T细胞分离方法研究

T细胞分离方法研究（精选10篇）

T细胞分离方法研究 篇1

铷作为典型的分散元素，没有单独的工业矿床，常与锂、钾、铯等碱金属矿物共伴生，以固体形式主要存在于锂云母、铯镏石、锂铯云母、天河石等，液体形式存在于地热水、盐湖卤水及海水中[1,2]。提取铷的最终过程均在液相中进行，由于与碱金属元素钾、钠、锂共存共生且性质相似，给铷分离和提纯带来较大困难[3]。目前，溶剂萃取法由于其处理量大、反应速度快等优点在铷的分离提取中受到广泛研究[4,5]。常用萃取剂有冠醚、酚醇类试剂、二苦胺及其衍生物等[6,7]。酚醇类试剂中应用最多的是4-叔丁基-2-(α-甲苄基)酚(tBAMBP)，具有稳定性好、不易挥发、选择性强、易于反萃、毒性小等优点，而被广泛应用于铷、铯、钾的分离研究[8,9,10]。本文采用t-BAMBP作为萃取剂，对某天河石浸出后除钙净化液中铷、钾进行了分离研究。

1 实验

1.1 原料、试剂和仪器

原料:某天河石浸出液除钙后净化液，其主要化学组成见表1。

试剂:4-叔丁基2(α-甲苄基)酚(t-BAMBP，磺化煤油，D80溶剂油，二甲苯，环己烷，氢氧化钠。

仪器:HY-5型调速回旋振荡器，梨形分液漏斗。

1.2 实验方法

以氢氧化钠调节碱度的料液与萃取剂按照一定的相比置于分液漏斗中，在室温下振荡反应一定时间后静置，待两相分层清晰后取水相进行分析，测定萃余液中铷、钾的含量，负载有机相中的铷、钾含量采用差减法计算，进而计算铷、钾的萃取率及分离系数以铷、钾的萃取率和分离系数确定最优工艺条件。

2 试验结果与讨论

2.1 稀释剂种类的影响

在t-BAMBP萃取反应中，稀释剂在萃取过程中可以增加萃取剂的流动性，对萃取分离效果有重要影响。实验选择以D80溶剂油、二甲苯、环己烷和磺化煤油四种溶剂作为稀释进行试验，选择萃取条件为t-BAMBP浓度1.0 mol/L，料液的碱度1.0 mol/L，萃取相比O/A=3，萃取时间5 min，考察比较稀释剂对铷、钾的萃取率和分离系数的影响，试验结果见表2。

注:C(t-BAMBP)浓度1.0 mol/L，料液碱度1.0 mol/L，相比O/A=3，萃取时间5 min。

由表2可以看出，所选择的不同稀释剂与t-BAMBP组成的的萃取体系中，铷的单级萃取率ERb均在85%以上，分离系数βRb/K均大于12，因此上述所选稀释剂单从萃取率和分离系数均适合-BAMBP萃取体系。但是由于烷烃类、溶剂油类稀释剂，在后续水洗阶段会出现乳化现象，综合考虑，最终选择磺化煤油作为稀释剂。

2.2 萃取时间的影响

选择t-BAMBP和磺化煤油的萃取体系，萃取条件选取t-BAMBP浓度为1.0 mol·L-1，料液碱度1.0 mol·L-1，萃取相比O/A=3，改变萃取时间，考察萃取时间对铷、钾的萃取率和分离系数的影响，其结果如图1所示。

由图1中可以看出，在t-BAMBP和磺化煤油萃取体系中，随着萃取时间的延长，铷和钾的萃取率基本保持不变，铷和钾的分离系数没有明显升高，萃取时间对铷、钾萃取率以及分离系数影响不大，延长萃取时间并不能提升萃取率和分离系数，表明铷钾的萃取过程在短时间内即可以达到平衡。为了保证萃取效果，综合考虑，选择萃取时间为5 min。

2.3 萃取剂t-BAMBP浓度的影响

在t-BAMBP和磺化煤油的萃取体系中，萃取条件选取料液碱度为=1.0 mo·L-1，萃取相比O/A=3，萃取时间5 min，改变萃取剂t-BAMBP的浓度，试验考察其对铷、钾的萃取率和分离系数的影响，试验结果如图2所示。

由图2可以看出，在t-BAMBP和磺化煤油的萃取体系中，随着萃取剂浓度的增加，铷和钾的萃取率均增大，分离系数βRb/K缓慢降低。当萃取剂浓度大于1.0 mol·L-1时，铷和钾的萃取率均又趋于平缓，继续增大萃取剂的浓度，铷的萃取率提高缓慢，而钾的萃取率呈现出显著的提高，不利于铷和钾萃取分离，综合考虑，选择萃取剂浓度为1 mol/L。

2.4 料液碱度的影响

在t-BAMBP和磺化煤油的萃取体系中，选取萃取条件t-BAMBP浓度为1.0 mo·L-1，萃取相比O/A=3，萃取时间5 min，采用氢氧化钠调节料液的碱度，考察料液碱度对铷、钾的萃取率和分离系数的影响，试验结果如图3所示。

由图3可以看出，在t-BAMBP和磺化煤油的萃取体系中，随着萃取料液碱度的增大，钾和铷的萃取率均呈现出明显的增加，当料液碱度达到0.4 mol/L时，铷、钾的萃取率趋于平缓，表明萃取基本达到平衡，继续增大碱度对萃取率的影响不明显。随着料液碱度的增加，铷和钾的分离系数先增加后降低，之后达到平衡，综合考虑，选择料液碱度为0.4 mol/L。

2.5 萃取相比的影响

在t-BAMBP和磺化煤油的萃取体系中，选择萃取条件为萃取剂t-BAMBP浓度1.0 mol·L-1，料液碱度c(OH-)=0.40 mo·L-1，萃取时间为5 min，改变萃取相比(O/A)，考察萃取相比对铯、铷萃取率和分离系数的影响，试验结果如图4所示。

由图4可以看出，在t-BAMBP和磺化煤油的萃取体系中，钾和铷的萃取率随着萃取相比的增大均呈现逐渐同步增大的趋势，铷和钾的分离系数随着萃取相比的增大先增大后趋于平缓，当相比O/A=2时，铷的萃取率可达到84.0%以上，而此时钾的萃取率比较低，有助于铷和钾的分离。因此，综合考虑，选择萃取相比为O/A=2。

3 结论

采用t-BAMBP为萃取剂，磺化煤油为稀释剂，对母液中的铷、钾进行了萃取分离的研究，确定了适宜的萃取工艺条件，对同类型含铷天河石矿浸出液中的铷、钾分离提供了技术参考。

参考文献

[1]曹冬梅,张雨山,高春娟,等.提铷技术研究进展[J].盐业与化工,2011,40(1):44-47.

[2]王威,曹耀华,高照国,等.铷铯分离提取技术研究进展[J].矿产保护与利用,2013(4):54-58.

[3]张利珍,谭秀民,张秀峰,等.提锂母液萃取分离铷铯研究[J].无机盐工业,2015,47(9):62-64.

[4]杨少华,赖晓晖,王君,等.t-BAMBP萃取分离高钾钠卤水中的铷工艺研究[J].有色金属科学与工程,2015,6(5):17-21.

[5]李瑞琴,刘成林.t-BAMBP萃取法提取卤水中铷、铯及影响因素分析[J].盐业与化工,2014,43(1):17-19.

[6]闫明,钟辉,张艳.卤水中分离提取铷、铯的研究进展[J].盐湖研究,2006,14(3):67-71

[7]蒋育澄,岳涛,高世扬,等.重稀碱金属铷和铯的分离分析方法进展[J].稀有金属,2002,26(4):299-303.

[8]杨玲,王林生,赖华生,等.不同稀释剂中t-BAMBP萃取铷铯的研究[J].稀有金属,2011,35(4):627-632.

[9]杨锦瑜,张倩,刘雪颖,等.从负载低浓度铷的t-BAMBP有机相中反萃铷[J].稀有金属,2007,31(2):228-231.

[10]安莲英,宋晋,卢智,等.t-BAMBP萃取分离高钾卤水中的铷[J].化工矿物与加工,2010(10):14-17.

T细胞分离方法研究 篇2

体外分离培养小鼠胃Cajal间质细胞的实验方法研究

目的 对KM小鼠胃Cajal间质细胞进行体外分离、培养,并对其进行鉴定,摸索高效实用的方法,为进一步探索研究Cajal间质细胞的移植、替代治疗及药物实验提供基础.方法 以KM株小鼠胃为组织来源,体外分离、培养ICC,并进行细胞传代,光镜下观察其形态,用荧光标记C-Kit特异性抗体标记细胞,进行免疫组化鉴定.结果 细胞稳定贴壁后,形成梭形或三角形突起,3 d后可出现长突起,并可逐渐形成网络连接.结论 酶解法分离细胞成功,但纯度低,数量不足;体外培养ICC 24 h后逐渐稳定贴壁,3 d以后可形成网络连接,可稳定培养3周以上;传代后细胞正常形态逐渐发生变化,20 d后可逐渐凋亡.

作 者：柳利明 农晰婷 秦榕 路明亮 黄华 作者单位：昆明医学院第二附属医院消化内科,云南,昆明,650101刊 名：昆明医学院学报 ISTIC英文刊名：JOURNAL OF KUNMING MEDICAL UNIVERSITY年，卷(期)：31(3)分类号：Q813.1+1关键词：小鼠 胃 Cajal间质细胞

T细胞分离方法研究 篇3

材料与方法

脐带血的采集：无菌条件下，将新生儿已经结扎的脐带进行脐静脉穿刺，取脐带血。

冷冻保护剂：取DMSO缓慢加入1640液中摇匀，配成含20%DMSO的1640保护液。

细胞分离液：①6%右旋糖酐：分子量20～30万。②泛影葡胺聚蔗糖淋巴细胞分离液：比重1.007。

分离：Ⅰ：离心法。Ⅱ：沉降法。Ⅲ：淋巴细胞分离液法。

冻存：样品用程控降温仪降温。降温速率为从4℃到-30℃每分钟1℃，从-30℃到-80℃每分钟3℃。液氮气箱中平衡2小时，放入液氮液箱保存。

复温：40℃水浴快速复温。

检测：单个核细胞计数，台盼兰拒染率，GM-CFUC培养。以上检测均用常规方法。

结 果

3种分离方法分离的脐带血造血干细胞冻前的台盼兰拒据染率及冻存后的核细胞分离液法的有核细胞回收率分别是：90.4±3.8%（Ⅰ），90.6±3.3%（Ⅱ），85.4±3.4%（Ⅲ）。检验表明，Ⅲ组的有核细胞回收率低于Ⅰ组（P<0.05）和Ⅱ组（P＜0.05）。冻存前台盼兰拒染率分别是：Ⅰ组98.2±0.8%、Ⅱ组97.9±0.8%、Ⅲ组98.2±0.9%，3组比较亦无显著差别。

GM-CFU-C回收率分别是：Ⅰ组80.5%，Ⅱ组81.6%，Ⅲ组61.2%。Ⅲ组的GM-CFU-C回收率低于Ⅰ组和Ⅱ组（P＜0.05）。

讨 论

T细胞分离方法研究 篇4

关键词：脐血造血细胞,HES法,Ficoll法,明胶法,效率

脐血造血细胞分离是脐血移植过程中的重要环节, 也是脐血库建立的关键性步骤, 对血液病患者的疾病治疗有着重要的作用。目前, 最常见的脐血造血细胞分离方法为HES法、Ficoll法、明胶法, 其中HES法的分离效率较高, 其体积浓缩效果较好。本研究将133例脐血标本分为3组, 3组分别应用HES法、Ficoll法及明胶法, 比较3组的分离效果, 现报道如下。

1材料与方法

1.1材料

本研究共133例脐血标本, 均由我市某医院妇产科提供, 脐血标本采集量50.2-140.5ml, 平均81.7ml。标本采集后保存于4℃的温度条件下, 保存时间控制在24h之内。依据随机方法, 将133例脐血标本分为3组, A组45例, B组44例, C组44例。

1.2方法

1.2.1 HES法

A组45例标本选择HES法, 即在整份脐血中加入25%的羟乙基淀粉60g/L, 混合均匀后进行500r/min离心处理, 时间控制在5min, 之后去掉红细胞, 再进行1200r/min离心处理, 时间控制在13min, 将部分血浆去掉, 确保体积浓缩至25ml左右, 最后将白细胞重悬在剩余的血浆中。

1.2.2 Ficoll法

B组44例标本选择Ficoll法, 即选择Ficoll 10ml, 相对密度为1.077, 将其置于离心管 (50ml) 中。每例标本取10ml脐血, 并置于液面上, 之后进行1800r/min离心处理, 时间控制在10min, 选择白细胞层重悬在RPMI 1640培养液10ml中。

1.2.3明胶法

C组44例标本选择明胶法, 即从44例标本中顺利取出20ml, 并放置于离心管 (50ml) 与30g/L明胶 (20ml) 中, 混合均匀后, 进行30min沉降处理, 之后将上清液置于另一个离心管 (50ml) 中, 添加50% 30g/L明胶, 进行30min沉淀处理, 保留上清液。

1.2.4 CD34+细胞检测

抗体主要选择美国Pharmigen公司生产的抗人CD34抗体, 同时选择美国Becton Dick-inshon公司生产的流式细胞仪进行检测。将抗体20μl置入脐血100μl中, 混合均匀后在4℃温度条件下进行30min孵育, 选择氯化铵裂解红细胞, 时间控制在30min, 之后进行两次PBS洗涤, 选择多聚甲醛进行固定后再实施检测, 同时开淋巴细胞窗。

1.2.5造血祖细胞体外培养

选择体外培养方法, 培养体系主要选择甲基纤维素半固体培养基, 其包括四个成分, 即白细胞介素-3 (10ng/ml) 、粒细胞集落刺激因子 (200ng/ml) 、干细胞因子 (50ng/ml) 、红细胞生成素 (1U/ml) 。选择2×105个有核细胞, 将其置于2ml培养体系中, 并在体积分数保持在5% CO2、温度保持在37℃基础上进行14d的培养, 之后分别计数BFU -E、CFU -GM以及CFU -Mix, 同时准确计算出三者之和, 即CFCs[1]。

1.3统计学方法

选择SPSS10.0软件进行统计分析, 计量资料用均数±标准差 (x±s) 表示, 选择ANOVA与Bonferroni两两比较方法进行分析, 当P<0.05时表示差异有统计学意义。

2结果

2.1 CD34+细胞产率

A组分离前CD34+细胞为 (8.81±1.90) ×107, 分离后CD34+细胞为 (8.67±1.67) ×107, 产率为 (98.15±5.68) %;B组分离前CD34+细胞为 (1.08±0.40) ×107, 分离后CD34+ 细胞为 (0.36±0.01) ×107, 产率为 (32.85±4.77) %;C组分离前CD34+细胞为 (2.17±0.69) ×107, 分离后CD34+细胞为 (2.08±10.36) ×107, 产率为 (81.46±5.93) %。A组CD34+细胞产率高于B组, C组CD34+细胞产率高于B组, A组CD34+细胞产率高于C组, 组间两两比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。

2.2 CFCs产率

A组分离前CFCs为 (2.41±0.31) ×106, 分离后CFCs为 (2.20±0.33) ×106, 产率为94.56%;B组分离前CFCs为 (3.07±0.40) ×105, 分离后CFCs为 (9.57±0.86) ×104, 产率为30.87%;C组分离前CFCs为 (5.88±0.81) ×105, 分离后CFCs为 (5.22±0.58) ×105, 产率为78.49%。A组CFCs产率高于B组, C组CFCs产率高于B组, A组CFCs产率高于C组, 组间两两比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。

3讨论

脐血是临床医学中重要的造血干细胞来源, 其可以替代骨髓实施造血干细胞移植, 在血液疾病治疗中发挥重要的作用。在脐血移植及脐血库建立中, 脐血干细胞分离技术起着积极性的作用, 科学、 有效的分离技术可以快速分离脐血中的有核细胞, 为脐血库的建立奠定基础[2]。

Ficoll法、明胶法、HES法是目前科研中广泛应用的脐血干细胞分离方法, 不同的分离方法, 其对造血细胞回收所产生的影响也有所不同, 分离效率也不尽相同。运用Ficoll法进行分离, CD34+细胞损失超过60%以上, 干细胞丢失严重, 且每次仅可分离出较少的脐血量, 在脐血库建立中存在一定的局限性。应用明胶法分离时, CD34+ 细胞损失率低于Ficoll法, CFCs损失率也比较低, 对脐血库建立非常有利, 但经明胶分离后, 终体积所占的比率比较大, 约为原体积的75%。HES法具有操作简单、用时少、分离效率高、体积浓缩效果好等多种优点, 其CD34+细胞损失率通常不超过5%, CFCs损失率通常不超过10%, 且其分离后终体积所占的比率比较小, 通常不超过原体积的25%。本研究将133例脐血标本分为3组, A组应用HES法, B组应用Ficoll法, C组应用明胶法, 结果显示, A组CD34+细胞产率及CFCs产率均高于B组、C组, 证实HES法分离脐血造血细胞的效率高于Ficoll法、明胶法。

综上所述, 在分离脐血造血细胞中, HES法分离效率较高, 其分离效果优于Ficoll法与明胶法, 有助于脐血库建立, 是分离脐血造血细胞首选的方法, 值得推广。

参考文献

[1]王颖超, 殷楚云, 冯磊, 等.三种不同方法分离脐血造血干细胞的效果比较[J].实用儿科临床杂志, 2012, 27 (10) :766-768+794.

T细胞分离方法研究 篇5

优化分离及培养骨髓间充质类成纤维样集落细胞的实验研究

[目的]探讨分离培养骨髓间充质类成纤维样集落细胞的最佳条件,并观察其生物学活性.[方法]采用优化分离方法,常规细胞培养、传代技术,光镜技术及细胞增殖活性检测法,观察不同浓度血清、不同接种密度对骨髓间充质类成纤维样集落细胞生长、增殖、形态及集落形成率的`影响,观察培养细胞的生物学特性并将该类细胞向成骨细胞诱导分化.[结果]以差速贴壁法,加入10%进口胎牛血清、接种密度为5×104个/ml的培养条件为最适宜细胞生长;在此条件下,具有快速增殖的能力及较高的集落形成率;光镜下细胞呈梭状或类成纤维状,2～8代的细胞呈均质状;诱导后的成骨细胞AKP检测成阳性.[结论]明确了骨髓间充质类成纤维样集落细胞培养所需的细胞接种密度,血清培养浓度,该类细胞具有干细胞特性,为进一步深入研究该类细胞的应用打下了基础.

作 者：张璇 林春博 杨渊 谢富荣  作者单位：张璇,杨渊,谢富荣(广西骨伤医院,广西,南宁,530012)

林春博(广西中医学院,广西,南宁,530001)

刊 名：广西中医学院学报 英文刊名：JOURNAL OF GUANGXI TRADITIONAL CHINESE MEDICAL UNIVERSITY 年，卷(期)： 12(4) 分类号：Q25 关键词：优化分离   优化培养   骨髓间充质类成纤维样集落细胞  

黄芪对T淋巴细胞影响的实验研究 篇6

关键词：黄芪,运动员,递增负荷,T淋巴细胞,免疫

随着大众健身意识的增强和人们对自身健康关注程度的提高, 机体免疫方面的研究在竞技体育和全民健身中的应用更加的广泛, 在免疫机能研究方面, 对于T淋巴细胞和B淋巴细胞群方面的研究更为突出, 研究成果也更为集中, 从运动训练过程中机体的免疫应答特征分析、机理研究、信号传导因子的分析等方面的研究都已经取得众多研究成果, 另外一方面, 关于各种中药药材和营养补剂对于机体免疫机能的影响及药材的免疫特性等方面的研究也开展的如火如荼。目前关于黄芪单剂在运动免疫学方面的理论与实践研究成果主要来源于大鼠实验, 并通过大鼠实验对T淋巴细胞群和B淋巴细胞群的影响机理都有比较深入的研究分析, 其中对于T淋巴细胞群的研究除了对免疫指标的变化有详细的描述之外, 在最新的国内外研究中还加入了内分泌指标, 通过内分泌指标和免疫指标的特征性变化及二者内在关联的理论基础更深入的探讨了黄芪作用于大鼠免疫机能的机制。对于黄芪单剂对于人体的实验研究报道并不多, 大多数研究报道主要涉及到黄芪多糖对人体“三态”的影响, 而黄芪单剂对于“三态”的的影响, 目前也主要集中在安静状态下, 对于定量负荷状态及最大负荷状态都未见有报道, 更谈不上递增负荷状态的相关研究报道及理论探讨。

本研究在总结前人研究成果的基础上, 从以下两方面充实现有研究成果:一方面是将黄芪单剂的免疫特征与递增负荷运动模型有机的结合起来, 并细化实验分组, 通过有效的分组排除相互干扰因素, 分析研究黄芪单剂在不同负荷阶段对于机体免疫机能影响的特征, 探讨黄芪干预与运动负荷干预两项因素对机体T淋巴细胞的影响, 丰富了现有的研究成果;另外一方面, 递增负荷运动模型是反映机体各项惰性指标连续性、适应性变化的常用模型, 而免疫学指标大多数都属于惰性指标, 所以此类实验模型对于机体免疫机能的研究具有非常重要的意义和价值。在人体干预实验中, 以往主要是中大强度的力竭运动研究较多, 本文选用的改良型递增负荷运动负荷实验模型尚未见有系统研究报道。基于上述两方面因素, 本文在前人研究成果的基础上, 通过有效的递增负荷运动实验模型及可靠的免疫学实验指标, 进一步研究和探讨机体运动与免疫的相互关联性, 并在此基础上, 分析研究黄芪单剂在运动员免疫机能方面的作用特征及作用机理, 就该领域的研究进一步充实和补充。

一、研究对象与研究内容

(一) 实验安排

18名女子篮球队员随机分为三组, 一组为实验参照组 (C1组) , 一组为负荷实验组 (H1组) ;一组为服药实验组 (M1) ;30名普通女大学生也随机分为三组, 一组为实验参照组 (C2组) , 一组为负荷实验组 (H2组) , 一组为服药实验组 (M2) ;运动员在实验前3周未有大强度的比赛, 实验前一周未进行密集型高强度运动训练, 所有受试对象身体状况良好。C1和C2组不进行递增负荷实验, 只参与日常的体育活动, 每天晨起 (6∶00~6∶30) 服用黄芪单剂;H1和H2组进行12周四级递增负荷, 同时每天晨起 (6∶00~6∶30) 服用普通饮料, 服用量为100~150ml。M1和M2组进行12周四级递增负荷 (跑台) , 同时每天晨起 (6∶00~6∶30) 服用黄芪单剂。采血时间定在实验开始前和负荷后次日清晨 (6∶00~6∶30) 。

(二) 实验负荷选择依据

查阅大多数文献资料, 我们发现对于递增负荷运动项目, 运动负荷根据运动员身体机能的不同及运动项目的差异性存在很大的差异性, 目前对于运动员递增负荷运动测试方案还没有固定不变的实验模型, 但是大多数递增负荷实验模型的设计与选择都通过预实验呼吸商或心率的监测来校正和选择实验模型, 本文选取的受试对象在通过前期实验测试之后发现上述运动方案对于运动员免疫机能影响最为直接有效且操作性便捷, 故采取上述实验方案。

(三) 单剂制作原理及制作方法

根据本实验设计的需要, 我们重点需要研究黄芪单剂对免疫机能的影响, 而黄芪药物样品根据现有研究报道其中的微量元素包括有Ca、Fe、Mg、Mn、Cu、Cr和Zn等7种之多, 对免疫机能产生积极影响且研究相对比较成熟的主要是Zn, 目前众多研究表明山西和吉林地区黄芪样品中Zn的含量差别比较小, 但明显高于山东等产地Zn含量, 再加上在制作加工过程中, 研究发现山西地产黄芪乙醇溶出率与水的溶出率差距比较小, 且总灰分相对较低[3], 所以本研究选用地产山西的黄芪, 因黄芪属于补气血常用中药材, 可以采取水煎服也可以采取泡水喝, 但目前大多数文献资料报道均采用水煎服服用方法, 故本实验采取15克水煎服, 具体制作方法如下:称取15克黄芪单剂, 加入300ml纯净水, 先用水泡10分钟, 然后先大火至煮沸, 关小火再煮30分钟左右, 之后滤出药液。

二、实验结果与分析讨论

黄芪属于补中益气的中药, 其最主要的作用是降低炎症反应及提高机体的免疫功能。综合上述四项指标, 我们可以看出, 运动训练与服用黄芪单剂 (包括单纯服用和服药+运动) 各项指标的变化基本上都在6周之后出现明显的差异性, 且变化趋势表现明显, 根据以往的研究成果, 普通女大学生的免疫机能变化与女子运动员的免疫机能变化应该存在较大差异性, 本研究与以往研究存在一定的差异性, 分析原因可能有以下几方面因素:首先是样本来源于西安工业大学, 从学校体育运动开展状况来看, 学校比较重视体育活动和体育文化生活, 这在一定程度上也使得大多数学生比较喜欢体育, 所以学生日常参加体育活动的积极性较高, 所以经常性体育锻炼对于免疫机能和身体运动能力的提升是比较明显的。其次, 本文所选用的女篮队员有正式队员, 也有培训队员, 再加上队员属于高校培养高水平运动队队员的模式, 所以队员身体免疫机能的差异性可能也对整体测试结果产生了一定的影响。最后是个体因素导致黄芪单剂的药效吸收可能也影响了实验结果。

三、结论

结合本实验研究结果, 我们发现:在递增负荷运动训练中, 6周持续性运动训练是机体免疫性抑制表达运动诱导的适宜性运动强度;连续服用6周黄芪单剂可以有效降低运动诱导免疫性抑制的作用和影响, 使运动员身体免疫机能得到较明显的改善。其机理一方面在于黄芪单剂直接作用于机体免疫机能发挥作用, 另外一方面在于黄芪单剂作用于机体内分泌系统而间接影响机体免疫机能。

参考文献

[1]王玉琴, 李骁君.周期性大强度运动训练对竞技健美操运动员细胞免疫机能的影响[J].北京体育大学学报, 2006.

T细胞分离方法研究 篇7

关键词：血细胞分离机,分离,成分血,优势

随着近些年临床对成分血需求的日益增长, 高效、安全地分离成分血就显得尤为重要。临床应用各种成分血, 对患者对症治疗, 同时节省了血液资源, 实现一袋血可以分出不同的血液成分, 输给更多的患者, 做到一血多用。血细胞分离机是分离、制备各类成分血的先进仪器, 使用血细胞分离机, 将比传统的手工制备方法大大提高制备成分血的速度, 保证血液成分的质量, 因此, 血细胞分离机分离血浆和红细胞的方法在未来几年将得到各大血站的普遍应用, 比传统分离法占有明显优势[1]。

1 血细胞分离机的特点

(1) 分离、称量、热合一系列过程自动操作。 (2) 减少人工误差。只要分离机设置好程序, 分离出的血浆可以调整容量的上限和下限, 防止血浆过多或过少, 添加保存液的量是根据保存液袋子的厚度调整的, 避免了保存液添加不完全的现象发生。 (3) 方便快捷。所有操作按部就班地进行, 操作起来既轻松又规范, 胜于手工操作手忙脚乱, 杂乱无章的场景。 (4) 已成流行趋势。血细胞分离机作为新生代分离血浆及红细胞悬液的先进仪器, 既符合提高血液质量的要求, 又紧跟时代进步的步伐, 智能、高效地制备各种血液成分, 也彰显着一个先进血站的实力水平。

2 操作方法

(1) 打开开关, 开启压缩机。 (2) 显示屏进入初始化模式, 仪器进行自检, 自检过程中工作人员要观察分离机是否运作正常, 自检结束, 所有数据显示正常方可使用。 (3) 选择要制备血液产品对应的程序。因为血细胞分离机可以制备滤白冷沉淀, 滤白新鲜冰冻血浆和悬浮红+冰浆等, 因此, 选对程序非常重要。如果制备成分程序选择错误, 将导致分离失败等各种严重后果, 严重影响血液质量。分离血浆和红细胞悬液要选择悬浮红+冰浆程序。 (4) 按照提示挂好血袋, 掰开母袋活塞, 连接各个导管, 确保每根导管都在卡钳里, 并且每根导管都通畅, 不打折。如果活塞没有完全掰开或导管打折或导管未完全卡在卡钳内, 机器不仅会报警, 有时还会出现热合不完全或漏血现象, 因此, 操作前检查非常重要。 (5) 按“开始”按钮, 扫描制备者条形码和血液条形码, 进行分离制备。逐袋扫描制备者献血码, 这样通过联网, 每袋血液制品的制备信息都可以轻松查到, 使制备者更加认真负责地工作, 为血液制备的各步骤监管提供了安全保障, 能更放心地为临床提供高质量的血液制品。 (6) 分离结束自动称量, 自动热合。避免手工操作转场称量, 热合, 符合血液制品轻拿轻放及冷链的原则。

3 注意事项

(1) 关机之后再切断电源, 保证其使用寿命。 (2) 进行分离操作过程中, 当挤压板移动时, 避免手指接触挤压板, 避免挤伤手指。 (3) 挂血袋时, 仪器光感区不要遮挡, 以免引起误操作。如果光感区被遮挡, 仪器就不能感应红细胞的位置, 就容易造成红细胞大量冲进血浆袋中, 发生制备错误。

(4) 操作过程中, 每一步程序未结束, 不要强行进行下一步操作。 (5) 对设备每两周进行一次称量校准。 (6) 每天清洁消毒, 擦干待用。 (7) 每年厂家工程师保养1次, 随时维护。

4 血细胞分离机制备滤白红细胞悬液与传统分离制备红细胞血液方法的比较

(1) 传统分浆夹分离法:将经过良好离心后的滤白全血轻轻放入分浆夹, 掰开阻塞, 慢慢靠分浆夹的压力将大部分血浆分离出来, 然后往红细胞主袋加入保存液的方法, 现在添加的保存液为ACDP, 使红细胞保存期限延长至35 d。 (2) 传统虹吸法:将经过良好离心后的滤白全血直接挂在低温操作台的挂钩上, 掰开阻塞, 用手轻轻挤压母袋, 使少量血浆先流入子袋, 然后利用虹吸原理把血浆与红细胞分离, 再往红细胞袋内添加保存液的方法。 (3) 血细胞分离机分离法:将经过良好离心的全血通过血细胞分离机的自动挤压板和多区域光学传感器将血浆和血细胞分离出来, 并自动添加保存液的方法。 (4) 经过1559袋全血进行分离制备红细胞悬液及血浆的实验发现:使用分离机分离速度更快, 准确率更高, 数据保存更完整, 不需要二次离心[2]。见表1。

使用分浆夹和虹吸法, 分离结束, 需要手工添加保存液, 手工排气, 热合, 称量, 摆放, 计算机扫入, 而血细胞分离机方法一步到位, 所有步骤连续完成, 简化了工作程序。从表1可以看出, 拿100袋血为例, 血细胞分离机耗时1 h 40 min, 而且血细胞分离机添加保养液准确率为100%, 因为血细胞分离机通过感应区感应红细胞, 确保血浆被分离出来后自动停止 (不会有红细胞混入血浆袋内) , 然后自动进入下一步, 自动添加保存液, 感应区须智能感应保存液袋子的厚度, 如果保存液添加不完全, 血细胞分离机自动报警, 页面提示检查, 保证保存液添加充分, 不会残留。排除血液自身原因与离心意外, 分离出的血浆无需再次离心, 如果离心效果不好, 需要二次离心的, 血细胞分离机还能够自动冲管, 确保二次离心效果。100袋血分浆夹耗时3 h, 添加保养液准确率为99.8%, 需要再次离心的袋数是2袋, 容易出现保养液添加不完全、卡子关闭不严、二次离心等;100袋血, 虹吸法耗时2 h 50 min, 准确率99.7%, 二次离心2.6袋。100袋血, 血细胞分离机耗时1 h 40 min, 添加保存液100%, 不需二次离心。

由此可见, 血细胞分离机比传统的手工分离方法快速、高效, 避免了人为因素带来的质量偏差, 人工分离整个过程需要人工密切监控, 稍有不慎, 红细胞一瞬间就进入血浆, 造成红细胞浪费, 血浆还必须进行二次离心, 工作人员整个过程精神高度紧张, 整个制备过程很忙乱。使用血细胞分离机, 只要对工作人员做好培训, 设置好分离机参数, 监测机器正常运转, 血细胞分离机通过多方位探头监测分离工作, 非常准确有效地自动控制整个分离过程, 有条不紊地进行分离制备工作。随着科学技术的不断发展、工作人员的共同努力研究, 相信血细胞分离机会更加快速高效、更加智能。因此, 血细胞分离机迅速取代手工分离方法是成分血制备的一大进步。

参考文献

[1]中华人民共和国卫生部, 中国国家标准化管理委员会.全血及成分血质量要求 (GB18469-2012) [S/OL].http://w w w.nhfpc.gov.cn/zw gkzt/s9 4 9 3/2 0 1 2 0 7/5 5 3 8 0.shtm l.

T细胞分离方法研究 篇8

关键词：支持细胞,体外培养,小鼠,分离,纯化

支持细胞(sertoli cell,SC)也称足细胞,是由早期发育的胚胎生殖嵴细胞分化而成,与精原细胞一起构成睾丸曲细精管。睾丸支持细胞是柱状的大型细胞,其基底部接在曲细精管基底膜上,另一端突向曲细精管腔形成树枝状的突起[1,2]。在光镜下观察时,支持细胞呈不规则的三角形或多边形,核仁明显。电镜下观察时,支持细胞呈不规则三角形或多边形,侧面和腔面有许多不规则凹陷。胞质内有许多微丝和微管,相邻睾丸支持细胞侧面近基部的胞膜形成紧密连接。在精子的形成过程中,卵泡刺激素(FSH)与支持细胞膜上的FSH受体结合,激活腺嘌呤核苷酸环化酶,产生磷酸腺苷(cAMP),后者再激活磷酸化酶,使m RNA活化,产生雄激素结合蛋白(ABP),ABP与睾酮结合,维持曲细精管内睾酮的浓度,造成生精细胞分化成熟的环境。

多年来,支持细胞的功能被认为是生精细胞的支架,为生精细胞提供必需的营养物质,可分泌缪勒管抑制物(MIS)、ABP以及多种生长因子(如TGF-α、TGF-β、b-FGF、EGF-α、EGF-β、IGF-1等),也对精原细胞的体外分化培养起着至关重要的作用[3,4]。因此,支持细胞体外培养是进行生殖细胞培养研究的基础,目前已有多种支持细胞体外培养方法,并已建立永生支持细胞株。

另外,由于支持细胞表达并分泌自杀相关因子配体(FasL),从而被用于睾丸以外的部位,为移植的细胞提供免疫豁免的环境,为糖尿病和帕金森病的治疗开辟了广阔的前景;此外,支持细胞在体外可促进神经元以及胰岛细胞的存活及功能的发挥。近期还有人报道了支持细胞用于体细胞克隆的可能性。所有这些均说明支持细胞的功能非常广泛,应用前景广大,其具体的作用机制以及更广泛的应用有待于人们去进一步开发。

1 材料

F12/DMEM培养基,Gibco公司生产;胎牛血清(FBS)、胶原酶Ⅳ、胰蛋白酶和透明质酸酶、油红O、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES),Sigma公司生产;青霉素、链霉素,哈药集团制药总厂生产;谷氨酰胺,Merk公司生产。

生物安全柜,HFD公司生产;CO2培养箱,Termo公司生产;低温高速离心机,Eppendorf公司生产;倒置显微镜,Nikon公司生产;电子分析天平,沈阳龙腾电子有限公司生产;超低温冰箱,NBS公司生产;超纯水制备机,PALL公司生产;低温冰箱,SANYO公司生产;4℃冰箱,海尔集团生产;磁力搅拌器,杭州仪表电机厂生产;数显恒温水浴锅、培养皿、解剖用眼科剪刀、眼科直头镊子、眼科弯头镊子、显微镊子、200目钢筛、离心管(2 m L、15 m L、50 m L)和移液枪及枪头,江苏常熟医疗机械厂生产。

16～22日龄睾丸发育良好的雄性昆明小白鼠10只,由西安交通大学医学院实验动物中心提供。

2 方法

2.1 小鼠睾丸细胞悬液的制备及支持细胞的分离

取16～22日龄雄性昆明小白鼠10只,采用颈椎脱臼法处死,在无菌条件下,切开阴囊取出睾丸,去除睾丸白膜和血管,暴露生精小管,用D-Hank’s液反复冲洗;用吸管轻轻吹打以吹散精曲小管,再用小剪刀将生精小管剪成1～4 mm长的碎块;加入10倍于组织体积的1 mg/m L胶原酶溶液,于37℃、5%CO2条件下孵育15 min(期间晃动数次);1 000 r/min离心5 min;弃去上清液,加入0.25%胰蛋白酶和1.5 mg/m L的透明质酸酶溶液作用15 min;加入适量的血清终止消化,用200目钢筛过滤悬液,收集滤液,以1 000 r/min离心5 min;弃去上清液,用D-Hank’s液洗涤2～3遍,然后用F12/DMEM洗涤2次。

2.2 支持细胞的纯化

将分离的细胞悬液用Tris-HCl溶液(0.05 mol/L,pH值为7.4)低渗处理(3～5 min)以除去混杂的其他睾丸细胞;利用睾丸支持细胞贴壁而生殖细胞不贴壁的性质,培养24 h弃去悬浮于培养液中的杂细胞。纯化后,活细胞含量和支持细胞的纯度可进一步提高。

2.3 支持细胞的培养及其生长曲线的绘制

将分离得到的细胞在倒置显微镜下用细胞计数板进行计数,并采用台盼蓝染色判断睾丸支持细胞的活性,重新加入含10%胎牛血清的F12/DMEM培养液调整细胞密度为(3～3.5)×106/m L,培养24 h;弃去培养液,进行细胞计数;加少量20 mmol/L Tris-HCl液,低渗处理细胞3～5 min;再用Hank平衡盐溶液(HB-SS)冲洗2次,去除大部分生精细胞,加入含10%胎牛血清的F12/DMEM培养液,重新调整细胞密度,置于37℃、5%CO2、100%湿度条件下培养[5]。

取传至第3代刚好铺满瓶底、生长旺盛的睾丸支持细胞,用D-Hank’s液清洗后,用0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化2～3 min;用培养液中和,吹打成单个细胞,调整细胞浓度为3×104/m L,接种在24孔细胞培养板中,每孔接种1 m L,于37℃、5%CO2、100%湿度条件下培养,每24 h消化收集细胞,用血细胞计数板计细胞数,每次计3孔,每孔计2次,取平均值,连续计数8 d,每天1次。绘制细胞生长曲线。

2.4 支持细胞的形态、结构和生长增殖情况

2.4.1 H.E.染色

用0.25%的胰酶对汇合度达到80%的原代支持细胞进行消化并洗涤,然后将其接种在培养皿中,且放入经多聚赖氨酸包被的盖玻片,继续在培养箱中培养以制作细胞爬片;将贴有支持细胞的爬片用37℃、无Ca2+、Mg2+离子的PBS漂洗3次,每次20～60 s;浸入95%的乙醇中固定15 min;用上述PBS洗2次,每次1 min;将盖玻片浸入苏木精染液中5～10 min;用去离子水洗涤,浸入稀盐酸乙醇溶液中数秒钟;用去离子水洗涤,浸入淡氨水中3～5 min;用自来水洗涤干净,浸入伊红染液中5～10 min;用去离子水洗涤,通过70%、80%、90%乙醇各1次,95%乙醇2次,100%乙醇3次,每次1 min;通过二甲苯3次,每次1 min;用中性树胶封片,观察细胞和细胞核形态。

2.4.2 油红O染色

将贴有支持细胞的爬片用10%的中性甲醛固定12～15 h;再用70%乙醇洗涤数次后,加入0.5%的油红O,室温下染色10 min;弃去染液,经过70%乙醇洗涤后,用去离子水洗涤干净,苏木素复染2 min;用中性树胶封片,观察细胞和细胞核形态。

3 结果与分析

3.1 台盼蓝染色活率鉴定

细胞活率=[1-染色细胞数/细胞总数]×100%=1-13/181=92.81%。混合细胞台盼蓝染色结果见180页彩图1。

3.2 支持细胞的生长曲线(见图2)

由图2可以看出,睾丸支持细胞在培养至第2天时进入对数生长期,细胞增殖旺盛,至第6天时进入平台期,增殖速度开始减慢,但培养至第7天仍没见到凋亡的细胞。

3.3 支持细胞生长状况的观察

支持细胞贴壁性良好,接种后游离时间很短,一般4 h以后细胞开始发生极化,伸出突起,胞质拉长。体外培养10 h后完全贴壁,随即进入增殖期。培养24 h后弃去培养基,并经过Tris-HCl低渗处理后,可见胞体较大,呈长柱状贴壁生长,有的出现2个或多个突起,折光性较强。培养48 h后,可见睾丸支持细胞体积增大,呈不规则形,胞核清晰可见,位于胞体的中央或稍偏位。随着培养时间的延长,睾丸支持细胞的折光性降低,增殖减慢,细胞的连接非常紧密。各个培养阶段的支持细胞见180页彩图3～6。

3.4 H.E.染色

睾丸支持细胞呈长柱状或不规则的多边形,有3～4个突起,胞质铺展很大,被染成红色。细胞核为1个或多个,呈圆形或卵圆形,被染成淡蓝色或蓝紫色(见180页彩图7)。

3.5 油红O染色

睾丸支持细胞经油红O染色后,显微镜下观察可见胞质中有大小不一的圆形或卵圆形的空泡状结构,被染成红色或桔红色,这些空泡状结构是脂质小滴,存在于细胞的两极或核的周围(见180页彩图8)。

4 讨论与结论

4.1 对小鼠日龄的选择

由于睾丸支持细胞在睾丸中所占比例很低,因此分离的纯度常受到生精细胞及间质细胞的影响。胚胎鼠睾丸中生精细胞较少或不存在,但睾丸支持细胞产量亦较低;成年鼠睾丸中含有大量的生精细胞,所得睾丸支持细胞纯度较低。故试验选取16～22日龄的幼鼠,其睾丸均未下降到腹腔,曲细精管的生精上皮内主要有支持细胞和精原细胞两类细胞。这样既保证了产量,也提高了细胞的纯度。

4.2 睾丸支持细胞悬液的制备方法

适当的分离程序及消化分离方法对制备良好单细胞悬液非常重要。16～22日龄小白鼠的睾丸主要由支持细胞与各级生精细胞组成生精上皮,其中支持细胞基部位于由多层细胞及非细胞成分组成的固有膜上,故采用胶原酶和胰蛋白酶进行联合消化[6,7]。取出睾丸之后,先用显微镊子仔细去除脂肪垫及睾丸白膜,然后将睾丸组织剪碎,反复离心冲洗以去除血细胞,进行胰胶原酶消化时,将睾丸间质消散后,静置沉淀或低速离心,去除掉大部分间质组织及管周肌样细胞;再进行胰蛋白酶和透明质酸酶消化,去除基底膜部分并使曲细精管内细胞充分散开,释放出睾丸支持细胞和精原细胞,消化后的细胞组织液用200目滤网过滤,进一步去除筋膜,以去除大部分成纤维细胞,提高睾丸支持细胞的纯度。国外相关的文献报道和笔者的试验结果表明,这种多步骤消化过程能有效地分离到纯度较高的曲细精管段并获得较高产量的单细胞悬液,减少酶对细胞的损伤,同时确保去除大部分间质成分、管周肌样细胞。

4.3 细胞悬液的低渗处理

通过对前人方法的改进,试验在分离细胞过程中将分离的细胞悬液用0.05 mol/L的Tris-HCl低渗处理,以去除混杂的部分精原细胞和间质细胞,然后利用培养时睾丸支持细胞贴壁而生殖细胞不贴壁的特性,培养至24小时弃去悬浮于培养液中的杂细胞。通过该方法纯化后,平均每个睾丸可获得2×106个细胞,活细胞占总数的95%以上,睾丸支持细胞的纯度可达90%。与以往学者在39℃条件下培养48 h以去除精原细胞、纯化睾丸支持细胞的方法相比,明显降低了高温对细胞的损害,提高了睾丸支持细胞的纯度和活率。

4.4 睾丸支持细胞的形态、结构和生长、增殖

睾丸支持细胞分离培养至第3天时体积增大,膜状铺在培养皿底壁上,相互间连接呈网状。随着培养时间的延长(培养5～6 d后),睾丸支持细胞融合成片,折光性减弱。但睾丸支持细胞在体外培养时活性很强,培养至2周时,细胞仍存活良好,经H.E.染色、光镜下观察可见睾丸支持细胞呈宽大的柱状或不规则状,有多个粗大的突起,细胞核呈圆形或卵圆形,核膜上有小凹。睾丸支持细胞经油红O染色后,显微镜下观察可见胞质中散在有圆形、卵圆形、大小不一的空泡状结构。这些空泡状结构是脂质小滴,被染成红色或桔红色,聚集于睾丸支持细胞的两极或散布于核的四周。鉴定结果表明,含有红色或橘红色空泡状结构的细胞为睾丸支持细胞。

4.5 睾丸间质细胞与支持细胞的相互作用

间质细胞能够在促黄体生成素(LH)的作用下合成和分泌雄激素,而支持细胞能够在FSH的作用下使间质细胞产生的雄激素发生芳香化反应;雄激素又可促进支持细胞产生ABP并影响其他代谢功能。支持细胞的分泌产物可以通过旁分泌途径调节间质细胞的功能。研究表明,间质细胞的主要功能是合成和分泌雄激素,即一类含19个碳原子的类固醇激素,主要有睾酮、雄烯二酮等。支持细胞对生殖细胞具有支持和营养作用,同时还可形成睾丸内微环境、构成血睾屏障、吞噬细胞残体、调节精子的发生、产生类固醇类物质及分泌100余种不同的蛋白质以调节生殖功能。研究已证实支持细胞维持着睾丸组织的免疫豁免。总之,支持细胞通过分泌雄激素和一些含氮类细胞因子间接或直接地作用于间质细胞,在支持细胞与间质细胞之间形成短环式结构,以优化间质细胞的雄激素生成过程。间质细胞产生的睾酮对支持细胞的分泌功能起促进作用;间质细胞还产生非类固醇性调节物质对支持细胞的分泌功能具有抑制或者促进作用[8]。

参考文献

[1]FAGNEN Q,PHAMANTU N T,BOCQUET J,et al.Inhibition of tr-ansmembrane calcium influx induces decrease in proteoglycan syn-thesis in immature rat sertoli cells[J].J Cell Bio Chem,1999,76(2):322-331.

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[3]MERONI S,CANEPA D,PELLIZZARI E,et al.Regulation of gam-ma-glutamyl transpeptidase activity by Ca(2+)-and protein ki-nase C-dependent pathways in sertoli cells[J].Int J Androl,1997,20(4):189-194.

[4]TOUYZ R M,JIANG L,SAIRAM M R,et al.Follicle-stimulating hormone mediated calcium signaling by the alternatively spliced growth factor typeⅠreceptor[J].Biol Reprod,2000,62(4):1067-1074.

[5]许少华,郭筠秋.大鼠睾丸支持细胞的分离及培养方法[J].哈尔滨医科大学学报,2001,35(3):185-188.

[6]朱宛宛,王淑艳,吴迪,等.胰酶和Ⅳ型胶原酶在人胚胎干细胞传代中的作用特点[J].首都医科大学学报,2008,29(4):445-450.

[7]李玉荣,白瑜,尹晓敏,等.大鼠睾丸支持细胞体外培养及FSH对其增殖的影响[J].河北农业大学学报,2008,31(3):73-76.

T细胞分离方法研究 篇9

关键词：膜片钳,心肌细胞,大鼠,豚鼠

心肌细胞的分离是膜片钳实验当中重要的步骤。能否得到质量好、数量多的细胞是膜片钳实验能否顺利进行的关键因素。自从1969年Kono[1]首次报道了酶解法被运用于细胞分离以来, 不少人在实验中对这种实验方法进行了改进[2,3], 但分离后的细胞存活率和钙耐受性总是不稳定, 因此直接导致膜片钳实验不能顺利进行。本文所采用的细胞分离方法参考了刘恭鑫等[4]的方法, 并总结自己在实验当中的经验对细胞分离的方法做了改进, 分离细胞过程简单, 时间短, 获得细胞存活率高, 结构完整, 纹理清晰, 具有良好的钙耐受性和较长的存活时间。

1 材料与方法

1.1 实验动物

Wistar大鼠、豚鼠, 体重200 g~250 g, 雌雄不限, 由山西医科大学实验动物中心提供。

1.2 药品及溶液配制

HEPES[4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazine-ethanesulfonicacid]、牛磺酸 (taurine, TAU) 、L-谷氨酸 (L-Glutamic acid) 为美国Sigma公司产品, 胶原酶P (collagenase P) 为 Roche Diagnostic GmbH Mannheim 德国产品, 其余试剂均为国产分析纯试剂。

台氏液:KCl 5.4 mmol/L, NaH2PO4 0.33 mmol/L, HEPES 5 mmol/L, Glucose 10 mmol/L, MgCl2 1 mmol/L, NaCl 140 mmol/L, CaCl2 1.8 mmol/L, 用1.0 mmol/L的NaOH调pH值到7.35~7.40。无钙台氏液:去除钙离子的台式液。酶液:KCl 5.4 mmol/L, NaH2PO4 0.33 mmol/L, HEPES 5 mmol/L, Glucose 10 mmol/L, MgCl2 1 mmol/L, NaCl 125 mmol/L, Taurine 20 mmol/L, CaCl2 75 μmol/L, 胶原酶P 5 mg~7mg。KB液:L-谷氨酸 50 mmol/L, KCl 30 mmol/L, 牛磺酸 20 mmol/L, KH2PO4 30 mmol/L, HEPES 10 mmol/L, Glucose10 mmol/L, MgCl2 1 mmol/L, EGTA 0.5 mmol/L, 用1.0 mmol/L的KOH调pH值到7.35~7.40[5]。

1.3 实验方法

取大鼠或豚鼠, 腹腔注射肝素200 U/kg, 20 min后迅速剪断动物颈部放血, 开胸取出心肺, 立即置于0 ℃氧饱和的无钙台式液中修剪, 保留心脏并游离出长1.5 cm~2.0 cm长的主动脉, 插入Langendorff灌流装置的主动脉套管, 并用棉线固定;在7 kPa~8 kPa灌注压下, 用纯氧饱和的37 ℃~38 ℃无钙台式液灌流7 min~8 min;然后再用酶液循环灌流15 min~20 min, 这种条件下心脏灌流得充分, 为鲜红稍带黄色, 心肌组织松软;最后再用氧饱和37 ℃无钙台式液灌流1 min~2 min。剪下心室部分置于室温KB液中剪碎, 用粗口吸管轻轻吹打, 然后用150 μm的筛网过滤, 室温下稳定1 h后, 放入冰箱2 ℃~6 ℃下冷藏4 h备用。

2 结 果

经上述方法分离大鼠和豚鼠的心肌可以得到单个心肌细胞, 存活率大约为70%~90%, 在KB液中放置72 h后仍有40%~50%存活。状态良好的心肌细胞光镜下观察:呈杆状或矩形, 具有清晰的横纹, 立体感强, 台盼蓝拒染, 心肌细胞长60 μm~160 μm, 宽10 μm~40 μm, 大鼠与豚鼠心肌细胞静息电位均为-70 mV~-80 mV, 复钙后大约有60%~70%的细胞存活。

3 讨 论

膜片钳技术中的吉欧封接是技术改进的一次革命, 而理想的单个心肌细胞标本的制备是能够形成吉欧封接的先决条件, 因此心肌细胞标本的质量直接影响实验的成功率。本实验研究所采用的心肌细胞分离方法快速简便, 分离细胞的结果稳定, 细胞存活率高, 结构好, 耐钙且存活时间长, 因而大大提高了膜片钳实验当中的工作效率。细胞分离的质量以及存活率和以下一些因素有关。

3.1 实验条件的控制

实验条件包括实验用水, 各种实验试剂, 溶液成分、温度、pH值和氧饱和度。实验中所用水质的好坏直接关系到分离细胞的成败[2], 在进行心肌细胞分离时应使用三蒸水或者去离子水, 要求水的电导在1 μs/cm以下。溶液当中的各种成分纯度至少要在化学纯以上, 酶的效价和用量是细胞分离当中的关键因素, 酶的量过多会使细胞结构遭到破坏, 存活的细胞未达到高阻封接便破膜死亡。酶的用量过少时, 不能很好地消化细胞间的连接, 分得的细胞很多呈捆状或链状连在一起, 即使有一些单个细胞, 由于细胞膜上残存的未被消化的物质, 直接影响细胞膜与玻璃电极之间的封接。酶的用量应在实践中不断摸索调整到最适用量。温度也是细胞分离当中的重要因素, 取出心脏后置于0 ℃氧饱和的无钙台式液中, 可在修剪时减低心肌组织的代谢从而保护心肌;细胞分离过程中要求室温保持在25 ℃~30 ℃, 灌流液体的温度保持在37 ℃~38 ℃, pH值调到7.35~7.40是模拟内环境, 以便使酶的活性保持最佳状态。本方法中动物在体的肝素化可以有效防止冠状动脉内血栓的形成, 保证液体灌流的畅通, 从而保证心肌组织的供氧供能, 提高细胞的存活率和保持良好的状态。

3.2 熟练的实验操作

在控制好实验条件后, 分离细胞过程中

1) 为山西省回国留学人员科研基金资助项目 (No.2007-42)

熟练的操作也是非常重要的。分离心肌细胞是一个程序化的连贯工作, 此过程中各个步骤紧密联系相互影响。处死大鼠要快, 这样不但可以减少动物的痛苦, 还可以保证心室腔不会形成血栓;开胸取出心脏、修剪心脏和悬挂心脏动作要准确而迅速, 这样可以减少心肌组织缺氧, 从而保证分得的心肌细胞数量和质量, 熟练的操作是在实验当中逐步培养成的。细胞分离的过程中每一步操作和每一个实验条件都是非常重要的, 任何小的疏漏都可能影响分得的细胞数量和质量, 所以要求实验者在工作中要细心和耐心。

参考文献

[1]Kono T.Roles of collagenase and other proteolytic enzymes in the dispersal of animal tissues[J].Biochim Biophys Acta, 1969, 178:397-400.

[2]Wolska BM, Solaro RJ.Methodfor isolation of adult mouse cardi-ac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry[J].AmJ Physiol, 1996, 271:1250.

[3]Tytgat J.How to isolate cardiac myocytes[J].Cardiovasc Res, 1994, 28:280.

[4]刘恭鑫, 顾全堡, 郭棋, 等.大鼠、豚鼠心肌细胞的简单快速分离[J].中国应用生理学杂志, 1997;13 (4) :

T细胞分离方法研究 篇10

关键词：青蒿琥酯/药理学,T细胞淋巴瘤细胞/药物作用,细胞凋亡,体外研究

青蒿琥酯是具有倍半萜内酯类抗疟药青蒿素的衍生物, 除具有高效抗疟作用外, 还具有免疫调节、抗寄生虫、抗病毒、抗肿瘤、保肝、抗炎、松弛平滑肌等作用[1]。青蒿琥酯对于T细胞淋巴瘤的抑制作用以及作用机制如何, 文献鲜见报道。本研究观察了青蒿琥酯对T细胞淋巴瘤细胞株的凋亡诱导作用并探讨其可能的作用机制, 为其进一步应用于淋巴瘤的临床治疗提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 药品和主要试剂

注射用青蒿琥酯:桂林南药股份有限公司产品, 5%碳酸氢钠1 ml溶解后, 用RPMI 1640配制所需浓度。四甲基偶氮唑蓝 (MTT) 及PI试剂盒:购自Sigma公司;细胞凋亡DNA LADDER提取试剂盒:北京博大泰克生物基因技术有限公司;Bcl-2、Bax、Caspase-8、辣根过氧化物酶连接的抗鼠Ig G、辣根过氧化物酶连接的抗兔Ig G:均购自美国Cell Signal公司;actin和ICAD单克隆抗体:美国Santa Cruz公司产品。

1.2 细胞和细胞培养

T细胞淋巴瘤细胞株Jurkat:由浙江大学医学院附属第一医院血液病研究所提供。细胞悬浮生长于RPMI1640培养液中, 培养于37℃、体积分数为5%CO2的饱和湿度孵箱中, 每2~3天传代1次, 取对数生长期细胞进行实验。

1.3 观察指标及测定

1.3.1 Jurkat细胞增殖检测

MTT法。取对数生长期细胞, 以1×105·ml-1细胞密度接种于96孔培养板, 设空白对照组, 将药物稀释成不同浓度, 分别作用24、48、72小时后, 测细胞增殖抑制率, 半数抑制浓度 (IC50) 用Logit法计算。实验重复3次, 设复孔3个, 取平均值为最终结果。

1.3.2 Jurkat细胞形态观察

取不同时相细胞涂片, 瑞特染色, 观察细胞形态变化。

1.3.3 Jurkat细胞DNA片段化检测

取对数生长期细胞, 调整浓度为1×105·ml-1, 加入青蒿琥酯8、16、32μg/ml共同培养48小时, 收集各组细胞, 用PBS洗2次, 裂解细胞, 提取细胞DNA, 将其溶于20μl TE缓冲液中, 取5μl加入含EB的1%的琼脂糖凝胶, 于50 V恒压下电泳约1小时, 凝胶自动成像系统拍照。

1.3.4 Jurkat细胞凋亡率检测

流式细胞仪检测。

1.3.5 Jurkat细胞Bcl-2、Bax、ICAD蛋白表达及Caspase-8 剪切激活的测定

Western-blot分析。总蛋白提取后, Braford法测蛋白质浓度, 取10μg蛋白样品与2×加样缓冲液等体积混合, 煮沸变性5分钟后上样于100、120、150g/L SDS-PAGE电泳分离, 电转移至PVDF膜上, 室温封闭1小时, 立即加入一抗溶液, 平缓摇动, 4℃过夜。室温下加二抗溶液孵育1小时。以β-actin作为内参照, 显影参照ECL试剂盒说明书操作。

1.4 统计学处理

实验数据以 (±s) 表示, 多组资料之间的比较采用单因素方差分析、相关与回归分析。采用SPSS13.0 for Windows软件进行分析处理。

2 结果

2.1 青蒿琥酯对Jurkat细胞增殖的抑制作用

MTT法检测结果显示, 以2~64μg/ml青蒿琥酯作用Jurkat细胞24、48、72小时, 能够明显抑制细胞增殖, 且生长抑制率与药物作用浓度呈正相关 (P<0.01) , 呈浓度依赖性, 见图1。青蒿琥酯作用Jurkat细胞24、48、72小时后的IC50分别为 (22.97±3.78) μg/ml、 (8.08±2.43) μg/ml、 (1.95±0.76) μg/ml。

2.2 青蒿琥酯对Jurkat细胞形态学的影响

瑞特染色, 油镜下观察青蒿琥酯作用前后Jurkat细胞形态学变化, 结果显示, 8μg/ml青蒿琥酯作用于Jurkat细胞48小时后, 细胞出现典型的凋亡形态学特征, 可见细胞核染色质凝聚、分布不均、呈致密浓染的块状, 细胞核固缩碎裂, 胞浆空泡化, 细胞形态基本完整, 见图2。

2.3 青蒿琥酯对Jurkat细胞凋亡DNA片段化的影响

8、16、32μg/ml青蒿琥酯作用于Jurkat细胞48小时后, 琼脂糖凝胶电泳呈现典型的梯状条带, 而对照组DNA集中于加样孔附近。表明青蒿琥酯可诱导Jurkat细胞发生明显的DNA片段化, 诱导细胞发生凋亡, 见图3。

2.4 青蒿琥酯对Jurkat细胞凋亡的影响

青蒿琥酯作用于Jurkat细胞48小时后出现亚二倍体峰 (即细胞凋亡峰) , 且亚二倍体峰所占比例随青蒿琥酯浓度的增加而增加。空白对照组及8、16、32μg/ml浓度组的细胞凋亡率分别为1.94%、28.62%、60.45%和95.58%。

2.5 青蒿琥酯对Jurkat细胞Bcl-2、Bax、ICAD蛋白表达及Caspase-8剪切激活的影响

分别以8、16、32μg/ml青蒿琥酯作用于Jurkat细胞48小时后, 随药物浓度的增加, Bcl-2和ICAD蛋白表达下降, 而Bax蛋白表达上调;而Caspase-8出现明显的剪切激活带, 见图4。

1.空白组;2.8μg/ml;3.16μg/ml;4.32μg/ml

3 讨论

T细胞淋巴瘤的临床化疗效果欠佳, 针对晚期T细胞淋巴瘤需要寻找新的化疗药物。青蒿琥酯作为一种抗肿瘤新药, 可以选择性地杀伤肿瘤细胞而对正常细胞的毒性较小, 与传统化疗药物不产生交叉耐药[2];通过抑制谷胱甘肽-S-转移酶的活性, 青蒿琥酯可以逆转肿瘤细胞对化疗药物的多药耐药[3], 笔者前期实验证明青蒿琥酯对白血病U937细胞具有诱导凋亡作用[4]。在抗淋巴瘤方面, 文献报道其对T细胞淋巴瘤细胞株Jurkat细胞有体外抑制作用, 且与其他化疗药联用具有协同作用[5]。在作用机制方面, 曾彦等研究显示青蒿琥酯对Jur kat细胞作用后可以诱导细胞在形态学上出现凋亡改变[6], 提示与诱导细胞凋亡有关, 但诱导凋亡的途径尚未研究。

细胞凋亡是一种细胞主动死亡过程, 目前认为细胞凋亡有两条主要途径:一是肿瘤坏死因子 (TNF) 受体家族成员 (如CD95/Fas) 参与的通过Caspase-8活化的途径, 称外源性凋亡途径;二是细胞色素C参与的通过Caspase-9活化的途径, 称内源性凋亡途径。两条途径最后均通过激活下游效应因子Caspase-3和Caspase-7, 使细胞发生凋亡。Bcl-2家族是重要的凋亡调节因子, 有两类作用相反的蛋白参与凋亡的调控, 促凋亡蛋白如Bax、Bik等可以促进凋亡的发生, 而抗凋亡蛋白如Bcl-2、Bcl-x L等可以抑制凋亡的发生[7]。ICAD/DFF55是CAD (caspase-activated deoxyri-bonuclease) 的抑制蛋白, CAD可以造成凋亡时DNA的片段化。在正常细胞中CAD-ICAD以无活性的复合物存在, 因而不处于激活状态。细胞凋亡时, Caspase水解ICAD, CAD即处于活性状态并最终使DNA片段化。有意义的是, CAD只在ICAD存在时才能合成并显示活性, 因而ICAD对CAD的活化与抑制是必需的, 即ICAD在细胞凋亡核事件中发挥着重要作用[8]。

本研究结果显示, 以2~64μg/ml青蒿琥酯作用Jurkat细胞能够明显抑制细胞增殖, 诱导Jurkat细胞凋亡;8、16、32μg/ml青蒿琥酯作用Jurkat细胞48小时后, 出现明显的细胞凋亡峰;随药物浓度的增加, Bcl-2和ICAD蛋白表达逐渐下降, 而Bax蛋白表达上调, Caspase-8蛋白出现明显的剪切激活带;提示青蒿琥酯既能通过线粒体途径又能通过外源性途径诱导T细胞淋巴瘤细胞株Jurkat细胞凋亡, 但具体信号转导机制如何, 还需进一步研究。

参考文献

[1]娄小娥, 周慧君.青蒿琥酯的药理和毒理学研究进展.中国医院药学杂志, 2002, 22 (3) :175.

[2]Efferth T, Dunstan H, Sauerbrey A, et al.The antimalarial artesunate is also active against cancer.Int J Oncol, 2001, 18 (4) :767.

[3]Mukanganyama S, Widersten M, Naik YS, et al.Inhibition of glutathione stransferases by antimalarial drugs possible implications for circumoenting anticancer drug resistance.Int J Cancer, 2002, 97 (5) :700.

[4]陈均法, 郑智茵, 陈小红, 等.青蒿琥酯对U937细胞凋亡的诱导作用及其对Bcl-2、Bax、ICAD和Caspase-8表达的影响.中国中医药科技, 2011, 18 (27) :117.

[5]Efferth T, Giaisi M, Merling A, et al.Artesunate induces.ROS-mediated apoptosis in doxorubicin-resistant T leukemia cells.Plosone, 2007, 2 (1) :e693.

[6]曾彦, 倪勋, 孟文彤, 等.青蒿琥酯对人淋巴细胞白血病/淋巴瘤细胞抑制作用及机理的研究.四川大学学报:医学版, 2009, 40 (6) :1038.

[7]Levine B, Sinha S, Kroemer G.Bcl-2 family members:dual regulators of apoptosis and autophagy.Autophagy, 2008, 4 (5) :600.