提取分离方法

提取分离方法（共11篇）

提取分离方法 篇1

熊果酸 (ursolic acid, UA) , 又名乌索酸、乌苏酸, 是五环三萜类乌苏烷型的代表性化合物, 他在体外对革兰阳性菌、阴性菌及酵母菌有抑制活性, 并具有抗病毒、抗肿瘤、安定等作用[1]。熊果酸以游离形式或与糖结合成苷的形式存在于多科植物中, 所以提取精制的方法比较广泛, 本文对常用的制取方法作一综述。

1 熊果酸的提取

1.1 溶剂法

根据熊果酸的基本性质, 去杂过程中使用石油醚除去脂溶性杂质后再水洗, 以除去水溶性杂质、糖, 再用正丁醇萃取精制。文小静等采用4种不同的溶剂和5种不同的方法对山茱萸中所含的熊果酸进行提取, 通过比较其收率和含量, 选出最佳工艺为用95%乙醇、破碎提取法[2]。谢艳等通过单因素试验, 以提取的选择性和提取率为指标, 确定各因素对熊果酸提取效果的影响程度从高到低分别是:提取时间>提取次数>乙醇体积分数>液固比[3]。李晓等人通过考察这四种因素对提取工艺的影响, 确定出连翘中提取熊果酸的最佳工艺为6倍量95%乙醇热回流2次, 每次60min, 测得熊果酸的含量平均值为25%, 确定该提取工艺提取率高, 稳定性好, 操作简便, 适合工业化生产[4]。高晓旭等、谷芳芳等、王建明等、梁振益等分别从光叶山楂、山楂叶、山楂、迷迭香中提取熊果酸, 所得的提取率 (提取率计算公式:提取率=提取液中熊果酸的质量/原料中熊果酸的质量×100%) 分别为92.5%、93.47%、92.9%、92.38%[5,6,7,8], 吴梨等、黎海彬分别从枇杷叶、山楂中提取所得熊果酸的纯度分别为95.3%、97.0%[9,10], 这些数

*通讯作者:E-mail:tcmyxs@126.com

[6]聂琼, 林久祥.错合畸形牙弓宽度比较[J].现代口腔医学杂志, 2000,

据证明了所采取的工艺的提取效率都很高。

溶剂法提取熊果酸设备要求低、工艺流程简单、更适合于工业化生产, 我们就应该结合各因素对提取效果的影响, 从方法的稳定性、熊果酸的得率、资金成本的节约出发, 进一步优化工艺。

1.2 酶解法

纤维素酶辅助法已广泛应用在植物活性成分的提取中, 它具有操作简单、高效率、稳定等优点。曾超珍研究纤维素酶法提取构骨叶熊果酸工艺的过程中得出最佳工艺:p H5.2, 酶量6mg/g, 酶解温度50℃, 酶解时间3h, 使熊果酸的得率为1.23mg/g, 各因素对酶解反应影响的顺序为:p H>酶解温度>酶量>酶解时间[11]。张利等得到的酶法提取车前草中熊果酸的工艺为:p H=5.0, 酶用量5.0mg/g, 酶解温度60℃, 酶解时间2.5h, 他们认为此工艺路线较短, 操作简单, 提取率高, 成本低, 适合工业化生产[12]。陈亮等利用酶解法从金叶女贞的花、叶、果实中得到熊果酸并测定含量, 得出其果实中熊果酸含量最高[13]。

与溶剂法相比, 酶解法提取熊果酸显著地简化了操作、提高了效率, 更适合工业化生产, 但是此种方法对酶解的温度、酸度、时间精度要求稍高些, 而且从不同的植物中不同部位提取所需要的纤维素酶不同, 这就要求我们需要寻找合适的酶。

1.3 超声提取法

张如心等在研究超声波提取山茱萸中熊果酸工艺的过程中发现超声影响因素的主次顺序为:超声频率>溶媒用量>超声功率>超声时间[14]。罗荣珍等在研究微波-超声波协同作用时, 以从苦丁茶中提取熊果酸的提取率为标准得出, 在所得的最佳工艺条件下即:95%乙醇, 1∶10的固液比, 70℃的提取温度, 240s的提取时间, 得出微波-超声波

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影响的比较研究[J].现代口腔医学杂志, 2006, 20 (1) :28-30.

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[11]傅民魁.口腔正畸学[M].4版.北京:人民卫生出版社, 2003:22.协同作用、单纯微波法、超声波法的提取率分别为98.97%、56.79%、14.75%[15], 可见微波-超声波协同作用的提取率更高些。李跃中等以枇杷叶为原料, 筛选出熊果酸的最佳提取工艺为:超声提取2次, 每次20min, 乙醇浓度90%, 得到熊果酸的纯度为95.8%[16];李贵文得出从锁阳中提取熊果酸的最佳工艺为:提取温度70℃, 料液质量比为12∶1, 超声功率225W, 提取2次, 每次提取60min, 得出的提取率达到94.2%[17], 从纯度和提取率的角度看, 超声提取精制了熊果酸并且从很大程度上提高了药材的利用率。

超声提取法显著地提高了提取率, 达到了90%以上, 但是超声自身设备的问题, 不适合大工业生产。

1.4 超临界流体萃取法 (Supercritical Fluid Extraction, SFE)

韩智慧等[18]以CO2为超临界流体物质利用SFE萃取山茱萸中熊果酸的过程中发现, 酸解醇提法中熊果酸较高, SFE中较低。鲁长征等优化所得沙棘果中提取熊果酸的工艺为:萃取压力22.5MPa, 萃取温度40.4℃, CO2流量23.3L/h, 得出熊果酸的浸出率为374mg/100g[19]。超临界流体萃取的效率较低, 但是可以避免无机酸与大量有机溶剂的使用, 具有成本低、杂质少、提取完全、环境污染少的优点。

1.5 其他提取方法

熊果酸的提取方法还有常温超高压提取法、湿法超微粉碎法[20,21]、渗漉法。超温超高压提取法和湿法超微粉碎提取法可以破坏植物的细胞壁、细胞膜, 使熊果酸充分的从植物中提取出来, 而且提取时间短, 得率高, 使用前景很好。但是超高压要求压力达到100MPa以上, 对实验设备要求高;超微粉碎的力度要求是20µm, 粒度再小会产生吸附作用影响熊果酸的提取, 过大提取不充分, 所以实验技术要求高不易掌控;渗漉法由于溶剂消耗量大、提取时间长很少采用。

2 熊果酸的分离纯化

2.1 溶剂法

利用中草药化学成分在不同极性溶剂中的溶解度进行分离纯化, 是将提取物选用几种不同极性的溶剂, 由低级到高级分步进行提取分离。两相溶剂萃取法一般使用氯仿、乙醚、苯等萃取熊果酸, 系统溶剂萃取法一般使用石油醚或正己烷脱出亲脂性杂质, 继而以氯仿、乙酸乙酯、正丁醇分布萃取[22]。谢艳在研究白花蛇舌草中熊果酸的提取纯化过程中发现, 采用10m L石油醚/g浸膏, 洗涤2次, 除杂效果最好, 可使熊果酸的含量由原先的2.5%左右提高到6.4%;采用氯仿做萃取剂, 1∶1的料液比萃取两次后萃取物回收率和纯度较理想[23]。

2.2 沉淀法

分离纯化熊果酸主要采用碱溶酸沉的方法。谷芳芳计算出在调节提取液p H值的范围>4时, 可使提取液中有机酸以离子状态或游离状态存在, 从而利用酸碱差异来分离, 通过实验得出碱处理最佳p H为11.00, 酸处理最佳p H为4.50[24]。任秀莲用沉淀吸附法提取纯化苦丁茶中熊果酸的工艺为:乙醇提取液用质量分数为10%的Na OH溶液碱化至p H值约为10.96, 过滤除去多酚等杂质, 沉淀后, 滤液先用体积分数为10%的H2SO4酸化至p H值为4.00, 再用相同体积的p H值为4.00的酸性水溶液稀释, 得到沉淀, 然后用甲醇溶解后, 将样品溶液p H值调整为7.07, 洗脱液p H值调整为11.0, 用D型大孔树脂吸附, 分布洗脱, 收集体积分数为90%乙醇溶液的洗脱液, 浓缩得到结晶。沉淀的纯度为23.12%, 吸附分离后的纯度可达90.23%[25]。

沉淀法可以较好的得到纯度较高的熊果酸, 但是酸碱物质的使用增大了环境污染、不太适合工业化生产。

2.3 硅胶柱色谱

苦丁茶中提取纯化三萜皂苷元的研究中, 选用了200~300目的硅胶装柱, 洗脱剂为氯仿-甲醇体系, 流速为1BV/h, 得到熊果酸的纯度为65%, 回收率为82%[26]。白花蛇舌草中熊果酸提取纯化工艺的研究中, 选用了80~120目的硅胶, 洗脱剂为氯仿-甲醇体系梯度洗脱, 流速为0.8BV/h, 并确定湿法装柱最好在室温下, 用无水乙醇结晶, 使熊果酸的纯度达到71.56%, 回收率较低, 仅为31%[27]。

硅胶柱色谱法所得熊果酸纯度较低, 加上硅胶柱自身的特点, 不太适合于大工业化生产, 但是由于操作简单, 可以用于实验室中鉴别药材中是否含有此类物质。

2.4 大孔树脂吸附法

在富集女贞子中齐墩果酸和熊果酸的树脂型号及纯化工艺的研究中, 认为HPD-100树脂对齐墩果酸和熊果酸的吸附与解吸性能较好, 产品中齐墩果酸、熊果酸的质量分数分别为25.21%、15.65%, 转移率分别达到98.64%、98.58%[28]。在山茱萸果实中熊果酸的提取纯化研究中, 确定树脂对熊果酸的饱和时间为1h, 最佳样品溶液p H=7.05, 80%的乙醇溶液p H=10, 流速为1~2m L/min, 可以将85.24%的熊果酸洗脱下来, 纯度达到76.64%, 回收率为86.95%[29]。山茱萸中熊果酸的提取分离确定的最佳工艺为:吸附2h, 80%乙醇洗脱, p H=11, 流速为1~1.5m L/min, 纯度为79.03%[30]。

和硅胶柱色谱法相比, 大孔树脂吸附法具有相同的优缺点, 但是大孔树脂可以回收利用。

2.5 其他方法

范杰平[31]使用的一种提取分离精制熊果酸的方法:柿叶粉用石油醚提取3次, 每次2h, 温度为60℃, 液固比为6, 然后用乙酸乙酯提取3次, 每次2h, 温度70℃液固比为6, 这时得到三萜类混合物。乙酸乙酯提取物用石油醚脱色除杂3次, 每次30min, 温度为60℃, 液固比为30, 然后以每0.4g乙酸乙酯提取物用40m L乙醇溶解, 30℃下, 加入约0.4g活性炭脱色2次, 每次20min, 减压蒸干乙醇, 得到白色固体经乙醇重结晶后得到晶体, 可得熊果酸的纯度为98%。这一工艺的纯化过程中没有使用柱层析及酸碱物质, 缩短了流程并且避免了使用酸碱物质带来的环境污染, 对于工业生产的参考价值很高, 最重要的是提高了纯度。

3 其他

熊果酸在植物中的广泛分布, 为我们从植物中提取分离得到熊果酸提供了很大的优势。每一种提取分离方法或工艺都有它的优点和缺点, 在实验室可以取得很好的结果, 进入中试或在工业化生产上可能不适用, 我们应该根据自身的需要来选择最合适的方法或工艺, 尽量的使方法简便、得率和纯度高、节约资本、环境污染少等。

摘要：熊果酸是多种中药的有效成分之一, 在药用植物中分布广泛, 具有多种生物学效应。研究其提取分离方法, 对发开植物资源, 研制新药具有重要意义。

关键词：熊果酸,提取,精制

提取分离方法 篇2

藻类肝毒素的富集提取与分离

采用固相萃取(SPE)和高效液相色谱法(HPLC)对蓝绿藻肝毒素进行富集与分离.以悦目颤藻为研究对象,选择最佳方式破坏其细胞,使其释放出细胞内肝毒素,对肝毒素进行SPE富集提取.用反相HPLC技术,以C18柱作分离柱,32%乙腈-水(含0.01 mol/L乙酸铵)为流动相,达到了对藻类肝毒素的良好分离.

作 者：苑宝玲 曲久辉 作者单位：中国科学院生态环境研究中心刊 名：分析化学 ISTIC SCI PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF ANALYTICAL CHEMISTRY年，卷(期)：200129(12)分类号：O65关键词：悦目颤藻 藻类肝毒素 固相萃取 高效液相色谱

提取分离方法 篇3

关键词：虎杖;黄酮;α-葡萄糖苷酶;抑制剂;体内活性

中图分类号：R284.2文献标识码：A文章编号：1673-2197（2007）11-037-06

1 概述

1.1 虎杖

虎杖为蓼科蓼属草本植物。虎杖的根及茎，为我国传统中药，可祛风利湿，散瘀定痛，止咳化痰。迄今已从虎杖中分离得到的化学成分主要有蒽醌及蒽醌甙；芪类化合物；酚性成分；黄酮类化合物。现代药理研究表明虎杖具有降血糖作用，对动物实验性糖尿病，能降低其糖尿病的发生率和死亡率。

1.2 α-葡萄糖苷酶抑制剂与糖尿病

α-葡萄糖苷酶抑制剂通过抑制存在于小肠粘膜微绒毛膜表面的麦芽糖酶和蔗糖酶等水解酶，能够延缓或减少肠道对碳水化合物消化与吸收，具有降低餐后血糖的作用。α-葡萄糖苷酶抑制剂是一种安全有效的新型口服降糖药。

1.3 本课题的主要研究工作

本课题的研究内容是从原药材虎杖中提取对α-糖苷酶有抑制活性的有效部位——虎杖黄酮，考查其物理、化学性质、酶学性质及温度、pH稳定性质。

2 试剂与仪器

2.1 材料

中药虎杖；D101型大孔吸附树脂。

2.2 试剂

2.2.1 α-葡萄糖苷酶酶活力测定试剂配制

磷酸钾缓冲液；α-D-葡萄糖苷酶；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）；还原型谷胱甘肽；Na2CO3终止液；对硝基酚（PNP）。

2.2.2 己糖激酶酶活力测定试剂配制

Tris-HCl缓冲液；葡萄糖；辅酶Ⅱ溶液；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；MgCl2溶液；己糖激酶酶溶液；ATP溶液；还原型辅酶Ⅱ标准液。

2.2.3 提取及成分分析试剂

三氯化铁试剂；茚三酮试剂；双缩脲试剂；香草醛-盐酸试剂；Frhde试剂；α-萘酚试剂；磷钼酸试剂。

2.3 仪器与设备

电热恒温水浴锅；752紫外光栅分光光度计；低速离心机；热恒温鼓风干燥箱；旋转蒸发器；冻干机；-86℃冰箱；电子分析天平等。

3 实验方法

3.1 虎杖中有效成分的提取分离

3.1.1 虎杖中黄酮类成分的提取

乙醇浸提：200g虎杖，用60%乙醇浸提,过滤，滤液用60%的无水乙醇浸提，过滤，反复共3次，得初提液。减压浓缩，回收乙醇，得到浸膏。

水醇法除叶绿素：乙醇浓缩液加蒸馏水离心,沉淀即为叶绿素，弃去。

石油醚脱脂：浸膏用蒸馏水洗下，石油醚脱脂，回收石油醚。脂类物质无抑制剂活性，水相有强的抑制剂活性。

乙醇洗脱：用40%乙醇洗脱至无色，再用70%乙醇洗脱至无色，最后用无水乙醇洗脱至流出液呈无色。

3.1.2 大孔吸附树脂处理

预处理:取200mlD101大孔吸附树脂，用无水乙醇浸泡1天。

装柱：采取湿法装柱，加入无水乙醇连续冲洗至洗出液与蒸馏水1∶2混合后不产生混浊为止，改用大量蒸馏水冲洗至无醇味，用pH=9的NaOH溶液洗柱。 

洗脱：样品溶于少量蒸馏水，加至柱上端。先用水洗脱，至洗出液无色；再分别用40%乙醇、70%乙醇溶液洗脱，最后用无水乙醇溶液洗脱。40%、70%和100%乙醇洗脱液分别减压浓缩。

3.2 提取物成分分析

3.2.1 检测氨基酸

样品中滴加数滴茚三酮溶液，加热至沸腾，冷却后如显蓝紫色表明含氨基酸。

3.2.2 检测蛋白质

样品中加入适量双缩脲试剂，冷却后如果显紫红色表明可能含蛋白质或肽类。

3.2.3 检测酚类

样品中加入三氯化铁试剂，如显蓝绿色表明可能含有酚类。将样品点样于滤纸上，喷洒香草醛-盐酸试剂，具有间苯三酚或间苯二酚结构的物质显红色。

3.2.4 检测糖类

样品中加入α-萘酚试剂，再滴加少量浓硫酸。如果样品液于浓硫酸接触面产生紫红色环，即表明可能存在糖类、甙类或其它还原性物质。

3.2.5 检测皂甙

样品的乙醇提取液蒸去乙醇后的残渣溶解或悬浮于醋酐中，滴加1滴浓硫酸，如果显示紫红色并且溶液上层逐渐变绿，表明含甾体三萜类或皂甙。

样品中加入Frhde试剂数滴，当皂甙遇此试剂时初呈橘红色，渐变紫黑色。

3.2.6 检测黄酮类

取乙醇提取液，加入镁粉，再加入浓盐酸，如果产生的泡沫处显桃红色则可能含有黄酮类物质。

三氯化铝反应：将样品溶于甲醇中，加三氯化铝甲醇溶液，3-羟基黄酮、5-羟基黄酮与Al3+产生螯合物而呈鲜黄色。

3.2.7 检测生物碱类

取提取液，加入磷钼酸溶液，若出现白色或黄褐色无定形沉淀，再加氨水沉淀转变为蓝色，则可能含有生物碱类。

3.2.8 检测蒽醌类

样品溶于无水乙醇，点样于滤纸上，喷KOH溶液，在紫外下显黄、橙、紫色荧光，则表明含有蒽醌类物质。

3.2.9 检测鞣质

取明胶于试管，加入样品水溶液，若产生沉淀，则表明含有鞣质。

3.2.10 发泡性实验

取提取物，加水煮沸后滤出水液，振摇产生持久性泡沫，则皂甙检验为阳性。

3.3 有效成分的酶学性质

3.3.1 抑制剂的溶解性

在抑制剂粉末中分别加入蒸馏水、95%乙醇、乙酸乙酯、乙醚、氯仿、环己烷溶液，观察其溶解情况。

3.3.2 有效成分对pH的稳定性试验

先将虎杖提取物用pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的缓冲液配成浓度为0.5mg/ml的溶液，取不同pH的提取物溶液测定其对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，取不同pH的提取物溶液测定其对己糖激酶的激活活性。

3.3.3 抑制剂对温度的稳定性试验

先将的抑制剂溶液分别于20、40、60、80、100℃保温,迅速冷却至室温，然后各取20μl测定对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。

3.3.4 虎杖提取物与α-葡萄糖苷酶和己糖激酶作用时间对酶活的影响

在试管中依次加入磷酸钾缓冲液、还原型谷胱甘肽、α-葡萄糖苷酶和虎杖提取物溶液，37℃分别保温0.5、1、2、4、6min,加PNPG反应后测定抑制活性。

在Tris-HCl缓冲液溶液中，依次加入葡萄糖溶液，辅酶Ⅱ，G-6-PDH，氯化镁溶液，己糖激酶和虎杖提取液,在37℃下保温0.5、1、2、4、10min，加ATP溶液为反应开始，在340nm处扫描6min内吸光度的变化。

3.3.5 虎杖提取物不同加量对酶活性的影响

在各试管中加入磷酸缓冲液，还原型谷光甘肽，α-葡萄糖苷酶，然后分别加入0、5、10、15、20、25、30、35、40μl浓度为0.25mg/ml的虎杖提取物溶液，再用磷酸缓冲液补充测酶活体系为1ml,测定对α-葡萄糖苷酶抑制活性。

在各试管中依次加入Tris-HCl缓冲液溶液，葡萄糖溶液，辅酶Ⅱ，G-6-PDH，10μl氯化镁溶液，己糖激酶,然后分别加入0、20、40、60、80、100、200μl桑叶提取物溶液,再用Tris-HCl缓冲液补充体系总体积为0.99ml，在37℃下保温，加ATP溶液为反应开始，在340nm处扫描6min内吸光度的变化。

3.4 抑制剂溶液吸收峰分布情况

将抑制剂粉末配成0.2mg/ml水溶液，用紫外—可见分光光度计扫描200～800nm，观察其吸收峰出峰情况。

3.5 总黄酮含量测定方法

3.5.1 标准曲线的绘制

称取芸香叶苷对照品0.1730g,加甲醇溶解并稀释。吸取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml分别至25ml容量瓶中，各加水至6.0ml,加1.0ml5%亚硝酸钠，放置6min,加10%硝酸铝1ml,放置6min,加氢氧化

钠10ml,放置15min,在500nm处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。芸香叶苷：1.73mg/ml甲醇溶液。

3.5.2 样品含量测定方法

称取样品3.6mg，溶于1.8ml甲醇中，配成2mg/ml溶液：取0.05ml于比色皿中，加水0.55ml，加入5％亚硝酸钠0.1ml，放置6min，滴加10％硝酸铝0.1ml后，放置6min，加入lmo1／L氢氧化钠1ml，加水0.7ml（使总体积为2.5ml），放置15min，500nm处测定吸光度。在标准曲线中查找浓度，计算即可得出样品的黄酮含量。

3.6 虎杖提取物对小鼠的降血糖作用

3.6.1 糖尿病小鼠模型的建立

四氧嘧啶糖尿病小鼠：取65只正常小鼠，禁食16h,腹腔注射四氧嘧啶后，喂养72h，禁食4h后测血糖浓度，选取血糖值在11.0mmol/L以上者。

3.6.2 球后静脉丛取血

手持毛细管从小鼠内眦部插入，到达球后静脉丛，血液即从管内流入收集管。

3.6.3 分离血浆

取血后立即进行离心，10000r/min离心20min，上层为无色透明的血浆。

3.6.4 测定血糖

测定原理：采用葡萄糖氧化酶（GOD）法；过氧化物酶（POD）。

4 实验结果

4.1 抑制剂的性质测定

4.1.1 抑制剂的一般性质

分离得到的抑制剂为橙黄色粉末状固体，可溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿等极性溶剂，难溶或不溶于环己烷等非极性溶剂；遇碱后颜色迅速由黄色转变为深红色,遇酸则颜色变浅；在强酸作用下，该抑制剂会发生聚合，产生红棕色沉淀。由于黄酮类分子中结合有糖分子，羟基数多，能表现出强亲水性。实验结果说明该样品具有较强的极性，含有亲水性基团。

4.2 提取物成分鉴定

从表4可看出，经过成分化学分析，样品中不含有氨基酸，以及还原糖类物质；可以初步推测其主要成分为黄酮类物质，同时含有少量蛋白质和蒽醌类物质。

4.3 抑制剂的吸收峰分布：

抑制剂样品的水溶液在200～800nm波长范围内扫描吸收峰如图1～3所示。

样品的扫描图谱在220～280nm左右有一个强烈的吸收峰。扫描结果提示在获得的抑制剂分子中含有苯环或者其它具有紫外吸收的基团。此外，成份分析试验的结果也表明抑制剂分子中含有大量的酚羟基。

4.4 虎杖提取物的酶学性质

4.4.1 不同浓度乙醇的洗脱物对α-葡萄糖苷酶活性的影响

如图4所示，40%乙醇洗脱物对α-葡萄糖苷酶的抑制率最高，其次是70%乙醇洗脱物，最后是100%乙醇洗脱物。由此可推断，该虎杖黄酮提取物中对α-葡萄糖苷酶有抑制活性的物质极性较弱，初步推测可能是黄酮苷元。

由于40%的乙醇洗脱物对α-葡萄糖苷酶的抑制率最高，所以接下来重点对40%的乙醇洗脱物进行酶学实验。

4.4.2 虎杖提取物对pH的稳定性

抑制剂样品对pH的稳定性实验结果如图5所示。由图可见，该样品在pH4～11的范围内抑制率维持在80%以上，只有当pH>11时抑制活力才有显著的下降。而在pH=3时，由于抑制剂已经有部分聚合，导致抑制活力比较低。

4.4.3 虎杖提取物对温度的稳定性

样品对温度的稳定性试验实验结果如图6所示。由图可见，在20～100℃范围内，抑制剂对α-葡萄糖苷酶的抑制活性不随温度的变化而发生明显的改变，说明该抑制剂有良好的热稳定性。

4.4.5 虎杖提取物与酶作用的速率

该提取物与α-D-葡萄糖苷酶作用非常迅速，如图7所示，该提取物与酶反应2分钟时，作用率达94.54％，4分钟时已基本作用完全。

4.4.5 虎杖提取物的量对酶的活性的影响

40%乙醇洗脱物对α-D-葡萄糖苷酶具抑制作用。如图8所示，当洗脱物样品（0.25mg/ml）量为25μl时,抑制率可达92.4%,表明该抑制剂成分对α-葡萄糖苷酶具有较强的抑制活性。

4.5 样品中黄酮总含量测定

4.5.1 芸香叶苷标准曲线

4.5.2 样品中总黄酮含量

在500nm处测得不同浓度乙醇洗脱物的吸光度如下表所示，将其代入回归方程后经计算可得出抑制剂中总黄酮的含量。

由表5可得，在乙醇梯度洗脱时，随着乙醇浓度的增高，洗脱物中总黄酮的含量逐渐降低。

4.6 动物实验结果

4.6.1 餐后血糖

选取18只小白鼠，先禁食10h，分成3组（给药组，拜糖苹组，生理盐水对照组），先空腹取血，再灌胃，灌胃后10min左右灌淀粉，在0.5h，1h，2h分别取血。灌药量：拜糖苹100mg/kg，淀粉5g/kg，虎杖提取物300mg/kg。

根据图10，说明该虎杖提取物对正常小鼠的餐后血糖的升高有较好的抑制作用，但与拜糖苹相比，该虎杖提取物对餐后血糖的抑制作用稍弱。

4.6.2 四氧嘧啶糖尿病小鼠模型的建立

取正常小鼠65只编号，禁食16h，腹腔注射四氧嘧啶，正常饲养72h后，禁食4h，测定其血浆血糖浓度。经过分析计算，选取其中的24只小鼠（血糖值在11.0mmol/L以上），并分组如下（见表6），各组小鼠之间的平均血糖值之差≤3mmol/L。

4.6.3 虎杖提取物连续给药对四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖含量的影响

四氧嘧啶糖尿病小鼠24只，分为3组，分别灌胃虎杖提取物（200mg/kg），格华止（100mg/kg），生理盐水，连续8天。末次灌胃后禁食4h，断尾取血测定血浆血糖浓度,结果如图11。

根据图11，表明该虎杖提取物连续给药对四氧嘧啶糖尿病小鼠有降血糖作用，其作用大小与降糖药格华止十分接近。

综合正常小鼠的餐后血糖实验和四氧嘧啶糖尿病小鼠的连续给药实验，两个实验的结果都表明，该虎杖提取物有较好的体内降血糖作用。

5 讨论

本文从虎杖中提取了黄酮类物质，并研究虎杖黄酮提取物的物理、化学以及酶学性质，尤其是对α-糖苷酶的抑制作用情况。

在动物实验中，做了正常小鼠的餐后血糖实验和四氧嘧啶糖尿病小鼠的连续给药实验。两个实验的结果都表明，该虎杖提取物有较好的体内降血糖作用。

从中药虎杖中分离得到的活性较高的α-葡萄糖苷酶抑制剂，是一种作用迅速，与酶的亲和力较好的抑制剂，并且它对于温度和pH有较大的适应范围，因此可作为糖苷酶抑制剂应用于降血糖和治疗糖尿病，开发研制新一代安全有效的抗糖尿病中药，为患者带来福音，发挥出中药虎杖所蕴含的巨大的商业价值，更好地弘扬祖国医学。

参考文献：

［1］ 丰田隆谦.α-糖苷酶抑制药［J］.日本医学介绍，1997,18(8):362-363.

［2］ 李莉.桑叶黄酮类化合物提取方法研究［J］.中国林副特产，2003（1）：30.

［3］ 俞灵莺，李向荣，方晓.桑叶总黄酮对糖尿病大鼠双糖酶的抑制作用［J］.中华内分泌代谢杂志，2002，18（4）：313-315.

［4］ 邵令娴.分离及复杂物质分析(第二版)［M］.北京:高等教育出版社,1994.

［5］ 孙文基.天然药物提取分离与制备［M］.北京:中国医药科技出版社,1994.

提取分离方法 篇4

1 两栖类皮肤分泌物的提取方法

1.1 处死直接提取

将两栖类用双毁髓法处死后, 在冰浴条件下迅速剥皮, 剪碎, 研磨, 以每5g皮肤40ml酸化乙醇 (无水乙醇和0.7盐酸的体积比为3:1) 的比例在4:1条件下浸提24h, 过滤, 收集滤液, 同样方法再浸提2次, 合并上述浸提液, 浓缩冷冻干燥。将冻干粉用蒸馏水溶解, 用枯草杆菌作抑菌试验。

1.2 活体诱导提取

最直接的方法是化学药剂诱导。两栖类可依靠其皮肤颗粒腺分泌相关物质作为物理屏障, 防御外界物质对其机体造成损伤。在此方法中, 人们可以向两栖类动物注射去甲肾上腺素或进行乙醚刺激来收集活性物质。[2]还有就是用物理方法刺激, 如对两栖类背部颗粒腺进行电流刺激等方式收集分泌物。这种该方法速度快, 刺激完的两栖类可再次利用量多。还有就是低温处理, 将两栖类置于零下摄氏低温中, 其表皮也会出现分泌物。

2 两栖类皮肤分泌物分离方法

有关多肽的分离纯化方法很多。常见的有高效液相色谱法 (HPLC) 、高效毛细管电泳法 (HPCE) 等。其中高效液相色谱法应用较为广泛.因为它分离效果好, 速度快, 样品容量大, 回收率高, 已成为生物多肽的主要分离纯化方法之一。HPLC根据样品在固定相和流动相分离过程的物理化学原理不同可分为离子交换色谱、凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱等。其中, 凝胶过滤色谱, 是按照肽分子的大小进行分离得。[3]而离子交换色谱, 按分子所具有的带电基团的胜质和数目进行分离;最后反相高效液相色谱, 按照肽分子的疏水性强弱进行分离。由于原理不一样, 所以这三种方法适用分离对象也不尽相同。

2.1 凝胶过滤色谱

凝胶色谱法是一种简便而有效的液相柱层色谱技术。它利用某些化学惰性的多孔网状结构的物质为填料, 通过洗脱液的连续洗脱, 使混合物中的各种物质按其分子大小不同得到分离。凝胶过滤层析所需设备简单, 具有操作方便、分离迅速.以及不影响样品的生物活性等优点, 广泛应用于大分子两栖类分泌物的分离纯化。

凝胶色谱的主要产品有Sephadcx系、Sepharose系、Bio Gel A系、Bio-Gel P系、Sephacry系、Superdex系及Bio-Beads S-X系等。

2.2 离子交换色谱

离子交换色谱是以离子交换剂作为固定相.交换剂由固定离子基团及可交换的平衡离子组成。当流动相带着组分离子通过离子交换柱时.组分离子与可交换的离子进行可逆变换, 最后达到交换平衡。离子交换色谱法的原理就是根据不同组分离子固定离子基团的亲和力的差别而达到分离的目的。离子交换色谱又可分为阳离子交换色谱和阴离子交换色谱。刘炯宇等利用阳离子交换柱层析SP-650M、凝胶层析凝胶过滤层Sephadex G.75、反相柱层析、高效液相等一系列步骤对无指盘臭蛙皮肤抗菌肽进行了分离纯化, 效果显著。

2.3 反相高效液相

反相高效液相色谱是利用非极性的反相介质为固定相, 极性有机溶剂或其水溶液作为流动相, 根据溶质疏水性的差别进行分离纯化的洗脱色谱法HPLC具有很高的分辨力, 分离对象几乎覆盖所有类型的化合物。由于可使用挥发忡冲洗剂作为流动相, 所以这种色谱不仅适用于分析型的实验, 还适用于制备型的分离。反相色谱利用非极性的反相介质为周定相, 极性有机溶剂 (如甲醇、乙腈等) 或其水溶液作为流动相进行溶质的洗脱分离, 是根据溶质极性 (疏水性) 的差别进行分离纯化的洗脱色谱法。Conlon等利用半制备型RP-H PLC (C18柱) 对R·boylii和R·sp henocep hala皮肤抗菌肽进行了分离纯化, 并将RP-HPLC与质谱结合, 在分离纯化的同时对所收集的抗菌肽分子质量进行测定, 所得两栖类皮肤抗菌肽洗脱峰及分子质量的类别形成了特定两栖类物种的指纹图谱。

3 前景展望

两栖类抗菌肽潜在的应用价值使其备受关注, 我国拥有丰富的两栖类资源, 在近300多种两栖动物中, 有2/3为我国特有物种, 为研究两栖类活性物质提供了丰富的资源库。尽管两栖类皮肤抗菌肽的分离纯化方法很多, 但是, 其分离纯化工艺及应用还存在许多问题。首先, 两栖类抗菌肽天然来源主要是两栖类动物个体, 直接进行提取时需要处死动物个体, 是一种粗放、非持续的利用方式, 从物种保护上也是不支持的。其次, 分离纯化两栖类皮肤抗菌肽时可采取多种不同的技术路线, 但要得到高纯度活性抗菌肽, 相应的分离纯化工艺复杂, 对本身已经非常有限的抗菌肽造成不可避免的损失, 同时也提高了生产成本。[4]两栖类动物皮肤分泌物中含有能够抵御微生物侵染和防止被捕食者侵吞的一些生物活性肽, 这些肽通过演变在哺乳动物中产生了与之相对应的物质。因此两栖类动物皮肤中的生物活性肽的研究在临床方面以及药物的设计和研发的意义已越来越受到关注。鉴于抗菌肽的抗菌谱广, 具有耐药性等特点, 在农业中也发挥着不可替代的作用, 通过转基因技术可以提高动植物的抗病能力。

摘要：因为两栖类皮肤分泌物中富含多种活性肽, 所以两栖类皮肤分泌物越来越受到蛋白质研究人员的关注。本文简述了几种两栖类皮肤堕多肽的纯化方法, 以期为两栖类皮肤多肽的研究提供理论依据。

关键词：两栖动物,皮肤多肽,提取纯化

参考文献

[1]LAI Ren, ZHAO Yu, YANG Dong-ming, et al.comparative Studyof the Biological Activities of the Skin Secretions from Six CommonChinese Amphibians[J].Zoological Research, 2002, Apr, 23 (2) :113-119.[1]LAI Ren, ZHAO Yu, YANG Dong-ming, et al.comparative Studyof the Biological Activities of the Skin Secretions from Six CommonChinese Amphibians[J].Zoological Research, 2002, Apr, 23 (2) :113-119.

[2]马瑜, 孙燕, 李治.两栖类皮肤抗菌肽的分离纯化与抗菌活性检测技术[J].药物生物技术, 2010, 17.[2]马瑜, 孙燕, 李治.两栖类皮肤抗菌肽的分离纯化与抗菌活性检测技术[J].药物生物技术, 2010, 17.

[3]白冰, 王剑.两栖动物皮肤几类生物活性多肽的研究进展[J].科技信息, 2011 (5) .[3]白冰, 王剑.两栖动物皮肤几类生物活性多肽的研究进展[J].科技信息, 2011 (5) .

叶绿体色素的提取分离实验报告 篇5

第一部分提取与分离

一实验目的学习应用薄层色谱法分离叶绿体色素的实验方法

二实验原理

叶绿体是进行光合作用的细胞器。叶绿体中的叶绿体a(C55H72O5N4Mg)、叶绿素b(C55H72O6N4Mg)、胡萝卜素(C40H56)和叶黄素(C40H56O2)与类囊体膜结合成为色素蛋白复合体。这些色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇等有机溶剂提取。提取液可用薄层色谱法加以分离与鉴别。

薄层色谱分析法是将吸附剂均匀的涂在玻璃板上成一薄层，将此吸附剂薄层做固定相，把待分离的样品溶液点在薄层板的下端，然后用一定量的溶剂做流动相，将薄层板的下端浸入到展开剂中。流动相通过毛细管作用由下而上的逐渐浸润薄层板，并带动样品在板上也向上移动，样品中各组分在吸附剂和展开剂之间发生连续不断的吸附、脱附、再吸附、再脱附……的过程。由于吸附剂的吸附能力大小不同，吸附力强的物质相对移动慢一些，而吸附力弱的则相对移动快一些，从而使各组分有不同的移动速度而彼此分开。

三实验材料与试剂新鲜的菠菜叶片体积分数为95%的乙醇，碳酸钙粉末，展开剂(石油醚:丙酮:苯=7:5:1，体积比)3 天平，研钵，漏斗，三角瓶，剪刀，点样毛细管，层析缸，硅胶预制板，滤纸

四实验步骤

(一)色素提取液的制备取新鲜叶片4至5片(2g左右)，洗净，擦干叶表面，去中脉剪碎，放入研钵中。研钵中加入少量碳酸钙粉末，加2至3ml体积分数为95%的乙醇，研磨至糊状，再加10至15ml体积分数为95%的乙醇，上清液用漏斗过滤，残渣再用10ml体积分数为95%的乙醇冲洗一次，一同过滤于三角瓶中，即制成叶绿体色素提取液。提取液应避光保存。

(二)叶绿体色素的分离取硅胶预制板一个，用点样毛细管吸取上述提取液，平行于硅胶板的短边，距下边缘约1cm处用毛细管划线，风干后再划第二次，重复操作3至4次。在干洁的层析缸中加入适量的展开剂，高度约0.5cm，将硅胶预制板带有色素的一端放下，使其浸入展开剂中(但不要使待测样品浸入展开剂中)。迅速盖好层析缸盖。此时，展开剂借毛细管作用沿硅胶预制板向上扩散，并把叶绿体色素向上推动，不久即可以看到各种色素的色带。当各种色素的得到较好分离，展开剂前沿接近硅胶预制板上端近边缘处时，取出硅胶预制板，并迅速用铅笔标出展开剂前沿和各色素带的位置。

五实验结果及数据、分析

经过薄层色谱分离后，叶绿素a为蓝绿色，叶绿素b为黄绿色，叶黄素为鲜黄色，胡萝卜素为橙黄色。各色素带在薄层中的位置可用相对比移值Rf表示，即

Rf=斑点中心到原点的距离/溶剂前沿至远点的距离

由于不同组分具有不同的Rf值，所以比较Rf值可以进行定性分析。但是，实验中的很多因素也可以影响到Rf的值，例如吸附剂的种类、层析缸的形状大小、温度、展开剂的浓度等等。

最后测得数据：Rf(胡萝卜素)=0.972，Rf(叶绿素a)=0.908,Rf(叶绿素b)=0.856，Rf(叶黄素)=0.804。

第二部分理化性质

一 实验目的验证叶绿体色素的理化性质

二实验原理

叶绿素是一种由叶绿酸和叶绿醇形成的复合酯，故可与碱起皂化反应而生成甲醇和叶绿醇及叶绿酸盐，产生的盐能溶于水，故可用此法将叶绿素和类胡萝卜素分开。叶绿素吸收光量子而转变成为激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回倒基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。叶绿素的化学性质很不稳定，容易受到强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。叶绿素中的镁可以被H+所取代而生成褐色的去镁叶绿素。去镁叶绿素遇铜则成为铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易被破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。

三实验材料及试剂新鲜菠菜叶片刻度试管，小试管，试管架，水浴锅，10ml移液管体积分数为95%的乙醇，苯，醋酸铜粉末，质量分数为5%的稀盐酸，醋酸-醋酸铜溶液，氢氧化钾-甲醇溶液

四实验步骤

(一)光对叶绿素的破坏作用取2支小试管，各加入2.5ml叶绿体色素乙醇提取液，并用体积分数为95%的乙醇稀释一倍。其中一支放在直射日光下，另外一支放在暗处或用锡箔纸包严，40分钟后对比观察颜色有何变化。另取本实验中用薄层层析分离成的硅胶色谱板一个，按长度方向将一半用黑色纸或塑料薄膜包住，放在直射日光下，半小时后观察，比较色谱板上各色素的颜色有何变化。

(二)皂化作用取1支10ml刻度的试管加入3ml浓的叶绿体色素乙醇提取液，加入1ml氢氧化钾-甲醇溶液，充分摇匀。片刻后，加入3ml苯，摇匀，再沿试管壁慢慢加入1ml左右的蒸馏水，轻轻摇匀(勿激烈摇荡)，然后置于试管架上静置分层。若溶液不分层，则用滴管吸取蒸馏水，沿管壁滴加，边滴加边摇动，直到溶液开始分层时，静置。

(三)H+和Cu+对叶绿素分子中的Mg+的取代作用取两支试管，第一支试管中加叶绿体色素提取液5ml，作为对照。第二支试管中加入叶绿体色素提取液5ml后，再加入质量分数为5%的HCl数滴，摇匀，观察溶液颜色变化。当溶液变褐后，再加入少量醋酸铜粉末，60℃水浴加热，观察溶液颜色变化情况，并与对照试管相比较。取新鲜植物叶片两片，放入试管中，加醋酸-醋酸铜溶液，使之没过叶片，90℃水浴加热，随时观察叶片颜色的变化，直至颜色不再变化为止。

(四)荧光现象的观察

取一支小试管加入3ml浓的叶绿素乙醇提取液，在直射光下照射，比较溶液的透射光与反射光的颜色有何不同。

五实验结果及分析在光对叶绿素的破坏的实验中，未观察到提取液的颜色变化以及个色素的颜色变化，分析其原因，可能是因为当时的阳光已经不够强烈，不足以对色素达到破坏的程度，而且放置的位置不够好，不能使样品被阳光直射，而且放置的时间也可能不够长，所以导致此试验失败。2 静置一段时间之后，溶液逐渐分为两层，下层是稀的乙醇溶液，其中溶有皂化的叶绿素a和叶绿素b(以及少量的叶黄素)，呈绿色；上层是苯溶液，其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素，呈黄色；最下层有少量黄色乳状液体，这是由于皂化液沉积引起的。·当加入了少量的盐酸后，溶液在短时间内变为了褐色，再加入少量的醋酸铜粉末，水浴加热一段时间后，溶液又重新变为了蓝绿色。

·90℃水浴加热约半个小时以后，叶片变为黄色，约一个半小时以后，叶片又逐渐恢复为蓝绿色。荧光现象:透射光下呈绿色，反射光下呈红褐色。

提取分离方法 篇6

【关键词】高中生物 实验提取与分离完善的策略

【中图分类号】G633.91【文献标识码】A 【文章编号】2095-3089（2016）05-0182-01

生物是一门多实验学科的课程，它大量的学科知识都来源于实验，对于高中阶段的学生来说，生物课中的实验研究就显得尤为重要了。我们要在生物教材中不断的学习与探索，让学生既能学到学科知识，又能学到实验方法。本文就对绿叶中色素的提取与分离中的实验进行适量的探讨与完善，使实验更简单，学生更容易接受。[1]

一、“绿叶中色素的提取与分离”实验研究的必然性

“绿叶中色素的提取与分离”是高中生物实验课的课程中最为重要的一课。我们在学习光合作用的这一课时，按照其生物课教学目标的指示，想要进行良好的光合作用，就必须掌握并学习好叶绿素的提取与分离技术，因为在进行光合作用普光的时候，叶绿体是光合作用开展的主要场所，它也是光合作用在进行光照的过程中最为重要的组成部分，所以，我们在高中生物课的教学目标指引下，如若要熟练的掌握好“叶绿体中色素的提取与分离”才能更好的完全理解进行光合作用，色素的类别、色彩以及提取的作用，从而进一步掌握自我对光合作用的理解。[2]

二、“绿叶中色素的提取和分离”的实验探讨与完善的策略

（一）材料的完善与装置的改进

1.改善实验材料

将原有的实验材料赤根菜换成为竹叶菜。原因是竹叶菜的色度较为浓绿，菜叶片比较薄，它的含水量较少，黑褐色变化的过程不太明显，其次选择它的原因是竹叶菜的色素量较高，在不停的研制后液体量可变得非常浓稠，而且它是绿色植物中一种常见的植物，所以在选取过程中材料容易找到。[3]

2.改进滤纸条

将原已准备好的滤纸晒程干燥状态，在将滤纸条的长宽度进行调整。然后在滤纸条的末端剪去两个角，再在该角处1.5cm地方，用彩笔做记号。

3.改进层析装置

教材中所使用的层析装置是试管。试管的入口较小，它能有效的减少层析液体的挥发，但由于试管内部空间狭小，导致滤纸条容易贴在试管壁上，从而导致实验容易失败。针对这一点现将层析装置改为简单的层析瓶。这样才能使滤纸条不贴在试管壁上。[4]

（二）实验过程的改进

1.过滤网的改进： 由于单层纱布的透光性好，所以在过滤时选择单身纱布较好，这样既可以是叶绿素更好的进行光合作用，又可以避免叶绿素直接与空气接触，防止叶绿素被挥发和损坏。

2.叶绿素色度的分层：使用已经准备好的滤纸条，用彩笔画出滤液的高度，在标记滤液高度的时候要均匀的摇晃液体，使色度层次清晰可见，等首次划线部分完全干之后再重复前面的方法才能重新画2至3次，让色素的颜色变深，以至于可以保证分层之后的色度清晰可见，效果最好。在把分好层的绿叶素色度，根据上述装置的改进，笔者觉得在使用烧制器皿方面用烧杯的方法最好，我们可以依照烧杯的高度研制备用的滤纸条，让滤纸条的长度高于烧杯1厘米，再将其高出的部分折成直角样子，然后用透明的胶带放在培育的皿杯中。在将分层装置底层层析液体隔开烧杯内壁，在放置过程中尤其小心不要随意摆动装有液体层的烧杯，要阻止滤纸条碰触到烧杯内层壁上的层析液体。且分层的时候，滤液中线也不要沾到分层中的液体，不然会导致色度会溶进分层的液体中，从而导致叶绿素中的色素度的色度量变少，严重的结果将会使得叶绿素分层失败。[5]

以上装置的改进与实验的阐述，教师可以依照指导学生的实际情况后得出的结果，再对课本中的其他实验进行相似的改进与探究。教师也要在教授实验的时候，注重培养学生的观察能力；分析事物的能力、控制事物的变因以及能正确的传达、预测推理能力。将实验中将要出现的情况进行假设实验结果的分析能力。

三、结语

综上所述， 在新课程标准的改革之下，高中生物课的教学目标不再只是要学生掌握生物课本中的知识了，而更多的是，高中阶段的学生在学习课本知识的同时，要掌握并熟练运用生物实验室的器材进行自我的实验操作。因此，教师在上高中的生物实验课时，不仅要善于培养与伐善学生对生物实验课潜在的能力，也要开展好并实施好传统生物的实验课。对于实验操作的经验上来说，要把实验性与探究性作为实验课研究的主要目的，要将自己多年的实验经验，以最简便的方式和最通俗易懂的语言传递给学生。让学生在进行实验课操作的时候能更好的让他们自己发现探究意识的趣味性和动手能力的重要性，从而提升学生自我解决问题的能力和在试验操作中既能与知识完美的结合。[1]

参考文献：

[1]张姝.谈科学过程技能在高中生物探究性实验教学中的培养——以“绿叶中色素的提取和分离”为例[J].山东教育学院学报，2010，02：83-85.

[2]赵艳玲. 新课程下高中生物探究实验存在的问题及实验教学的策略研究[D].东北师范大学，2008.

[3]张梦瑶. 浅析高中生物“绿叶中色素的提取和分离”的实验完善[J]. 亚太教育，2015，34：38.

[4]苏晶晶，韩琳，陈德来. “绿叶中色素的提取和分离”实 验材料的选择[J].中学生物教学，2015，（ 08） ： 63.

提取分离方法 篇7

关键词：绵萆藓,甾醇类,提取分离鉴定方法

绵萆薢(Rhizoma Dioscoreae Septemlobae)为薯蓣科植物,主产于江西、浙江、福建等地。据江西赣南的民间流传,将绵萆薢用白酒浸泡后,外用治疗带状疱疹及后遗神经痛。经临床验证,甾醇类是其有效成分。本文将绵萆薢中甾醇类的提取分离和鉴定方法报告如下。

1实验仪器、材料与试药

TGL-16高速台式离心机,上海医疗器械六厂。TG328A电光分析天平,上海天平仪器厂。绵萆藓,端午节前从集市上收购鲜货,加工成干燥、细薄的饮片,备用。胆固醇(500 g/瓶,批号070227,山东泰山生化原料公司)。薯蓣皂甙元(100 mg/支,批号200705,江西省食品药品检验所提供)。石油醚,乙醚,氯仿,丙酮,乙醇等均为分析纯试剂。

2方法与结果

2.1 提取分离

取绵萆藓饮片1000 g,置具密封盖的玻璃罐中,加50%乙醇1000 ml,密闭浸泡7 d,期间不时搅拌。然后,用四层纱布初滤,挤压滤渣,滤液密闭静置后,移开上层清液,将下层沉淀离心。合并两清液,再用滤纸过滤,得滤液600 ml。将滤液减压浓缩至浸膏,50℃干燥,得提取物35.8 g。

取上述提取物,加石油醚60 ml,在水浴上加热回流1 h,过滤,滤液减压浓缩至浸膏,50℃干燥,所得提取物编号为1。同样操作,将前面的滤渣依次使用乙醚、氯仿、丙酮、乙醇提取,所得提取物分别编号为2、3、4、5。最后剩下的滤渣编号为6[1,2]。

2.2 药液配制

取上述六个组分,分别加入50%乙醇,充分溶解或提取,配制成相应编号的浓度为2%的药液,密闭,冷藏备用。

2.3 鉴定

根据甾醇类的结构和理化特性,对六个组分做初步鉴定。

2.3.1 取1号药液适量,用pH试纸测定呈中性。

置试管中振摇后,产生持久性肥皂样泡沫,滴加胆固醇乙醇溶液,产生沉淀。这些特性提示含甾体皂甙类物质[1]。其余五个组分反应不明显。

2.3.2 取1号组分约0.1g,加氯仿3 ml振摇数分钟,取上清液供试。

另取薯蓣皂甙元用氯仿制成1 mg/ml作对照。各取10μl点样于同一硅胶-1%CMC薄层板上,用氯仿-丙酮(13:1)展开12 cm,喷雾3%磷钼酸乙醇试液,105℃加热显色。对照品显蓝色,供试品在相应位置上有相同色斑[2]。其余五个组分反应不明显。

2.3.3

取1号组分少许,溶于5ml用盐酸酸化的无水乙醇中,加异烟肼试液(0.5 mg/ml)4 ml,加塞振摇,逐渐产生黄色。这是与甾醇结构中C3-酮基形成异烟腙的表现[3]。其余五个组分反应阴性。

2.3.4

取1号组分少许,溶于乙醇中,使成约1mg/ml,取20 ml置于50 ml带玻塞的锥形瓶中。取20 ml乙醇置于另一带塞锥形瓶作为空白。各加入蓝四氮唑试液2 ml,再加入稀氢氧化四甲基铵试液2 ml,混合,黑暗处放置90 min。供试液变成红色,空白对照不变色。将红色的供试液加热,则变蓝色。这是甾醇结构中C17-醇酮基将四氮唑盐还原为有色formazan的表现[3]。其余五个组分反应阴性。

3讨论

3.1 使用50%乙醇提取,是参照民间白酒浸泡药材的乙醇浓度。鉴定结果表明,1号组分的反应最明显,与临床试验中疗效最显著的结果相一致。初步鉴定含有甾体皂甙类、薯蓣皂甙元、甾醇类等。绵萆薢含有4种以上薯蓣皂甙类物质,都会水解产生薯蓣皂甙元及甾醇类物质[4]。

3.2 薯蓣皂甙元是合成激素类药物的重要原料,而许多甾醇类物质具有皮质激素样的抗炎、抗毒素作用[2]。皮质激素可抑制带状疱疹引起的神经细胞炎症过程,减轻神经节的炎症,对抑制成纤维细胞的增值、降低胶原的合成、抑制炎症后纤维化有明显的作用,能有效缓解疼痛并防止后遗神经痛的发生[5]。因此,绵萆薢能够有效治疗带状疱疹神经痛,可能与其含有类似皮质激素的成分有关。

参考文献

[1]王宪楷.天然药物化学.人民卫生出版社,1988:34,506.

[2]徐国钧.生药学.人民卫生出版社,1987:459.

[3]安登魁.药物分析.人民卫生出版社,1986:198.

[4]张贵君,徐国均主审.常用中药鉴定大全.黑龙江科学技术出版社,1993:790.

提取分离方法 篇8

鸡血藤为豆科植物密花豆属密花豆(Spatholobussuberectus Dunn)的干燥藤茎。鸡血藤,又名大血藤、血藤、血风藤、三叶鸡血藤,是补血活血的传统中药。

鸡血藤中的化学成分复杂,包含黄酮类、三萜类、蒽醌类化合物及钙、锌、铜、钠、镁、铁、锰、铝等微量元素。其中的黄酮类化合物是主要成分,但是人工栽培的鸡血藤原药中,总黄酮的含量低于2%,不能较好发挥其活性成分。因此,研究鸡血藤中黄酮类化合物的最佳提取方案和提取条件具有重要的意义。

本文主要概述了鸡血藤的药用价值以及近年来鸡血藤中有效成分(主要是黄酮类化合物)的提取、分离方法的研究进展。

1 鸡血藤的药用价值

鸡血藤味苦,微甘,性温,归肝、肾经。鸡血藤始载于《本草纲目拾遗》,分布于广西、云南、广东、贵州、福建,主产于广西,在广西主要分布于宁明、龙州、南宁、金秀等地。《本草再新》中称其能补中燥胃;《本草纲目拾遗》中称其能活血,暖腰膝,具有补血活血、调经止痛、舒筋活络之功效,常用于月经不调、痛经、经闭、风湿痹痛、麻木瘫痪、血虚萎黄等患者的治疗,药用需求量大。

近年来,临床上常用鸡血藤治疗贫血以及各种原因(如放疗、化疗)引起的白细胞、血小板、红细胞等全血象减少和再生障碍性贫血等疾病,且疗效较好。现代药理学研究证明,鸡血藤还具有抗肿瘤、抗病毒、免疫调节、对酪氨酸酶双向调节、抗炎、抗氧化、镇静催眠等作用[1]。鸡血藤除具有改善造血系统的作用以外,还具降血脂、降血压、抗心律失常等作用。然而,鸡血藤叶为非药用部位,至今对其资源的开发利用研究尚未起步,临床上虽有用于治疗神经性皮炎[2],但不多见。

1.1 对心血管系统的影响

王秀华等[3]通过研究鸡血藤对颈动、静脉旁路血栓形成的影响,测定了ADP诱导的血小板最大聚集率,结果表明:鸡血藤具有明显的抑制血小板的聚集性作用,可显著降低血栓湿重,说明鸡血藤具有显著的抗血栓形成作用,从理论上验证了鸡血藤活血化瘀的传统功效。

李丽等[4]通过观察鸡血藤总黄酮对实验性急性心肌缺血大鼠的保护作用,采用结扎左冠状动脉前降支方法,复制大鼠急性心肌缺血模型,观察鸡血藤总黄酮对大鼠的不同时间点心电图及心肌组织形态学的影响,得出结论:鸡血藤总黄酮对结扎左冠状动脉前降支所致大鼠急性心肌缺血具有明显的保护作用,其机制可能与清除自由基和抗脂质过氧化物有关。

1.2 对肝损伤的改善

亢泽春等[5]通过观察鸡血藤总黄酮对乙醇所致肝损伤小鼠的保护作用及其抗肝损伤作用机制,发现鸡血藤总黄酮能明显改善乙醇所致肝损伤,抑制氧化应激反应,减轻线粒体损伤。

1.3 对血液系统的影响

刘屏等[6]通过研究从鸡血藤中提取的9个单体化合物对骨髓抑制小鼠造血祖细胞增殖的影响,采用血清药理学方法,通过造血祖细胞培养观察9个化合物对骨髓抑制小鼠CFU-E、BFU-E、CFU-GM、CFU-Meg生长的作用,结果表明:从鸡血藤中提取的单体化合物可刺激骨髓抑制造血祖细胞的增殖,缓解造血祖细胞的内源性增殖缺陷。

梁宁等[7]通过观察鸡血藤总黄酮(STF)对化学因素所致的血虚小鼠外周血象及血清白细胞介素-3(IL-3)、促红细胞生成素(EPO)水平的影响,采用盐酸苯肼(APH)、环磷酰胺(CTX)复合造模,检测外周血象RBC、HGB、HCT及血清IL-3、EPO水平,得出结论:鸡血藤总黄酮具有抗贫血作用,其作用机理与促进机体分泌IL-3、调节EPO水平、促进红系造血有关。

1.4 抗肿瘤作用

唐勇等[8]通过体外、体内实验研究鸡血藤黄酮类组分的抗肿瘤作用,采用MTT法,观察鸡血藤黄酮类组分体外对人肺癌(A549)和人大肠癌(HT-29)细胞系的生长抑制率,得出结论:鸡血藤黄酮类组分具有直接的抗肿瘤作用,细胞周期阻滞是其药效的作用机制之一,该组分无骨髓抑制作用,对红细胞生成有一定促进作用。

1.5 镇静催眠的功效

李娜等[9]将鸡血藤粉碎成粗粉,精密称取500 g,加6倍蒸馏水煎煮2 h,过滤;药渣加4倍蒸馏水煎煮1.5 h,过滤;药渣加2倍蒸馏水煎煮1.5 h,过滤;合并滤液,浓缩至625 m L。给药后,通过记录小鼠自主活动次数,发现鸡血藤水提物具有镇静和催眠的作用。

1.6 抗辐射作用

刘屏等[10]对鸡血藤儿茶素的抗辐射效果进行了研究,通过乙酸酐、丙酸酐、苯甲酰氯在碱性溶剂下与儿茶素反应,对合成产物纯化后进行结构鉴定。60Co-γ射线(剂量为6 Gy)照射小鼠造成辐射模型,照后给予儿茶素灌胃,并于照射前后取鼠尾静脉血,测外周血白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、血小板(PLT)数值,结果表明:儿茶素有一定的抗辐射作用。

1.7 调脂作用

王巍[11]将6周龄日本鹌鹑喂有胆固醇和脂肪的诱发饲料,同时灌喂其煎剂每天6 g/kg,连续给药60天,测定血中胆固醇含量,结果表明:鸡血藤对血中总胆固醇含量随时间延长有降低趋势;对高密度脂蛋白HDL2-C有升高趋势,而HDL3-C则明显降低,明显增加LCAT活性,有利于防治动脉粥样硬化,亦能延缓强直性脊柱炎As的病变过程。

2 鸡血藤中的有效成分

鸡血藤中的化学成分主要包括黄酮类、萜类、甾醇类、木质素类、蒽醌类及一些微量元素,其中黄酮类化合物的含量最多。

2.1 微量元素

鸡血藤中含有多种微量元素,包括钙、锌、铜、钠、镁、铁、锰、铝等,采用HNO3及HCl O4混合酸的湿法消解体系,用电感耦合等离子体原子发射光谱法可同时测定鸡血藤中的铁、锰、镁、锌、铜5种元素[12]。

殷晶玉等[13]建立了硝酸-高氯酸混酸消化、火焰原子吸收法,来测定鸡血藤中的多种微量元素,该方法快速、灵敏、准确,为鸡血藤的进一步研究提供了科学依据。

池玉广等[14]建立了广东和广西产鸡血藤中4种微量元素的检测方法。

2.2 黄酮类化合物

郑岩等[15]用溶剂法和色谱法从鸡血藤95%乙醇提取物的石油醚及醋酸乙酯萃取物中分离鉴定了5种化合物:分别为3-羟基9-甲氧基紫檀烷、芒柄花素钠、芒柄花素、大豆苷元、7,4′-二羟基-3′-甲氧基异黄酮。

冯洁等[16]通过色谱法从丰城鸡血藤中分离得到了4种异黄酮类化合物,用理化性质及波谱方法鉴定其结构,分别为3′-O-methylorobol(1)、染料木素(genistein,2)、鹰嘴豆芽素A(biochanin A,3)、阿弗洛莫生(afromosin,4)。

2.3 三萜类化合物

崔艳君等[17]从鸡血藤原植物白花油麻藤中分离出了亚洲积雪草酸甲醋、马思宁酸甲醋、油麻藤宁A、油麻藤宁B、3-O-(6-O-甲基-β-葡萄糖醛酸基吡喃糖基)亚洲积雪草酸甲醋等8种三萜类化合物。

严启新等[18]从密花豆脂溶性部位中分离得到了羽扇豆醇(lupeol)、羽扇豆酮(lupeone)这两种羽扇豆烷型三萜类化合物。

2.4 蒽醌类化合物

严启新等[19]通过乙醇回流提取、有机溶剂萃取和硅胶柱色谱法,从鸡血藤的醋酸乙酯和正丁醇部位中分离得到了6种化合物。通过光谱数据和理化常数分析,鉴定了它们的结构,分别为7-酮基谷甾酮(Ⅰ)、大黄素(Ⅱ)、大黄酸(Ⅲ)、芦荟大黄素(Ⅳ)、胡萝卜苷(Ⅴ)和表儿茶精(Ⅵ)。

3 鸡血藤中有效成分的提取

3.1 传统提取法

鸡血藤中有效成分的传统提取方法有浸渍、渗漉、水煎煮、有机溶剂回流提取等,这些提取方法在中草药的有效提取中应用较为广泛。

张夏辉等[20]采用水浴加热法提取鸡血藤中的黄酮类化合物,以乙醇为提取溶剂,在单因素考察的基础上,进行四因素三水平正交试验。在最佳提取条件下,即料液比1:30、乙醇体积分数50%、提取温度80℃、提取时间3 h,鸡血藤中总黄酮的提取率为7.75%,提取效果理想。

刘仰斌等[21]用索式提取器,采用U(94)均匀设计表设计试验,提取鸡血藤总黄酮,最佳条件是:60%的乙醇、鸡血藤粉碎程度50目、料液比为1:40、提取药材时间为2.5 h。此工艺操作简便合理,结果稳定可靠,重复性好,具有可行性,可推广应用。

黄福荣等[22]选择水煎煮法,采用正交设计试验,以总黄酮提取率为指标,优化提取工艺,得到最优提取工艺为:以加8倍的水煎煮3次,每次2.5 h。此提取工艺能最大限度地提取出云南鸡血藤中的总黄酮,方法简单、经济,既适合于实验室提取,也适用于工业化大生产。

张凌等[23]选择溶剂浸提法,采用正交实验,以提取液在460 nm波长处的吸光值为考察指标,考察提取温度、提取时间、液料比、溶剂p H对鸡血藤红色素提取效果的影响。最佳提取条件为:提取温度60℃、时间120 min、液料比30:1、pH值为2的60%乙醇溶液提取3次。在此工艺条件下,鸡血藤红色素提取率为96.7%。该提取工艺稳定,可用于鸡血藤红色素的提取。

3.2 超声波辅助提取法

超声提取技术是近年来应用在中草药有效成分提取分离方面的一种较新的且较为成熟的手段。研究表明,利用超声波产生的强烈振动、高加速度、强烈空化效应、热效应、搅拌作用等,可以使得药物有效成分快速进入溶剂,从而提高提取效率,缩短提取时间,节约溶剂,且免去了高温对提取成分的破坏[24]。

程悦等[25]以超声波辅助提取鸡血藤中的总黄酮,最佳提取条件为:60%乙醇超声30 min、回流30 min,提取的总黄酮为9.86%,远高于H2O回流60 min提取得到的总黄酮5.47%。

周光姣等[26]以超声辅助乙醇提取鸡血藤中的总黄酮,最佳提取条件:50%乙醇、超声波功率为100 W、提取1.5 h、提取温度为80℃。超声波辅助提取可大大缩短提取时间,减少溶剂用量,降低提取污染,节能减排,符合工业化大生产的发展趋势。

3.3 微波辅助提取法

微波提取是利用不同结构的物质在微波场中吸收微波能力的差异,使基体物质中的某些区域或提取体系中的某些组分被选择性加热,从而使被提取物质从基体或体系中分离进入介电常数较小、微波吸收能力相对差的提取剂中。

赖红芳等[27]利用正交试验法对微波辅助提取鸡血藤多糖的工艺条件进行了优化,其最佳提取条件:固液比1:40、提取时间5 min、提取次数4次、微波功率80 W。此时鸡血藤多糖的提取率为5.59%。

3.4 酶解提取法

酶解提取是天然产物分离过程中的一种新方法,在提取植物有效成分的过程中,当存在于细胞原生质体中的有效成分向提取介质扩散时,必须克服细胞壁及细胞间质的双重阻力。选用适当的酶,如纤维素酶、果胶酶等,作用于药用植物材料,可使细胞壁及细胞间质中的纤维素、果胶质等降解,破坏细胞壁的致密结构,减小细胞壁、细胞间质等传质屏障对有效成分从细胞内向提取介质扩散的传质阻力。酶解提取具有反应条件温和、选择性高的特点,而酶的专一性可避免对底物以外物质的破坏,在提取热稳定性差或含量较少的化学成分时,优势更为明显。

4 鸡血藤中有效成分的分离

4.1 溶剂萃取法

溶剂萃取法是利用化合物在两种互不相溶或微溶的溶剂中溶解度或分配系数的不同,使化合物从一种溶剂内转移到另外一种溶剂中的方法。

章丽华[28]采用乙酸乙酯萃取法、氯仿萃取法、大孔树脂S-8、AB-8、H-103三种方法提取富集在丰城鸡血藤中的活性成分———黄酮类化合物,大孔树脂S-8提纯物总黄酮量最高,乙酸乙酯和氯仿提纯物及大孔树脂AB-8、H-103与S-8提纯物活性成分的组成基本相同,大孔树脂S-8提纯物对DPPH、O2-·和·OH自由基都具较强的清除活性,而其他四种提纯物对·OH自由基基本没有清除活性。

4.2 超临界二氧化碳萃取法

CO2具有较温和的临界温度31.1℃和临界压力7.31 MPa,而且它具有价格低、无毒、阻燃、易于分离并可循环利用等优点[29]。因此,超临界CO2被广泛应用于萃取、化学反应(有机合成、催化反应、氧化反应、加氢反应、聚合反应等)、材料制备(高分子材料及其改性、无机及有机材料)等方面。其中研究最多的是超临界CO2萃取技术在医药保健品、食品、天然香料的提取等方面的应用[30]。在食品工业中,利用超临界CO2萃取植物油脂的技术越来越引起人们的关注。因为超临界萃取可以在接近室温的情况下操作,能有效地防止热敏性生物活性成分的氧化和逸散,所以该技术特别适用于分离、精制低挥发度和热敏性物质的提取,可有效地避免传统提取方法中有机溶剂的残留对人体的毒害和对环境的污染。

4.3 大孔树脂分离纯化法

大孔树脂作为一种新型吸附剂,在中药纯化、富集黄酮类化合物方面有着广泛的应用。大孔树脂是一种具有大孔结构的有机高分子共聚体,是一类人工合成的有机高聚物吸附剂。其理化性质稳定,一般不溶于酸碱及有机溶媒,在水和有机溶剂中可以吸收溶剂而膨胀。大孔树脂的分离纯化原理是通过范德华力和氢键的作用形成吸附,根据不同极性树脂对不同极性物质产生选择性吸附,从而达到分离纯化的目的。

韩伟等[31]通过对六种型号大孔树脂的静态实验,筛选出最佳树脂,考察最佳树脂对鸡血藤总黄酮的吸附及洗脱性能,优化工艺参数。结果表明:HZ820为最佳树脂,其纯化总黄酮的优化工艺条件为上样液质量浓度3.31 mg/m L,吸附流速4 BV/h(1 BV为20 m L),上样液体积500 m L,树脂吸附量达79.31 mg/g;以60%乙醇为洗脱剂,洗脱流速3 BV/h,洗脱用量5 BV,解吸率达92.72%,减压浓缩得鸡血藤总黄酮浸膏,纯度为79.49%。

王宏等[32]以鸡血藤总黄酮含量为指标,考察了四种不同型号大孔树脂对鸡血藤总黄酮的比吸附量和比洗脱量。结果发现:通过吸附容量和洗脱效果的比较,FL-2和DS-401型号树脂对鸡血藤总黄酮的吸附容量大,易洗脱。

王婷婷等[33]通过静态吸附实验研究了AB-8和H103两种大孔吸附树脂对丰城鸡血藤总黄酮的吸附特性,筛选出适合丰城鸡血藤总黄酮分离纯化的树脂,并对其进行了动态吸附特性研究。结果表明:AB-8树脂对丰城鸡血藤总黄酮具有良好的吸附和解吸性能,经AB-8树脂吸附富集后,样品总黄酮含量由7.44%提高到40.61%。

应军等[34]测试了六种树脂对鸡血藤总黄酮的吸附率、吸附速率、解吸率和产物得率及其黄酮含量,研究发现,HPD400、AB-8弱极性树脂是性能良好的鸡血藤总黄酮吸附剂,可用于从鸡血藤提取物中富集总黄酮,制备含量达50%以上的总黄酮,为鸡血藤中总黄酮的开发提供新工艺。

4.4 高速逆流色谱分离纯化法

高速逆流色谱(high speed countercurrentchro-matography,简称HSCCC),是一种液-液色谱分离技术,它的固定相和流动相都是液体,没有不可逆吸附,样品无损失,无污染,高效、快速,制备量大。与传统柱色谱相比,高速逆流色谱具有分离速度快、样品吸附低、分离重现性好等优点,因此在天然植物有效成分的分离纯化领域得到较广泛的应用。

冯雪娇等[35]利用正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水四元两相溶剂体系,通过HSCCC法从鸡血藤醋酸乙酯萃取物中分离得到了两种黄酮类成分,鉴定为甘草素(CS1)和刺芒柄花素(CS2),用HPLC峰面积归一化法分析两者的质量分数分别为93.6%和94.3%。用MTT法抗肿瘤活性测定发现,CS1对A549细胞显示增殖抑制活性,当质量浓度为200μg/m L时,对A549细胞的增殖抑制率为49.9%。

阮征等[36]利用高效液相色谱测定丰城鸡血藤中刺芒柄花素在两相溶剂体系中的分配系数K,通过K值优化确定高速逆流色谱分离的两相溶剂体系,并测定刺芒柄花素的纯度。用于高速逆流色谱分离的两相溶剂体系为:正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(4:5:4:5,V/V),体系的上相为固定相,下相为流动相。高速逆流色谱分离条件为:流速2 m L/min、转速800 r/min、检测波长260 nm、温度26℃。从鸡血藤乙醚提取物中可一步纯化得到活性成分刺芒柄花素,其得率为16.1%,高效液相色谱检测其纯度达96.3%。

4.5 聚酰胺树脂分离纯化法

聚酰胺树脂是近年来在天然产物分离领域得到广泛应用的一种分离树脂。聚酰胺基团可在酸性条件下与质子结合形成正电荷基团,对黄酮类化合物具有很强的吸附作用。

周光姣等[37]采用聚酰胺柱层析法分离鸡血藤总黄酮,用UV法测定总黄酮含量,检测波长278 nm,最后得到最佳的纯化工艺为:上样量9.076 mg/g、上样液质量浓度1.261 g/L、吸附、洗脱速度2 BV/h,加水5 BV和20%乙醇3 BV洗脱除杂,加70%乙醇4 BV洗脱,收集第2~4 BV洗脱液,最后总黄酮纯度达81.5%,转移率77.5%。

该纯化工艺稳定可行且重复性好,可有效富集鸡血藤总黄酮部位。

5 鸡血藤中有效成分含量的测定

5.1 鸡血藤原儿茶酸、儿茶素和表儿茶素的含量

张敏等[38]采用Phenomenex Kinetex XB-C18色谱柱,以乙腈-磷酸-水为流动相,等度洗脱,流速1.3 m L/min,柱温25℃,检测波长260 nm,进样体积2μL,测得鸡血藤药材中原儿茶酸的含量为0.028 1~0.172 2 mg/g,儿茶素的含量为0.338 8~0.883 4 mg/g,表儿茶素的含量为0.541 2~2.254 mg/g。

5.2 鸡血藤微量元素的含量

刘小英等[39]用ICP-AES法测得鸡血藤中Mg、Fe、Mn、Zn、Cu的含量分别为624.85μg/g、132.77μg/g、49.90μg/g、23.80μg/g、20.72μg/g。

5.3 鸡血藤芒柄花素的含量

郭希庆等[40]用Agilent Epclipseplus C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)测定鸡血藤芒柄花素的含量,测定条件为流动相:乙腈-水(33:67)、流速:1.0 m L/min、检测波长:248 nm。最后测得芒柄花素在进样量为0.010 25~0.512 5μg范围内呈良好的线形关系,相关系数为0.999 9,平均回收率为98.73%,RSD为0.24%。

三个鸡血藤糖浆样品的芒柄花素含量分别为1.481 g/m L、1.549 g/m L、1.557 g/m L。

6 结语

从20世纪70年代开始,豆科植物鸡血藤逐渐引起国内外学者的普遍关注,对其化学成分及药理作用的研究结果表明,鸡血藤具有广泛的药理作用和多种类型的化学成分,黄酮类化合物作为鸡血藤中主要的有效成分,具有极高的药理价值,因此受到了越来越多人的关注。近年来,随着鸡血藤的研究越来越引人注目,黄酮类化合物的提取和分离方法也逐渐被人所重视。传统提取分离方法简单、经济,适用于工业化生产;新型提取分离方法,如超声波辅助提取法、大孔树脂分离纯化法、高速逆流色谱分离纯化法等,不仅能提高黄酮提取率,大大缩短提取时间,还可减少溶剂用量,减少提取污染,节能减排,符合工业化大生产的发展趋势。

柱层析技术提取和分离银杏内酯 篇9

自20世纪80年代开始, 许多国家采用现代分离技术对银杏叶的主要活性成分银杏内酯进行研究, 传统分离方法主要有溶剂萃取分离法和柱色谱分离法[2,3]。传统方法存在着步骤多、过程复杂和生产成本高等问题。本文将溶剂萃取和柱色谱分离技术结合起来, 对提取溶剂和柱色谱条件进行了考察, 成功开发出一种程序简单、成本低且稳定可靠的银杏内酯分离提取工艺。

1 材料、试剂及仪器

材料:浙江康恩贝集团产标准银杏叶提取物EGB (粒度100-200目, 总黄酮醇苷>24%, 总内酯>6%) 。

试剂:乙醇、乙酸乙酯、丙酮、层析用酸性A1203 (分析纯) ;层析用硅胶 (青岛海洋化工厂分厂) ;银杏内酯A对照品 (SIGMA公司, 批号G4028) , 银杏内酯B对照品 (SIGMA公司, 批号G6910) , 银杏内酯C对照品 (SIGMA公司, 批号18309) 。

仪器:Waters2695高效液相色谱仪 (美国Waters公司) , 数据处理软件Waters Millennium 2010 色谱工作站。

2 实验部分

2.1 提取溶剂的选择

取EGB粉末4份, 每份10 g, 分别用乙酸乙酯、乙醇、丙酮和水各300 mL搅拌溶解30 min, 其中对乙酸乙酯、乙醇加热促溶, 其余溶剂在室温下进行。过滤, 蒸干滤液, 照2.4项下HPLC方法分析银杏内酯含量, 结果见表1。

结果表明, 使用水作溶剂时效果较差, 使用另外3种有机溶剂所得到的银杏内酯纯度较高。由于银杏内酯A、B、C 的分子极性依次增强, 而不同极性的有机溶剂对其具有不同的选择溶解性。因此, 分别选用丙酮、乙酸乙酯和乙醇依次溶解EGB, 可分别溶出GA、GB、GC。

2.2 不同梯度洗脱液的选择

取EGB 10 g, 分别用丙酮、乙酸乙酯、乙醇依次溶解。丙酮浓缩液上酸性氧化铝柱, 以丙酮—乙酸乙酯混和液梯度洗脱;乙酸乙酯浓缩液上酸性氧化铝柱, 以乙醇—乙酸乙酯混和液梯度洗脱;乙醇浓缩液上硅胶柱, 以乙酸乙酯—石油醚梯度洗脱。收集洗脱液, 蒸干, 照2.4项下HPLC方法分析洗脱液, 结果分别见表2、表3和表4。

由表2可知, 丙酮浓缩液上酸性氧化铝柱, 以丙酮体积分数为20%的丙酮—乙酸乙酯混和液洗脱较为合适。

由表3可知, 乙酸乙酯浓缩液上酸性氧化铝柱, 以乙醇体积分数为10%的乙醇—乙酸乙酯混和液洗脱较为合适。

由表4可知, 乙醇浓缩液上硅胶柱, 以乙酸乙酯体积分数为60%的乙酸乙酯—石油醚混和液洗脱较为合适。

2.3 银杏内酯提取、分离、纯化方法总结

通过以上分析, 可将银杏内酯的提取、分离、纯化方法总结如下:EGB粉末经丙酮、乙酸乙酯、乙醇依次溶解后, 再经柱层析分离、纯化。具体工艺流程见表5。

2.4 HPLC法定量测定银杏内酯纯度

2.4.1 色谱条件

色谱柱:Hypersilbds C18 (4.6 mm ×200mm, 5 μm) ;流动相:水-甲醇 (70∶30) ;检测器:DAD;检测波长:220nm;流速:0.8 mL/min;柱温:25℃;进样量:20μL。

2.4.2 溶液的制备

①对照品溶液的制备:分别精密称取银杏内酯A、B、C对照品, 用甲醇制成每1mL中各含1mg的混和液, 作为对照品溶液。②供试品溶液的制备:取上述柱层析样品0.15 g, 加水10 mL, 置水浴中温热使溶解, 加2%盐酸溶液2滴, 用乙酸乙酯振摇提取3次 (10 mL、10 mL、10 mL) , 合并提取液, 用5%的醋酸钠溶液20 mL洗涤, 分取醋酸钠溶液, 再用乙酸乙酯10 mL洗涤。合并乙酸乙酯提取液及洗液, 用水洗涤2次, 每次20 mL, 分取水液, 用乙酸乙酯10 mL洗涤, 合并乙酸乙酯液, 回收溶剂至干, 残渣用甲醇溶解并转移至5 mL容量瓶中, 加甲醇至刻度, 摇匀, 过滤, 续取滤液, 即得。

2.4.3 测定法

精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL, 分别注入液相色谱仪, 测定峰面积, 按外标法分别计算银杏内酯A、B、C的含量。

2.4.4 测定结果

5批银杏叶提取物样品测定结果见表6, 对照品及供试品色谱见图1。

(n=5)

注:图中峰自左至右依次为银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C

3 讨论

本文根据3种银杏内酯在不同极性的有机溶剂中具有不同的溶解性和溶解速度, 分别用丙酮、乙酸乙酯和乙醇对标准EGB进行三级溶解, 并为每级溶解液选择了合适的柱层析吸附剂和洗脱液, 成功开发出一种程序简单、成本低且稳定可靠的银杏内酯分离提取工艺。利用柱层析分离技术从银杏提取物中分离纯化银杏内酯是一种廉价高效的方法, 值得推广。

摘要：目的:建立银杏提取物中银杏内酯的分离、纯化方法。方法:银杏内酯A、B、C (简称GA、GB、GC) 分子极性依次增强, 分别用丙酮、乙酸乙酯、乙醇依次溶解银杏提取物, 并选择合适的柱层析吸附剂与洗脱液, 以分离、纯化银杏内酯。采用高效液相色谱 (HPLC) 法检测, 对所得银杏内酯A、B、C进行测定。结果:本方法可将银杏内酯的纯度由6%以下提高至80%以上, 并将其逐一分离。结论:该方法廉价、高效, 可用于银杏内酯的提取、分离及纯化。

关键词：银杏内酯,柱层析,高效液相色谱法

参考文献

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[2]VAN BEEK T A, LELYVELD G P.Preparative isolation andseparation procedure for Ginkgolides A, B, C and bilobalide[J].Nat Prod, 1997 (60) :735-738.

多糖类药物提取及分离分析 篇10

1 多糖类药物提取分离提纯方法

见图1。

2 结果

不同步骤对多糖类药物提取分离后得到的溶液浓度, 如表1。

2.1 多糖类提取方法

2.1.1 溶剂提取法

溶剂提取法为目前常用的一种提取方法, 其利用多糖成分在乙醇溶液中不溶解的性质, 在所得的提取液中加入乙醇、甲醇或丙酮, 从而使多糖成分得以沉淀, 来实现初步纯化的效果。本组研究结果为得到浓度为20.08%溶液。在采取溶剂提取法进行分离时, 一般需要遵循相似相容原则, 多糖成分属于极性相对较大的化合物, 因此可采取水、醇等强极性的溶剂[1]。

2.1.2 酸提取法

尽管现在中药研究领域强调避免在酸性条件下进行有效成分的提取, 否则会引起糖苷键发生断裂。

2.1.3 碱提取法

研究证实, 有一部分多糖成分在碱溶液中具有较高的提取率, 特别是一些含有糖醛酸基团的多糖, 经碱溶液提取时可加入适量的氮气或硼氢化钠、硼氢化钾, 对多糖发生降解进行避免。曾有学者采取碱液对山茱萸多糖进行提取, 操作步骤为碱提取、盐酸中和、减压浓缩、醇沉淀、洗涤、真空干燥, 最终得到了褐色的山茱萸多糖[2]。

2.1.4 超临界流体萃取法

目前超临界流体萃取技术为一种新型的提取分离技术, 在气体超过限定的温度、压力后便会进入到临界状态, 此时的流体被称为超临界流体, 目前应用较多的是二氧化碳。

2.2 多糖杂质的去除

2.2.1 蛋白质的去除

研究证实, 在采取醇沉淀或其它溶剂进行多糖提取时会含有较多杂质, 其中以蛋白质最为常见, 因此需要采取有效的措施展开杂质去除操作, 现阶段常用于去除蛋白质的方法有Sevage法 (如表2) 。还有酶法除蛋白:取龙眼、荔枝粗多糖, 按1%比例加入木瓜蛋白酶, 防腐保温48h, 按照多糖体积的20%加入氯仿, 再加入氯仿体积20%的正丁醇, 剧烈震荡, 除去水层与溶剂层交界处的软质弹性变性蛋白[3]。本组蛋白质去除后得到溶液浓度为53.24%。

2.2.2 色素的去除

在提取过程中由于氧化作用因此会有色素生成, 进而对多糖的色谱分析及性质鉴定产生一定程度的影响。

2.3 多糖的分离与纯化方法

2.3.1 超滤法

超滤方法对多糖成分进行分离纯化时, 一般采取中空纤维滤膜对多糖中去除蛋白质后的小分子杂质进行滤过。本组研究得到溶液浓度为86.84%。

2.3.2 沉淀法

目前常用的沉淀法以季铵盐沉淀法和分解沉淀法最为常用。

2.3.3 柱层析法

现阶段常用的柱层析法包括凝胶柱层析法、离子交换柱层析法。凝胶柱层析法常用的凝胶为葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶, 洗脱剂多为不同浓度的盐酸溶液及缓冲溶液。研究证实, 该技术不适合对粘多糖进行分离。

2.3.4 色谱法

目前色谱法为比较常用的一种多糖分离方法, 主要有离子交换色谱法和凝胶色谱法。曾有学者采取DEAE纤维素离子交换色谱法对板蓝根的多糖成分进行分离, 并采取Sephadex G75凝胶色谱柱进行纯化, 所用的洗脱流动相为磷酸缓冲溶液, 最后共得到四种板蓝根多糖[4]。

3 讨论

目前水提醇沉为提取多糖成分最为常用的手段, 该方法的工艺简单、成本低, 且安全, 适合工业化生产。然近几年有研究证实, 一些多糖物质适合在稀酸的条件下进行提取, 譬如说采取乙酸或盐酸溶液提取含有葡萄糖醛酸等酸性基团的多糖, 能够促进多糖沉淀的析出, 提高提取率[5]。有学者采取浓度为5%的盐酸和水提取茜草中多糖成分, 结果发现盐酸组组成黏度较水组低, 这是由于H+对酸性杂质的溶出进行了有效抑制, 提高了提取物纯度。采取碱液提取多糖在提高提取率的同时也可有效缩短提取时间, 而提取液中会含有较多的杂质, 黏度相对较大, 过滤时存在一定的困难。超临界流体萃取技术具有气液两重性的特点, 不但具有较高的渗透能力, 而且还具有同液体相近的溶解能力和密度。曾有学者采取超临界流体萃取技术对雪灵芝中多糖成分进行提取, 结果发现多糖提取率发生了明显提高[6]。该技术具有高效、清洁等独特优势, 溶解能力强, 萃取效率较高, 选择性良好, 耗能较低, 安全无污染, 为一种值得推广的分离提取技术。

曾有研究指出, 首先采取蛋白酶对蛋白质进行水解, 而后再采取Sevage法进行蛋白质的去除效果更佳, 一直受到高度重视[3]。目前常用的脱色方法有吸附法、氧化法、离子交换法等。吸附法中包括DE-AE纤维素、硅藻土、活性炭等, 氧化法则以过氧化氢最为常用[7]。

曾有学者采取超滤法对芥子蛋白进行纯化;还有学者经超滤法成功对海洋真菌多糖提取液中的小分子杂质进行去除。季铵盐以及氢氧化物均属于乳化剂, 可与酸性糖产生不溶性的沉淀, 在酸性多糖的分离中比较常用。曾有学者在提取得到铁皮石斛多糖后采取热溶法将沉淀滤除, 所得到的滤液经CTAB络合精制最终得到多糖精制品[8]。离子交换柱层析法中常用的交换介质为DEAE-葡萄糖凝胶、DEAE-纤维素、DEAE-琼脂糖凝胶等。研究证实, 该分离方法适合对各种酸性、中性多糖及粘多糖进行分离。常用的洗脱剂为不同浓度的碱溶液、硼砂溶液以及盐溶液等。

综上所述, 中药多糖成分的提取与分离方法相对较多, 且更多的方法正在逐渐更新, 在今后的实验研究中应依据多糖的性质选取适当的提取与分离方法, 从而达到最佳的提取和分离效果。

摘要：目的 对多糖类药物的提取与分离方法和效果进行分析探讨, 为今后的药物分析工作提供可靠的参考依据。方法提取方法有溶剂提取法、酸提取法、碱提取法、超临界流体萃取法;分离方法包括超滤法、沉淀法、柱层析法以及色谱法。结果 通过上述提取分离方法能够获得多糖成分。结论 近几年多糖类药物的药理作用已经受到了高度的重视, 使得多糖类药物的提取与分离技术也得到了良好的发展。

关键词：多糖类药物,提取方法,分离纯化,研究

参考文献

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[3]张晓静.刘会东.植物多糖提取分离及药理作用的研究进展[J].时珍国医国药, 2003, 14 (08) :495-496.

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[5]黎海彬, 李琳, 郭祀远, 等.药用植物有效成分提取技术[J].现代化工, 2012, 22 (05) :59-62.

[6]赵宇, 彭晓霞.多糖类化合物提取工艺研究[J].甘肃科技纵横, 2006, 35 (02) :223-224.

[7]孟宪元, 邢连宗.茜草多糖的提取与分析[J].北京中医, 2005, 24 (01) :35-36.

辣椒素提取及初步分离纯化研究 篇11

辣椒素可促进肾上腺分泌儿茶酚胺, 并有抑制细菌的作用, 具有镇痛止痒、抗炎消肿[3]、调节食欲、促进脂肪代谢[4]、催泪催嚏、防治风湿与抗肿瘤[5]等作用, 在医药工业中已得到广泛应用。因辣椒素具有纯天然、低毒害、无污染、有多种生物功能等特点, 因而在食品工业和饲料工业中作为添加剂广泛使用。高纯度的辣椒素晶体在军事上是制造催泪弹、催泪枪和防卫武器的主要原料, 具有重要的研究价值[9]。因此研究从辣椒中有效提取分离辣椒素具有重要的意义。

1 材料与仪器

1.1 实验材料

干红辣椒 (购自山西省忻州市高城乡) , 辣椒碱标准品 (购自贵州五倍子公司, 其纯度≥98.5%) 、95%乙醇为药用级别、乙醇 (分析纯, 江苏强盛化工有限公司出品) 、木质颗粒活性炭、盐酸 (分析纯, 江苏强盛化工有限公司出品) 、乙醚 (分析纯, 天津市富宇来精细化工有限公司) 、甲醇 (色谱纯, 天津市四友精细化工有限公司) 、恒温水浴锅、TDL80-2B型台式离心机。

1.2 实验仪器

万能粉碎机 (30B型, 常州市苏力干燥设备有限公司) ;萃取浓缩设备 (型号YC-EC-30、YC-VC-10, 元成机械股份有限公司) ;UV-1800紫外分光光度计 (北京瑞利仪器有限公司) ;岛津UV-2350可见-紫外分光光度仪;日本岛津高效液相色谱仪 (LC-10ATVP溶剂输入泵, SPD-10AVP紫外检测器) ;HW-2000色谱工作站 (南京千谱软件有限公司) 。

2 方法与结果

2.1 辣椒素提取工艺

辣椒素的提取工艺流程见图2。

2.2 辣椒素分离纯化工艺

(1) 辣椒碱标准曲线的制备。取120μg/mL的辣椒碱乙醇溶液, 将此溶液以无水乙醇稀释成下列浓度:10、17、34、50、60μg/mg。在280nm波长下测定各溶液的吸光值 (A) , 处理得回归方程A=0.0093C+0.0123, R2=0.9992。见图3。

(2) 活性炭分离纯化工艺结果。见表1。

辣椒素粗提物经活性炭纯化后, 其溶液颜色由深红变成浅红色, 辣椒碱转移率为60.1%。

(3) pH法分离纯化工艺结果。根据辣椒素分子中含有酚羟基, 呈弱酸性, 可与强碱发生反应的原理, 进行纯化。比较加入碱液后, 辣椒素中辣椒碱在沉淀层及溶液层中含量的分布, 从而计算出辣椒碱的转移率, 验证该方法对辣椒碱的影响, 其紫外吸收值如表2。

辣椒素粗提物经pH法纯化后, 沉淀层颜色仍为深红色, 其中辣椒碱的转移率为55.7%。

(4) 萃取-结晶法结果。利用辣椒素物质均含有酚羟基的特点, 采用乙醚萃取、氢氧化钠溶液反萃辣椒素, 再结晶的方法分离制备辣椒素化合物, 比较萃取结晶前后, 辣椒素中辣椒碱的转移情况, 其紫外吸收值如表3。

辣椒素粗提物经萃取结晶后, 结晶物呈淡红色, 其中辣椒碱的转移率为87.1%。

2.3 HPLC法测定辣椒碱转移率

前述采用UV对不同纯化辣椒碱的工艺进行了探索, 在确定了乙醚-酸碱萃取分离辣椒素的工艺后, 为了准确检测在萃取过程辣椒碱的转移率, 选择HPLC[11]测定辣椒粗提物及萃取结晶后辣椒碱的含量。

(1) 色谱条件。仪器:岛津液相色谱仪LC-20A;色谱柱为ODS-C18柱 (4.6mm×150mm, 5mm) ;检测器:SPD-10A紫外检测器;柱温:40℃;流动相:甲醇-水 (60∶40) ;流速:1.0mL/min;检测波长:280nm。

(2) 辣椒碱对照品溶液的配制及HPLC图谱。见图4。

(3) 辣椒素结晶物溶液的配制及HPLC图谱。取0.8g萃取结晶物加乙醇至10mL, 取1mL加无水乙醇至10mL。取1mL加无水乙醇至30mL, 其高效液相色谱如图5。

精密量取供试液, 进样20μL, 用外标法 (峰面积) 计算辣椒碱含量, 辣椒提取物萃取结晶过程中辣椒碱的转移率为81.1%。

3 讨论

本次实验主要解决的难点在于从辣椒粗提物中分离辣椒素, 共采取了3种不同方法, 结果分析如下:

活性炭分离纯化辣椒素方案:结果表明辣椒碱洗脱不完全, 辣椒碱转移率低。

pH法分离纯化辣椒素方案:该方法所得到的结晶物为深红色, 达不到分离辣椒素与辣椒色素的目的。其可能原因是辣椒色素有一部分可溶解于NaOH溶液中, 造成结晶物颜色呈深红色。

萃取-结晶法:该方案所得到的溶液呈浅红色, 其紫外分光光度图谱显示, 在400nm后基本无吸收, 说明辣椒素与辣椒色素得到初步分离, 辣椒碱的转移率为81.1%。该方案工艺成本低, 辣椒碱转移率高, 操作简单, 可作为分离纯化辣椒素的最终方案。

4 结语

从本实验结果来看, 相比活性炭纯化法及pH法, 乙醚萃取—结晶法分离纯化辣椒素的效果较好, 辣椒碱转移率高, 工艺成本低, 操作简单, 辣椒素物质得到初步分离, 有利于辣椒素类物质的精制, 可作为工业化分离纯化辣椒素的方案。

摘要：目的:从辣椒中提取并分离纯化辣椒素。方法:采用70%乙醇提取辣椒素;以辣椒碱的含量为指标, 运用紫外-可见分光光度法及高效液相色谱法比较活性炭法、pH法、乙醚萃取结晶法三种方法分离纯化辣椒素的效果。结果:采用乙醚萃取辣椒粗提物, 乙醚相用氢氧化钠水溶液萃取, 所得氢氧化钠萃取液调pH值后结晶, 得到辣椒素粗品, 辣椒碱总收率为81.1%。结论:乙醚萃取结晶工艺得到的辣椒素含量高, 回收率高, 工艺成本低, 可作为辣椒素的生产方案。

关键词：辣椒,辣椒素,活性炭法,pH法,乙醚萃取结晶法

参考文献

[1]董新荣, 刘仲华, 李本祥, 等.制备型高效液相色谱法制备纯化3种辣椒素单体[J].色谱, 2008, 3 (26) :366-369.

[2]吴艳阳, 陈开勋, 邵纪生.辣椒素的制备工艺及分析方法[J].化学世界, 2004 (4) :218-221.

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