血细胞分离

血细胞分离（通用11篇）

血细胞分离 篇1

摘要：目的 比较使用全自动血细胞分离机分离血浆和红细胞的方法与传统方法的优劣。方法 以100袋全血为例, 比较分离速度、准确率、血液质量、信息保存情况及二次离心率。结果 应用血细胞分离机分离速度是传统速度的1.78倍, 准确率达到100%, 信息直接联网, 无须二次人工输入, 无须二次离心。结论 血细胞分离机分离血浆与红细胞的方法比传统方法更高效、安全、先进。

关键词：血细胞分离机,分离,成分血,优势

随着近些年临床对成分血需求的日益增长, 高效、安全地分离成分血就显得尤为重要。临床应用各种成分血, 对患者对症治疗, 同时节省了血液资源, 实现一袋血可以分出不同的血液成分, 输给更多的患者, 做到一血多用。血细胞分离机是分离、制备各类成分血的先进仪器, 使用血细胞分离机, 将比传统的手工制备方法大大提高制备成分血的速度, 保证血液成分的质量, 因此, 血细胞分离机分离血浆和红细胞的方法在未来几年将得到各大血站的普遍应用, 比传统分离法占有明显优势[1]。

1 血细胞分离机的特点

(1) 分离、称量、热合一系列过程自动操作。 (2) 减少人工误差。只要分离机设置好程序, 分离出的血浆可以调整容量的上限和下限, 防止血浆过多或过少, 添加保存液的量是根据保存液袋子的厚度调整的, 避免了保存液添加不完全的现象发生。 (3) 方便快捷。所有操作按部就班地进行, 操作起来既轻松又规范, 胜于手工操作手忙脚乱, 杂乱无章的场景。 (4) 已成流行趋势。血细胞分离机作为新生代分离血浆及红细胞悬液的先进仪器, 既符合提高血液质量的要求, 又紧跟时代进步的步伐, 智能、高效地制备各种血液成分, 也彰显着一个先进血站的实力水平。

2 操作方法

(1) 打开开关, 开启压缩机。 (2) 显示屏进入初始化模式, 仪器进行自检, 自检过程中工作人员要观察分离机是否运作正常, 自检结束, 所有数据显示正常方可使用。 (3) 选择要制备血液产品对应的程序。因为血细胞分离机可以制备滤白冷沉淀, 滤白新鲜冰冻血浆和悬浮红+冰浆等, 因此, 选对程序非常重要。如果制备成分程序选择错误, 将导致分离失败等各种严重后果, 严重影响血液质量。分离血浆和红细胞悬液要选择悬浮红+冰浆程序。 (4) 按照提示挂好血袋, 掰开母袋活塞, 连接各个导管, 确保每根导管都在卡钳里, 并且每根导管都通畅, 不打折。如果活塞没有完全掰开或导管打折或导管未完全卡在卡钳内, 机器不仅会报警, 有时还会出现热合不完全或漏血现象, 因此, 操作前检查非常重要。 (5) 按“开始”按钮, 扫描制备者条形码和血液条形码, 进行分离制备。逐袋扫描制备者献血码, 这样通过联网, 每袋血液制品的制备信息都可以轻松查到, 使制备者更加认真负责地工作, 为血液制备的各步骤监管提供了安全保障, 能更放心地为临床提供高质量的血液制品。 (6) 分离结束自动称量, 自动热合。避免手工操作转场称量, 热合, 符合血液制品轻拿轻放及冷链的原则。

3 注意事项

(1) 关机之后再切断电源, 保证其使用寿命。 (2) 进行分离操作过程中, 当挤压板移动时, 避免手指接触挤压板, 避免挤伤手指。 (3) 挂血袋时, 仪器光感区不要遮挡, 以免引起误操作。如果光感区被遮挡, 仪器就不能感应红细胞的位置, 就容易造成红细胞大量冲进血浆袋中, 发生制备错误。

(4) 操作过程中, 每一步程序未结束, 不要强行进行下一步操作。 (5) 对设备每两周进行一次称量校准。 (6) 每天清洁消毒, 擦干待用。 (7) 每年厂家工程师保养1次, 随时维护。

4 血细胞分离机制备滤白红细胞悬液与传统分离制备红细胞血液方法的比较

(1) 传统分浆夹分离法:将经过良好离心后的滤白全血轻轻放入分浆夹, 掰开阻塞, 慢慢靠分浆夹的压力将大部分血浆分离出来, 然后往红细胞主袋加入保存液的方法, 现在添加的保存液为ACDP, 使红细胞保存期限延长至35 d。 (2) 传统虹吸法:将经过良好离心后的滤白全血直接挂在低温操作台的挂钩上, 掰开阻塞, 用手轻轻挤压母袋, 使少量血浆先流入子袋, 然后利用虹吸原理把血浆与红细胞分离, 再往红细胞袋内添加保存液的方法。 (3) 血细胞分离机分离法:将经过良好离心的全血通过血细胞分离机的自动挤压板和多区域光学传感器将血浆和血细胞分离出来, 并自动添加保存液的方法。 (4) 经过1559袋全血进行分离制备红细胞悬液及血浆的实验发现:使用分离机分离速度更快, 准确率更高, 数据保存更完整, 不需要二次离心[2]。见表1。

使用分浆夹和虹吸法, 分离结束, 需要手工添加保存液, 手工排气, 热合, 称量, 摆放, 计算机扫入, 而血细胞分离机方法一步到位, 所有步骤连续完成, 简化了工作程序。从表1可以看出, 拿100袋血为例, 血细胞分离机耗时1 h 40 min, 而且血细胞分离机添加保养液准确率为100%, 因为血细胞分离机通过感应区感应红细胞, 确保血浆被分离出来后自动停止 (不会有红细胞混入血浆袋内) , 然后自动进入下一步, 自动添加保存液, 感应区须智能感应保存液袋子的厚度, 如果保存液添加不完全, 血细胞分离机自动报警, 页面提示检查, 保证保存液添加充分, 不会残留。排除血液自身原因与离心意外, 分离出的血浆无需再次离心, 如果离心效果不好, 需要二次离心的, 血细胞分离机还能够自动冲管, 确保二次离心效果。100袋血分浆夹耗时3 h, 添加保养液准确率为99.8%, 需要再次离心的袋数是2袋, 容易出现保养液添加不完全、卡子关闭不严、二次离心等;100袋血, 虹吸法耗时2 h 50 min, 准确率99.7%, 二次离心2.6袋。100袋血, 血细胞分离机耗时1 h 40 min, 添加保存液100%, 不需二次离心。

由此可见, 血细胞分离机比传统的手工分离方法快速、高效, 避免了人为因素带来的质量偏差, 人工分离整个过程需要人工密切监控, 稍有不慎, 红细胞一瞬间就进入血浆, 造成红细胞浪费, 血浆还必须进行二次离心, 工作人员整个过程精神高度紧张, 整个制备过程很忙乱。使用血细胞分离机, 只要对工作人员做好培训, 设置好分离机参数, 监测机器正常运转, 血细胞分离机通过多方位探头监测分离工作, 非常准确有效地自动控制整个分离过程, 有条不紊地进行分离制备工作。随着科学技术的不断发展、工作人员的共同努力研究, 相信血细胞分离机会更加快速高效、更加智能。因此, 血细胞分离机迅速取代手工分离方法是成分血制备的一大进步。

参考文献

[1]中华人民共和国卫生部, 中国国家标准化管理委员会.全血及成分血质量要求 (GB18469-2012) [S/OL].http://w w w.nhfpc.gov.cn/zw gkzt/s9 4 9 3/2 0 1 2 0 7/5 5 3 8 0.shtm l.

[2]褚新建, 郑萌, 夏晓.Trima Accel和MCS+两种血细胞分离机采集血小板的比较[J].中国中医药咨讯, 2011, 3 (14) :330.

血细胞分离 篇2

我们知道每一个细胞内部都是由多个结构组成的，比如说有细胞核，线粒体，内质网，高尔基体等，如果要研究细胞内这些部位的结构和功能，以及细胞器在细胞活动中所起的作用时，那么首先必须将其从生物材料中提取出来，进行分离纯化和测定之后，然后才能进行更深入的研究。我们今天就以小鼠的肝细胞核的提取为例，来了解一般分离提取的基本原理和方法。

通过本次实验，要求我们达到以下两个目的，1：掌握离心技术的原理和使用方法

2：掌握细胞核分离的原理和方法。那关于离心机的原理及使用方法我们在第一次实验课上已经讲过了，那么在这里我只强调两点，就是在使用的时候首先要注意配平原则并且规范操作，一定要注意安全，安全是第一的。那接下来我们就看一下细胞核的分离原理。

由于细胞内不同结构它的比重和大小是不同的，在同一离心场内的沉降速度也是不相同的。因此我们可以首先将我们的生物材料研磨成匀浆，然后通过离心的方法分离出细胞质和粗制细胞核，细胞核粗制品加入0.25mol/L蔗糖—柠檬酸溶液（含Ca2+,可防止细胞核凝集，维持细胞核的正常形态），混匀制成匀浆，然后选用高渗蔗糖—柠檬酸溶液作为梯度介质，调整离心力，通过密度梯度离心的方法进行离心，可以使细胞核单独沉淀于离心管底部，从而将细胞核与其他比重相接近的亚细胞结构分离开。在这里我要告诉大家细胞器沉降的先后顺序是细胞核、线粒体、溶酶体和其他微体、核糖体和大分子。那接下来我们看一下在这个实验中需要用到哪些试剂？

实验试剂：1，生理盐水 2, 1.5%柠檬酸 3,0.25mol/L蔗糖—柠檬酸溶液 4，0.88mol/L蔗糖—柠檬酸溶液 5，核洗液 6，0.02mol/L NaOH溶液，关于各试剂的作用我们在操作的时候会说到。接下来我们看一下具体的操作步骤。

（1）首先第一步就是肝细胞匀浆的制备。用颈椎脱位的方法杀死小白鼠后，迅速剖开腹部取出肝脏，剪成小块（去除结缔组织），尽快置于盛有生理盐水的烧杯中，反复洗涤，尽量除去血液，剪碎，称取0.5g的肝组织，放入匀浆器中，加1.5%的柠檬酸溶液4.5mL，柠檬酸具有抑制核酸酶活性的作用，因此可以防止核酸的降解。反复研磨制成匀浆。再将匀浆用尼龙布过滤2-3次，除去残渣。

（2）分离细胞质和细胞核

a.将过滤好的匀浆液转入离心管中，放入普通离心机，大家注意一定要配平，然后以3500r/min的转速，离心15min.离心之后的上清液含有细胞质，要倒到另外一个试管中保留，待测定核酸时使用。

b.余下的沉淀物就是粗制的细胞核，然后加入0.25mol/L蔗糖—柠檬酸溶液1mL，用玻璃棒搅匀，制成细胞核悬液，在这个溶液中加入了CaCl2,因此含有Ca2+,这可防止细胞核凝集，能够维持细胞核的正常形态。

c.另取一个离心管，先加入0.88 mol/L蔗糖—柠檬酸溶液9Ml,用滴管吸取上述的核悬液，沿管壁缓缓铺于0.88 mol/L蔗糖—柠檬酸溶液面上，因为该溶液中含有蔗糖，且浓度较高，所以溶液比较黏，跟上面的核悬液能有一个明显的界面。然后再以2000r/min 转速离心10min,倾去上清液，将试管倒立于试纸上，以吸干余液，沉淀即为初步纯化的细胞核。

d.加入核洗液5mL，以2000r/min离心10min，除去上清液，再重复洗涤一次，得到的白色沉淀即为纯化的细胞核。

观察植物细胞的质壁分离和复原 篇3

一、说教材

该实验出现在人教版高中生物必修一第四章第一节《物质跨膜运输的实例》中，是学生在高中阶段第一次接触的“探究实验”，不仅可以培养学生探究能力；还可以使学生学会如何从生活现象中发现问题、提出问题，做出合理的假设，并根据假设来设计实验。

二、说教学目标

教学目标，即三维目标：

1.知识目标：理解植物细胞发生渗透作用的原理

2.能力目标：尝试提出问题，作出假设

3.情感、态度与价值观目标：通过学习、体验该实验活动，激发学生科学探究的兴趣，并培养学生团结协作的能力。

教学重点和难点：

1.教学重点：尝试提出问题，做出假设

2.教学难点：解决实验过程中遇到的困难

三、说教法

直观演示法、活动探究法、集体讨论法等教学方法。

四、说学法

自主探究法、思考评价法、总结反思法等。

五、说教学过程

具体过程包括以下6个环节：

1.创设情境，直入主题

上课开始时，拿出预先准备好的白菜，在白菜表面撒些盐，过一段时间就会在白菜表面看到有水分渗出，针对这一现象引导学生提出问题。

2.针对现象，提出问题

同学们提问题很积极，提出的问题也很多，其中大家最感兴趣的就是：白菜表面的水分是从哪里来的？

3.分析现象，做出假设

针对这一问题，学生做出的假设主要有两种观点，一是认为水来自于細胞间隙，还有一种观点认为水是来自于细胞液。

4.具体实验，探究发现

（1）材料用具的选择。

紫色洋葱、镊子、载玻片、盖玻片、显微镜、滴管、吸水纸、0.3 g/mL的蔗糖溶液、清水等。

（2）设计并操作实验步骤。

①洋葱外表皮临时装片的制作与观察。

②洋葱外表皮质壁分离与复原的操作与观察。

（3）分析并解决部分同学未作出理想装片的问题。

对于初学者来说极难取到只有单层细胞的外表皮，后来发现内表皮容易撕取，但是却无色，不利于观察；接着就想到了给内表皮染色，但发现实验室没有中性红染色剂，然后又想到用加入红墨水的蔗糖溶液代替中性红染色剂，最后制作装片，观察装片。

5.整理实验台

6.实验评价

最后的几分钟时间，同学们都进行自我评价，找出自己实验成功和未成功的原因，并和同学们一起分享。

血细胞分离 篇4

关键词：脐血造血细胞,HES法,Ficoll法,明胶法,效率

脐血造血细胞分离是脐血移植过程中的重要环节, 也是脐血库建立的关键性步骤, 对血液病患者的疾病治疗有着重要的作用。目前, 最常见的脐血造血细胞分离方法为HES法、Ficoll法、明胶法, 其中HES法的分离效率较高, 其体积浓缩效果较好。本研究将133例脐血标本分为3组, 3组分别应用HES法、Ficoll法及明胶法, 比较3组的分离效果, 现报道如下。

1材料与方法

1.1材料

本研究共133例脐血标本, 均由我市某医院妇产科提供, 脐血标本采集量50.2-140.5ml, 平均81.7ml。标本采集后保存于4℃的温度条件下, 保存时间控制在24h之内。依据随机方法, 将133例脐血标本分为3组, A组45例, B组44例, C组44例。

1.2方法

1.2.1 HES法

A组45例标本选择HES法, 即在整份脐血中加入25%的羟乙基淀粉60g/L, 混合均匀后进行500r/min离心处理, 时间控制在5min, 之后去掉红细胞, 再进行1200r/min离心处理, 时间控制在13min, 将部分血浆去掉, 确保体积浓缩至25ml左右, 最后将白细胞重悬在剩余的血浆中。

1.2.2 Ficoll法

B组44例标本选择Ficoll法, 即选择Ficoll 10ml, 相对密度为1.077, 将其置于离心管 (50ml) 中。每例标本取10ml脐血, 并置于液面上, 之后进行1800r/min离心处理, 时间控制在10min, 选择白细胞层重悬在RPMI 1640培养液10ml中。

1.2.3明胶法

C组44例标本选择明胶法, 即从44例标本中顺利取出20ml, 并放置于离心管 (50ml) 与30g/L明胶 (20ml) 中, 混合均匀后, 进行30min沉降处理, 之后将上清液置于另一个离心管 (50ml) 中, 添加50% 30g/L明胶, 进行30min沉淀处理, 保留上清液。

1.2.4 CD34+细胞检测

抗体主要选择美国Pharmigen公司生产的抗人CD34抗体, 同时选择美国Becton Dick-inshon公司生产的流式细胞仪进行检测。将抗体20μl置入脐血100μl中, 混合均匀后在4℃温度条件下进行30min孵育, 选择氯化铵裂解红细胞, 时间控制在30min, 之后进行两次PBS洗涤, 选择多聚甲醛进行固定后再实施检测, 同时开淋巴细胞窗。

1.2.5造血祖细胞体外培养

选择体外培养方法, 培养体系主要选择甲基纤维素半固体培养基, 其包括四个成分, 即白细胞介素-3 (10ng/ml) 、粒细胞集落刺激因子 (200ng/ml) 、干细胞因子 (50ng/ml) 、红细胞生成素 (1U/ml) 。选择2×105个有核细胞, 将其置于2ml培养体系中, 并在体积分数保持在5% CO2、温度保持在37℃基础上进行14d的培养, 之后分别计数BFU -E、CFU -GM以及CFU -Mix, 同时准确计算出三者之和, 即CFCs[1]。

1.3统计学方法

选择SPSS10.0软件进行统计分析, 计量资料用均数±标准差 (x±s) 表示, 选择ANOVA与Bonferroni两两比较方法进行分析, 当P<0.05时表示差异有统计学意义。

2结果

2.1 CD34+细胞产率

A组分离前CD34+细胞为 (8.81±1.90) ×107, 分离后CD34+细胞为 (8.67±1.67) ×107, 产率为 (98.15±5.68) %;B组分离前CD34+细胞为 (1.08±0.40) ×107, 分离后CD34+ 细胞为 (0.36±0.01) ×107, 产率为 (32.85±4.77) %;C组分离前CD34+细胞为 (2.17±0.69) ×107, 分离后CD34+细胞为 (2.08±10.36) ×107, 产率为 (81.46±5.93) %。A组CD34+细胞产率高于B组, C组CD34+细胞产率高于B组, A组CD34+细胞产率高于C组, 组间两两比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。

2.2 CFCs产率

A组分离前CFCs为 (2.41±0.31) ×106, 分离后CFCs为 (2.20±0.33) ×106, 产率为94.56%;B组分离前CFCs为 (3.07±0.40) ×105, 分离后CFCs为 (9.57±0.86) ×104, 产率为30.87%;C组分离前CFCs为 (5.88±0.81) ×105, 分离后CFCs为 (5.22±0.58) ×105, 产率为78.49%。A组CFCs产率高于B组, C组CFCs产率高于B组, A组CFCs产率高于C组, 组间两两比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。

3讨论

脐血是临床医学中重要的造血干细胞来源, 其可以替代骨髓实施造血干细胞移植, 在血液疾病治疗中发挥重要的作用。在脐血移植及脐血库建立中, 脐血干细胞分离技术起着积极性的作用, 科学、 有效的分离技术可以快速分离脐血中的有核细胞, 为脐血库的建立奠定基础[2]。

Ficoll法、明胶法、HES法是目前科研中广泛应用的脐血干细胞分离方法, 不同的分离方法, 其对造血细胞回收所产生的影响也有所不同, 分离效率也不尽相同。运用Ficoll法进行分离, CD34+细胞损失超过60%以上, 干细胞丢失严重, 且每次仅可分离出较少的脐血量, 在脐血库建立中存在一定的局限性。应用明胶法分离时, CD34+ 细胞损失率低于Ficoll法, CFCs损失率也比较低, 对脐血库建立非常有利, 但经明胶分离后, 终体积所占的比率比较大, 约为原体积的75%。HES法具有操作简单、用时少、分离效率高、体积浓缩效果好等多种优点, 其CD34+细胞损失率通常不超过5%, CFCs损失率通常不超过10%, 且其分离后终体积所占的比率比较小, 通常不超过原体积的25%。本研究将133例脐血标本分为3组, A组应用HES法, B组应用Ficoll法, C组应用明胶法, 结果显示, A组CD34+细胞产率及CFCs产率均高于B组、C组, 证实HES法分离脐血造血细胞的效率高于Ficoll法、明胶法。

综上所述, 在分离脐血造血细胞中, HES法分离效率较高, 其分离效果优于Ficoll法与明胶法, 有助于脐血库建立, 是分离脐血造血细胞首选的方法, 值得推广。

参考文献

[1]王颖超, 殷楚云, 冯磊, 等.三种不同方法分离脐血造血干细胞的效果比较[J].实用儿科临床杂志, 2012, 27 (10) :766-768+794.

观察植物细胞的质壁分离和复1 篇5

当细胞液的浓度小于外界溶液的浓度时，细胞液中的水分就透过原生质层进入到外界溶液中，使细胞壁和原生质层都出现一定程度的收缩。由于原生质层比细胞壁的伸缩性大，当细胞不断失水时，原生质层就会与细胞壁分离。当细胞校的浓度大于外界溶液的浓度时，外界溶液中的水分就透过原生质层进入到细胞液中，使原生质层慢慢地恢复原状，使植物细胞逐渐发生质壁分离复原。

目的要求

1．学会观察植物细胞质壁分离与复原的方法。

2．了解植物细胞发生渗透作用的原理。

材料用具

紫色的洋葱鳞片叶、紫鸭趾草叶片。

刀片、镍子，滴管，载玻片，盖玻片，吸水纸，显微镜。

质量浓度为 0．3 g／mL的溶液蔗糖，清水。

方法步骤

1．撕下一小块洋葱鳞片叶紫色的外表皮制作成临时装片。

2．用高倍显微镜观察洋葱鳞片叶片细胞中紫色大液泡（原生质层紧贴细胞壁）。

3.向盖玻片的一侧滴入蔗糖溶液，在另一侧用吸水纸吸引。这样重复几次，盖玻片下面的洋鳞片叶表皮就浸润在蔗糖溶液中。用高倍显微镜观察，细胞中液泡的大小、颜色变化。

5．从一侧滴入清水，在盖玻片的另用吸水纸吸引。这样重复几次，洋葱鳞片叶又浸入清水中。用高倍显微镜观察，细胞中液泡的大小、颜色变化。讨论

1.洋葱鳞片叶表皮细胞在什么条件下发生质壁分离？在什么条件下发生质壁分离复原？

2.如果将上述表皮细胞浸润在与细胞液浓度相同的蔗糖溶液中，这些表皮细胞会出现什么现象？

血细胞分离 篇6

关键词：表皮干细胞；细胞分离；细胞培养

中图分类号： Q593. 2 文献标识码： A 文章编号： 1674-0432（2014）-18-17-1

表皮干细胞也可称角质干细胞，不同部位的表皮干细胞分布存在差异，其主要分布于表皮基底层和毛囊外根鞘隆凸部及皮脂腺边缘[1]。表皮干细胞在维持皮肤的自我更新、创伤修复、皮肤肿瘤的发生等方面扮演着重要的角色，因此成功地分离、培养表皮干细胞对临床上创伤修复、皮肤癌的研究起着至关重要的作用[2]。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及用具

1.1.1实验材料 0～7日龄SD大鼠。

1.1.2实验试剂 中性蛋白酶，胰蛋白酶-EDTA消化液，IV型胶原，DMEM培养液，D-Hanks，KSFM培养液，冻存液，75%酒精。

1.1.3实验用具 剪刀、镊子、尼龙纱网、手术刀、培养瓶、培养皿、冻存管、水浴锅、CO2培养箱、超净工作台，电子显微镜，离心机等。

1.2 实验方法

1.2.1表皮细胞的分离 取0 ～7日龄SD大鼠，脱颈锥处死， 75%酒精清洗，剪取背部皮肤，D-Hanks清洗，将其切割为0.5×1.0厘米的皮肤组织，0.25%中性蛋白酶在4℃处理12～16小时，吸弃上清液，D-Hanks清洗后分离表皮和真皮。表皮剪碎呈糜状，以2.5克/升胰酶+0.2克/升 EDTA消化液在37℃条件下消化5～10分钟，用含小牛血清的DMEM培养液终止消化，吹打至悬液，100目尼龙纱网过滤，1000转/分钟离心5分钟，弃上清液，以培养液重悬制成单细胞悬液。

1.2.2 胶原黏附法选择表皮干细胞 将单细胞悬液以2×105 个/毫升的密度接种在铺被IV型胶原的培养瓶内，37℃、5%CO2培养箱中孵育10～15分钟。吸出细胞悬液，粘附在胶原被膜上的细胞则为表皮干细胞。

1.2.3 表皮干细胞培养 在去除细胞悬液铺被IV型胶原的培养瓶中加入无血清角质形成细胞培养基（KSFM）进行培养，12小时后换液以除去未贴壁的细胞，以后每2天换液一次，光学显微镜下观察细胞生长情况。

2 结果与分析

2.1 原代培养的表皮干细胞

刚刚接种的表皮干细胞，细胞均匀分散呈圆形，核大，胞体小，培养一周（图1）进入增殖期，第12天达到高峰表皮干细胞渐渐伸展形成扁平的多角状，胞质近中央处有圆形核并开始形成小克隆，细胞即连接成片，紧密相靠，相互衔接，呈铺路石状，汇合成片。

2.2 传代培养的表皮干细胞

原代细胞接种24小时后即伸展，相互聚集，粘附在胶原上，呈克隆样生长，细胞聚集在集落中心周围呈辐射状生长，5～6天表皮干细胞增殖能力加强，达到融合铺满培养瓶的瓶底。

3 结语

不同的细胞外基质对细胞的黏附作用不同，表皮干细胞主要通过表达整合素实现其对基底膜的粘附，同时也是干细胞维持其特性的基本条件。IV型胶原作为细胞外基质的主要成分对细胞的粘附、生长、移行等方面起重要作用，表皮干细胞不仅对IV型胶原有较强的粘附性，而且在IV型胶原上能很好的生长，由此进行筛选、培养、纯化表皮干细胞，结果表明，获得的表皮干细胞较纯净，其仍具有较强的分裂增殖能力，于培养后第二天，大量克隆细胞形成，5～6天汇合成片，可以长期传代。该方法操作简便，表皮干细胞生长良好，具有较高的克隆形成率。

无血清培养基及其附加的营养成分在细胞生长与培养液之间提供了较好的平衡体系，有利于表皮干细胞的增殖及其表型的维持，由于培养基中不含血清，没有血清中的各种复杂和不明的成分，排除血清中许多未知因素对干细胞分化的影响，是目前培养表皮干细胞被认可的方法[3]。

参考文献

[1] 孙晓燕，付小兵，孙同柱.表皮干细胞的分离培养和鉴定，中华实验外科杂志[J]，2007，24（2）：163-164.

[2] 王海燕.肺出血·肾炎综合征抗基底膜抗体型.北京人民卫生出版社[M]，1998：912-922.

[3] 刘德伍，陈国安，曹勇，等.人表皮细胞无血清培养的实验研究[J]，1997，13（6）：419-420.

血细胞分离 篇7

本研究以30～45日龄的绵羊胚胎生殖嵴及其邻近组织为材料,采用与其胎儿成纤维细胞共培养的方式从PGCs成功分离得到绵羊ES细胞,并传至9代。在研究目的、试验设计等方面虽然与国内外同行具有相同之处,但在动物的选择、组织学染色及超微结构观察等方面具有自己的独创点。通过对ES细胞的分离与鉴定充分认识ES细胞,为加速ES细胞的实际应用奠定基础。

1 材料

研究所用胚胎材料从呼和浩特市伊斯兰屠宰场收集得到,要求胚体完整,无严重污染。选出胚长为20 mm左右的胚胎用添加青霉素(80万单位/L)、链霉素(100万单位/L)的PBS(-)浸洗5～10次,将胚胎表面的杂物充分清理干净。

2 方法

2.1 绵羊胎儿的处理

去掉胚胎头、尾、四肢、内脏后置于青霉素瓶内,用睫毛剪剪碎,使之成为1 mm以内的组织碎块。

2.2 细胞的消化

加入2 m L胰蛋白酶+EDTA消化液消化3～5 min,消化液由清亮变混浊时再加入等体积的DMEM培养液,摇匀,终止消化。

2.3 细胞的原代培养

1)用孔径为50μm的滤纱将胚胎组织悬液过滤,1 000 r/min离心5 min;弃去上清液,加入培养液吹打,使细胞悬浮。

2)二次离心,弃上清液,加入3 m L培养液吹打,制成细胞悬液,调整细胞浓度,置培养箱中(38.0℃、5%CO2饱和湿度)培养,48 h后换培养液,此后每24 h更换培养液1次。

2.4 传代培养

1)待其鸟巢状集落周围出现分化细胞之前弃去培养液,进行消化,1～3 min后加入培养液,终止其消化。

2)吹打使细胞脱离瓶底而悬浮,将细胞悬液以1 000 r/min离心5 min;弃上清液,加入培养液制成细胞悬液,吹打混匀。

3)取细胞悬液3 m L,调整细胞浓度,进行传代培养。

4)待其细胞集落成熟时,用同样方法来完成传代工作。

2.5 胚胎干细胞的鉴定

2.5.1 AKP染色鉴定

吸取培养瓶中的培养液,用PBS(-)冲洗,加入3 m L 95%乙醇,放进培养箱固定1 h;倒掉乙醇,PBS(-)冲洗,再加入新配制的AKP染色液作用30 min;再用PBS(-)冲洗1次(AKP阳性细胞被染成深棕红色,其他细胞被染成浅黄色或不着色)。

2.5.2 H.E.染色鉴定

刮取绵羊ES细胞集落用2.5%戊二醛磷酸缓冲液固定24 h;琼脂包埋,冲洗,脱水,透明,浸蜡,包埋,切片(厚8～16μm),常规H.E.染色,光镜观察。

2.5.3 核型分析

取生长状况良好的绵羊ES细胞集落加入0.8μg/m L秋水仙素DMEM培养液,置培养箱中培养3 h之后机械分散集落,再用4 m L0.075 mol/L KCl溶液低渗作用30 min;置于甲醇-冰醋酸(3∶1)中固定,离心,再固定,染色体冰冻制片,干燥,进行Giemsa染色。

2.5.4 透射电镜观察

弃培养液,用0.1 mol/L磷酸缓冲液冲洗2次,放入2.5%戊二醛固定液固定24 h;倒掉固定液,剥离下来ES细胞集落用0.1 mol/L磷酸缓冲液冲洗2次,每次15～20 min;按常规电镜制片方法制备50 nm的薄片,进行醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色,电镜观察。

3 结果

3.1 绵羊成纤维细胞原代培养效果

试验所用胚胎为30日龄的绵羊胚胎。成纤维细胞主要取材于生殖腺、生殖嵴及其邻近组织。消化时间为3～5 min,消化温度为室温。消化胚胎组织后,放入培养瓶中进行培养,然后在倒置显微镜下观察结果。结果表明:细胞呈球形,单个离散分布于瓶底或悬浮在培养液中;还可见大量细胞碎片及未消化充分的组织碎块(见179页彩图1A)。培养12 h后可观察到部分细胞突起伸出,细胞呈梭形,有很多球状未贴壁细胞。48 h之后,成纤维细胞数量增加(见179页彩图1B)。随着培养液的更换,很多未贴壁细胞及细胞碎片被清除掉。96 h后细胞密度增大,多个成纤维细胞聚集在一起,形成放射状结构(见179页彩图1C)。

3.2 绵羊ES细胞生长行为

细胞培养延续至第6天,成纤维细胞呈放射状结构,有几处出现鸟巢状集落(见179页彩图1D)。细胞之间界限不清,细胞核大。随着培养时间的延长,“鸟巢”体积逐渐变大。由原来只在显微镜下可见到逐渐成长为可以用肉眼所看到的“小米粒”状结构。多数集落呈鸟巢状,但也有少数形似山包状、葵花状。所有集落及集落团均明显凸出于数量庞大的同源成纤维细胞表面。此时,集落周围出现分散的、大小不等的球形细胞,而且有一种黏性液体把这些零乱的细胞粘连在集落周围。

原始生殖细胞培养的第7天,连同成纤维细胞进行胰蛋白酶+EDTA消化并传代,继续培养至第11天第2代鸟巢状集落出现(见179页彩图1E),此时的集落层细胞较多,集落之间相距较近。第15天出现第3代集落;第20天出现第4代集落;第23天出现第5代集落;第28天出现第6代集落,第32天出现第7代集落,此时的集落仍保持其细胞紧密排列,细胞之间界限不清、细胞核大、形似鸟巢状等。

3.3 ES细胞的鉴定结果

3.3.1 AKP染色鉴定结果

AKP染色于培养144 h后进行。所有ES细胞集落团均染成深棕红色,周围的分散细胞着色浅。成纤维细胞则呈黄色或棕黄色(见179页彩图1F)。

3.3.2 ES细胞集落的光镜切片观察结果

对第4代ES细胞集落进行H.E.染色可以观察到鸟巢状集落被切成马蹄状(见179页彩图1G),有几个生长中心(见179页彩图1H)。围绕生长中心有很多成纤维细胞,中心有生长旺盛的ES细胞。细胞核大,细胞质少,细胞之间界限不清,有几处可见到ES细胞的凋亡现象,细胞核固缩,形成凋亡小体。凋亡的ES细胞出现在生长中心内部,生长中心的外边缘ES细胞生长较旺盛,细胞核质比高。

3.3.3 绵羊胚胎干细胞核型的鉴定结果

试验对传至6代的绵羊胚胎干细胞做相应的核型分析,结果表明,核型为正常二倍体,其染色体数目与正常绵羊的一样,均为54条(见179页彩图1I)。说明所用培养体系不含导致ES细胞染色体畸变的因素,能基本满足ES细胞正常生长的需求。

3.3.4 透射电镜切片观察结果

为了更深入观察绵羊胚胎干细胞克隆集落内部的干细胞形态,运用透射电镜对其第7代绵羊ES细胞进行观察。结果可见绵羊胚胎干细胞集落内部细胞排列非常紧密(见179页彩图2A),内质网发达(见179页彩图2B),线粒体较发达(见179页彩图2C)。大部分胚胎干细胞胞体小,胞核较大,核质比高,胞质电子密度低,核异染色质少(见179页彩图2D),而核糖体较多,高尔基体不发达。部分细胞核膜上出现小泡,染色质边集,形成凋亡小体(见179页彩图2E)。

4 讨论

多数学者在从PGCs中分离、克隆ES细胞时,都以小鼠胎儿成纤维细胞或小鼠原代胎儿成纤维细胞作饲养层,并且在培养液中添加各种细胞因子。如M.J.Shamblott等[5]、常万存等[6]从人胎儿PGCs中分离、克隆ES细胞时添加了LIF、Forskolin等细胞生长因子。R.A.Cherny等[7]用丝裂霉素处理的同龄牛胎儿成纤维细胞作饲养层,以传统ES细胞培养基成功地从29～35日龄牛胎儿PGCs分离、克隆到ES细胞,并证明其具有多能性。

试验结果表明,在未加任何细胞因子的情况下,与其胎儿成纤维细胞共培养也能分离得到具有诸多ES细胞特征的PGCs集落。笔者认为,采用适宜胎龄胎儿的PGCs与其生殖嵴成纤维细胞共培养的方式培养,未经过任何处理的生殖嵴成纤维细胞可与PGCs协同竞争生存,成纤维细胞分泌细胞生长因子,促进PGCs增殖,同时也有可能分泌一些分化抑制因子,抑制PGCs分化、凋亡。当成纤维细胞生长分裂至一定程度,PGCs则凋亡不能形成ES细胞集落。本研究重复多次操作,并且每次所用胚胎胚龄有所不同,最大为45日龄,最小为30日龄,多次的试验结果证明超出该胚龄范围则很难培养出类ES细胞集落。其原因可能是培养体系里的PGCs较少或绵羊胎儿已发生性别分化,大多数PGCs分化成了精原细胞或卵原细胞而丧失了形成类ES细胞集落的能力。试验结果表明,在未添加细胞因子的情况下,采用PGCs与其胎儿生殖嵴成纤维细胞共培养也可以分离、克隆出具有ES细胞诸多特征的绵羊类ES细胞。

A.培养初期的生殖嵴组织细胞,来自30日龄胚胎;B.培养48小时的成纤维细胞,来自30日龄胚胎(10×5);C.放射状聚集在一起的绵羊成纤维细胞(10×5);D.原代绵羊ES细胞集落(20×5);E.传至第2代绵羊ES细胞集落(20×5);F.AKP染色强阳性ES细胞集落;G.第4代鸟巢状ES集落的竖切面,形似马蹄(4×3.3);H.ES集落的几个生长中心(→所示,10×3.3);I.第6代绵羊ES细胞染色体,54条。

A.绵羊ES细胞之间的紧密排列,来自30日龄胚胎;B.绵羊ES细胞发达的内质网(12 000×);C.绵羊ES细胞的线粒体,来自30日龄胚胎(18 000×);D.透射电镜下7代绵羊ES细胞,来自30日龄胚胎(7 000×);E.绵羊ES细胞凋亡小体,来自30日龄胚胎(→所示,12 000×)。

参考文献

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[6]常万存,窦忠英,马鸿飞,等.原始生殖细胞的人类胚胎干细胞克隆[J].西北农业大学学报,1998,26(6):105-108.

血细胞分离 篇8

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取在2010年4月~2014年10月在西京医院血液科细胞分离室行血细胞分离术的患者120例,随机分为实验组和对照组。实验组:在血细胞分离过程中回流侧使用18GB Y型安全型浅静脉留置针,采集侧使用16GB钢针。对照组:在血细胞分离过程中回流侧及采集侧均使用16GB钢针。纳入标准:2010年4月~2014年10月期间,年龄15~60岁,在西京医院血液内科血细胞分离室行血细胞分离术的未行股静脉置管的患者。排除标准:2010年4月~2014年10月期间,在血液内科血细胞分离室行血细胞分离术,年龄小于15岁或大于60岁,行股静脉置管术的患者。样本量:选取符合以上条件的120例患者。两组患者基本资料无统计学差异(P>0.05),具有可比性,见表1。

1.2 方法

1.2.1 调查工具

采用本科针对血细胞分离术所制定的调查问卷。在血细胞分离过程中回流侧使用18GB浅静脉留置针,采集侧使用16GB钢针。操作前做好解释工作,说明目的、操作步骤,使患者能够配合。

1.2.2 穿刺静脉及穿刺工具的选择

选择粗、直、血流量丰富、有弹性、无静脉窦且远离关节、活动方便、易于固定的血管,使用威海洁瑞公司生产的Y型静脉留置针18GB。

选择恰当的穿刺点,在其上方5~10 cm处捆扎止血带,检查留置针,严格无菌操作,消毒范围直径要大于8 cm,取出静脉留置针,去除针管,放松外套管,转动针芯,使针尖斜面朝上,嘱患者握拳,护士左手绷紧皮肤,右手持针与皮肤呈15°~30°刺入静脉血管,见到回血后,降低角度再将穿刺针推进0.2~0.5 cm,右手固定针芯,嘱患者松拳,轻巧地将针芯一次性抽出。留置针用无菌透明敷贴先固定针柄及穿刺部位,然后把敷贴均匀按压在皮肤上,保持无张力固定,中间没有空气,并注明穿刺日期。留置时间为3~4 d,一般不超过4d[3]。在血细胞分离术结束后,要进行封管,每6 h封管一次,封管是影响留置时间长短的关键,封管液常用生理盐水100 ml加肝素12500U配成1:50的肝素液[4]。本科室采用先冲管后封管的正压封管方法:取6~8 ml肝素液,均匀缓慢推入,当封管液推入到最后1 ml时,夹闭留置针延长管上的夹子,然后一边推注一边退针。对凝血功能障碍的患者可用生理盐水10 ml正压封管。留置针管腔内有回血现象时,应及时用封管液重新封管,忌强行挤压[5]。使用浅静脉留置针前应告知患者及家属浅静脉留置针应用的目的、意义,让其了解常见并发症及其预防措施,以及有关静脉留置针的护理常识,在留置期间保持穿刺部位清洁、干燥,不可淋浴;患者更衣或活动时,不要将导管带出或拔出,如贴膜污染、卷曲,穿刺部位疼痛、发热等,应及时通知医护人员;平时应将患者留置肢体抬高,促进静脉回流,避免留置部位受压和用力。对于不能配合的患者,医护人员在患者家属同意下行约束固定,以保证留置时间。

1.3评价标准为了解血细胞分离术患者使用Y型浅静脉留置针的可行性,在分离过程中以调查问卷内容为观察指标,将调查问卷的十项结果进行逐项对比分析,计算每项百分比,以血细胞分离机正常运转未发生报警及报警原因是否与浅静脉留置针有关为主要指标,探讨浅静脉留置针的可行性。

1.4统计学方法使用SPSS 11.0统计软件进行统计学处理,计数资料用百分率(%)表示,采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

实验组及对照组结果比较,见表2。观察组在接听电话、喝水饮食、床上小便、肢体活动及反复穿刺的方面明显优于对照组,Y型浅静脉留置针值得在血细胞分离过程中推广使用。

3讨论

血液成分的分离采集能否顺利进行,进出两条通道的流量大小是血细胞分离术的关键指标,流量大压力小,则机器停止采集。因此回流静脉管道是否顺利通畅直接影响到采集能否顺利进行。实验组60例患者中只有2例出现一过性回流侧血流不足报警,简单处理后恢复,未出现因为流量大压力小而机器停止采集。Y型浅静脉留置针在血细胞分离中使用有如下优势:

3.1减轻患者痛苦分离过程中使用的钢针均为16GB针长约4.5 cm,穿刺部位为双上肢贵要或正中静脉,分离一般需要5~6小时,单侧使用Y型浅静脉留置针可减轻患者痛苦。

3.2减少反复静脉穿刺血液科患者由于需要反复化疗造成大血管破坏,或者肥胖患者静脉达不到要求时,就要行腹股沟深静脉置管,使用浅静脉留置针对血管的要求没有钢针严格可以减少反复穿刺,避免因血管原因行股静脉置管术。

3.3可做适当活动浅静脉留置针由于是软管,在分离过程中可做适当活动。实验组86.7%患者在治疗中接听电话,而对照组只有3.3%,实验组93.3%患者在治疗中床上小便,对照组只有6.7%的患者在治疗中床上小便。实验组90.0%患者在治疗中喝水饮食对照组只有6.7%。

3.4穿刺部位选择性大钢针由于针头较粗对血管的选择很严格,一般选择肘窝静脉含有头静脉、肘正中静脉、贵要静脉,是可见的静脉里面最粗,易固定,最易穿刺的,但它位于肘关节处,不利于患者活动易致患者关节僵硬,浅静脉留置针可以选择一些较细的血管,如腕部、前臂,脚踝等处静脉,实验组60例患者在分离过程中均未出现回流压力过低而影响血细胞分离术的正常进行,研究证明使用Y型浅静脉留置针完全能够达到回流压力的要求。

3.5 便于使用药物和急救

在分离过程中需要随时补充钙剂,也有一些患者会出现过敏,抽搐等急症,需要立即给药,Y型浅静脉留置针由于是双头,可方便给药,为急救争取时间,便于抢救。而对照组的患者则需重新建立静脉输液通道,延误抢救时间。

研究证明Y型浅静脉置管操作简单,使用安全,具有保护血管避免反复穿刺的作用,既减少了患者由于反复穿刺而造成的痛苦,保护了静脉,又提高了护理工作效率。正确使用静脉留置针可减少反复多次穿刺给患者带来的痛苦,降低对浅表静脉的损伤,可减少输液意外感染的几率。静脉留置针可使患者在整个血细胞分离过程中感觉舒适,且能够保持静脉管道的通畅,便于抢救,且静脉留置针为一次性用品,对于血细胞分离后需输液的患者,既安全又可避免交叉感染的发生。Y型浅静脉留置针适合于在血细胞分离术中使用,值得推广运用。

参考文献

[1]刘长风,刘长秀,张丽英.外周造血干细胞采集的全程护理[J]中国实用护理杂志,2005,21(6):53.

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[4]丁庆华.浅静脉留置针留置时间的影响因素及预防对策[J].中外健康文摘,2010,04:42.

植物细胞核分离纯化的探讨 篇9

关键词：植物,细胞核,分离,纯化

植物细胞非对称融合、染色体杂交育种、大片段基因组文库构建、DNA纤维制备、细胞核中DNA、RNA、蛋白质含量的分析及染色质结构分析等, 需要分离纯化出较多个体完整, 分散较好的细胞核。学者们曾尝试用不同方法进行植物细胞核的分离, 比如大豆、玉米、水稻、烟草、小麦、棉花、长春花、杉木等细胞核的分离或纯化近来又有过报道[1,2,3,4,5,6,7], 但由于不同植物材料由于结构和组分的不同, 所以适合一种植物的细胞核制备方法并不适合于其它植物。本文就一些分离纯化植物细胞核的方法进行探讨。

对动物细胞核的分离纯化已经有了比较好的方案可查, 然而对植物细胞却不尽然。主要是由于植物细胞在结构与内含物等方面显著不同于动物细胞, 植物细胞除了具有细胞壁外, 还含有胞间连丝和次生代谢物, 这就给细胞核的制备增加了难度。分离纯化细胞核需要在材料选择、预处理、提取液选择、细胞的破碎方法及纯化方法上做综合考虑。

1 材料选择

制备植物细胞核一般可以选择愈伤组织、下胚轴、子叶、悬浮培养细胞和叶片等材料, 其中选择后者居多。然而, 愈伤组织和悬浮培养细胞有着自身的优越性。愈伤组织和悬浮培养细胞取材方便, 本身就是无菌材料更便于做融合、杂交试验。离体培养的植物细胞更易于进行同步化处理, 且黑暗下培养的细胞基本不含叶绿体, 这些都便于核的纯化。

2 预处理

处于不同细胞周期的细胞核的大小是不同的, 体积可相差几倍之多, 为了便于纯化、提高收率, 可先将用于制备细胞核的植物材料进行同步化处理。通常可采用低温 (用冰水混合物) 培养12h-48h的物理方法;也可采用使用羟基脲、8-羟基喹啉 (0.001M-0.004M) 或秋水仙素 (0.01%-0.5%) 的化学方法, 处理时间在4h-24h。对于离体培养材料, 还可以尽量缩短继代的周期使得细胞经常处于对数增殖期的办法使细胞核尽可能均匀一致。对于悬浮培养细胞还应在破碎细胞之前去除漂浮的已自溶的细胞碎片等杂质。

3 细胞破碎方法

主要有研磨法、刀切法、酸解法和酶解法。研磨法提取植物细胞核, 在研磨过程中酚类等物质易氧化, 不可避免的对提取细胞核产生影响, 细胞核提取质量不高。研磨时间长短和力度大小难以掌握, 致使很多细胞核被破坏, 产率较低。刀切法, 一种是用剪刀将叶片快速剪碎, 另一种是用锋利刀片在放置于冰上的培养皿中于将叶片切碎至尽量细小的匀浆状。刀切法的操作手法也不容易保持一致, 不适用于愈伤组织、悬浮细胞和根茎尖等材料。酸解法一般采用1M-3M盐酸解离细胞。酸解法效果不稳定。酶解法是利用纤维素酶、果胶酶和/或半纤维素酶等处理细胞。酶浓度在0.5%-2%, 纤维素酶浓度高于果胶酶, 半纤维素酶有助于纯化过程, 不添加也可。使用蜗牛酶没有看到更好的结果。酶解时间为4h-24h。酶解法可以先得到原生质体, 再通过挤压低渗涨破质膜或添加表面活性剂溶膜而释放细胞核, 也可以不收集原生质体, 一步实现收获细胞核, 而且不必使用表面活性剂, 这时需要延长酶解时间 (12h左右) 并使材料处于震荡当中。利用酶解法制备植物细胞核收获量较大, 当然收获量的大小还与所用的提取液 (酶解液) 的其它成分密切相关。

4 提取液

可以使用缓冲盐或非缓冲盐。缓冲盐常被选用的包括Tris、MES、HEPES、MOPS和柠檬酸等, 浓度在0.015-0.2M, p H7.0-8.0居多, 也有使用p H2.0-3.0的。提取液中可选择添加的成分比较多, 比如Mg2+、K+、Na+、精胺、Triton X-100、Tween20、EDTA、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、甘油、PVP、β-巯基乙醇、DTT、PMSF、抗坏血酸等。这些成份能够稳定核染色质 (体) 、提供一定的离子强度、维持渗透压、促进细胞核释放, 移走细胞质, 分散叶绿体, 减少核粘连、防止细胞核被氧化、减轻酚类等次生物质的干扰, 提高细胞核质量。这些成份用量在0.1m M-0.6M, 其中糖类物质用量大。

5 分离纯化方法

过滤、差速离心和密度梯度离心是最常用的方法。细胞破碎以后通常需要过滤。过滤常利用不锈钢、尼龙网 (120目-400目) 和过滤棉等。差速离心需多次反复沉淀和再悬浮, 容易使核破裂。沉淀核的离心速度很低即可, 如果离心时间过长和速度过高, 虽然会提高核的产量, 但也会增加其他非核材料的沾染。密度梯度溶液多用蔗糖、甘露醇和Percoll。浓度高的蔗糖溶液是非常粘的, 而且这种溶液的粘度受蔗糖含量的增加影响大, 浓度高的蔗糖溶液浓度的小的改变对核的沉淀速度会产生很大的影响, 所以用蔗糖作梯度离心纯化细胞核需格外小心。甘露醇溶液用粘度没有蔗糖高, 但同密度情况下, 甘露醇溶液的渗透压要高于蔗糖溶液的, 这也是需要注意的, 以免核皱缩。Percoll是较好的介质, 只是价格偏高。低速离心 (500×g左右) , 细胞核集中30%、35%的蔗糖界面较多。

6 存在主要问题及解决措施

植物细胞核提取遇到的主要问题有杂质多、核与内质网等粘连成网、容易破裂。杂质主要来自细胞壁、膜碎片和细胞质成分。过滤可以去除一些杂质, 但严重降低核的收率, 一方面网筛的大小不好选择, 另一方面导致细胞核破裂, 特别是使用抽滤。图1告诉我们植物细胞核膜连着一些网状的细胞成分, 筛孔小了, 它过不去, 筛孔大了, 大的杂质就会多。如果将通过化学的方法将与膜连接的成分尽量去除, 发现核又非常容易破损, 即使是盖玻片轻轻的一压 (见图2) 。因此, 对于与核膜连接的成分, 既要去除, 又要不能伤及核膜。减轻核与其它细胞成分粘连方法, 可以考虑使用偏酸性的提取液、酶, 不建议使用表面活性剂。低速离心甚至静止片刻 (相当于1×g的离心) 是较好的初步去除杂质的方法, 精细去除杂质则需要进行梯度离心了。对于核容易破裂的问题, 可以考虑使用一些膜的保护试剂, 特别是在纯化的后期, 比如葡聚糖硫酸钾、葡聚糖、蔗聚糖、2- (N-吗啉) -乙烷磺酸、氯化钙、磷酸二氢钾等, 同时注意提取纯化过程中溶液酸碱度的稳定, 离心时尽量不使细胞核沉到离心管底部, 而用蔗糖等溶液托住更好。

总之, 植物细胞核的提取纯化目前还没有普遍适用的方法, 探索适用不同植物、不同材料的核提取纯化方法还是需要研究的工作。

A被盖玻片压破的细胞核 (箭头指处, 棒状影像是由盖玻片造成的) , B是未加盖玻片观察到的细胞核

参考文献

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血细胞分离 篇10

巨噬细胞(Macrophage)能吞噬感染异物并诱导T细胞活化,启动免疫应答[1],在机体损伤修复、抵抗病原入侵[2]等方面起重要作用,是机体先天免疫的重要部分[3]。巨噬细胞属于无颗粒白细胞的一种,是由单核细胞(Monocyte)分化而来的。单核细胞来源于骨髓,成熟后释放进入血液并随外周血循环进入组织,分化成为巨噬细胞发挥相应的功能[4]。研究者可以对人外周血进行分离,获取单核细胞后进行体外分化,分化得到的巨噬细胞可用于进行各种功能研究。

目前常用的获取人外周血单核细胞的方法是密度梯度离心法。基于Ficoll-Hypaque的单次密度梯度离心可以将红细胞,粒细胞,血小板以及单个核细胞逐层分开。其中,外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)主要包括淋巴细胞和单核细胞,进一步对PBMC离心清洗并用贴壁方法去除悬浮细胞后,可得到单核细胞[5]。但该方法对于液层吸取操作要求较高,获得的单核细胞中会存在较多淋巴细胞,粒细胞以及血小板的污染。通常的解决方法是用抗体标记结合免疫磁珠对PBMC中的单核细胞进行纯化富集。然而不论基于抗体阴选还是阳选的方法,都不可避免对单核细胞产生一定程度的免疫刺激或者机械损伤;分选操作过程较长,在实验过程中要对细胞进行反复洗涤离心等操作,也会造成目的细胞的遗失,对于少量的临床样品难以操作。另外也可以选择基于Percoll分层液的连续密度梯度离心分离法,可以直接将单核细胞与淋巴细胞、红细胞、粒细胞分层,但是操作繁琐,耗时较长,对试剂的消耗量也比较大。因此,寻找一种简便、快捷而又高效的单核细胞分离方式对于单核-巨噬细胞相关研究的开展至关重要。

单核细胞是体积最大的白细胞,其内容物的颗粒形状与淋巴细胞以及粒细胞等具有显著的差别。本文中尝试对外周血白细胞直接进行流式细胞分选,根据细胞组分的分群特征,直接获得其中的单核细胞,并通过单核细胞表面标志物CD14染色进行验证,该方法对于单核细胞的分选效率能达到85%以上,可以简单快捷的获得纯度较高的单核细胞用于实验。

1 材料与方法

1.1 实验材料和试剂

人外周血白细胞成分血来自军事医学科学院附属医院输血科。红细胞裂解液(10×,#420301)购自Biolegend公司。人CD14抗体(130—091—242)购自Miltenyi Biotec公司。流式细胞分离管购自BD公司。人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子GM-SCF购自R&D公司。RPMI1640 培养液(C11875),进口胎牛血清,购于 Invitrogen 公司。

1.2 红细胞裂解

人外周血白细胞成分血中仍含有大量红细胞,在流式分选前需要进行红细胞裂解处理。将白细胞成分血与稀释为1×的红细胞裂解液按照1∶10的比例混合,避光室温裂解15 min,300 g 离心10 min,PBS洗涤一次。细胞计数,将细胞用流式缓冲液重悬(1×107细胞用500 μL缓冲液重悬)。

流式缓冲液:高压灭菌的PBS,pH值为7.2,加入0.5%的牛血清白蛋白以及 2 mol EDTA。

1.3 流式抗体标记

取1×106细胞,即50 μL上述细胞悬液,加入1 μL CD14-PE抗体,避光冰上标记10 min,向离心管中加入1 mL流式缓冲液终止染色,迅速离心去除上清后将细胞重新用100 μL 流式缓冲液悬起,通过细胞滤网后进行流式细胞分析。其余经红细胞裂解处理的细胞按照细胞计数结果直接用流式缓冲液重悬,通过细胞滤网后放置于冰上,准备进行流式分选。

1.4 流式细胞仪分选

本室购置的流式细胞仪为BD FACS AriaTMII 。根据外周血各个成分细胞的分群,确定单核细胞在流式细胞仪中的大小以及颗粒度等特征,限定分选条件,获取单核细胞。同时对CD14-PE抗体标记的细胞进行流式分析,确定单核细胞分群中CD14阳性的细胞所占比率。

1.5 单核细胞体外培养分化

上述分选得到的单核细胞经300 g离心后用含有10%进口胎牛血清以及双抗的RPMI—1640培养基重悬,种于细胞培养皿中,加入10 ng/mL GM-CSF 共培养(5~7)d,镜下观察分选得到的单核细胞体外分化的巨噬细胞形态。

2 实验结果

2.1人外周血流流式细胞检测分群以及CD14抗体预染分析

外周血白细胞成分血经过红细胞裂解处理并进行CD14抗体预染,流式细胞仪分析,结果见图1,左图为样品直接流式分群结果,其中左上角为粒细胞群,中间圈定细胞群(P1)为单核细胞,占白细胞总数的8%左右;居中偏下的为淋巴细胞群。右图为CD14抗体阳性细胞(P2),该阳性细胞群占左图中单核细胞分群(P1)的85%~90%左右。结果证明,根据目的细胞群的大小以及颗粒度的差异通过流式细胞分群方式可以分离并获取单核细胞。

2.2流式细胞仪直接分选得到的单核细胞CD14抗体标记分析

将其余的外周血白细胞成分血根据细胞分群直接选择单核细胞群进行分选。将分选得到的单核细胞进行CD14抗体标记后,再次进行流式分析。结果如图2,左图为分选后细胞经流式细胞仪直接分析,R1即分选得到单核细胞;右图显示该群单核细胞分选后CD14抗体标记的结果, CD14阳性的细胞占分选获得所有细胞的比例为85%左右。如在后期实验中进一步优化条件,预期可以获得纯度更高的单核细胞。

2.3流式细胞仪分选得到的单核细胞体外培养分化

上述流式分选得到的单核细胞经过体外分化培养7 d,镜下观察细胞形态与文献报道一致[6]。证明基于流式细胞分选得到的人外周血单核细胞分化正常,可以用于对巨噬细胞进一步的功能研究。

3 讨论

单核巨噬细胞的相关研究是当前免疫学研究的热点,2011年底,免疫学国际顶级期刊《Nature.Reviews Immunology》对近年来单核巨噬细胞的的相关研究进行专刊评述,对巨噬细胞的极化过程[7],巨噬细胞与感染和免疫[8]、巨噬细胞与机体保护和致病[9]以及巨噬细胞与重要疾病[10]的关系等列为免疫学的前沿领域的热点问题进行了全面的总结和述评。

传统方法对于单核细胞的分离过程需要反复离心清洗,会造成大量细胞在操作过程中的遗失,而且操作时需要对抗凝血作适当稀释,在血量较多时要分成数管进行离心,对于分离试剂的需求较大。如需获取纯度较高的单核细胞进行实验操作,则需要进一步利用抗体以及磁珠等技术方法加以纯化,增加了实验成本,而且获得的单核细胞容易被激活而给实验结果带来影响。

基于流式细胞仪的功能,根据细胞的大小以及颗粒度等特征,对白细胞直接进行分选获取人外周血中的单核细胞的方法,避免了多次重复离心,节省了梯度离心的试剂。经重复验证,本方法能够分选得到纯度在80%~90%之间的单核细胞用于实验。该方法可以用于在少量临床血液样本中获取高纯度的单核细胞,为深入研究单核-巨噬细胞与疾病之间关系提供了良好的技术平台。

参考文献

[1] Gordon S,Taylor P R.Monocyte and macrophage heterogeneity.NatRev Immunol,2005;5:953—964

[2] Mantovani A,Sozzani S,Locati M,et al..Macrophage polarization:tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mono-nuclear phagocytes.Trends Immunol,2002;23:549—555

[3] Gordon S.Alternative activation of macrophages.Nat Rev Immunol,2003;3:23—35

[4] Van Furth R,Cohn Z A.The origin and kinetics of mononuclearphagocytes.J Exp Med,1968;128:415—435

[5] Berthold F.Isolation of human monocytes by ficoll density gradientcentrifugation.Annals of Hematology,2004;43:367—371

[6] Li T,Morgan M J,Choksi S,et al.MicroRNAs modulate the nonca-nonical transcription factor NF-kappaB pathway by regulating expres-sion of the kinase IKKalpha during macrophage differentiation.NatImmunol,2010;11(9):799—805

[7] Lawrence T,Natoli G.Transcriptional regulation of macrophage po-larization:enabling diversity with identity.Nature Reviews Immunol-ogy,2011;11:750—761

[8] Shi C,Pamer E G.Monocyte recruitment during infection and inflam-mation.Nature Reviews Immunology,2011;11:762—774

[9] Murray P J,Wynn T A.Protective and pathogenic functions of macro-phage subsets.Nature Reviews Immunology2,011;11:723—737

血细胞分离 篇11

有资料显示, 对于反刍动物瘤胃上皮细胞的培养技术早在1980年就有记录, P.Gálfi等[2]采取胰蛋白酶消化法对牛瘤胃上皮细胞进行分离, 并成功培养了牛的瘤胃上皮细胞。此后, 研究者们在此基础上对反刍动物瘤胃上皮细胞的培养技术进行了多次改进, 但大多局限于牛和绵羊[3], 其他反刍动物瘤胃上皮细胞体外培养的技术鲜有报道, 而对驯鹿瘤胃上皮细胞体外培养的技术未见报道。

本研究以内蒙古呼伦贝尔市敖鲁古雅乡的中国驯鹿为研究对象, 结合牛、羊瘤胃上皮细胞的培养技术对驯鹿的瘤胃上皮细胞进行原代分离及体外培养, 以期为相关的体外研究提供一定的技术支持。

1 材料

1.1 试验动物

驯鹿, 内蒙古自治区呼伦贝尔市某猎民点淘汰的驯鹿。

1.2 主要试剂

细胞培养试剂:M199培养基和胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂 (insulin-transferrin-selenium-X) (ITS) , 购自Gibco公司;胰蛋白酶 (trypsin) 、L-谷氨酰胺、Na HCO3, 购自Sigma公司;胎牛血清 (FBS) , Hyclone公司生产;两性霉素B, 购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

细胞培养用液:磷酸盐缓冲液 (PBS) , M199培养基添加了15%的FBS、2 mmol/L L-谷氨酰胺、2μg/m L ITS、200 IU/m L青霉素及200μg/m L链霉素等。

细胞鉴定试剂:细胞角蛋白一抗 (醛缩酶A, CK19) , 购自Sigma公司;即用型快捷免疫组化MaxVisionTM试剂盒和苏木素体细胞快速染色液, 由福州迈新生物技术有限公司提供。

其余试剂为实验室常规试剂。

2 方法

2.1 驯鹿瘤胃上皮细胞的分离

将取来的瘤胃组织用4℃灭菌生理盐水冲洗去食糜及污染物后, 浸入4℃灭菌PBS溶液 (含500μg/m L青霉素, 250μg/m L链霉素, 0.5μg/m L两性霉素B, 100μg/m L庆大霉素) 中, 带回实验室;钝性分离瘤胃组织的黏膜上皮层和固有层, 并取2~4 cm2的上皮层以上述PBS溶液反复清洗3次, 再用不含抗生素的灭菌PBS溶液浸泡10 min;置入约15 m L 0.25%Trypsin-0.02%EDTA消化液中于37℃水浴中连续振荡消化, 每30 min取其消化液过滤并于显微镜下观察, 同时更换新的消化液, 直至消化液中出现非上皮细胞。将主要包含上皮细胞的消化液用200目的不锈钢细胞滤网过滤收集并用15 m L含有10%血清的培养液终止消化。将混合液转移至离心管, 吹打混匀后1 500 r/min离心10 min;弃去上清液, 加入PBS缓冲溶液后, 充分吹打混匀, 1 500 r/min离心10 min;如此反复洗涤2次, 第2次弃去上清液后, 加入10 m L完全培养液, 充分吹打混匀后, 调整细胞密度至1×105/m L, 并转移至细胞培养瓶中, 于37℃、5%CO2的培养箱中静置培养, 24 h后观察有无染菌, 在显微镜下观察其生长状况。

2.2 驯鹿瘤胃上皮细胞的传代培养

培养基采用M199加15%的FBS, 将细胞分装于25 cm2培养瓶中, 置于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养48~72 h后, 更换培养液, 弃去未贴壁的细胞, 根据细胞生长情况, 每3~4 d全量换液1次。待细胞达到80%~90%融合时, 用0.25%Trypsin-0.02%EDTA消化液消化3~4 min, 显微镜下观察, 如细胞隆起, 胞质回缩变圆、变亮, 加入含有血清的培养液终止消化, 并用移液枪轻轻吹打使之悬浮, 再转移至离心管中离心、洗涤 (方法同原代培养) , 最后转移至细胞培养瓶中, 继续于37℃、5%CO2的培养箱中静置培养。

2.3 驯鹿瘤胃上皮细胞的形态学观察及免疫细胞化学鉴定

在显微镜下对细胞的形态和生长情况进行观察。

根据上皮细胞的标志性中间丝蛋白为细胞角蛋白, 对驯鹿瘤胃上皮细胞的角蛋白进行免疫细胞化学的鉴定。取对数生长的瘤胃上皮细胞用37℃的0.25%Trypsin-0.02%EDTA消化液消化下来, 在6孔细胞培养板中进行常规的盖玻片爬片培养 (3 d) ;取出爬片, 用4%多聚甲醛固定15 min;PBS洗涤3次, 加0.5%Triton作用20 min;PBS洗涤3次, 加3%H2O2孵育15 min;PBS洗涤3次, 加封闭血清孵育20 min;加入一抗, 37℃孵育60 min;PBS冲洗3次, 加入通用型二抗工作液37℃孵育30 min;PBS洗涤3次;DAB显色;自来水冲洗;苏木素核复染, 自来水冲洗;显微镜下观察照像。空白对照用PBS代替一抗。

3 结果

3.1 驯鹿瘤胃上皮细胞的分离结果

瘤胃上皮细胞经0.25%Trypsin-0.02%EDTA消化液消化第4次起在显微镜下可观察到大量上皮细胞分散存在, 直到消化至第6次, 细胞数量开始减少, 且组织变得黏腻。收集后于显微镜下观察, 可见细胞数量多, 单个散在, 大小均一, 具有较好的折光度 (见228页彩图1A) 。调整细胞密度进行培养, 培养的细胞在72 h后有大部分贴壁, 细胞颜色发暗, 呈多角形, 并已开始生长, 呈岛屿状分布;也有未贴壁悬浮的细胞, 细胞折光度好, 体积较小, 形态较圆 (见228页彩图1B) 。96 h后生长迅速, 细胞增殖明显, 可见典型的铺路石状生长, 进入对数生长期 (见228页彩图1C) 。随后的7~9 d, 细胞生长融合成片, 呈单层状生长 (见228页彩图1D) 。

3.2 驯鹿瘤胃上皮细胞的传代培养结果

传1代后的细胞可在12 h内贴壁, 并迅速进入对数期生长增殖, 细胞形态完整, 生长良好 (见228页彩图2A) , 可在3~4 d铺满细胞瓶。传2代后细胞增殖迅速, 但细胞形态发生变化, 大小极不均一, 部分细胞胞体宽大、扁平, 胞浆内出现空泡和黑色颗粒 (见228页彩图2B) , 后期细胞增殖减慢, 甚至生长停滞, 逐渐死亡, 从瓶壁脱落。

3.3 驯鹿瘤胃上皮细胞的形态学及免疫细胞化学鉴定结果

细胞经分离培养48 h后, 可见细胞单个或数个贴壁, 呈扁平多角形, 胞浆丰富, 轮廓清晰。进入对数期后, 细胞呈小岛屿状生长, 各细胞岛屿间可见有细胞连接。7~9 d时, 各细胞岛屿连接成片, 呈铺路石样生长, 是典型的上皮形态 (见228页彩图3A) 。经免疫细胞化学方法的鉴定, 可见细胞胞浆为黄褐色, 即角蛋白CK19染色呈阳性 (见228页彩图3B) , 可判断所培养细胞为上皮细胞。

4 讨论

近年来, 我国驯鹿的数量一直徘徊在千只左右, 内蒙古大兴安岭北部敖鲁古雅民族自治乡的驯鹿是我国唯一的驯鹿种群, 均为鄂温克族所豢养, 呈半野生状态。虽然我国于2003年实行了生态移民, 但移民后的2个月间 (7—9月份) 有200多头驯鹿因消化不良引起疾病死亡, 驯鹿种群数量由搬迁前的800多只下降至不足600只[4]。无奈大部分鄂温克族人又牵着驯鹿返回原始森林过着游牧生活, 不定期地迁居, 是中国最后的狩猎部落。因此, 加强驯鹿圈养的相关科学研究, 不仅能恢复驯鹿种群的数量, 也是结束“中国最后狩猎部落”的有效办法。

P.Gálfi等[2]首次培养牛的瘤胃上皮细胞时采用剪切瘤胃乳头的方法进行分离及培养, 成功建立了牛的瘤胃上皮细胞的体外培养方法;同样类似的方法于第2年成功地培养了绵羊瘤胃上皮细胞[5];F.Stumpff等[6]在前人的培养技术基础上改进了取材方法, 设计并制作了一种模具, 使胰蛋白酶只作用于乳头来分离上皮细胞;沈赞明等[7]在培养奶公牛瘤胃上皮细胞时, 钝性分离瘤胃黏膜上皮与固有层以获得较为纯净的上皮细胞。本试验在总结前人试验的基础上, 采用钝性分离瘤胃黏膜得到上皮层的方法, 对上皮组织整体进行胰蛋白酶消化, 经试验鉴定获得了可扩增培养的瘤胃上皮细胞。本试验方法简便易行, 具有较强的可操作性。

有研究表明, 胃肠道上皮细胞的原代培养已在实践中大量应用。有人指出, 人的胃黏膜上皮细胞是以胶原酶和透明质酸酶对胃黏膜进行处理得到的[8];猪小肠黏膜上皮细胞采用组织块贴壁法能获得活性好的黏膜上皮细胞[9];而周传丽等[10]报道, 利用Ⅺ型胶原酶和Ⅰ型中性蛋白酶的混合液灌注仔猪小肠能消化分离小肠黏膜上皮组织得到形态完整、容易贴壁生长的小肠绒毛细胞团。本试验采用0.25%的胰蛋白酶-0.02%EDTA对驯鹿瘤胃黏膜上皮进行处理, 结果表明, 可以获得大量活性较好的上皮细胞, 易于培养。

反刍动物的瘤胃壁由黏膜、黏膜下层、肌层和浆膜4层构成。瘤胃黏膜表面被覆复层扁平上皮, 其由外至内分为角质层、颗粒层、棘细胞层和基底层[11], 其中角质细胞没有细胞活性, 而基细胞具有很强的分裂增殖能力, 其次为颗粒细胞[2]。分离瘤胃上皮细胞时选择胰酶多次连续振荡消化可获得大量上皮细胞, 但在细胞的游离状态下不能确切区分每一层的细胞。本试验中发现, 角质细胞不贴壁, 不生长, 不影响其他细胞的贴壁和生长, 在换液时会随细胞培养液被弃掉。由本试验结果可以推测, 尽管细胞贴壁生长但由于处于非生理的条件下, 在显微镜下观察均呈典型的上皮样生长, 不体现颗粒细胞、棘细胞或是基细胞的形态特性。

角蛋白存在于上皮细胞胞浆中构成上皮细胞内细胞骨架, 是上皮细胞中特异性的抗原, 具有多种表型。有人对仔猪小肠黏膜上皮细胞[9]和肾小管上皮细胞[12]的CK18进行了鉴定;多曙光等[13]对牛乳腺上皮细胞中的CK5和CK8进行了鉴定;李海甲[14]培养的兔气管黏膜细胞是采用广谱抗角蛋白单克隆抗体进行免疫组织化学染色。本试验在形态鉴定的基础上, 对所培养细胞中的角蛋白CK19进行了免疫细胞化学的染色, 呈阳性反应。

尽管对于瘤胃细胞的原代培养有大量文献佐证, 但未见有关其传代培养的报道。本试验经多次反复尝试与改进, 成功地进行了驯鹿瘤胃上皮细胞的传1代体外培养, 但对于驯鹿瘤胃上皮细胞能否连续传代培养, 是否受培养条件局限, 仍需进一步验证。

J.J.Gildea等[15]分别用传统的方法和三维细胞培养技术培养了人的肾上皮细胞, 结果表明, 用三维细胞培养技术获得的细胞在基因表达、基质分泌及细胞功能活动等方面与传统细胞培养技术获得的细胞有差异, 而与体内细胞的生长情况更为相似, 而且三维细胞培养既能保留体内细胞微环境的物质结构基础, 又能体现细胞培养的直观性及条件可控制性, 所得到的研究结果也更为可靠。由此启示人们, 今后可以从这一方面加以突破。

中国驯鹿瘤胃上皮细胞体外分离培养方法的初步建立为体外研究中国驯鹿瘤胃上皮细胞的生理功能奠定了试验基础。