豚鼠膀胱Cajal样间质细胞的分离、培养及其鉴定

2024-06-19

豚鼠膀胱Cajal样间质细胞的分离、培养及其鉴定(精选2篇)

豚鼠膀胱Cajal样间质细胞的分离、培养及其鉴定 篇1

豚鼠膀胱Cajal样间质细胞的分离、培养及其鉴定

目的` 探索豚鼠膀胱Cajal样问质细胞的原代培养方法.方法 颈部脱臼法处死豚鼠,无菌条件下分离出膀胱肌组织制备成肌条.采用V型胶原酶酶解法分离细胞,将细胞悬液接种于含干细胞因子的细胞培养基中培养,隔日换液.用酪氨酸蛋白激酶受体特异性抗体标记细胞,证实细胞类型.结果 培养后的Cajal样间质细胞保持其固有特征,可见胞体为梭形且胞体两极有两个细长突起,该类细胞酪氨酸蛋白激酶受体抗体荧光染色阳性证实细胞培养成功.结论 用V型胶原酶消化法可获得成年豚鼠膀胱Cajal样问质细胞,并在体外条件下生长,可用于Cajal样间质细胞的电生理学研究.

作 者:Wang Qian 王勤章 Ding Guofu 李维仁 Wang Wenxiao 王江平Li Yinglong Wang Qian Wang Qinzhang Ding Guofu Li Weiren Wang Wenxiao Wang Jiangping Li Yinglong 作者单位:新疆石河子大学医学院一附院泌尿外科,新疆石河子,83刊 名:现代泌尿外科杂志 ISTIC英文刊名:JOURNAL OF MODERN UROLOGY年,卷(期):200813(4)分类号:Q813.11关键词:干细胞因子 V型胶原酶 酪氨酸蛋白激酶受体 Cajal样间质细胞

豚鼠膀胱Cajal样间质细胞的分离、培养及其鉴定 篇2

KEY等[2]从1993年开始尝试用两种不同的抗体检测同一组织或细胞的两种不同抗原,即双染色法。此技术可以在同一张切片上显示两种不同抗原,同时观察细胞及组织中两种不同抗原的分布情况。笔者成功地在一张切片上显示c-Kit与n-NOS2在豚鼠膀胱Cajal样间质细胞的共表达情况,期望为深入研究膀胱ICCs样细胞的起搏功能提供形态学基础资料并为其神经内分泌功能提供依据。

1 材料与方法

1.1 标本

取成年豚鼠(300 g)膀胱以1 mg/m L胶原酶Ⅴ溶液消化培养出原代成年豚鼠膀胱ICCs样细胞。

1.2 主要试剂

Ⅴ型胶原酶(Sigma公司)、大鼠抗小鼠c-Kit单克隆抗体(ACK2,1∶400,Chemicon公司)、羊抗大鼠CY3抗体(1∶200,Abcom公司)、兔抗大鼠NOS2单克隆抗体(n-NOS2,1∶200,Santa cruz公司)、羊抗兔FITC抗体(1∶100,Sigma公司)

1.3 主要仪器

湖北产YLD-2000型电热恒温干燥箱、苏州产SW-CJ-2FD超净工作台、德国产ZEISS510型激光共聚焦显微镜均由新疆石河子大学医学院实验室提供。

1.4 实验方法

颈部脱臼法处死成年豚鼠,无菌条件下切取膀胱,置于含双抗(青霉素100 u/mL和链霉素100μg/m L)的0.01 M PBS溶液中浸泡,无菌操作台上将膀胱剪成1 mm3小块,漂洗2次;换入1mg/m L胶原酶Ⅴ溶液(Sigma公司),盖紧瓶盖,置入37℃培养箱中消化,离心,去除上清液,重复3次,吹打分散组织细胞片,转入35 mm培养瓶中,瓶内加入适量DMEM培养液中培养,细胞爬片后取出,以PBS漂洗,100%丙酮液室温下固定,0.3%过氧化氢/甲醇封闭内源性过氧化物酶,1%BSA室温下孵育,先滴加0.2%BSA/0.01 M PBS稀释的第一抗体(大鼠抗小鼠的单克隆c-Kit抗体,1∶400),湿盒内孵育4℃48 h,再滴加羊抗大鼠CY3标记荧光抗体(1∶200)(此后各步操作均需避光),丙酮液室温下再次固定,滴加第二种一抗体(兔抗大鼠的单克隆NOS2抗体,1∶200),最后加入羊抗兔FITC标记荧光抗体(1∶200),甘油封片剂封片,激光共聚焦显微镜(德国产ZEISS510型)400倍视野下观察。

2 试验结果

2.1 原代ICCs样细胞培养及细胞特征鉴定

2.1.1 细胞生长形态

培养细胞置于倒置显微镜下观察(×200倍),培养3 h后细胞已开始贴附在瓶底,胞体为梭形,细胞两极有2个细长突起,见附图。细胞增殖能力较弱,培养1周细胞数目无明显增加。

2.1.2 免疫组化鉴定

ICCs样细胞爬片KIT免疫组织化学染色为阳性。

2.2 免疫荧光双染结果

激光共聚焦显微镜(×400倍)下观察,c-Kit抗体主要在细胞膜表达,阳性呈红色;n-NOS2抗体主要在胞浆表达,阳性呈绿色。c-Kit、n-NOS2抗体同时表达可见细胞膜呈红色、细胞浆呈绿色。

3 讨论

免疫组织化学双染色法[3]是在同一张切片上显示两种抗原的方法,与免疫组织化学单染色法相比具有以下优点:(1)对比鲜明,便于观察,有利于两个指标的对照性研究。(2)节约组织。(3)减少劳动量,包括实验时间和阅片时间。(4)因实验组织和实验条件相同,并在同一切片上观察两个指标,可减少实验和阅片误差。(5)两个指标可同时保存在一张切片上,减少存储切片的空间。

近年对胃肠自主节律性运动的调控研究取得了令人瞩目的进步。研究证明,ICC作为胃肠自主节律性运动的起搏细胞,在调控胃肠蠕动运动中具有重要作用[4]。而且在哺乳动物和人的一些具有自主收缩运动的组织和器官,如豚鼠和人膀胱[1],豚鼠阴茎[5]、家兔门静脉[6]以及人和大鼠的胰腺[7]外分泌部等部位陆续发现均有Cajal样细胞存在[8,9,10]。

C-Kit为一种原癌基因,其编码产物KIT,是位于细胞膜上的酪氨酸蛋白激酶受体,也是干细胞生长因子受体,可表达于造血细胞、肥大细胞及ICC等多种细胞[11]。由于平滑肌细胞、神经纤维和成纤维细胞不表达KIT,KIT免疫组织化学染色是鉴别肠道和泌尿道ICC的可靠方法。

研究发现,ICCs内有一氧化氮合酶阳性产物表达,推测其可能在一氧化氮合酶作用下产生一氧化氮(NO),使细胞内钙离子增多,进一步释放某种可弥散物质(可能是NO)使邻近的平滑肌细胞内钙离子水平下降。这提示ICCs具有将抑制性信号放大的作用,而神经末梢释放递质作用于ICCs,控制NO产生,从而控制神经信号传导[12]。而膀胱Cajal样细胞是否是膀胱收缩的起搏细胞及其功能如何,还有待研究,如未起搏细胞是否也具有胃肠道起搏细胞的神经分泌功能等。

本研究用c-Kit免疫荧光染色证明在豚鼠膀胱内Cajal样细胞的存在,其形态特点与胃肠道Cajal细胞相似,胞体为梭形,细胞两极有2个细长突起。并通过c-Kit和n-NOS2荧光双染法发现其在膀胱Cajal样细胞共表达的现象,说明膀胱Cajal细胞具有分泌NO的基础,可以通过分泌NO抑制平滑肌的收缩,将神经末梢递质的作用传递给平滑肌,扩大了神经的调控作用,从而增加了对膀胱Cajal样细胞在神经内分泌功能上的了解,提示膀胱Cajal样细胞可以产生NO从而调节逼尿肌的收缩活动,为“神经-Cajal样细胞-肌肉”作用单元的形成提供依据,为其作为起搏细胞提供了功能学的基础。但关于在生理条件下组织中膀胱Cajal样细胞对膀胱逼尿肌的调节问题,还有待进一步研究。

摘要:提要:目的研究c-Kit与n-NOS2在豚鼠膀胱Cajal样间质细胞的共表达情况。方法采用培养成年豚鼠膀胱Cajal样间质细胞,c-Kit免疫荧光和n-NOS2免疫荧光双重染色。结果豚鼠膀胱内Cajal样间质细胞体为梭形或卵圆形,常见2~3个细长的突起。c-Kit和n-NOS2免疫荧光双重染色发现两种抗体在Cajal样间质细胞共表达。结论本研究结果提示在豚鼠膀胱Cajal样间质细胞内c-Kit和n-NOS2共存,Cajal样间质细胞具备产生NO的功能,Cajal样间质细胞存在调节膀胱自律活动的结构基础。

关键词:Cajal样间质细胞,酪氨酸激酶受体(c-Kit),一氧化氮合酶2(n-NOS2),免疫荧光双染

参考文献

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