CD31、KDR、eNOS、VE-Cadherin多克隆抗体(Bioworld公司);FITC-UEA-I(Sigma公司);Dil-acLDL(Molecular Probe公司);免疫组化染色试剂盒(北京中杉金桥)。

1.2 ECFCs的培养

脐血与0.9%氯化钠(NaCl)1:1稀释混匀后平铺于等体积LymphoprepTM分离液的离心管中,在20℃,800×g离心20 min。小心吸出MNCs层,0.9%NaCl洗涤2次,250×g离心10 min,以含10%胎牛血清EGM-2MV培养基(含hFGF-B,VEGF,hEGF,GA-1000,R3-IGF-1,ASCORBIC ACID,HYDROCORTISONE)重悬并计数,以107/mL密度接种于人纤维连接蛋白包被的25 cm2培养瓶,置于培养箱中培养,3 d后首次换液吸弃未贴壁细胞,贴壁细胞继续培养,以后每3天换液。显微镜下观察ECFCs的生长并拍照。原代细胞融合达60%~70%时,进行传代。

1.3 ECFCs的鉴定

1.3.1 细胞表型鉴定

(1)流式细胞仪检测:0.25%胰蛋白酶消化第2代ECFCs,制成1010/L的细胞悬液,分成每管100μL,分别加入20μL CD14-FITC、CD45-PC5小鼠抗人单克隆抗体工作液,室温下孵育30 min。同种荧光标记的小鼠IgG作为阴性对照,流式细胞仪检测。(2)细胞免疫化学染色:免疫细胞化学法检测CD31、KDR、eNOS、VE-Cadherin,0.25%胰蛋白酶消化的第2代细胞爬片成功后,按SP染色试剂盒步骤进行操作,DAB显色,苏木素复染,中性树胶封片,阴性对照组用PBS代替一抗。

1.3.2 细胞功能鉴定

取第2代ECFCs,爬片成功后,与Dil-ac-LDL避光孵育4 h,PBS洗3次;4%多聚甲醛固定10 min;PBS洗3次;加入FITC-UEA-I(10μg/mL)避光孵育1 h;PBS洗3次;封片后荧光显微镜下成像。

2 结果

2.1 ECFCs细胞形态

刚分离的人脐静脉血MNCs呈圆形,3~10 d出现边界清楚的类圆形单层鹅卵石样细胞集落,开始由几个至几十个细胞组成,随时间延长,细胞增至几百至数千个,且克隆数目也增加。4周左右相邻ECCs相互融合,传代后细胞仍呈内皮细胞样形态(图1)。

2.2 ECFCs的鉴定

2.2.1 ECFCs细胞表型

流式细胞仪分析示:ECFCs不表达造血系细胞表面标记CD14、CD45。免疫细胞化学示高表达内皮系表面抗原,CD31、KDR、eNOS、VE-Cadherin均呈阳性反应,细胞浆呈棕黄色,苏木素衬染的细胞核为蓝色(图2)。

2.2.2 ECFCs功能鉴定

ECFCs可吞噬Dil-ac-LDL并结合FITC-UEA-I的能力(图3)。

3 讨论

EPCs作为内皮细胞的祖细胞,具有克隆形成、持续自我更新、高增殖及分化为成熟内皮细胞的能力,它的重要作用包括参与机体损伤部位内皮细胞的修复及新血管的形成。由于EPCs缺乏统一的培养方法及特异性的细胞表面抗原,不同实验室获得了不同类型的EPCs,它的定义也仍存在争议。最初将表达CD34+VEGFR2+CD133+的细胞定义为EPCs,而CASE等[4]最近研究认为从脐血及外周血中分离得到的CD34+CD133+VEGFR-2+细胞事实上是一类富含CD45+的造血祖细胞群,不能生成内皮细胞,不具有血管形成能力。REHMAN[5]等研究发现外周血EPCs来源于单核细胞/巨噬细胞,它的增殖能力低,可通过分泌促血管生长因子发挥其血管形成作用。可见,CASE及REHMAN培养7 d以内所获得的早期EPCs事实上并不是真正的EPCs。LIN[6]等对不同性别患者进行异基因骨髓移植后发现,外周血MNCs培养至较晚期可出现一类具有旺盛增殖能力的细胞克隆,称为内皮外向生长细胞(endothelial outgrowth cells,EOCs)。INGRAM等[7]则成功从成人外周血、脐静脉血及大量的人动静脉血管壁中培养出具有不同克隆增殖能力的细胞,并称这类细胞为ECFCs。以上研究进一步证明了EPCs包含了处于不同分化阶段的不同形态、增殖能力及功能的细胞群,而上述的EOCs、ECFCs、晚期EPCs其实是同一类有相同特征及功能的细胞[8]。目前认为EPCs的鉴定可通过同时检测多个细胞表面抗原并结合EPCs一个或多个细胞功能特点。

INGRAM等[7]培养脐静脉血和外周血来源的ECFCs发现,脐血内皮细胞克隆出现时间较成人外周血早1周,且数量是外周血的15倍,成人外周血ECFCs连续传代不能超过30代,而脐血ECFCs至少能体外连续传100代却无显著的衰老迹象;并且脐静脉血EPCs还表现出更强大的克隆增殖能力及稳定的血管形成能力。可见脐血中EPCs数量较外周血明显更多,另外,脐静脉血因为来源十分丰富、再生能力强、免疫原性相对弱,是获取大量EPCs的理想来源。因此,本研究选择人脐静脉血作为获取ECFCs的来源,为其在缺血性疾病、细胞移植治疗和血管组织工程中的应用提供基础。

分离MNCs常用的方法包括免疫磁珠分选法及密度梯度离心法,磁珠分选法可有效的排除其他细胞干扰,提高分离纯度,但对细胞活性影响较大,细胞增殖能力严重减低,所得细胞数目少并且成本高,同时因EPCs缺少与成熟内皮细胞及造血细胞相区别的特异性表面标记及功能分析,用于EPCs分选纯化的抗体十分有限,常用的有CD34、CD133、KDR,但CD34的表达并不是EPCs必需的,表达CD34-的造血干细胞及间充质干细胞也表现出能够生成EPCs并分化为成熟内皮细胞的能力。因此,本实验采用了成本低且易操作的密度梯度离心法分离MNCs。EPCs对培养基的要求十分高。YANG N等[9]比较M199完全培养基及EGM-2MV培养基培养兔骨髓来源的单个核细胞发现,M199培养基培养出的是早期EPCs,而EGM-2MV培养可培养出晚期EPCs。根据前面的研究,我们选择了合适的培养基—EGM-2MV,经细胞形态、细胞表面抗原、细胞功能等鉴定,成功培养出了ECFCs。

综合上述,通过密度梯度离心法分离的脐血MNCs培养于10%FBS的EGM-2MV,3天后首次换液的简单培养方法,我们获得了生长状态良好,细胞克隆数较多的ECFCs,为其临床应用与进一步实验研究提供了充足细胞来源。

参考文献

[1]Li DW,Liu ZQ,Wei J,et al.Contribution of endothelial progenitor cellsto neovascularization(Review)[J].Int J Mol Med,2012,30(5):1000-1006.

[2]Ingram DA,Caplice NM,Yoder MC.Unresolved questions,changingdefinitions,and novel paradigms for defining endothelial progenitorcells[J].Blood,2005,106(5):1525-1531.

[3]Yoder MC,Mead LE,Prater D,et al.Redefining endothelial progenitorcells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cellprincipals[J].Blood,2007,109(5):1801-1809.

[4]Case J,Mead LE,Bessler WK,et al.Human CD34+AC133+VEGFR-2+cells are not endothelial progenitorcells but distinct,primitive hematopoietic progenitors[J].ExpHematol,2007,35(7):1109-1118.

[5]Rehman J,Li J,Orschell CM,et al.Peripheral blood"endothelialprogenitor cells"are derived from monocyte/macrophages and secreteangiogenic growth factors[J].Circulation,2003,107(8):1164-1169.

[6]Lin Y,Weisdorf DJ,Solovey A,et al.Origins of circulatingendothelial cells and endothelial outgrowth from blood[J].J ClinInvest,2000,105(1):71-77.

[7]Ingram DA,Mead LE,Tanaka H,et al.Identification of a novelhierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral andumbilical cord blood[J].Blood,2004,104(9):2752-2760.

[8]Yoder MC.Endothelial progenitor cell:a blood cell by manyother names may serve similar functions[J].J Mol Med(Berl),2013,91(3):285-295.

细胞分离培养 篇9

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

Wistar大鼠(大连医科大学动物中心提供),胎牛血清(Hyclone公司),淋巴细胞分离液(Pharmacia 公司),兔抗八因子相关抗原(Ⅷ- R Ag)多克隆抗体(北京中衫金桥公司),CD34、CD29单克隆抗体(Phar Mingen公司),血管内皮细胞生长因子(VEGF, Cytolab/Peprotech公司),碱性成纤维细胞生长因子(bFGF, Cytolab/Peprotech公司),流式细胞仪 (FACS Calibur, BD公司)。

1.2 骨髓MSCs的分离培养

取健康0.2 kg左右Wistar大鼠1只,在无菌的条件下取出股骨和胫骨,骨剪剪断关节处,用5 ml注射器抽取无血清的L-DMEM将骨髓腔中的骨髓冲入含肝素的小瓶中,将骨髓细胞轻轻吹打制备细胞悬液,1 000 r/min离心10 min,弃上清液,用无血清的L-DMEM重悬细胞,将细胞悬液轻轻重层于等体积的淋巴细胞分离液(比重1.077 g/ml)上,2 000 r/min离心25 min。收集白膜层细胞于另一离心管中,用含10%胎牛血清的L-DMEM洗涤两次(1 000 r/min离心10 min),弃上清液,用含10%胎牛血清的L-DMEM重悬。以1×107cells/cm2密度接种于6孔板中,37℃,5%的CO2,饱和湿度下孵育,倒置相差显微镜下每天观察生长情况。2 d后半量换液,4 d时完全换液,弃去未贴壁细胞,贴壁细胞继续培养,以后每2～3天换液1次。待10 d左右细胞融合时,吸弃培养液,用PBS液冲洗一次,以去除残余的含血清培养液,以免影响胰蛋白酶活性。然后加入0.25%胰蛋白酶消化液1 ml消化,倒置相差显微镜下观察,待细胞变圆,部分脱落后,加入含血清的培养液,终止消化,按1 ∶ 2比例传代。传代后的细胞生长加快,一般2～3 d可传1代,定期观察细胞的生长情况。

1.3 骨髓MSCs的鉴定

细胞传至第4代后,用消化液消化细胞,PBS洗涤2次(1 000 r/min),流式细胞术检测CD34、CD29的表达情况。

1.4 骨髓MSCs向血管内皮细胞诱导分化及诱导条件的优化

选取状态较稳定的第4代细胞, 按1×106/ml的细胞密度接种于6孔板,分别用10%胎牛血清和2%胎牛血清的诱导液(终浓度为10 ng/mlVEGF、2 ng/mlbFGF的DMEM培养液)继续培养,每3～4天换液一次,倒置相差显微镜下观察细胞形态的变化。当细胞融合时,胰蛋白酶消化传代,于第14天免疫组化法观察FVIII的表达情况。

1.5 骨髓MSCs分化的血管内皮细胞的鉴定

选取2%胎牛血清诱导液诱导后的细胞分别于第7天、14天用流式细胞术和免疫组织化学法检测CD34和FVIII因子的表达情况。

2 结果

2.1 骨髓间充质干细胞的培养

从Wistar大鼠骨髓获得的MNC为比较一致的球型细胞。原代培养24 h,少部分细胞贴壁生长,其中大多数即为间充质干细胞。此细胞散在生长,形态长梭形,类似成纤维细胞。4 d内呈相对静止状态,之后细胞增殖加速,出现团、簇状细胞群。10 d时细胞贴满瓶底,此时呈鱼群样、漩涡状、辐射状或网状排列(图1)。传代后细胞增殖迅速,一般2～3 d可传一代。

2.2 骨髓间充质干细胞的鉴定

选取状态较稳定的第4代MSCs,流式细胞术分析结果显示,CD34阳性率为(1.01±0.56)%、CD29阳性率为(97.32±2.77)%。结果如图2、3。

2.3 骨髓MSCs向血管内皮细胞诱导分化及诱导条件的优化

在细胞培养至第4代,细胞生长倍增稳定,分别用10%胎牛血清和2%胎牛血清的诱导液继续培养发现,用10%胎牛血清诱导液诱导的MSCs增殖仍快,细胞每2～3 d可传一代,细胞形态变化不大;而用2%胎牛血清诱导液诱导的MSCs增殖放慢,细胞每4～5 d可传一代,细胞仍呈长梭形,但细胞变宽,且顺应性增加,呈铺路石样排列(图4)。14 d后免疫组织化学法检测FVIII的表达,10%胎牛血清诱导体系,细胞的阳性率为(12.21±2.32)%;而2%胎牛血清诱导体系,细胞的阳性率为(91.43±6.32)%。后者明显高于前者(P<0.01)。

图2,3 MSCs CD34和CD29的表达情况

2.4 骨髓MSCs分化的血管内皮细胞的鉴定

选取含2%胎牛血清诱导液诱导的MSCs,分别于第7天 ,14天流式细胞术和免疫组织化学法分析CD34和FVIII因子的表达情况(图5,6,表1)。结果提示随着诱导时间的延长,CD34、FVIII表达逐渐增强,从而初步证明了用VEGF和bFGF可以诱导骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞。

图5,6 骨髓MSCs诱导14 d后FVIII、CD34的表达情况

3 讨论

3.1 MSCs的分离、纯化及鉴定

目前对骨髓中MSCs的分离、纯化、培养还没有统一的方法,密度梯度离心结合贴壁培养法是近年发展起来的一种有效的获得MSCs的常用方法。首先根据比重差异,用比重为1.077的淋巴细胞分离液分离骨髓MSCs,经梯度离心后,能有效地将绝大部分红细胞、粒细胞、脂肪细胞和血小板除去,获得纯度较高的单个核细胞,然后根据MSCs与血系细胞贴壁性能差异,随换液弃除悬浮生长的血细胞,贴壁细胞主要是MSCs,也可能混有单核细胞、淋巴细胞。再通过细胞传代方法使MSCs得到进一步纯化,经几次传代,细胞变为形态更均一,排列更有序的成纤维细胞样,有报道[12]通过密度梯度离心分离培养的MSCs在第一代时纯度达95%,第二代超过98%。由于MSCs没有特异性表面标志物,所以目前采用联合鉴定方法:①具有较强的贴壁生长特性;②人类MSCs(>98%)表达CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124、CD166等表面抗原;③不表达分化相关标志如II、III型胶原、骨桥蛋白等;④不表达造血系统标志,包括CD14, CD34及白细胞共同抗原CD45;⑤能被SH-2、SH-3、SH-4识别;⑥具有多向分化潜能等。本实验通过密度梯度离心结合贴壁培养法有效的分离纯化出形态均一的成纤维细胞样细胞,流式细胞术分析结果显示,CD34阳性率为1.01%、CD29阳性率为97.32%,初步证明此细胞即为MSCs。

3.2 骨髓MSCs向血管内皮细胞诱导分化及诱导条件的优化

CD34即CD34抗原,是一个分子量为105～120 kD的跨膜细胞表面糖蛋白,CD34基因选择地在人和鼠造血系统的干/祖细胞中表达,也可在胚胎及成体组织血管的内皮细胞中表达,是血管内皮细胞特异的细胞表面标志,在血管内皮细胞分化成熟、胚胎的血管形成可能有着重要作用。FVIII相关抗原存在于血管内皮细胞的胞浆内,因此可以用FVIII染色作为鉴定血管内皮细胞的特异性标志。在细胞体外培养阶段,我们于诱导前、诱导后7 d和14 d分别对细胞进行CD34和FVIII相关抗原的检测,结果提示随着诱导时间的延长,CD34、FVIII表达逐渐增强,初步证明了用VEGF和bFGF可以诱导MSCs分化为血管内皮细胞。骨髓间充质干细胞诱导分化为血管内皮细胞的研究,国内多采用10%胎牛血清诱导体系,本实验通过10%胎牛血清诱导体系与2%胎牛血清诱导体系的比较发现,10%胎牛血清更利于MSCs的增殖,而2%胎牛血清则更利于MSCs向血管内皮细胞分化。

3.3 临床意义

治疗性血管新生是近年来治疗严重缺血性血管疾病的一种新技术,它通过模拟体内血管生成机制以达到促进血管新生,改善侧支循环的目的。血管生成的自然过程是多种因子协调有序、相互作用的复杂过程,MSCs不仅可分泌多种促进血管生长因子[13,14],且本身可以发育为血管内皮细胞。因此MSCs可能成为治疗性血管新生及组织工程中理想的种子细胞,应用前景极为广阔。

摘要：目的建立分离和培养大鼠骨髓源间充质干细胞(MSCs)的方法及定向分化为血管内皮细胞诱导条件的优化。方法淋巴细胞分离液(比重1.077 g/ml)密度梯度离心法分离单个核细胞(MNC),在含10%胎牛血清L-DMEM培养基中培养,并传代扩增MSCs;选取状态较稳定的第4代细胞,分别用含10%胎牛血清和2%胎牛血清的诱导液(终浓度为10 ng/mlVEGF、2 ng/mlbFGF的DMEM培养液)继续培养,于第7、14天用流式细胞术分析CD34的表达情况,免疫组化法观察FVIII的表达情况。结果密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化MSCs,细胞呈均一的成纤维细胞样,流式细胞术分析MSCs结果显示,CD34阳性率为1.01%、CD29阳性率为97.32%;诱导14 d后免疫组织化学法检测FVIII的表达,10%和2%胎牛血清诱导体系细胞的阳性率分别为12.21%和91.43%。结论密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化MSCs;就诱导效果而言,2%胎牛血清诱导体系明显好于10%胎牛血清诱导体系,说明低浓度的胎牛血清更有利于MSCs向血管内皮细胞分化。

细胞分离培养 篇10

1 材料与方法

1.1 实验动物

受孕14 d的Sprague Dawley (SD) 胚胎大鼠由我校实验动物中心提供。

1.2 重组质粒及主要试剂

含GFP报告基因的HIF-1α腺病毒载体由本室构建, HIF-1α抗体由武汉博士德生物工程有限公司提供, DMEM/F12 (1∶1) 培养基 (Hyclone) 、B27复合物 (Gibco) 、b FGF (Invitrogen) 、EGF (Invitrogen) 、胎牛血清 (杭州四季青) 、多聚赖氨酸 (Sigma) 、Brd U (Sigma) 、巢蛋白 (nestin) 抗体 (Sigma) 、神经原特异烯醇化酶 (NSE) 抗体 (Sigma) 、胶质原性纤维酸蛋白 (GFAP) 抗体 (Sigma) 、DAB液体 (Boster) 二抗试剂盒 (Boster) 、HIF-1α蛋白Western-blot检测试剂盒 (Boster) 、HIF-1αm RNA原位杂交试剂盒 (Boster) 。其他试剂均为国产分析纯或化学纯。

1.3 神经干细胞的分离、培养及鉴定

取孕14 d的SD大鼠1只麻醉后打开腹腔暴露子宫, 分离后放入4℃生理盐水冲洗。迅速取出胎鼠放入4℃DMEM/F12培养基中。显微镜下分离间脑, 剪碎, 巴氏吸管反复吹打机械分离, 调整细胞浓度约为 (0.5~1.0) ×106个/m L, 在含有2%B27, 青霉素 (100μg/m L) 和链霉素 (100μg/m L) 的DMEM/F12培养基的6孔培养板上种植细胞, 最后在培养基中加入20 ng/m L b FGF, 20 ng/m L EGF, 放入含50m L/L二氧化碳的培养箱中37℃常规培养。每3、4天换液, 每7、8天传代。观察克隆形成情况, 由单细胞增殖形成的克隆即单细胞克隆。

取培养第2代的神经干细胞加于多聚赖氨酸处理过的盖玻片上贴壁4 h, 弃去培养液, 免疫荧光法检测神经干细胞的特异性抗原巢蛋白;同样取培养第2代的神经干细胞加入5μmol/L的5'-溴尿嘧啶 (Brd U) 后, 在六孔培养板中继续培养4 d, 然后加于多聚赖氨酸处理过的盖玻片上贴壁4 h以检测培养细胞的自我增殖能力;在培养基中加入10%胎牛血清使细胞发生分化, 免疫组织化学法检测神经元特异性抗原NSE (DAB法) 及神经胶质细胞特异性抗原GFAP (免疫荧光SABC-Cy3法) 。

1.4 HIF-1α基因重组腺病毒感染神经干细胞

取培养第2代的El2胎鼠神经干细胞 (1×106个/m L) 离心后加入无血清培养液, 轻柔吹打混匀成单细胞悬液, 计数后调整种植密度为1×106/m L。按感染复数 (MOI) 为200 PFU/细胞将含HIF-1 (的腺病毒颗粒储存液加入培养瓶中, 放入培养箱中孵育48和72 h后收集细胞进行检测, 另外一组细胞与相同滴度的非基因重组的腺病毒共培养, 作为对照 (空病毒载体组) , 另设空白对照组, 每组30只胚鼠。

1.5 基因工程化神经干细胞的鉴定

1.5.1 免疫原位杂交法检测转染后HIF-1αm RNA

的表HIF-1αm RNA原位杂交所用探针为经地高辛标记的针对HIF-1α基因的多相寡核苷酸探针。探针序列为:5'-TTATGAGCTTGCTCATCAGTTGCCAC TTCC-3';5'-CTCAGTTTGAACTAACTGGACACAGT-GTGT-3';5'-GGCCGCTCAATTTATGAATATTATCAT GCT-3';操作步骤按HIF-1αm RNA原位杂交试剂盒 (Boster) 说明书进行。结果判定:阳性细胞质或细胞核呈棕黄色。过程如下:贴有感染基因重组腺病毒神经干细胞的盖玻片用0.1M PBS (p H7.4) 洗2 min×3次。用含有1/1 000 DEPC的4%多聚甲醛/0.1MPBS (p H7.2~7.6) , 室温固定20 min, 蒸馏水充分洗涤。30%H2O2和纯甲醇的混合液 (1∶50) 室温处理30 min, 蒸馏水洗3次。切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶室温消化80 s, 原位杂交用PBS洗3次×5 min, 蒸馏水洗1次。含1/1 000 DEPC的1%的多聚甲醛/0.1 MPBS (p H7.2~7.6) , 室温固定10min, 蒸馏水洗3次。按每张切片20μL分别滴加预杂交液, 放入湿盒, 在40℃的恒温箱处理4 h时, 祛除多余液体, 不洗。按每张切片20μL分别滴加HIF-1α寡核苷酸探针杂交液, 将原位杂交专用盖玻片盖在切片上, 恒温箱40℃过夜。揭掉盖玻片, 37℃水温的2×SSC洗涤5 min×2次, 37℃0.2×SSC洗涤15 min×1次。滴加封闭液, 37℃30 min, 甩去多余液体, 不洗。滴加生物素化鼠抗地高辛, 室温120 min, 原位杂交用PBS洗5 min×4次。滴加SABC, 室温30 min, 原位杂交用PBS洗5 min×3次。滴加生物素过氧化物酶, 室温30 min, 原位杂交用PBS洗5 min×4次。DAB显色20 min, 充分水洗。酒精脱水, 二甲苯透明, 封片观察。

1.5.2 HIF-1α蛋白的Western-blot检测

分别收集转染组、空病毒载体组、空白对照组细胞各2.0×106, 用裂解缓冲液裂解细胞, 提取蛋白。取蛋白样品10μL, 加入等量的2×SDS凝胶加缓冲液, 沸水浴10 min, 每孔加样20μL, 行10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳, 采用半干法将蛋白转移至NC膜。NC膜用10%脱脂奶封闭, 加入兔源HIF-1α多克隆一抗 (1.2μg/m L) 和兔源β-actin单克隆一抗 (浓度为0.4μg/m L) , 平缓摇动0.5 h后置于4℃冰箱过夜。次日回收一抗洗膜后加入相应羊抗兔二抗, 37℃平缓摇动2 h。NBT/BCIP显色, 水洗终止反应。扫描图像, 分析结果, 以β-actin为内参照。

1.6 图像分析及统计学处理

免疫原位杂交染色切片采用LEICA QWin图像处理与分析系统进行图像分析, 每组选择相对应的4张切片检测免疫原位杂交染色阳性细胞的光密度。测量时, 每个细胞取3个测量点, 每个测量点测量的像素量一致, 每张切片取相对应部位测量5个阳性细胞。采用SPSS 11.0统计软件分析, 数据以均数±标准差表示 (x±s) , 两组间比较采用t'检验, 多组间比较采用单因素方差分析法 (ANOVA) 进行统计学分析, 检验水准α=0.01。

2 结果

2.1 原代及传代大鼠胚胎NSC的形态观察

原代培养细胞在无血清培养基中第2天后, 单个细胞大量减少, 培养板底见许多细胞碎片, 部分胞体较大、圆形、折光性较强的悬浮细胞发生分裂, 部分细胞有出芽现象 (不对称分裂) (图1) 。同时形成由数个到数十个细胞组成的大小不等的悬浮生长的细胞球, 形态规则, 折光性强, 无突起生长 (图2) 。体外培养一周后, 随着细胞球不断增大, 可形成上百个细胞的大克隆, 部分细胞球贴壁放射状向四周发出突起, 克隆间可有纤维相连。

2.2 大鼠胚胎NSC及自我增殖能力的鉴定

神经干细胞选择性的表达神经巢蛋白, 属胞浆中的中间丝蛋白。经传代培养的神经干细胞球和单个神经干细胞nestin免疫荧光显示均有明显的红色荧光阳性着色 (图3) , 证实所培养的细胞均为nestin抗原阳性细胞。5'-溴尿嘧啶 (Brd U) 是胸腺嘧啶的同源替代物, 可以在细胞周期的S期掺入细胞DNA。如果在培养的神经干细胞内检测到Brd U, 则证明神经干细胞能够进行增殖。在培养第2代的神经干细胞的培养基中加入5μmol/L的Brd U培养4d后, 抗Brd U抗体免疫反应阳性, 证实了所培养的细胞具有自身复制增殖的能力 (图4) 。

2.3 大鼠胚胎NSC的诱导分化及鉴定

在含胎牛血清的培养基中培养24 h后, 即可见到细胞团贴壁, 并可见从细胞团边缘伸出突起, 诱导分化2、3 d后即可见到大量神经样细胞和突起, 出现明显的神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞的形态。7 d后原有的细胞团消失。诱导第3天后对分化细胞进行的免疫细胞化学鉴定结果显示nestin表达消失。可见GFAP和NSE免疫反应阳性细胞, GFAP免疫反应阳性细胞体积较大, 细胞突起很多, 为星形胶质细胞 (图5) ;NSE免疫反应阳性细胞体积较小, 细胞突起很长, 为神经元 (图6) 。证明了所培养的细胞具有多向分化潜能。

2.5转染后神经干细胞的观察

倒置相差显微镜观察转染后的神经干细胞仍然保持不断分裂增长的特性, 神经球不断增大。转染48 h后神经干细胞生长状态无明显改变, 少量神经干细胞分化, 自神经球向四周长出放射状突起。细胞胞体透明, 胞浆均质, 折光性强。72 h后用波长488nm的紫外线激发, 荧光显微镜下见许多发出绿色荧光的神经干细胞球 (图7) 。观测到绿色荧光蛋白提示转染到神经干细胞内的HIF-1α基因片段能够表达蛋白质。

2.4 HIF-1αm RNA原位杂交检测结果

原位杂交检测结果显示, 在相同的实验条件 (温度、湿度、反应时间) 下, 大部分转染72 h后的神经干细胞出现HIF-1αm RNA原位杂交检测阳性结果, 神经干细胞胞浆着色呈深棕黄色 (图8) 。而未转染组和空载体组细胞的HIF-1αm RNA原位杂交检测着色均不明显 (见图9、10) 。用图像分析仪分析测定了各组阳性细胞的平均光密度值, 结果见附表, 经统计学分析, 转染组与空载体组和未转染组相比差异有显著性 (P<0.01) , 证明转染组的HIF-1αm R-NA显著高于空载体组。

注:覮与空载体组和空白对照组比, P<0.01。

2.5 转染后HIF-1α蛋白的Western-blot检测结果

Western-blot结果显示, 在相对分子质量120KD处可见一清晰条带, 而空病毒载体组和空白对照组无此特异条带, 说明HIF-1α基因片段成功转染入神经干细胞, 并能表达具有生物活性的HIF-1α蛋白 (图11) 。

3 讨论

1992年REYNOLDS等及RICHARDS等最先从成年大鼠纹状体及海马中分离得到NSCs, 随后又从成年哺乳动物大脑中纹状体的室管膜下和海马的颗粒层发现NSCs聚集区[6]。NSCs能分化成少突胶质细胞、神经元、星形胶质细胞, 其特性标志为神经巢蛋白 (nestin) [7], 具有以下生物学特征: (1) 具有自我维持和自我更新的能力; (2) 具有多方向分化潜能, 能分化成本系大部分类型的细胞; (3) 增殖分裂能力; (4) 自我更新能力和多向分化潜能可维持很长时间, 甚至终生; (5) 对损伤和疾病具有反应能力, 损伤和疾病能刺激干细胞的分化。传统的观点认为, 中枢神经系统是终末分化组织, 神经细胞死亡后不能再生[8]。因此, NSCs的发现打破了传统观点认为中枢神经系统细胞不能再生的观念。NSCs易于进行转基因操作并可携带多个外源基因且有高水平的表达, 是进行基因治疗的良好载体[3], 将携带各种生长因子或细胞因子的报告基因的神经干细胞植人体内, 能够表达外源性基因, 产生相应的生长因子或细胞因子, 因此达到细胞替代和基因治疗的双重作用, 为中枢神经系统损伤修复及某些疾病的治疗带了新的希望。

HIF-1是1992年SEMENZA等[9]首次从低氧处理的Hep3B细胞的蛋白提取物中得到的, 后来进一步的研究发现它是一种核转录因子, 定位于染色体14q21-24。其亚基HIF-1α受氧体积分数变化的调节, 是HIF-1结合活性的主要决定因素;HIF-1β是结构单位, 其活性不受氧体积分数的影响, 二者必须以二聚体形式才能在细胞核中稳定存在。研究表明在机体缺氧状态下可诱导神经元HIF-1α的表达增加, 二聚体形成, HIF-1α构型发生变化, 增加其与靶基因缺氧反应元件 (HRE) 中5'-RCGTG-3序列结合的能力, 上调红细胞生成素、血管内皮生长因子、葡萄糖载体蛋白-1等靶基因的表达[10,11], 与神经血管再生、细胞增殖、糖代谢等密切相关, 从而达到神经保护作用[12~14], 目前已经确定的HIF-1α调控的靶基因有近50种[15]。

构建能长期稳定表达HIF-1α蛋白的神经干细胞系, 并将其移植入受损的神经系统, 将可以协同发挥神经干细胞和HIF-1α两者修复神经组织的作用, 达到更有效的治疗效果。腺病毒携带HIF-1α基因能否成功转染入神经干细胞, 并表达具有生物活性的HIF-1α蛋白, 是本实验的重点。腺病毒可感染非分裂细胞, 以及对靶细胞的高感染性和低病源性, 因而在目前神经系统疾病的基因治疗中被认为是合适的载体[16]。本实验通过在生长旺盛的神经干细胞中加入HIF-1α基因重组腺病毒的上清液 (200 PFU/细胞) 转染HIF-1α基因, 并通过免疫原位杂交实验, Western-blot实验证明转染入神经干细胞的HIF-1α基因能够大量表达具有生物活性的HIF-1α蛋白, 且转染后神经干细胞的生长特性也没有发生大的变化, 继续保持了不断生长增殖和能够分化的特性。