植物黄酮分离纯化研究

2024-09-17

植物黄酮分离纯化研究（通用7篇）

植物黄酮分离纯化研究篇1

黄酮类化合物是一类存在于自然界中具有2-苯基色原酮结构的化合物。绝大部分植物都含有黄酮类化合物。黄酮类化合物具有抗氧化、抗癌、抑制脂肪酶、抗菌、消炎、抗突变、降压、清热解毒、镇静、利尿等作用[1]。其由2个具有酚羟基的苯环通过中央三碳原子互相连接而成的, 常含酚羟基、甲氧基、甲基、异戊烯基等官能团, 提取方法常采用有机溶剂提取法 (甲醇、乙醇) 、超声辅助双水相萃取法;纯化常采用柱层析法、色谱法及大孔吸附树脂法。本文就黄酮类化合物的分离纯化方法进行介绍。

1 传统柱层析法

柱层析法具有分离效果好、操作简单等优点, 是一种传统的分离方法。余丹妮等[2]为建立益母草总黄酮含量测定方法, 在运用聚酰胺柱分离纯化样品后, 以三氯化铝试剂为显色剂, 芦丁为对照品, 采用紫外分光光度法测定芦丁在412nm波长处的吸光度, 并绘制出标准曲线, 发现芦丁在4.8~29.0μg/mL范围内与吸光度有良好线性关系, r=0.999 6, 回收实验中, 平均回收率为102%, RSD=3%。由此得出结论:柱层析—分光光度法操作简单, 准确可靠, 可作为益母草药材的含量测定方法。现今较少使用此类方法进行黄酮的纯化, 而多见于其优化工艺。李欣欣等[3]通过使用戊二醛交联胶原纤维吸附剂 (CFA) , 对两种结构相近的单糖基黄酮苷类化合物 (染料木苷和黄芪苷) 进行柱层析, 并测定此种吸附剂的分离性能, 发现改变乙醇水溶液的溶度可调节CFA对染料木苷和黄芪苷的吸附选择性:CFA的用量为6g, 层析柱的径比为10∶1时, 100%、90%和70%乙醇水溶液进行分步洗脱, 两者可分离, 纯度分别为98%、97%。此方法操作简单, 但洗脱过程繁琐耗时, 尤其是使用硅胶层析柱时要避免金属离子干扰。

2 金属离子络合纯化法

此方法是利用黄酮类化合物具有超离域度, 即黄酮类化合物的母核是由3个环组成, 2个苯环, 1个吡喃环, 大多数含有羟基或羰基, 此结构具有超离域度[4], 整个分子为一个大π键共轭体系, 氧原子具强配位能力, 与金属离子及稀土元素形成配合物后, 再由解络合剂达到纯化目的。随着对它研究的深入, 发现此类方法用于黄酮的纯化简便且有效。董艳辉[5]研究了金属络合法纯化火炭母黄酮的工艺, 通过单因素实验对4种不同金属盐与火炭母黄酮的络合效果进行了比较, 筛选出最佳络合金属盐为氯化钙, 同时在反应液的pH为8.0、氯化钙溶液浓度为6.0mmol/L、黄酮浓度为0.2mg/mL、解络剂EDTA与络合剂CaCl2的摩尔比为1.5∶1的纯化条件下, 黄酮含量由粗提物的20.5%提高到56.5%, 提高了2.8倍。由此证明此法纯化火炭母黄酮简便有效。此类方法主要适用于含邻二羟基结构的黄酮类化合物的分离纯化, 专属性强, 但其解络合比较困难。

3 膜分离法

膜分离技术是一种利用待分离物中各物质分子量的大小不同, 膜的选择渗透性作用, 在压力差推动下分离纯化的方法。它是一种工艺简单, 纯化效率较高的方法, 主要用于分子大小差别较大黄酮类物质的纯化, 易克传等[6]运用此法以菊花总黄酮纯度和操作过程稳定性为评价指标研究纯化菊花总黄酮工艺, 采用膜分离技术对菊花提取液进行处理, 对膜的规格、溶液温度、操作压力和操作时间进行了优选, 得最佳工艺参数下:陶瓷膜, 孔径0.5μm, 溶液温度50℃、操作压力0.25MPa;超滤膜, 截留分子量为8×103, 溶液温度40℃、操作压力1.60MPa总黄酮纯度达19.8%。同时采用陶瓷膜进行微滤预处理, 去除了大量大分子物质, 减轻了浓差极化和凝胶层阻隔作用, 超滤过程较为稳定。由这两项得出结论:采用膜技术纯化菊花总黄酮工艺操作简单, 纯化效果好。此类方法特别适用于热敏性化合物, 具有节能等特点, 但对于分子量相差不大、结构相似的黄酮类化合物不适用。

4 高效毛细管电泳

高效毛细管电泳法是一种在电场驱动下, 以毛细管为分离通道按待分离物分配系数的不同而进行液相分离的技术。其在分析、分离等方面的应用相比其他色谱方法更有优势, 如高灵敏度、高速、样品耗用量少、重现性好、自动化等, 这对长期生长于强辐射、日照时间长的环境下, 具有有效成分含量高、生物活性强等优势的我国特有的高原植物西北中藏药中黄酮类化合物的分析研究具有重要意义[7]。此类方法分离效能高, 分离速度快, 但对仪器要求高, 不适用于大规模生产的黄酮类化合物的分离纯化。周一鸣[8]等为建立一种高效毛细管电泳 (HPCE) 法测定黄酮类化合物含量的方法, 以荞麦芽粉为原料, 通过预试验, 确定在20mmol/L硼砂-硼酸溶液 (pH8.4) 电泳缓冲液中, 25℃、20kV压力条件下进行电泳, 在245nm波长处同时检测分离的槲皮素和芦丁方法, 发现所测结果与被测物质质量浓度呈良好线性关系, 在10min内黄酮类化合物完全分离, 符合定性研究和定量测定的要求, 由此建立测定荞麦芽粉中芦丁、槲皮素黄酮类化合物含量的高效毛细管电泳法, 为实现快速、准确测定植物样品中黄酮类化合物含量提供了一种新方法。

5 高效液相色谱法

早期, 此方法较纸色谱、柱色谱、薄层色谱的分离效果更理想, 但考虑到其分离成本较高, 更多用于黄酮类化合物的定性检测、定量分析或少量样品的制备等[9]。彭礼军等[10]以天麻提取物为原料, 采用硅胶柱层析和制备型高效液相色谱建立了分离纯化天麻素单体的制备工艺。先用柱层析对原料进行纯化得天麻素粗品, 再进行分析型高效液相色谱考察流动相的组成、流速和上样量等对分离效果进行考察, 通过将分析型高效液相色谱条件线性放大, 确定制备型高效液相色谱条件:流动相为乙腈—水5∶95 (V/V) , 流速为15mL/min, 上样量为45mg, 结果发现天麻素纯度达到99%以上。最后得出结论:较之目前常用的天麻素纯化方法, 本研究方法能较方便地制备出高纯度 (99%以上) 天麻素, 但因本方法难以实现产业化应用且在实验过程中出现天麻素不稳定的现象, 所以有待进一步研究。此类方法分离效能好, 但成本较高, 所以不常用于分离纯化。

6 高速逆流色谱法

高速逆流色谱 (HSCCC) 是一种无需载体或固体支撑物, 利用待分离物分配系数差异的液-液分配色谱分离方法, 常用于天然药物的分离纯化。尹鹭等[11]应用高效逆流色谱法分离纯化了化橘红中2种黄酮类化合物:运用高效逆流色谱分析柱分离纯化, 发现以乙酸乙酯-正丁醇-水 (1∶4∶5, V/V) 为两相溶剂系统, 可从1g粗提物中1次分离得到纯度大于98%的柚皮苷单体83.3mg。以二氯甲烷-甲醇-水 (10∶7∶4, V/V) 和正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水 (1∶1∶1∶1, V/V) 为溶剂系统, 可从1g粗提物的酸解物中经2次分离得到纯度大于98%的柚皮素单体27.5mg, 且两种物质分离时间均在60min内, 从而得出结论该法简便、快速、制备量大, 可用于化橘红中黄酮类化合物的快速分离制备。此类方法因未使用固体载体, 避免了色谱中的不可逆吸附, 可较好分离出天然药物中的单体, 并达到较高纯度, 所以对仪器要求高。

7 高速离心分离技术

高速离心分离技术是在离心机高速运转产生的离心力下, 利用待分离物与周围介质密度差异使物质沉降或悬浮而达到分离的目的。此法尤其适用于固液相的分离, 也是工业化生产的理想选择, 同时因为物理方法的运用, 也就避免了化学吸附带来的有效成分损失。潘廖明[12]通过正交试验优化离心法纯化大豆异黄酮的条件:大豆异黄酮样液浓度为20mg/mL, 溶解温度为40℃, 离心速度为2×103r/min, 离心时间为30min的优化条件下, 大豆异黄酮含量可由40.9%提高到71.2%, 达到了进一步提高大豆异黄酮含量, 满足其精细化需要的目的。此类方法主要依据化合物分子大小差异达到分离的目的, 所以对于小分子化合物不适用。

8 聚酰胺树脂纯化法

聚酰胺树脂纯化法是利用聚酰胺树脂中的酰胺基与黄酮类化合物中的羟基通过氢键结合, 由洗脱剂洗脱达到分离纯化的目的。近年来, 聚酰胺树脂已广泛应用于中药及其复方有效部位或有效成分的分离纯化, 且对黄酮类、酚类、醌类等成分的纯化比其他方法优越, 具有可逆、分离效果好等特点[13]。司建志等[14]在用聚酰胺树脂纯化八角渣黄酮试验中, 先通过静态解吸附实验, 确定了纯化八角残渣黄酮的聚酰胺树脂目数:30~60目, 然后采用单因素与正交实验优化吸附条件, 动态解析实验优化解析条件, 在最佳工艺:上柱液浓度为0.05g/mL (生药量) , 上柱液pH为5, 层析柱高度与内径的比值为12∶1, 上柱液流速为1~2BV/h, 饱和吸附量为150.06mg/g。4BV体积的90%乙醇冲洗树脂柱, 解析率为70.77%物质中黄酮的纯度达87.5%。以聚酰胺树脂对八角残渣黄酮的吸附量及解析率为指标证明聚酰胺树脂能有效纯化八角渣黄酮, 且最终所得的黄酮纯度高, 适于工业化生产。此类方法专属性较强, 可与黄酮类化合物形成可逆吸附, 但其吸附过程易受溶剂影响。

9 大孔吸附树脂纯化法

大孔吸附树脂法是利用吸附树脂对物质吸附差异, 运用解吸剂进行纯化的方法, 也是一种适合大规模生产的方法。最近研究多集中于从多种树脂中选出最适大孔树脂对含黄酮植物进行纯化。莫天录等[15]通过比较10种大孔吸附树脂纯化黄酮粗提取物的吸附及解吸性能, 筛选出纯化XDA-1树脂并进一步考察了XDA-1树脂对黄酮粗提取物的静态、动态吸附与解吸的性能, 得到XDA-1树脂纯化绿茄叶黄酮粗提取的最佳工艺参数:吸附平衡时间8h, 吸附浓度为2.00mg/mL, pH值3.0, 温度25℃, 上样流速2BV/h;解吸平衡时间2h, 解吸剂乙醇的体积分数为80%, pH值3.0, 解吸流速3BV/h。此条件下的纯化物浸膏中黄酮质量浓度为5.68mg/mL, 纯化倍数为2.37。证实大孔吸附树脂纯化绿茄叶黄酮方法简单可行, 为绿茄叶黄酮的分离纯化提供了实验依据。此类方法具有操作简便、理化性质稳定、不溶于酸碱及有机溶剂中、能较好保持化合物原本活性以及对有机物有较好选择性等优点, 但在使用时其分离效能受吸附剂性能、洗脱剂种类、温度等的影响。

植物黄酮具有较多生理作用, 所以有较多对它的分离纯化研究方法, 且日益成熟并在不断完善。目前研究主要集中在现有方法基础上, 对它的工艺条件优化;对色谱法中吸附材料的优选;对两种提取分离方法的合并联用, 预期提高纯化效率。在后来的不断研究中, 通过新的有机分子材料发现, 仪器的更新, 以及某类药物专有方法的使用, 黄酮的分离纯化可以达到更高的效率。对于一些正在发展中的方法如高速逆流色谱法、大孔吸附树脂法以及高效毛细管电泳法具有纯化纯度高、杂质少等优点, 具有很好的研究应用前景。

植物黄酮分离纯化研究篇2

分离纯化黄酮类化合物的方法有高速逆流色谱技术、超临界CO2萃取法、大孔树脂法等[6,7,8,9],其中大孔树脂法因具有简单易行、物化稳定性高、吸附选择性好等优点已被广泛应用于植物黄酮的分离纯化。用于分离纯化黄酮的大孔树脂种类较多,但因不同植物中黄酮的种类及结构不同,适宜分离黄酮的树脂也不同,但目前还没有关于利用大孔树脂分离纯化海蓬子黄酮及其抑菌活性的研究报道。因此,本研究拟通过单因素和多因素正交试验,研究两种大孔树脂对海蓬子黄酮的静态吸附和解吸特性,建立并优化X - 5型大孔树脂分离纯化黄酮类化合物的工艺,并比较黄酮纯化前后抑菌活性的变化,以期为海蓬子黄酮类化合物的应用开发提供一定参考依据。

1材料

1. 1原料

海蓬子,盐城市绿苑海蓬子开发有限公司; 供试微生物菌株包括大肠杆菌( Escherichia coli) 、金黄色葡萄球菌( Staphylococcus aureus ) 、白假丝酵母菌( Candida spp. ) ,购自中国微生物保藏中心。

1. 2主要试剂

芦丁对照品,购自国药集团化学试剂有限公司; AB - 8、X - 5大孔树脂,购自天津大茂化学试剂厂; 试验用水为纯化水,试验所用试剂均为分析纯。

1. 3主要仪器

高速万能粉碎机,购自天津市泰斯特仪器有限公司; 精密天平,购自上海鼎拓实业有限公司; 超声仪, 购自昆山市超声仪器有限公司; R系列旋转蒸发器, 购自上海申生科技有限公司。

2方法

2. 1海蓬子黄酮的提取

将新鲜采摘的海蓬子洗净,于60 ℃ 烘箱中过夜烘干,粉碎成粉末。称取一定量的海蓬子粉末浸于乙醇溶液中,微波辅助提取,真空抽滤除去滤渣,得到海蓬子黄酮乙醇粗提取液。

2. 2芦丁标准曲线的绘制

按照参考文献[1]中的方法进行。精密称取于105 ℃ 干燥至恒重的芦丁标准品10 mg,用70% 乙醇溶解,定容至100 m L,摇匀,得到0. 1 mg / m L的芦丁标准品溶液,备用。分别精确吸取芦丁标准品溶液0,2. 50,5. 00,7. 50,10. 00,12. 50,15. 00 m L于25 m L容量瓶中,先加入5% 亚硝酸钠溶液1. 00 m L,摇匀, 静置6 min; 再加入10% 硝酸铝溶液1. 00 m L,摇匀, 静置6 min; 最后加入1. 0 mol/ L氢氧化钠溶液5. 00 m L,用70% 乙醇定容至刻度,摇匀,静置10 min; 以空白液作为参比,用分光光度计测定510 nm处的吸光度值。根据所得数据,得到线性回归方程为: y = 7. 980 6x - 0. 000 7,R2= 0. 995 6。

2. 3样品的测定

取0. 2 m L提取液,用其代替芦丁,利用2. 2中的方法,在510 nm波长处测定其吸光度值,由回归方程计算样品中总黄酮含量。计算公式: 总黄酮含量( 以芦丁计) = ( C × V × 50 × 10- 3) /m × 100。式中: C为芦丁质量浓度,V为滤液粗提液体积,50为稀释倍数,m为海芦笋干粉质量。

2. 4大孔树脂的预处理

参照参考文献[10]中的方法进行预处理。

2. 5大孔树脂的筛选

参照参考文献[11]中的方法进行,根据树脂的吸附量和解析率确定分离纯化海蓬子黄酮的最佳树脂。吸附量的计算公式: Q = ( C0- Cr) × V / m。式中: Q为吸附量,C0为总黄酮初始质量浓度,Cr为平衡时总黄酮质量浓度,V为溶液体积,m为树脂质量。解析率的计算公式: D = ( C × V) /( M × Q) × 100。式中: D为解析率,C为解析液中总黄酮的质量浓度, V为解析液体积,m为树脂质量,Q为吸附量。

2. 6最佳树脂静态吸附和解析动力学研究

2.6.1静态吸附动力学研究

参照参考文献[12]中的方法进行研究。称取大孔树脂10.0 g,置300 mL带塞锥形瓶中,加入100 mL海蓬子黄酮粗提液,密封后置20℃、120 r/min恒温振荡器中振荡吸附,在不同时间测定上清液吸光度值,绘制该树脂的静态吸附动力曲线。

2.6.2静态解析动力学研究

参照参考文献[12]中的方法进行研究。将经过静态吸附的大孔树脂滤去上清液,用纯化水反复冲洗树脂至上清液澄清,加入70%乙醇溶液100 mL,密封后置20℃、120 r/min恒温振荡器中振荡解析,在不同时间测定吸光度值,绘制该树脂的静态洗脱曲线。

2. 7正交试验设计

在单因素试验的基础上,根据正交试验设计原理,选择对海蓬子黄酮纯化影响较大的进样流速、洗脱速度、进样液p H值及洗脱剂乙醇浓度等4个主要因素,考察大孔树脂纯化海蓬子黄酮的工艺参数。根据正交设计方案进行试验,确定海蓬子黄酮的最佳纯化工艺条件。

2. 8抑菌试验

将灭菌后的专用药敏纸片浸于50 m L浸提液中, 浸泡24 h使其充分吸收提取液,以灭菌水为空白对照,采用纸片琼脂扩散法测定抑菌圈直径,以反映供试品的抑菌能力。取液体培养基活化培养好的供试菌0. 1 m L,用无菌玻璃刮棒均匀涂布于相应的琼脂培养平板上,用无菌镊子将含有提取液的纸片贴于含菌琼脂平板表面。纸片应贴得均匀,各纸片中心距离不小于24 mm,纸片至平板内边缘距离大于15 mm。恒温培养放好滤纸片的含菌培养皿,细菌于37 ℃ 培养24 h,真菌于28 ℃培养48 h,用游标卡尺测定抑菌圈直径。

3结果与分析

3. 1大孔树脂的筛选

3.1.1不同类型树脂对海蓬子黄酮吸附量和解析率的影响

结果见表1。

由表1可知,X - 5型大孔树脂对海蓬子黄酮的吸附分离性能比AB - 8型大孔树脂好,这是因为黄酮类化合物多具有多酚结构和糖苷键,在水溶液中极性较弱,这有利于弱极性或非极性树脂的吸附。

3.1.2静态吸附动力学曲线的绘制

结果见图1。

由图1可知,吸附2. 5 h后吸附液中总黄酮的质量浓度随着时间的延长变化很小,也就是说树脂已基本达到吸附饱和平衡。说明这两种树脂对海蓬子黄酮的吸附都属于快速平衡型,快速吸附可缩短生产周期,这在工业上是很有益的。AB - 8型大孔树脂的解析液中总黄酮的质量浓度下降的速度比X - 5型大孔树脂慢,说明后者达到饱和平衡的时间更短,因此X - 5型大孔树脂的吸附分离效果更好。因此,结合吸附量和解析率,确定X - 5型大孔树脂作为分离纯化海蓬子黄酮的吸附树脂。

3. 2海蓬子黄酮提取工艺的优化( 结果见表1和表2)

在单因素试验基础上,根据正交试验设计原理, 以进样流速、洗脱速度、进样液p H值及洗脱剂乙醇浓度4个因素进行正交试验,对大孔树脂纯化海蓬子黄酮的工艺参数进行优化。

由表2可知,4个因素对海蓬子黄酮分离纯化影响的显著性依次为洗脱剂乙醇浓度> 进样流速> 进样液p H值> 洗脱速度。极差分析的结果表明,X - 5型大孔树脂纯化海蓬子黄酮的最佳提取工艺为A2B3C3D3,即进样流速为1. 0 m L/min、洗脱速度为2. 5 m L / min、进样液p H值为7. 0、洗脱剂乙醇浓度为75% 。在此条件下,测得的黄酮回收率为71. 58% , 黄酮纯度达到73. 5% ,高于正交试验的结果,说明最佳分离纯化工艺条件是可信的。

3. 3海蓬子黄酮纯化前后的抑菌试验( 结果见表3)

由表3可知,海蓬子黄酮类化合物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白假丝酵母菌具有很强的抑制作用,且经大孔树脂纯化后其抑菌作用明显增强,这为海蓬子的抗菌临床应用提供了有力证据,并且有助于海蓬子的进一步开发应用。

4结论

本研究采用大孔树脂纯化了海蓬子黄酮,并在单因素试验的基础上,采用正交试验法确定了X - 5型大孔树脂纯化海蓬子总黄酮的最佳工艺条件,即进样流速为1. 0 m L/min,洗脱速度为2. 5 m L/min,进样液p H值为7. 0,洗脱剂乙醇浓度为75% 。在此条件下, 测得的黄酮回收率为71. 58% ,黄酮纯度达到73. 5% 。

通过对纯化前后海蓬子黄酮类提取液进行抑菌试验,说明海蓬子黄酮具有较强的抗菌作用,且经大孔树脂分离纯化后,抑菌性明显增强,这为海蓬子黄酮的开发和利用提供了参考。

参考文献

[1]扶庆权,周峰,华春,等.微波辅助提取海蓬子总黄酮工艺的响应曲面法优化[J].南京师大学报:自然科学版,2013,36(2):96-103.

[2]曹纬国,刘志勤,邵云,等.黄酮类化合物药理作用的研究进展[J].西北植物学报,2003,23(12):2241-2247.

[3]延玺,刘会青,邹永青,等.黄酮类化合物生理活性及合成研究进展[J].有机化学,2008,28(9):1534-1544.

[4]赵军.黄酮类化合物的抗氧作用机制[J].华北煤炭医学院学报,2003,5(3):306-307.

[5]张纪宁,杨洁.黄酮类化合物的生物活性研究进展[J].伊犁师范学院学报:自然科学版,2009(2):29-31.

[6]邓启焕,高勇.第二类超临界流体萃取银杏叶有效成分的实验研究[J].中草药,1999,30(6):419-423.

[7]GUTZEIT D,WRAY V,WINTERHALTER P G.Preparative isolation and purification of flavonoids and protocatechuic acid from sea buckthorn juice concentrate(Hippopharhamnoides L.ssp.rhamnoides)by high-speed counter-current chromatography[J].Chromatographia,2007,65(1):1-7.

[8]阎欲晓,黄.甘蔗叶黄酮分离纯化工艺及生理活性研究[J].食品工业科技,2011,32(3):149-152.

[9]陈丛瑾,黄克瀛,李姣娟,等.大孔吸附树脂分离纯化香椿叶总黄酮的研究[J].离子交换与吸附,2008,24(4):335-344.

[10]吴娜,张瑞巧,余婷,等.大孔树脂分离纯化艾蒿黄酮的研究[J].食品科技,2008(1):160-163.

[11]于智峰,王敏.大孔树脂精制苦荞总黄酮工艺[J].中国中药杂志,2007,32(7):585-589.

植物黄酮分离纯化研究篇3

1 材料与仪器

1.1 材料

十子代平方组方,购自唐山市同仁堂药店;芦丁标准品,购自中国食品药品检定研究院;95%乙醇、无水乙醇、石油醚等均为分析纯,盐酸、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等均购自天津市永大化学试剂有限公司;AB-8、HPD700、DM130、HPD100、D900、D101大孔吸附树脂购自沧州宝恩吸附材料科技有限公司。

1.2 仪器

电子天平(上海第二天平仪器厂);微型高速粉碎机(深圳化试科技有限公司);电热恒温水浴锅(上海器械五厂);旋转蒸发器RE-SZAA(上海亚荣生化仪器厂);循环水式真空泵(北京中兴伟业仪器有限公司);TU-1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 十子代平方总黄酮提取

精密称定中药复方十子代平方组方粉末24g,置于索氏提取器中,以石油醚240mL于90℃下回流脱脂2次,每次2h,挥干石油醚,置于60℃烘箱中干燥2h,放至室温。再以80%乙醇350mL在热水浴(95℃)中回流浸提3次,每次3h,合并流液,回流结束后抽滤,收集滤液,浓缩得十子代平方总黄酮。

2.2 总黄酮含量测定

2.2.1 标准曲线制备[5]

精密称取芦丁标准品10.06mg,置于烧杯中用适量的无水乙醇溶解,转移到50mL容量瓶中,加入无水乙醇定容、摇匀。分别精密量取上述溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、6.0mL于25mL容量瓶中,加超纯水至8.0mL,然后加1.0mL 5%NaNO2摇匀,放置6min,加1.0mL 10%Al(NO3)3摇匀,放置6min,再加10.0mL 4%NaOH摇匀,用超纯水定容后放置15min,以第一份溶液作为空白对照在510nm处测定吸光度,以吸光度A对浓度C绘制标准曲线。标准曲线方程为A=17.687C-0.0166,R2=0.999 4,R=0.999 6,结果表明线性关系良好。

2.2.2 样品含量测定

精密量取上述总黄酮提取液10.0mL,置于100mL容量瓶中稀释至刻度,定容,摇匀。精确量取10.0mL样品溶液3份置于25mL容量瓶中,按测定标准曲线的方法操作测定吸光度,根据标准曲线计算得样品溶液中总黄酮浓度。样品含量=样品浓度C(mg/mL)×稀释倍数。见表1。

注:样品含量=0.8150mg/mL×10=8.150mg/mL

2.3 大孔吸附树脂筛选

2.3.1 大孔树脂预处理[6]

大孔吸附树脂一般有未聚合的单体及残留溶剂,使用前须先行去除。树脂用无水乙醇浸泡24h,蒸馏水洗至无醇味,抽去水分备用。

2.3.2 静态吸附与解吸附实验

分别称取预处理过的AB-8、HPD700、DM130、HPD100、D900、D101大孔树脂1.008g(湿重),置于100mL具塞锥形瓶中,加入总黄酮浓度0.815 0mg/mL的样品液25mL,在25℃下,180r/min振荡24h,充分吸附后,分别精密量取上层液1.0mL测定总黄酮浓度,之后用蒸馏水洗涤、抽滤得到吸附后的树脂,加入50mL体积分数80%乙醇,在相同条件下震荡5h,分别精密量取上层液1.0mL测定总黄酮浓度。

按照如下公式计算吸附量、吸附率和解吸率:

式中C1和C2分别为吸附前后样品溶液总黄酮浓度(mg/mL);C3为洗脱液中总黄酮的浓度(mg/mL);V为样品液体积(mL);G为树脂湿重(g)。静态吸附、解吸附实验结果见表2、表3。

由表2和表3可知AB-8大孔吸附树脂均优于其他树脂,因此选择AB-8树脂分离纯化十子代平方中总黄酮。

2.3.3 AB-8树脂静态吸附动力学曲线绘制称取已预处理的AB-8大孔吸附树脂1.003g(湿重),置于100mL具塞锥形瓶中,加入总黄酮浓度0.716 0mg/mL的十子代平方复方总黄酮提取液50mL,在25℃下,160r/min振荡,分别于0、30、60、90、120、150、180、210、240、480、600min吸取上清液1.0mL测定总黄酮浓度,绘制树脂静态吸附动力学曲线。结果见图1。

2.4 AB-8树脂分离纯化总黄酮动态吸附解吸附实验

2.4.1 最佳上样浓度确定

分别取4.008g AB-8大孔树脂7份,湿法装入玻璃层析柱中。分别取C1(0.867 1mg/mL)、C2(1.293mg/mL)、C3(2.412mg/mL)、C4(3.493mg/mL)、C5(4.353mg/mL)、C6(4.604mg/mL)、C7(4.938mg/mL)十子代平方总黄酮提取液30mL进行动态吸附,收集流出液,定容到50mL,摇匀。分别精确量取1.0mL上述样品溶液测定总黄酮的浓度,根据“2.3”项中的(2)式计算吸附率。结果见表4。由表4可知最佳上样浓度为2.412mg/mL。

2.4.2 洗脱剂浓度确定

分别取4.005g AB-8大孔树脂5份,湿法装入玻璃层析柱中。精密量取浓度2.412mg/mL十子代平方复方总黄酮提取液30mL上柱吸附,收集过柱液,吸附树脂经过水洗后,再分别用10%、30%、50%、75%、95%的乙醇溶液50mL进行洗脱,收集洗脱液。分别精确量取1.0mL样品液测定总黄酮的浓度。结果见图2。当乙醇体积分数达50%时,总黄酮浓度变化较小,综合考虑最佳洗脱剂浓度为50%。

2.4.3 吸附穿透曲线绘制

取4.0g AB-8大孔树脂,湿法装入玻璃层析柱中。取浓度2.412mg/mL的提取液上样,以10mL为1管分段收集流出液,分别精确量取0.50mL流出液测定各管的总黄酮浓度,绘制穿透曲线。结果见图3。由图3可知饱和吸附量为160mL。

2.4.4 洗脱剂用量确定

将“2.4.3”中吸附饱和的树脂,用水洗脱树脂柱至脱液近无色,用50%的乙醇洗脱,每10mL收集一管,测定各管总黄酮浓度,绘制洗脱曲线。结果见图4。由图4可知洗脱剂用量为150mL,即5BV。

3 讨论

大孔树脂的吸附性能受多种因素的影响,如树脂的极性、比表面积、孔径等。根据“相似相溶”的原则[7],AB-8树脂吸附效果最好,可能是因为AB-8树脂为弱极性,更容易吸附弱极性十子代平方复方总黄酮。AB-8树脂不仅吸附好,还能较快地达到平衡,节约时间。本实验确定了上样浓度、上样量、洗脱剂浓度、洗脱剂体积等因素对分离纯化效果的影响,为十子代平方中总黄酮类成分的分离纯化提供了新方法。

参考文献

[1]吴立军.天然药物化学[M].北京:人民卫生出版社,2011:183.

[2]张伟,陈素红,吕圭源.菟丝子功效性归经与现代药理学的相关研究[J].时珍国医国药,2010,21(4):808-811.

[3]郑秀棉,杨莉,王峥涛.车前子的化学成分与药理活性研究进展[J].中药材,2013,36(7):1190-1195.

[4]GAO M,WANG XL,GU M,et al.Separation of polyphenols using porous polyamide resin and assessment of mechanism of retention G-2422-2011[J].Journal of Separation Science,2011,34(15):1853.

[5]YANG SH,DOU K F,SONG W J.Prevalence of diabetes among men and women in China[J].N Engl J Med,2010,326(25):2425-2426.

[6]李洋,曹珊珊,张媛,等.大孔树脂分离纯化楮果总黄酮优化工艺研究[J].离子交换与吸附,2013,29(4):323-333.

植物黄酮分离纯化研究篇4

1 实验仪器与材料

1.1 实验仪器

R-501旋转蒸发仪 (上海申顺生物科技有限公司) 、DZF-6050型恒温干燥箱 (上海精宏实验设备有限公司) 、TU-1810型紫外可见分光光度计 (北京普析通用仪器有限责任公司) 、KQ-250DE数控超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司) 、30 m L三角瓶若干、漏斗若干、量筒、10 m L容量瓶若干、层析玻璃柱等。

1.2 实验材料

菊米 (浙江省) 、芦丁对照品 (中国药品生物制品检定所) 、95%乙醇 (工业纯) 、无水乙醇 (分析纯, 检测) 、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸银均为分析级。

大孔吸附树脂:D101大孔吸附树脂、HPD100大孔吸附树脂、AB-8大孔吸附树脂、HZ841大孔吸附树脂、HZ841B大孔吸附树脂。

2 实验方法

2.1 菊米提取物的制备

称取已粉碎的菊米粉末200 g, 按固液比1∶10加入70%的乙醇, 微沸状态下, 水浴回流3次, 1 h/次, 合并提取液, 减压回收溶剂至浸膏状, 恒温干燥得菊米提取物。

2.2 大孔吸附树脂的预处理

称取5种大孔吸附树脂各10 g, 用95%乙醇浸泡4 h, 放出洗脱液, 用95%乙醇充分淋洗至流出液加3倍水不显浑浊, 再用纯化水反复冲洗至无乙醇味。处理后的大孔吸附树脂用纯化水浸泡备用。

2.3 大孔吸附树脂筛选实验

吸干已处理好的大孔吸附树脂表面水分, 各称取2 g于三角瓶中。精密称取黄酮提取物, 配制成浓度10 mg/m L的供试液, 精密吸取10 m L供试液, 加入各三角瓶中, 置于超声波振荡吸附8 h, 以达到饱和吸附。取上清液测吸光度, 计算树脂的吸附率。

滤出饱和吸附总黄酮的树脂, 吸干表面水分, 精密加入60%乙醇20 m L, 在超声波中振荡2 h后滤出, 测定吸光度, 计算解吸率。

2.4 D101大孔吸附树脂对总黄酮的静态吸附实验

分别精密称取D101大孔吸附树脂1.0 g置于5个30 m L三角瓶中, 加入不同浓度的黄酮供试液各20 m L, 超声波中振荡吸附30 min。取吸附后的溶液测吸光度, 计算不同浓度黄酮供试液的树脂对黄酮的吸附率, 以确定黄酮供试液的最佳上柱浓度。

2.5 D101大孔吸附树脂对总黄酮的静态解吸实验

分别精密称取D101大孔吸附树脂1.0 g置于6个30 m L三角瓶中。精密称取黄酮提取物, 制成最佳上柱浓度的总黄酮供试液, 精密吸取20 m L加入大孔吸附树脂中, 超声波中振荡吸附30 min。过滤, 吸干表面的水分, 加入不同浓度的乙醇溶液15 m L解吸, 测定解吸液吸光度, 计算不同浓度乙醇对黄酮的解吸率, 以确定洗脱剂最佳浓度。

2.6 D101大孔吸附树脂对总黄酮的动态吸附与及解吸实验

称取D101树脂10 g装柱, 以最佳上柱浓度配置溶液上样, 流速1 m L/min, 每1个柱体积收集1瓶流出液, 测定吸光度, 计算出流出液中黄酮的浓度, 绘制树脂对菊米黄酮的吸附曲线。用纯化水洗脱杂质——多糖, 纯化水洗脱液每1个柱体积测定1次总黄酮的吸光度, 计算出总黄酮浓度, 确定水的洗脱倍量。再用60%乙醇对吸附后的树脂解吸, 每半个柱体积收集一瓶解吸液, 测定吸光度, 计算出解吸液中黄酮的浓度。

2.7 D101大孔吸附树脂的使用次数实验

取100 g D101大孔吸附树脂装柱, 用95%乙醇浸泡3～4 h (乙醇高于树脂层10～20 cm) 。结束后用95%乙醇洗至流出液加3倍量的水不显浑浊, 再加纯化水洗至流出液无明显乙醇味。以最佳上样浓度1.5 mg/m L配置溶液上样, 上样量为28 BV, 取吸附后的溶液测吸光度计算黄酮的总吸附量和吸附率, 再用6 BV的纯化水洗脱多糖, 用3 BV的60%乙醇洗脱黄酮。树脂再生:5个柱体积的5%HCL吸脱, 纯化水吸脱至中性, 5个柱体积5%NAOH洗脱至中性。将再生后的树脂重复上述实验, 通过计算吸附后的溶液的浓度确定树脂的吸附能力, 直至树脂的吸附能力降低, 确定大孔吸附树脂的重复使用次数。

2.8 提取液中黄酮含量测定

以芦丁作为标准物质, 采用紫外分光光度法测定总黄酮含量。

计算公式为:

黄酮含量 (以芦丁计) =nC0V1V3/ (WV2) 100%式中n——提取液稀释倍数 (未稀释为1) ;

C0——样液含黄酮浓度, mg/m L;

V1——定容体积, m L;

V2——显色反应测定取用样液体积, m L;

V3——提取液体积, m L;

W——称样量, mg。

3 结果与分析

3.1 大孔吸附树脂吸附量实验

大孔吸附树脂吸附量实验结果如表1所示。

从表1可知:D101大孔吸附树脂的吸附量最高, 吸附率及解析率都较高, 故选用D101大孔吸附树脂分离纯化菊米总黄酮。

3.2 大孔吸附树脂对菊米总黄酮的静态吸附实验

菊米总黄酮上柱液浓度。菊米总黄酮供试液浓度对树脂吸附效果的影响如图1所示。

由图1可见:随着黄酮浓度的增加, 其吸附率呈递减趋势。0.5 mg/m L时吸附率最大, 但供试液浓度偏小, 在生产操作中, 供试液体积偏大;1.0 mg/m L和1.5 mg/m L吸附率差别不明显。基于最大限度处理量的考虑, 选取1.5 mg/m L作为上柱浓度, 其吸附率达到73%, 即菊米总黄酮浓度在1.5 mg/m L左右时更有利于吸附。

3.3 D101大孔吸附树脂对总黄酮的静态解吸实验

洗脱剂的浓度。洗脱剂浓度对树脂解吸效果的影响如图2所示。

由图2可见:随着乙醇浓度的增加, D101大孔吸附树脂对菊米黄酮的解吸率呈递增趋势。当乙醇浓度达到60%以后, 解吸率趋于恒定。且乙醇浓度偏高, 会使其他杂货一起洗脱下来。基于实验的可行性及经济多种因素综合考虑, 选取60%乙醇作为洗脱剂。

3.4 D101大孔吸附树脂对总黄酮的动态吸附与及解吸实验

3.4.1 大孔吸附树脂对黄酮的动态吸附性能

大孔树脂对黄酮的吸附曲线如图3所示。

由图3可见:随着供试液上样量的增加, 流出液中黄酮含量增加, 即树脂对黄酮的吸附效果随上样量的增加而下降。上样量>28 BV (即405 m L) 时, 流出液中黄酮含量基本趋于平衡趋势, 即树脂吸附达到饱和。

3.4.2 纯化水洗脱的用量

纯化水对黄酮的解吸曲线如图4所示。

由图4可见:纯化水用量在6 BV时, 解吸液中黄酮总量基本不变, 所以纯化水的用量为6 BV。

3.4.3 60%乙醇洗脱的用量

60%乙醇对黄酮的解吸曲线如图5所示。

由图5可见:60%乙醇用量在6个1/2 BV时, 解吸液中黄酮总量基本不变, 所以60%乙醇用量为3 BV。

3.5 D101大孔吸附树脂对总黄酮分离纯化的次数实验

D101大孔吸附树脂使用次数与收率的关系如表2所示。

D101大孔吸附树脂吸附率变化曲线如图6所示。

由图6可见:D101大孔吸附树脂的吸附率随着使用次数的增加而不断下降, 第6次后吸附率降低至50%以下。从实际生产时的经济效益来看, D101大孔吸附树脂对总黄酮分离纯化次数为6次。

4 结语

(1) 5种大孔吸附树脂中, D101对菊米黄酮的吸附量较大, 吸附率与解吸率较高, 是较理想的载体, 适用于菊米黄酮的分离纯化。

(2) D101大孔吸附树脂分离纯化菊米黄酮流速为10 m L/min时, 最佳上柱供试液浓度约为1.5 mg/m L, 上样量为28 BV, 纯化水洗脱用量6 BV, 洗脱剂乙醇浓度60%, 乙醇洗脱用量3 BV, D101大孔吸附树脂柱的使用次数6次。

摘要：以总黄酮吸附量、吸附率及解析率为指标筛选分离纯化菊米总黄酮的工艺参数。结果:5种大孔吸附树脂中, D101大孔吸附树脂的静态饱和吸附量最高, 为46.2mg/mL, 最佳上柱供试液浓度约为1.5mg/mL, 纯化水洗脱用量6BV, 洗脱剂乙醇浓度60%, 乙醇洗脱用量3BV, D101大孔吸附树脂柱的使用次数5次。结论:D101大孔吸附树脂的静态饱和吸附量为46.2mg/mL, 上柱供试液浓度约为1.5mg/mL, 最佳上样量为28BV, 纯化水洗脱用量6BV, 洗脱剂乙醇浓度60%, 乙醇洗脱用量3BV, D101大孔吸附树脂柱的使用次数6次。

关键词：分离纯化,大孔吸附树脂,菊米,总黄酮,工艺

参考文献

[1]国家药典委员会.中国药典:一部[M].北京:中国医药科技出版社, 2010.1

[2]浙江大学.菊米中黄酮类物质的提取方法[P].中华人民共和国国家知识产权局, 200810162423.8

[3]张素华, 王正云.大孔树脂纯化芦笋黄酮工艺研究[J].食品科学, 2006, 27 (2) :182～186

[4]谢贞建, 唐鹏程, 焦士蓉.大孔树脂分离纯化枳实总黄酮工艺研究[J].食品与药品, 2009, 3:16～19

植物黄酮分离纯化研究篇5

大孔吸附树脂是一类有机高聚物吸附剂,具有选择性好、吸附量大、吸附速率快、机械强度高、易再生等优点,已被广泛运用于天然产物黄酮类化合物的分离纯化[10,11,12]。目前关于两种及多种树脂混用在天然产物分离纯化上的运用研究已有相关报道[13,14,15],而关于大孔树脂在竹叶黄酮类化合物的分离纯化的研究多为单一树脂的研究,未见多种树脂的混用技术的研究报道。

本研究采用大孔树脂混用技术,在8 种大孔吸附树脂中选取两种进行混合,对竹叶黄酮进行分离特性的研究,分离纯化效果好,样品中黄酮纯度得以大大提高,为竹叶黄酮的纯化提供了新方法,具有较好的应用价值,对竹叶资源的利用具有重要意义。

1 实验

1. 1 材料、试剂与仪器

竹叶采于2013 年贵州赤水,并通过自然风干,备用。

芦丁标准品( 中国食品药品检定研究院; 批号: 100080 -201409) ; 氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、石油醚、乙醇、甲醇、盐酸均为国产分析纯; 大孔吸附树脂( D101 - 1、D101、AB - 8、DM130、DM301、ADS - 17、S - 8) 来自安徽三星树脂有限公司、NKA - 9 来自沧州宝恩树脂有限公司。

恒温水浴锅、旋转蒸发器,上海亚荣生化仪器厂; SHB -IV循环水式多用真空泵,郑州长城科工贸有限公司; HH - 4数显恒温水浴锅,常州澳华仪器有限公司; 恒温循环器,北京博医康实验仪器有限公司; JC - 100 恒温培养振荡器,上海精旭实业有限公司; 酒精计,河北省武强县同辉仪表厂; JF1204电子分析天平,余姚市金诺天平仪器有限公司; 101 - 1AB电热鼓风干燥箱,天津市泰斯特仪器有限公司; UV - 6100S紫外/ 可见分光光度计,上海美谱达仪器有限公司; 雷磁PHS -25p H计,上海仪电科学仪器股份有限公司; 玻璃层析柱。

1. 2 实验方法

1. 2. 1 竹叶黄酮提取方法

取干燥未粉碎的竹叶,先按料液比1∶20( g/m L) 加入50%乙醇提取一次分离固液后,再以料液比1∶15( g/m L) 进行二次提取. 合并两次提取液,醇沉过夜以除去糖类、蛋白质等,浓缩至一定浓度,备用。

1. 2. 2 树脂处理方法

先用体积分数95% 乙醇溶液充分浸泡过夜,然后用无水乙醇洗至洗出液加适量水后无白色浑浊,再用去离子水洗至洗出液无醇味,转入酸碱处理,用4 BV的5% HCL溶液以5 BV/h流经层析柱后浸泡3 h,然后用去离子水洗至p H值为中性,用4 BV的5% Na OH溶液以5 BV / h流经层析柱后浸泡3 h,然后用去离子水洗至p H值为中性,浸泡于95% 乙醇中备用,使用前用水洗至无醇味。

1. 2. 3 竹叶黄酮的测定方法

1. 2. 3. 1 标准曲线的绘制

由于芦丁和黄酮类化合物都是以2 - 苯基色原酮为母核,具有相同的吸光度测试性质,故用芦丁为标准品,采用Na NO2- Al ( NO3)3- Na OH比色法测定总黄酮含量[16]。精确称量0. 0150 g芦丁标准品,置于100 m L容量瓶中,用甲醇定容至刻度,摇匀得浓度为0. 15 mg/m L的标准溶液。准确吸取芦丁标准溶液0 m L、1. 0 m L、2. 0 m L、3. 0 m L、4. 0 m L、5. 0 m L、6. 0 m L、7. 0 m L于25 m L具塞比色管中,用30% 乙醇补齐至10 m L,加0. 7 m L 5% Na NO2溶液摇匀放置5 min后,加入0. 7 m L 10% Al( NO3)3溶液摇匀6 min后,再加入5 m L 1 mol/L Na OH溶液,摇匀,用30% 乙醇定容至刻度。静止15 min后置于分光光度计于510 nm处测吸光度A,记录数值。以吸光度为纵坐标,芦丁质量浓度为横坐标,绘制标准曲线,所得线性标准回归方程为y = 11. 66071x + 0. 00186,相关系数R2=0. 99972。

1. 2. 3. 2 样品含量及纯度的测定

取一定量待测试样溶液,按绘制标准曲线的步骤,于510 nm处测定吸光度,根据标准曲线方程计算样品黄酮浓度。

竹叶黄酮精制后于50 ℃ 条件放置烘箱干燥至恒重,取精制产品100 mg,用30% 乙醇溶解并定容至100 m L,摇匀待测其黄酮浓度。

1. 2. 4 单一大孔吸附树脂的筛选

1. 2. 4. 1 静态吸附与解吸实验

准确称取1 g已处理好的8 种吸附树脂( 用滤纸吸干后称重)装入100 m L锥形瓶中,精密加入30 m L质量浓度0. 8 mg/m L竹叶黄酮样品溶液,于25 ℃ 下置恒温培养振荡器中振荡吸附24 h,过滤,测定剩余黄酮的质量浓度,按式( 1) 、( 2) 计算吸附量和吸附率; 吸附后的树脂用滤纸吸干后加入30 m L的95%乙醇,在25 ℃ 下置恒温培养振荡器中振荡解吸24 h,过滤测定洗脱液中黄酮质量浓度,按式( 3) 、( 4) 计算其解吸率。

1. 2. 4. 2 静态吸附与解吸动力学实验

根据1. 2. 4. 1 结果所示,选择其中2 种较理想的树脂进行静态吸附与解吸动力学实验。按1. 2. 4. 1 的方法,每隔1 h取样检测,测定其中吸附液剩余黄酮浓度,以树脂对黄酮的吸附量与时间作图,绘制大孔树脂静态吸附动力学吸附曲线及静态动力学解吸曲线。

1. 2. 5 混合大孔吸附树脂比例的筛选

将上述两种效果较好的树脂以一定质量比混合,按1. 2. 4. 1 的方法,于25 ℃ 下置恒温培养振荡器中振荡吸附5 h,解吸4 h,按公式( 1) ~ ( 4) 计算吸附量、吸附率和解吸率。筛选出最优树脂混合比例。

1. 2. 6 混合大孔吸附树脂静态吸附、解吸实验

1. 2. 6. 1 上样液质量浓度对吸附效果的影响

各取30 m L上样液质量浓度分别为0. 4 mg/m L、0. 8 mg/m L、1. 2 mg / m L、1. 6 mg / m L、2. 0 mg / m L的竹叶总黄酮提取液。加入1 g树脂( AB - 8∶D101 - 1 = 1∶2) ,于25 ℃ 下恒温振荡吸附5 h,取一定量上层清液按绘制标准曲线的方法测定其总黄酮浓度,计算其吸附率和吸附量。

1. 2. 6. 2 洗脱液体积分数对解吸率的影响

将吸附饱和的1 g树脂( AB - 8∶D101 - 1 = 1∶2) 用滤纸吸干后,分别加入体积分数为40% 、50% 、60% 、70% 、80% 、90% 乙醇各30 m L。下同1. 2. 6. 1,计算其解吸率。

2 结果与讨论

2. 1 单一大孔吸附树脂的筛选

2. 1. 1 静态吸附与解吸实验

竹叶黄酮具有一定的酚羟基且有一定的极性,而大孔吸附树脂是种表面吸附剂,吸附性能主要取决于吸附剂的表面性质,即树脂的极性( 功能基) 和空间结构( 孔径、比表面积、孔容等) ,由于不同树脂结构性质的不同,从而对竹叶黄酮树脂的吸附解吸难易程度不同。由表1 可知,如D101 - 1 型树脂吸附效果较好,吸附率达到71. 04% ; S - 8 型树脂虽然吸附效果最好,但是其解吸效果较低; 而解吸率最高的是AB - 8 型树脂达95. 07% 。综合考虑黄酮的吸附率、解吸率,本实验拟采用D101 - 1 和AB - 8 两种树脂按一定比例混合,筛选出对竹叶黄酮分离纯化效果更好的树脂混合比例。

2. 1. 2 静态吸附与解吸动力学实验

分别考察其静态吸附解吸动力学特性,结果如图1、图2所示,D101 - 1 与AB - 8 两种大孔树脂能够达到快速吸附与解吸平衡,在5 h时,D101 - 1 与AB - 8 的吸附量分别是15. 37mg / g和15. 09 mg / g,基本达到吸附平衡; 在4 h时,D101 - 1 与AB - 8 的洗脱液浓度分别是0. 490 mg / m L和0. 487 mg / m L,基本达到解吸平衡。

2. 2 混合大孔吸附树脂比例的筛选

大孔树脂对竹叶黄酮的吸附作用与其空间结构和功能团息息相关,考虑到不同树脂的协同作用和空间结构参数的不同,通过不同比例树脂的混合,混合树脂的空间结构和功能团有所差异。由表2 可知,当两种树脂以一定比例混合时,其不同的吸附率和解吸率作为判断对竹叶黄酮分离纯化效果的标准,当AB - 8∶D101 - 1 = 1 ∶2 时,吸附率与解吸率均较高所以选择以此比例混合后对竹叶黄酮进行分离纯化。

2. 3 不同条件下混合大孔吸附树脂对竹叶黄酮纯化工艺的实验

2. 3. 1 上样液质量浓度对吸附效果的影响

大孔树脂对竹叶黄酮溶液吸附过程是一种液固吸附过程,而液固之间的吸附不仅存在吸附剂与溶质之间的作用,还存在溶质- 溶质、溶质- 溶剂、溶剂- 吸附之间的作用[17]。由图3可知,随着上样液浓度的增加,吸附率逐渐降低,吸附量逐渐增大。综合考虑黄酮的吸附率与树脂的吸附量,选择最适上样液浓度为1. 2 mg/m L。

2. 3. 2 洗脱剂体积分数对解吸率的影响

常用的洗脱剂多为甲醇、乙醇、丙酮等,由于乙醇安全、无毒、易回收等优点,本实验选择乙醇作为洗脱剂,通过静态吸附解吸实验,吸附5 h后,考察不同乙醇体积分数对竹叶黄酮分离纯化的影响,如图4 所示。从图4 中可以看出,随着乙醇体积分数的增加,解吸率先增加后减少,在70% 时解吸率达到最大值90. 81% 。当体积分数大于70% 时解吸率降低,这是由于当乙醇浓度过高时,醇溶性杂质增加,降低洗脱液中黄酮纯度。

2. 3. 3 最佳上样体积的确定

取1. 2 mg/m L竹叶黄酮提取液,以2 BV/h流经层析柱。每0. 5BV为一收集段收集流出液,测定其黄酮质量浓度,绘制其泄漏曲线如图5 所示。流出液黄酮浓度随着上样量的增加而增加,则吸附率逐渐降低; 而上样量过少时,树脂的吸附量减小,树脂利用率降低。综合考虑树脂的吸附率与树脂的吸附量,选择3. 5 BV为最佳上样量体积。

2. 3. 4 最佳上样流速的确定

上样液通过树脂床的流速对树脂的吸附效率及生产效率均有着一定的影响。本实验通过控制不同流速考察对吸附效果的影响,将树脂( AB - 8∶D101 - 1 = 1∶2) 装柱,竹叶黄酮上样量浓度1. 2 mg/m L,上样量3. 5 BV,分别以1 BV/h、2 BV/h、3 BV / h、4 BV / h、5 BV / h的流速流经层析柱,测定吸附过程中流出液的黄酮质量浓度,计算黄酮吸附总量。结果如图6所示。随着上样流速的增加,吸附量降低,反之,流速降低,有利于总黄酮的吸附,但会影响生产效率,增加吸附时间,生产周期和成本增加。综合考虑树脂的处理量和黄酮的利用率,选择2 BV/h为最佳上样流速。

2. 3. 5 最佳洗脱体积的确定

按确定的最佳吸附条件上柱,用1 BV水洗去水溶性杂质,再用70% 乙醇作为洗脱剂以2 BV/h的流速洗脱,每0. 5 BV作为一收集段收集洗脱液,检测其中总黄酮质量浓度,绘制洗脱曲线如图7 所示。当洗脱体积达到4 BV时,洗脱液中黄酮浓度接近于0,考虑到洗脱效率与洗脱剂用量,选择4 BV为最佳洗脱体积。

2. 3. 6 最佳洗脱流速的确定

按确定的吸附条件上柱,先用1 BV水洗去水溶性杂质,用4 BV的70% 乙醇分别以1 BV/h、2 BV/h、3 BV/h、4 BV/h、5 BV / h的速度进行洗脱。测定洗脱液总黄酮质量浓度计算解吸率,如图8 所示。不同的流速对其解吸效果影响不大,考虑洗脱时间不至于过长,选用2 BV/h为最佳洗脱流速。

2. 4 混合树脂纯化工艺验证实验

上样条件: 上样质量浓度1. 2 mg/m L,上样量体积3. 5 BV,上样流速2 BV/h; 洗脱条件: 洗脱剂体积分数70% ,4 BV洗脱剂体积,洗脱流速2 BV/h。以此条件对竹叶黄酮进行精制,收集洗脱液经旋转蒸发器浓缩后烘干。测得其黄酮纯度为28. 16% ,与纯化前黄酮纯度8. 46% 相比,纯度为原来的3. 3倍。纯化效果显著。

3 结论

在8 种大孔吸附树脂中选取两种( D101 -1 与AB -8) ,采用混用技术进行分离纯化竹叶黄酮工艺条件考察,结论如下: D101- 1 与AB - 8 以2∶1 比例混合,上样液质量浓度1. 2 mg / m L、上样量为3. 5 BV、上样流速2 BV/h条件下上柱吸附、洗脱剂体积分数70% 、洗脱体积4 BV、洗脱流速2 BV/h的条件下进行洗脱。比较纯化前后黄酮纯度,较纯化前8. 46% ,纯化后黄酮纯度为28. 16%,纯度为原来的3. 3 倍。大孔树脂混用技术为竹叶黄酮的纯化提供了新方法,具有较好的应用价值。

摘要：采用大孔树脂混合使用技术,用于分离纯化竹叶黄酮的工艺研究。通过研究8种大孔树脂对竹叶黄酮的静态吸附与解吸实验,筛选出两种较好的树脂D101-1和AB-8,采用混用技术进行实验,结果表明:D101-1与AB-8的最优混合比例为2:1;上样液质量浓度1.2 mg/m L、上样量为3.5 BV、上样流速2 BV/h为最佳上样条件,洗脱剂体积分数70%、洗脱体积4BV、洗脱流速2 BV/h的条件下进行洗脱。在此条件下进行纯化实验,分离纯化效果最好,样品中黄酮纯度由原来的8.46%上升至28.16%。

植物黄酮分离纯化研究篇6

1 试验过程

1. 1 材料、试剂与仪器

材料: 八角莲采于梵净山,洗净、切碎,于60℃电热鼓风干燥箱中烘干,粉碎,室温保存备用。

试剂: AB - 8型、DM101型和DM130型大孔树脂 ( 勤实科技大孔树脂) ; 亚硝酸钠 ( 成都金山化学试剂有限公司) ; 硝酸铝 ( 天津市恒兴化学试剂制造有限公司) ; 氢氧化钠 ( 天津石英钟厂霸州化工分厂) ; 无水乙醇 ( 天津市富宇精细化工有限公司) ; 石油醚 ( 天津市富宇精细化工有限公司) ; 盐酸 ( 衡阳市凯信化工试剂有限公司) ;以上试剂均为分析纯。

仪器: PL602 - S型电子天平 ( 梅特勒 - 托利多仪器( 上海) 有限公司) ; 101 - 3型电热鼓风干燥箱 ( 北京科伟永兴仪器有限公司) ; FW80型高速万能粉碎机 ( 北京科伟永兴仪器有限公司) ;HH - 2型数显恒温水浴锅 ( 国华电器有限责任公司) ; SHZ - D( Ⅲ) 循环水式真空泵 ( 巩义市子华仪器有限责任公司) ; RE - 2000A型旋转蒸发仪 ( 上海豫康科教仪器设备有限责任公司) ;KR800型医用低速离心机 ( 常州市康仁医疗器械有限公司) ; 2004( C) 紫外可见分光光度计 ( 北京普析通用仪器有限责任公司) ; GL - 3250B型磁力搅拌器、98 - Ⅱ - B型磁力搅拌电热套 ( 天津市泰斯特仪器有限公司) 。

1. 2 实验方法

1. 2. 1 芦丁标准溶液曲线的配制及标准曲线的绘制

精密称取干燥至恒重的芦丁标准品10. 0mg,加体积分数为80 % 的乙醇溶解,水浴中微微加热,定容至100 m L容量瓶中,摇匀制成0. 1mg / m L标准溶液[4]。分别取上述芦丁标准溶液0、0. 2、0. 5、1. 0、2. 0、3. 0、4. 0 m L于10 m L容量瓶中,加5 g /m L亚硝酸钠0. 4m L,放置6 min,加10 g /100 m L硝酸铝0. 4 m L,放置6 min,再加4g /100 m L氢氧化钠4 m L。加蒸馏水至刻度,摇匀,放置15 min。取1m L稀释10倍,在510 nm波长下分别测其吸光度,用空白试剂作对照; 以芦丁标准样品质量浓度ρ ( mg /m L) 为横坐标,吸光度A为纵坐标绘制标准曲线。见图1,得回归方程:A = 0. 084ρ - 0. 004,相关系数R = 0. 999。

1. 2. 2 大孔吸附树脂的预处理

分别称取一定量的3种大孔吸附树脂,用4倍体积95 % 的乙醇浸泡24 h以后,用95% 的乙醇反复洗脱,洗至洗脱液与水( 体积比为1∶5) 混合不产生白色浑浊为止,再用蒸馏水反复洗至无醇味,再用4倍体积的2 % Na OH溶液浸泡3 h,再反复用蒸馏水洗脱至洗脱液呈中性,再用4倍体积的0. 5 % HCl溶液浸泡3 h后,用水洗至呈中性,后抽滤去水分备用[5,6,7]。

1. 2. 3 样品溶液的制备

将八角莲样品置于广口瓶中,按1∶3( g /m L)的比例加入石油醚,浸泡4 h后,除去色素,抽滤后烘干,将烘干后的粉末与60 % 乙醇按1∶20( g / m L) 比例放入锥形瓶中,将锥形瓶放入70℃恒温水浴锅中,加热1. 5 h,冷却后抽滤,将所得的滤液在60℃下进行旋蒸,将旋蒸出的溶液在离心机中离心分离( 3000 r/min) 10 min,冷藏备用。测定黄酮类化合物含量[8,9]。

2 结果与分析

2. 1 树脂类型的选择

采用静态吸附法测定各树脂对八角莲黄酮类化合物的吸附率,通过吸附率高低选择树脂类型。实验结果见图2。

由图2知,AB - 8型大孔树脂对八角莲黄酮类化合物的吸附率高于其他两种树脂。由于吸附率越高,其静态吸附率也越大[10]。所以选择AB- 8型大孔树脂进行吸附实验。

2. 2 静态吸附与解吸实验

2. 2. 1静态吸附条件选择

( 1) 树脂与样液比对静态吸附的影响

分别准确称取经预处理过的树脂1 g于5个100m L具磨口三角瓶中,分别加入10、20、30、40、50 m L黄酮溶液,25℃恒温振荡24 h充分吸附后,抽滤,吸取1 m L溶液,测定滤液中黄酮浓度。实验结果见图3。树脂对八角莲黄酮的吸附率按( 1) 式计算。

式中q为吸附率( mg /g) ; ρ0为提取液原液质量浓度( mg∕m L) ; ρ1为吸附后剩余溶液质量浓度( mg∕m L) ; V为提取液体积( m L) ; m为树脂质量( g) 。

吸附后黄酮溶液中的黄酮浓度越低,说明被吸附的黄酮越多。由图3可知,当树脂与样液比为1∶20 g /m L时,吸附后黄酮浓度最低,所以树脂与样液的最佳比例为1∶20 g /m L。

( 2) 吸附时间对静态吸附的影响

按最佳树脂与样液比例( 即1∶20 g /m L) ,25℃恒温振荡,24 h内每隔1 h取1 m L溶液测定黄酮浓度。实验结果见图4。

由图4知,吸附时间在3 h前时,吸附率逐渐增加,在3 h时达到顶峰,3 h后吸附率逐渐降低,所以吸附时间3 h为最佳。

2. 2. 2 静态解吸条件选择

( 1) 洗脱液体积分数对静态解吸的影响

将按最佳样液比和最佳吸附时间下得到的吸附有总黄酮的树脂,分别用40% 、50% 、60% 、70% 、80% 的乙醇溶液洗脱,恒温振荡3 h后,抽滤,测定滤液的总黄酮含量,计算解吸率,根据解吸率选择洗脱液( 乙醇) 的最佳体积分数。实验结果见图5。

解吸率( %) = ρ2* V2* 100 / ( ρ0- ρ1) * V1( 2)

式中,ρ0为原液质量浓度( mg /m L) ; V1为原液体积( m L) ; ρ1为吸附后溶液质量浓度; ρ2为解吸后剩余溶液质量浓度; V2为洗脱液体积。

由图5可知,解吸率在乙醇体积分数为60% 之前一直下降,当乙醇体积分数为70 % 时达到到最大值,随后又降低,所以最佳乙醇体积分数为70 % 。

( 2) 洗脱液用量对静态解吸的影响

用70 % 乙醇按照1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g / m L树脂和洗脱液的比例,恒温振荡3 h,抽滤,测定滤液的黄酮含量,计算解吸率。实验结果见图6。

由图6知,随着树脂与解吸液的比例逐步增大时,解吸率呈逐渐上升趋势,在树脂与解吸液的比例为1∶50 g /m L时达到最大,所以1∶50 g /m L为最佳的树脂与洗脱液的比例。

2. 3 动态吸附与解吸实验

2. 3. 1动态吸附条件选择

( 1) 动态流速对动态吸附作用的影响

准确称取与处理好的树脂装柱,通过恒流泵将样品液流经树脂柱床,流速分别为0. 1、0. 5、1. 0、1. 5 m L / min。控制流速,每10 min收集一流分,检测黄酮浓度,计算其吸附率,吸附率高的流速为最佳流速。实验结果见图7。

由图7知,流速在0. 5 m L/min以前,吸附率逐渐增加,在流速为0. 5 m L/min时吸附率达到最大值。之后呈下降趋势,所以流速为0. 5 m L/min是最佳的动态流速。

( 2) 静置时间对动态吸附的影响

确定黄酮的初始浓度,将树脂与原液比1∶20的溶液分别静置40、60、80、100、120 min,将溶液以最佳流速流出,取1 m L流出液测黄酮含量,根据吸附率,确定最佳静置时间。实验结果见图8。

由图8知,80 min以前吸附率随静置时间的增加而增加,在80 min时达到最高,之后呈下降趋势,所以最佳静置时间为80 min。

2. 3. 2 动态解吸条件选择

1) 解吸液体积分数对动态解吸的影响

称取2. 0 g树脂,吸附完全后,依次用不同体积分数的乙醇溶液洗脱,收集并测定洗脱液中黄酮含量,计算解吸率,考察乙醇体积分数对解吸率的影响。实验结果见图9。

由图9可得,在乙醇体积分数为60 % 之前其解吸率呈上升趋势,在60 % 时达到最高,以后解吸率逐渐下降,所以乙醇的体积分数为60 % 。

2) 洗脱液用量对动态解吸的影响

用60 % 体积分数的乙醇溶液按照1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g / m L树脂和解吸液的比例进行解吸,计算解吸率,确定最佳的洗脱剂用量。实验结果见图10。

由图10可知,树脂与解吸液的比例在1∶40 g / m L以前,解吸率随树脂与解吸液的比例增加而增加,到1∶40 g /m L时达到最大,之后有下降趋势,所以树脂与解吸液的比例为1∶40 g /m L解吸率最大。

3 结论

植物黄酮分离纯化研究篇7

大孔吸附树脂是近年发展起来的一类有机高分子聚合物吸附剂, 它具有物理化学性质稳定、吸附选择性独特和再生简便等优点, 广泛用于生化物质的分离纯化。本研究选用4种不同类型的吸附树脂对沙棘籽及果皮渣黄酮的粗提物进行吸附和解析, 确定选择性高、吸附速率快、吸附容量大且易于解吸的树脂种类, 并采用单因素试验确定纯化的最佳工艺条件。

1 试验材料与方法

1.1 材料

沙棘籽及果皮渣是蛟河沙棘研究所提油榨汁后的副产物;试剂为无水乙醇 (AR) 、硝酸铝 (AR) 、亚硝酸钠 (AR) 、氢氧化钠 (AR) 、D101、D201、H103、AB-8和S-8型大孔吸附树脂。芦丁为sigma公司提供的标准品。

仪器为UV2000紫外分光光度计, 上海天美科学仪器有限公司;RE-52AA旋转蒸发器, 上海亚荣生化仪器厂;BSZ-160F电脑自动部分收集器, 上海精科实业有限公司;DZF-6050真空干燥箱, 上海精宏试验设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 沙棘籽及果皮渣黄酮样品液制备

取10g粉碎过80目筛的沙棘籽及果皮渣, 按料液比为1∶40加入60%乙醇, 70℃水浴, 提取2次, 每次2h, 然后过滤得滤液备用。

1.2.2 沙棘籽及果皮渣黄酮含量测定

以芦丁为对照品, 采用Al3+显色法测定黄酮含量。

(1) 标准曲线的制备。精确称取芦丁标准品, 按Al3+显色法测定不同浓度的芦丁标准液, 绘制标准曲线, 得回归方程:y=10.446x-0.0027, R2=0.9991。

(2) 沙棘籽及果皮渣黄酮含量测定。移取适量黄酮提取液于10mL容量瓶中, 采用Al3+显色法进行测定, 根据回归方程计算提取液中黄酮含量。

1.2.3 树脂预处理

大孔树脂用95%的乙醇浸泡24h充分溶胀后, 用蒸馏水洗尽乙醇, 浸泡于蒸馏水中备用。

1.2.4 静态吸附法筛选树脂种类

(1) 树脂静态饱和吸附量确定。在50mL烧杯中装入处理过的D101、D201、H103、AB-8和S-8型树脂各10mL, 并于烧杯中加入黄酮粗提液40mL, 于水浴中震荡8h, 过滤, 测定滤液中的总黄酮含量, 计算饱和吸附量, 比较各树脂吸附率。

(2) 树脂静态吸附洗脱率。将上述饱和吸附沙棘籽及果皮渣黄酮的树脂滤干水分, 置于50mL烧杯中, 加入40mL的60%乙醇溶液浸泡, 放置震荡水浴中8h, 过滤, 测得滤液中总黄酮的含量, 比较各树脂解吸率。

1.2.5 树脂动态吸附黄酮工艺条件的优化

(1) 上样浓度对总黄酮回收率的影响。将经过处理的大孔树脂装入 (2.2cm×50cm) 的玻璃层析柱中, 装柱树脂高为40cm (138.2mL) 。取总黄酮浓度分别为0.5、4、6、8和10mg/mL的粗提物液体各30mL, 以2.5mL/min的流速, 分别加入5根同样的树脂柱中, 吸附完全后, 用水冲至流出液无色, 再用350mL 60%乙醇洗脱, 测定黄酮回收率, 选择最佳上样浓度。

(2) 乙醇洗脱液浓度对总黄酮回收率的影响。取总黄酮为2mg/mL的样品液5份, 各30mL, 以2.5mL/min的流速, 分别加入5根同样的大孔树脂中, 吸附完全后, 用水冲至流出液无色。分别用浓度为40%、50%、60%、70%和80%的乙醇以2.5mL/min的流速洗脱, 乙醇用量为350mL, 测定其回收率, 选取最适洗脱浓度。

(3) 乙醇洗脱速率对总黄酮回收率的影响。取总黄酮为2mg/mL的样品液5份, 各30mL, 以2.5mL/min的流速, 分别加入5根同样的大孔树脂中, 吸附完全后, 用水冲至流出液无色。用浓度为60%乙醇分别以1、2、3、4和5mL/min的流速洗脱, 乙醇用量为350mL, 测定其回收率, 选取最适洗脱浓度。

(4) 洗脱剂用量的选定。取总黄酮为2mg/mL的样品液5份, 各30mL, 以2.5mL/min的流速, 分别加入5根同样的大孔树脂中, 吸附完全后, 用水冲至流出液无色。用浓度为60%乙醇, 以2.5mL/min的流速洗脱, 每20mL收集1管, 共收集20管, 测定每管的黄酮浓度。

2 结果与分析

2.1 各树脂静态吸附量与解析率分析比较

由表1可知:选用的大孔树脂中S-8型大孔树脂对沙棘籽及果皮渣黄酮的吸附效果最佳, 但从解吸率来看, 只有D101树脂的解析率较高, 因此综合考虑本试验选择D101型大孔树脂对沙棘籽及果皮渣黄酮进行分离纯化, 并采用单因素试验对其纯化工艺进行优化。

2.2 上样浓度对总黄酮回收率的影响

由图1可知:以6mg/mL的浓度上样时, 黄酮回收率最高。随着上样浓度的增加, 黄酮回收率增加, 到上样浓度超过6mg/mL后随着浓度的增加, 黄酮回收率下降。因为上样浓度过低, 树脂对黄酮没有完全吸附, 而上样浓度过高容易将树脂堵塞, 导致洗脱不完全, 因此本试验选择6mg/mL为最佳上样液浓度。

2.3 乙醇洗脱液浓度对总黄酮回收率的影响

由图2可知:乙醇浓度过低, 大部分黄酮洗脱不下来, 乙醇浓度为60%时黄酮回收率最高, 超过60%以后, 回收率下降, 可能由于沙棘籽及果皮渣黄酮的极性与60%的乙醇相似, 从而其洗脱效果最好, 因此选择60%乙醇为最佳洗脱浓度。

2.4 乙醇洗脱速率对总黄酮回收率的影响

由图3可知:乙醇洗脱速率对黄酮回收率的影响不大, 随着乙醇洗脱速率的增加, 黄酮回收率逐渐下降, 但不明显, 流速太慢导致试验时间延长, 效率下降, 综合考虑, 本试验选择乙醇洗脱速率为3mL/min。

2.5 洗脱剂用量对总黄酮回收率的影响

将黄酮粗提液吸附在树脂上, 用洗脱液进行洗脱, 洗脱曲线如图4所示。在第9管时溶液中含有的黄酮浓度最大, 洗脱全过程共耗用400mL乙醇洗脱液, 但是从第16管以后, 黄酮浓度几乎为零, 洗脱剂用量过多对后续浓缩、干燥工艺带来不便, 因此综合考虑本试验选择洗脱剂用量为300mL。

2.6 树脂纯化黄酮的最大回收率及纯度

洗脱液经旋转蒸发浓缩, 后真空干燥得浅黄色粉末, 准确称量, 测定结果显示:纯化前黄酮粗提液中黄酮含量为0.651mg, 纯度为40.75%;纯化后黄酮含量为0.593mg, 洗脱率为91.09%, 洗脱后黄酮纯度为76.4%, 比纯化前明显提高。说明此大孔树脂种类选择合适, 工艺条件优化合理。

3 结论

本试验结果表明:分离纯化沙棘籽及果皮渣黄酮的最佳树脂为D101型树脂, 最佳工艺条件:上样液浓度6mg/mL、洗脱浓度为60%乙醇, 乙醇洗脱速率为3mL min和洗脱剂用量为300mL。经树脂分离纯化后的沙棘籽及果皮渣黄酮洗脱率为91.09%, 纯度为76.4%。

参考文献

[1]李晓花, 孔令学, 刘洪章.沙棘有效成分研究进展[J].吉林农业大学学报, 2007, 29 (2) :162-167.