植物代谢组学研究（精选9篇）
植物代谢组学研究 篇1
附子(Radix Aconiti Lateralis Preparata)为毛茛科植物乌头(Aconitum Carmichalii Debx.)的子根,其在我国传统中药中被誉为“回阳救逆第一品药”。其药理作用主要包括镇痛、消炎[1,2,3,4,5]、强心、抗心律失常、抗肿瘤、增强免疫力等[6]。但是由于附子治疗窗狭窄,往往在发挥治疗作用的同时伴随有严重的毒副反应,这些常会造成临床上的误用滥用现象。以乌头碱为代表的双酯二萜型乌头类生物碱是附子毒性的主要来源,其毒副作用主要表现为心脏毒性[7,8,9,10,11]与神经毒性[12,13]。
代谢组学是从整体角度研究生物体系受外部刺激而引起的代谢产物的变化规律,现在已经广泛应用于研究药物毒性[14,15,16,17]、新药安全性评价[18,19]、疾病诊断[20,21,22]等领域。粪便代谢物谱也是研究机体应激反应的重要方面,其能客观全面的反映肠道菌群对于食物、疾病及药物代谢的作用[23,24,25],为药物研究及疾病诊断提供辅助性的生物学信息。我们已经对附子、乌头类生物碱对大鼠血浆、尿液的代谢物谱的毒性作用进行了系统的研究[14,15,16]。本文主要利用核磁共振(NMR)的代谢组学方法检测大鼠粪样代谢物谱,考察乌头碱急性毒性作用时对大鼠肠道菌群的影响,通过多元统计的模式识别及相关性分析,寻找造成机体代谢紊乱的相关潜在差异代谢物,最终对相关代谢通路进行深入研究。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
健康雄性Wistar大鼠15只,体重(201.3±5.4)g,清洁级,军事医学科学院实验动物中心提供,合格证号:SCXK-(军)2007-004,在动物房代谢笼中12 h昼夜交替适应性饲养1周,动物自由摄食饮水,温度20~23℃,湿度60%左右。随机分为给药组、对照组,给药组10只,对照组5只。
1.2 试剂与仪器
乌头碱(Aconitine,中国药品生物制品检定所);重水(D2O,美国Norell公司);2,2,3,3,三甲基甲硅烷基丙酸(TSP,加拿大默克公司);戊巴比妥钠(国药化学试剂有限公司);Na H2PO4·2H2O,Na2HPO4·12H2O(国药化学试剂有限公司)。Varian UNITY INOVA 600 MHz超导脉冲傅立叶变换核磁共振谱仪(美国瓦里安公司);Eppendorf 5024离心机(德国Eppendorf公司);QL-901涡旋振荡器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。
1.3 实验方法
1.3.1 实验用药品的制备
精密称量8.80 mg乌头碱标准品,添加44 m L去离子水和30μL 36%~38%的浓盐酸,涡旋振荡,得到浓度为0.2 mg/m L的乌头碱溶液,4℃保存备用。
1.3.2 生物样品的采集
动物适应性结束后,给药组按照2.54 mg/kg的剂量灌胃给予乌头碱,对照组灌胃给予同剂量的饮用水,收集给药6 h后的大鼠粪样。然后腹腔注射戊巴比妥钠(3%,1.5 m L/kg)麻醉大鼠,分离心脏、肝脏及肾脏,用生理盐水冲洗,滤纸吸干,称重,并计算脏器系数。最后将生物样品保存在-20℃冰箱中,待用。
1.3.3 生物样品制备及处理
称量大鼠粪样40 mg,添加800μL重水配制的磷酸缓冲液(0.2 mol/L,p H=7.4,0.5 mmol/L TSP),搅拌涡旋使其完全溶解。然后在16 000 g的离心力下离心10 min,上清使用0.2μm的滤膜过滤后进行核磁检测。
1.4 核磁共振数据的采集与预处理
27℃下,在Varian INOVA 600 MHz超导脉冲傅立叶变换核磁共振谱仪上采用NOESY脉冲序列采集粪样水提物的一维1H-NMR谱。实验的主要参数为:谱宽8000 Hz,采样点数64k,累加次数64次,采用预饱和方式抑制水峰信号。自由感应衰减(free induction decay,FID)信号经过傅立叶变换转换为1H NMR图。谱图经调整相位、校正基线后,选择TSP峰作为参考峰,化学位移定为0。然后对1H-NMR谱图分段积分归一化,得到的数据转化为Exce表格后保存,进一步用于模式识别分析。
1.5 统计学方法
将所得积分数据用icoshift进行对齐(MATLAB R2008a,Math Works,Inc.,Natick,MA,USA)[26],对齐的数据进行模式识别及皮尔森(Pearson)相关分析,数据在使用正交偏最小方差判别分析(Othorgonal-Partial least squares discriminate analysis O-PLS-DA)前进行中心化(meancentering)和单位方差标度化(UV scaling)预处理,以此来减少噪音引起的误差(SIMCA-P12.0+,Umetrics AB,Umea,Sweden)[21,27,28]。模型的有效性验证采用了七倍交叉验证法(seven-fold cross-validation)[29,30]。相关系数图可以直观的找到具有一定相关性的差异代谢物。最后进一步对组间相关性强的差异代谢物使用SPSS 17.0(SPSS Inc.,Armonk,NY)进行Student t检验,找出存在显著性差异的代谢物。
2 结果
2.1 大鼠行为学观察、体重及脏器系数的变化
大鼠口服乌头碱后,出现活动量减少,反应迟钝,饮食及排泄物减少等中毒症状,30 min内出现4只给药组大鼠相继死亡,且1只给药组大鼠未收集到6 h的粪样。给药组大鼠体重相对给药前出现明显降低,脏器系数相对于对照组出现降低,其中心脏、肝脏差异有统计学意义(P<0.05),这说明乌头碱对大鼠脏器能够造成一定损伤。
注:与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01
2.2 大鼠粪样的1H-NMR谱图
图1是对照组中大鼠的粪便水提物代表性1H-NMR谱,谱图的指认参考了实验室的代谢物标准谱库、人类代谢组数据库(HMDB)[31,32]及参考文献[33,34]。已鉴定的代谢物包括短链脂肪酸、氨基酸、单糖、三羧酸循环中间体及嘧啶和嘌呤类等四十余种代谢产物。短链脂肪酸由肠道微生物酵解食物纤维而来,单糖来自未消化的纤维。氨基酸、三羧酸循环中间体及嘧啶和嘌呤的代谢产物则来自于肠道微生物的内源性新陈代谢。
2.3 多元统计分析
为了准确找出粪样水提物的组间差异代谢物,笔者建立了OPLS-DA模型,模型的R2X=0.388,R2Y=0.970,Q2=0.597,其中R2X和R2Y值表示模型的拟合情况,Q2值为七倍交叉验证法所得模型预测能力参数。使用MATLAB R2008a软件制作的相关系数图,其相关系数r临界值为0.811(n=5),即|r|>0.811的积分段所代表的代谢物是组间差异代谢物。图2-B、C中不同颜色代表不同代谢物对于组间区分的贡献差异,沿着右侧的色带越接近红色,表示相应谱峰代表的代谢物对组间差异贡献越大,谱峰的方向则代表含量的相对增加或减少。从图2-A(封三)可以看到给药组和对照组表现出了明显的分离趋势,图2-B、C(封三)则显示了引起组间差异的代谢物,与对照组相比较,在给药组的粪便水提物中α-氨基戊酸、谷氨酸、苯丙氨酸的含量降低,见表1。为了进一步验证差异代谢物的显著性,笔者对代谢物对应的谱峰下的积分面积使用Student t检验进行验证,发现α-氨基戊酸谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸均存在显著性差异(P<0.05),见表1。
3 讨论
在实验中,由大鼠的行为学、脏器系数及体重分析可知,乌头碱的摄入直接影响了大鼠心脏、肝脏、肾脏及神经系统的的正常生理功能,进而导致代谢通路及代谢物含量的紊乱,表明乌头碱对于机体具备极强的毒性,这也和之前关于乌头碱毒性的报道吻合[14,15,16]。
本实验采用的基于核磁共振的代谢组学方法研究了乌头碱对于大鼠粪样中代谢物的影响,客观全面地反映了机体受到应激后的病理生理变化。由大鼠的粪样1H-NMR谱分析可知,α-氨基戊酸、谷氨酸、苯丙氨酸的含量降低,显示乌头碱造成了机体氨基酸代谢的紊乱,在大部分哺乳动物体内,谷氨酸与精氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、天冬氨酸等能经过器官间复杂的新陈代谢可以实现相互转换,文中只出现谷氨酸的含量降低,可能是肠道新陈代谢中出现了相关酶及代谢通路的抑制[35]。谷氨酰氨与谷氨酸、γ-氨基丁酸之间的相互转换在维持脑的兴奋(谷氨酸为主)-抑制系统(γ-氨基丁酸为主)平衡方面发挥重要作用[36,37],谷氨酸含量降低,表明谷氨酰胺向谷氨酸转化的方向出现了障碍,这也与大鼠给药后出现活动量减少,反应迟钝等行为学表现相印证。谷氨酸对于哺乳动物的生长及维持肠道功能也至关重要,这点可能也与实验大鼠的食欲不振有一定的关系。
注:G1与G2比较,*P<0.05,**P<0.01;G1:对照组;G2:给药组;箭头(↓↑):与对照组比较,代谢物的变化趋势
芳香族氨基酸的酵解通常由肠道中的厌氧菌来完成,其代谢产物为酚和吲哚类化合物,这两类代谢物则分别是致癌辅助剂和结肠癌启动子[38]。实验中出现的苯丙氨酸在乌头碱摄入后的含量急剧降低,可能是大鼠在病理状态下厌氧菌的代谢增强,造成体内毒性物质蓄积,从而使肠道正常的生理功能被破坏。苯丙氨酸也是一些重要的小分子激素合成的前体,其含量的降低,可能会造成肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺等激素的功能障碍,进而影响机体正常的新陈代谢[39]。此外,氨基酸含量的降低,也可能是肠道菌群数量受到乌头碱摄入的影响,菌群数量的减少造成了蛋白质降解及氨基酸合成的降低,这在已有的一些报道中得到了证实[40,41]。
肠道菌群不仅参与食物的消化、吸收,而且在维持机体应激状态下的肠道功能正常方面也是至关重要的。因此,粪便代谢组学为本研究提供了有关宿主、饮食及共生的肠道微生物之间相互作用的生物学信息,为相关疾病的诊断提供了辅助性的工具。
本实验的结果分析表明,乌头碱的摄入不仅造成了大鼠心、肝、肾等脏器损伤,也导致了氨基酸、能量等代谢通路的紊乱,客观全面地反映了乌头碱对于粪便代谢物谱的影响。通过粪便代谢物谱的分析为相关学者认识肠道微生物及其在人体代谢中的特殊作用打开了窗口,也为进一步研究乌头类生物碱及中药毒性提供了新途径、新思路。
植物代谢组学研究 篇2
药物毒性作用机制的研究是药物毒理学的首要任务之一。药物一般会直接或间接地使基因表达发生改变，这种改变在代谢物水平上进一步被放大，所以说药物的毒性作用与代谢物的变化紧密相关。代谢组学是在代谢物的整体水平上，利用高通量检测技术检测机体在药物作用后的各种生理生化指标，再结合传统的病理学终点，更深入地了解药物的毒性作用机制。Slim等利用基于核磁共振波谱分析技术的代谢组学方法研究炎症反应与磷酸二酯酶抑制剂（CI-1081）导致的血管损伤的关系时，发现CI-1081组和加入抗炎药的CI-1081组的谱图没有分开，得出是血管损伤而不是继发的炎症反应造成了CI-1081引起的尿代谢组图谱改变。王勇等在研究三聚氰胺影响儿童尿液代谢时也运用了代谢组学法，结果发现三聚氰胺利用肾结石导致的物理性损伤来干扰机体的柠檬酸代谢。因此，我们可将代谢组学应用于三聚氰胺导致的代谢异常的研究及三聚氰胺导致肾损伤的无创检测。
3.2代谢组学在药理学研究中的应用
药物可影响人体的代谢并导致代谢物出现差异，因此可利用代谢组学分析代谢物的组成研究药物的作用机制。药理学的任务主要是研究药效学和药动学，这两个过程在体内是同时进行的且紧密相连。药效学主要研究药物是如何作用于机体的，以阐明药物防治疾病的规律。Kaddurah Daouk等比较了精神分裂症患者经奥氮平、利哌利酮和阿立呢唑治疗前后的代谢谱，并评价这三种抗精神分裂药物对脂类生化代谢的调节作用，发现除了都可以调节脂质代谢外，还各有其特有的效应：机体经奥氮平和利哌利酮治疗后，游离脂肪酸减少，甘油三酯升高，而阿立哌唑却没有这种效果。皮子凤等研究五味子治疗糖尿病肾病的作用机制，发现五味子是通过影响肠内菌代谢、脂肪酸代谢、色氨酸代谢、嘌呤代谢等通路对糖尿病肾病发挥治疗作用，也是采用了基于UPLC-Q-TOF-MS技术的代谢组学方法来分析大鼠血清内源性代谢物的变化而得以实现的。
药动学主要研究机体对药物的处置的动态变化，可为临床合理用药提供科学依据。例如，由于个体间的差异对药物反应也存在差异，为了提高用药安全性和有效性，可根据患者的`个体特征实行个体化治疗。Clayton等曾提出利用“药物代谢组学”的方法来实现给药方案个体化，以大鼠给予扑热息痛做初步的动物实验，结果发现给药后大鼠的组织学检测结果与给药前其尿的生化代谢谱呈显著的统计相关。由此曹蓓等以为：“药物代谢组学”可以作为群体筛选的一个基础，根据个体的特殊情况来预测药物的作用结果，针对性地改变给药剂量或挑选某类药物进行治疗。
综上所述，代谢组学方法应用于药理学研究具有巨大的潜力，对药理学的深入研究有推动作用。
3.3代谢组学在中药研究中的应用
将代谢组学应用于中药研究中，对认识中药产生毒副作用的物质基础、药效作用的物质基础，正确认识用药剂量和疗程、配伍减毒，对中药质量控制和优选资源、实现资源的可持续发展等都很有意义。
中药成分复杂，表现出的低毒性往往会影响中药的使用，而研究药物低毒性的比较全面且灵敏的方法之一便是基于化学计量学的药物代谢组学。吕天等设置空白对照组和以柴胡总皂苷（SS）给药组大鼠，并于给药后的第3天和第5天取其尿液样本，运用UPLC-MS代谢组学技术进行分析检测，获得了以质荷比和保留时间为变量的矩阵数据。结果发现给药累积剂量和肝毒性之间呈正相关，有累积肝毒性和明显的急毒性。
此外，同一药材由于采收季节、生产环境及加工方式等的不同，其所含化学成分的差异可能很大，其药性和临床用途也会有所不同。吴宏伟等利用基于的代谢组学分析方法，建立了能够分析来源于不同地区的姜科植物姜黄（Curcuma.LongaL）块根（中药郁金）和根茎（中药萎黄）的次生代谢产物的方法，利用主成分得分图（Score plot）成功地区分了姜黄的块根和根茎样品，表明块根和根茎的次生代谢产物在表达上是有差别的；利用载荷图（Loading）和t检验（t-test）发现了14种可能是导致姜黄根茎与块根药性差异和临床用途不同的化合物。Yongli Hua等运用代谢组学方法研究了当归经不同方式加工后提取出的多糖的保肝作用机理，结果表明，尽管当归的加工工艺不同，但其提取出的多糖作用机制相似，都是通过干预脂质和氨基酸代谢来发挥护肝作用的。
由此可见，代谢组学在中药研究领域中的应用已取得了很多的重要成果，而且随着代谢组学体系的逐渐完善，将会与中药研究更加紧密。所以代谢组学在中药研究方面的应用前景是不可估量的。
4结束语
近年来，代谢组学发展迅速，在药学研究领域已逐步显示出其独特的优势，然而，作为一门新兴的学科，代谢组学存在很大的发展空间，需要逐步完善，例如在分析技术和研究领域方面都可以继续创新和拓展。在分析技术方面，代谢组学的每种分析技术都有其优势和不足，若将其整合进行优势互补，使分析结果能统一、交叉验证是代谢组学发展的一个趋势。就代谢组学自身而言，代谢产物的标准值数据库也将进一步完善，可参考的价值也越来越大，越可靠。在研究领域方面，代谢组学将广泛应用到药物作用靶点的发现、新药的开发、中药现代化研究等领域，甚至可以深入藏医药基础理论、维吾尔族医药理论及其临床诊疗现代化研究中。以上这些都说明代谢组学具有巨大的发展空间，值得我们去研究，并将其发展和完善。
半夏厚朴汤抗抑郁的代谢组学研究 篇3
代谢组学是在基因组学、蛋白质组学和转录组学之后发展起来的一门新兴组学[1], 能够对外界刺激或遗传修饰的细胞及组织的代谢反应变化做出灵敏反应, 动态观察机体的整体代谢变化, 这与传统中医药的整体理论有异曲同工之处, 所以利用代谢组学研究中药具有一定的可行性。
LC-MS具有高灵敏度、高精密度以及良好的重现性, 先已逐渐成为代谢组学研究的有力助手[2]。本文采用基于LC-MS的代谢组学研究方法, 研究对照组、模型组以及半夏厚朴汤给药组大鼠尿液的代谢组学差异, 结合代谢路径解析尿液代谢物信息, 探索给药组和抑郁模型大鼠的代谢变化, 从而为半夏厚朴汤的抗抑郁机制提供代谢组学实验依据。
1 实验材料
1.1 实验动物
Sprague-Dawley (SD) 大鼠, 雄性, 体重 (200±20) g, 由军事医学科学院实验动物中心提供。饲育温度: (20±2) ℃, 湿度: (30±10) %, 12 h昼夜交替, 自由采食、饮水。
1.2 实验药材
半夏厚朴汤按张仲景的《金匮要略》原方药物组成成分及剂量购药。半夏, 厚朴, 茯苓、生姜和紫苏叶药材购自亳州市奥淼贸易有限公司, 经鉴定所购半夏为天南星科植物半夏pinellia ternate (Thumb.) Breit.的干燥块茎, 厚朴为木兰科植物厚朴Magnolia of ficinalis Rehd.et Wils.的干燥干皮, 茯苓为多菌科真菌茯苓Poria cocos (Schw.) Wolf.的干燥菌核, 生姜为姜科植物姜Zingiber of ficinale Rosc.的新鲜根茎, 紫苏叶为唇科植物紫苏Perilla frutescens (L.) Britt.的干燥叶。
半夏厚朴汤全方 (半夏130 g, 厚朴45 g, 茯苓60 g, 紫苏叶30 g, 生姜75 g) , 加10倍量水浸泡过夜后, 煎煮1 h, 用纱布过滤, 第二次和第三次煎煮都是以8倍量水, 煮沸回流1 h, 合并三次滤液, 抽滤, 减压浓缩至浸膏状, 冷冻干燥成粉末, 得率为15.2%, 置于阴凉处, 备用。
1.3 实验试剂
Na N3 (叠氮化钠) , Na H2PO4 (磷酸二氢钠) , Na2HPO4 (磷酸氢二钠) , 福尔马林均为国产分析纯。D2O (重水) 购于北京腾达远科技有限公司, 为美国CIL光谱纯, 国内分装。TSP (3- (三甲基硅基) 氘代丙酸钠) 购自加拿大默克公司。蒸馏水, 购于广州屈臣氏食品饮料有限公司。乙腈为Fisher Scientific光谱纯。
1.4 实验仪器
1260-6410型高效液相-质谱联用仪 (Agilent technologies公司) , LDZ5—2型台式离心机 (北京医用离心机厂) , TGL—16B型高速离心机 (上海安亭科学仪器厂) , B—260型恒温水浴锅 (上海亚荣生化仪器厂) , SHZ—Ⅲ型循环水真空泵 (上海亚荣生化仪器厂) , RE52CS—2型旋转蒸发器 (上海亚荣生化仪器厂) 。
2 实验方法
2.1 动物分组及处理
适应5 d后, 将15只SD大鼠随机分为给药组, 模型组和空白组, 每组5只。大鼠单笼饲养, 除正常对照组外, 其余两组均实施造模程序, 造模时间为24 d。造模开始后同时灌胃给药, 模型组和空白对照组给予等体积生理盐水, 每两天1次, 至实验结束。给药组剂量参照人体有效剂量, 为6.32 g生药/kg体重, 每只大鼠给予1 m L半夏厚朴汤水提物的生理盐水药液。
除对照组外, 给药组和模型组每天束缚6 h, 除收集动物尿样, 连续束缚24 d, 期间禁食禁水。实验前进行一次行为绝望实验 (强迫游泳试验) , 之后实验过程中每隔一周进行一次, 至实验结束。
2.2 行为学观察
强迫游泳实验 (FST) , 基于Porsolt[3]的方法, 将大鼠放入水温为 (25±2) ℃, 水深约为30 cm (确保大鼠在水中处自然伸展状态时尾巴不触碰到缸底) 的透明圆柱玻璃缸 (高为50 cm, 直径为20 cm) 中强迫游泳6 min。实验过程中, 除观察面可见, 其余面均用黑布包绕, 并保持实验环境安静, 大鼠会在水里挣扎试图逃脱, 努力无效之后会放弃挣扎而漂浮在水面上不动的状态, 记为不动时间, 统计大鼠在后5min内的不动时间。
2.3 尿样收集及处理
实验前采集一次尿样, 之后每隔一星期收集一次尿样, 每次连续收集大鼠24 h尿样。将集尿器置于 (0~4) ℃条件下, 每12 h换一次冰, 集尿器中预先加入0.5 m L 1%的Na N3防腐。将收集的尿液3000 r/min离心 (5~10) min, 取上清液保存于-20℃条件下, 备用。
2.4 大鼠尿样LC-MS分析
2.4.1 尿样检测前预处理
于-20℃取出尿样, 室温下解冻, 12 000 r/min离心5min, 取上清液400μL, 加入等体积乙腈-水 (1∶9) 溶液稀释, 混匀, 过0.22μm微孔滤膜后移至进样瓶内, 进样LC-MS分析。
2.4.2 LC-MS数据采集与分析
样品采用梯度洗脱的方式进样, 以期使样品中的复杂成分得以很好分离, 有助于提高检测灵敏度。经过对色谱条件优化, 最终确定的色谱条件是:色谱柱为Hewlett Packard ODS Hypersil C18 (5μm, 10×4.6 mm) ;柱温为30℃;流动相为0.1%甲酸水溶液-乙腈系统;检测波长为254 nm;洗脱梯度 (起始为2%乙腈, 30 min内增加至98%乙腈, 在1 min内降至2%乙腈并维持4 min, 后运行时间设为5 min;流速为0.4 m L/min;进样体积为2μL。
对质谱的主要参数进行优化, 以获得更好的灵敏度和分辨率, 质谱的主要参数设定为:采用电喷雾离子源 (ESI) , 负离子MS2 Scan模式;质荷比 (m/z) 采集范围是 (50~1 000) ;N2干燥气流速为10 L/min, 干燥气温度为350℃;使用高纯氮作为辅助喷雾电离与去溶剂气体, 雾化器压力为50 psi;毛细管电压为4 000 v。
采用Mass Hunter软件处理数据, 提取质谱, 以Excel文件格式导出数据, 利用SIMCA-P11.5数据处理软件进行模式识别分析。
2.5 统计分析
采用SPSS 17.0软件对体重和不动时间数值进行ANOVA方差分析, 组间差异选用LSD法分析, 最终结果以mean±S.E.M表示。
3 结果
3.1 体重变化
随束缚模型建立的时间延长, 模型组和给药组大鼠体重增长率逐渐下降, 这两组大鼠体重与空白组相比具有显著统计学差异。
注:*p<0.05, **p<0.01, 与模型组相比。
3.2 行为学观察
抗抑郁药通常借助行为绝望抑郁模型进行快速筛选, 这归因于该模型的行为学改变可被几乎所有类型的抗抑郁药所逆转。大鼠强迫游泳不动时间在一定程度上反映出大鼠的抑郁状态, 见表2, 给药组、模型组和空白组的强迫游泳不动时间呈现出显著差异。
注*p<0.05**p<0.01与模型组相比。
3.3 尿样LC-MS分析
3.3.1 尿样总离子流图及部分色谱提取图
观察所得各组尿样总离子流图, 发现面积相对较大的色谱峰保留时间在11.621 min和4.206 min处, 分别为马尿酸和柠檬酸, 其他部分色谱峰因成分复杂不一一列举。
3.3.2 PLS-DA分析
采用PLS-DA建立数学模型, 对三组大鼠尿样代谢物进行模式识别, 在建立的模型中R2Y值为0.918, 表明该模型可信度较高, 模型组、给药组和对照组得到了较好的分离;PLS-DA模型中Q2值为0.849, 显示该模型稳定性较好。在PLS-DA得分图中, 模型组及给药组与对照组相比, 出现显著偏移, 说明与对照组相比其他两组大鼠代谢物发生较大改变。
3.3.3 潜在生物标记物
PLS-DA的载荷图中距离原点越远的变量, 变异量越大, 而这些大的变异量在样品分类起决定性作用[图2 (b) ]。结合分析模型的VIP数据, 寻找出这些出现较大变异的物质, 再根据化合物精确质量数, 借助HMDB以及METLIN在线数据库进行检索, 在5 ppm的差异范围内得到候选化合物, 综合精确质量数和二级质谱推测出可能的标记物。
4 结论
实验结果显示, 模型组在FST中不动时间显著增加, 表明造模有效。综合三组大鼠体重、行为学结果以及尿样中代谢产物分析, 证实半夏厚朴汤具有抗抑郁样作用。
注:↓为色谱峰面积增加;↑为色谱峰面积减少。
与空白组相比, 模型组苯丙氨酸含量升高, 亮氨酸和色氨酸均下降, 给药组与空白组差异相对较小。氨基酸代谢异常与抑郁症发病机制存在相关性, 色氨酸是神经递质5-羟色胺 (5-HT) 的前体物质, 色氨酸浓度的降低可能是由于机体5-HT耗竭, 大量色氨酸代偿转化所致。中枢5-HT缺乏可导致抑郁, 现临床首选抗抑郁药多为抗5-HT再摄取抑制剂, 以期增加脑部5-HT浓度。研究表明, 抑郁患者血浆中苯丙氨酸含量增加[4], 苯丙氨酸为必需氨基酸, 只能从食物中获取, 含量增加只能是代谢受阻所致。亮氨酸为支链氨基酸, 在模型组代谢物中含量明显低于给药组, 而支链氨基酸的减少反映了机体的中枢性疲劳, 这也可诱导抑郁状态产生的因素之一[5]。
柠檬酸、2-酮戊二酸均为三羧酸循环 (TCA) 的中间产物, 在能量代谢过程中扮演着重要角色, 一旦这些中间产物出现异常, 便可能引起TCA功能缺失或者出现紊乱。2-酮戊二酸是体内多种转氨酶的受体, 并且可以与体内代谢产生的氨结合, 在哺乳动物体内, 过量的氨会影响大脑代谢, 改变神经递质水平。因此模型组尿中2-酮戊二酸水平下降, 可能是由于大鼠体内氨水平上升所致, 氨极易通过血-脑屏障, 使得脑细胞中2-酮戊二酸水平下降, TCA减弱, 能量生成减少, 机体出现疲劳怠倦。TCA是机体内重要的循环代谢途径, 这种循环受到抑制也可能引起器官损伤[6—8]。模型组乳酸含量增加, 是有氧呼吸受抑制, 代偿性兴奋无氧呼吸所致。肌酸和磷酸肌酸代谢产物之一为肌酸酐, 肌酸和磷酸肌酸在细胞能量转移过程中起着至关重要的作用, 肌酸酐和磷酸肌酸浓度的减少是引起疲劳的重要因素[9]。能量不足、怠倦和疲劳均是抑郁症的典型症状[10]。半夏厚朴汤给药组在一定程度上可以逆转以上机体功能的异常改变。
胆碱是卵磷脂的组成成分, 同时也是神经递质乙酰胆碱的前体物质。胆碱可以调控机体内的转甲基代谢, 此外胆碱对于维持细胞的稳定性也有一定的作用[11], 模型组胆碱减少致使机体内胆碱参与的各项生理反应紊乱。给药组无此异常或异常较小。尿酸主要有肾小管分泌, 尿液中尿酸含量减少, 表明尿素排泄机制异常, 长期可致高尿酸血症, 对机体损害严重。
简而言之, 给药后, 半夏厚朴汤通过综合作用于各种途径, 产生抗抑郁样效果。此外, 有待进行更全面的研究, 以明确半夏厚朴汤确切抗抑郁作用机制。
参考文献
[1] Ma Y L, Zhang P, Yang Y Z, et al.Metabolomics in the fields of oncology:a review of recent research.Molecular Biology Reports, 2012;39:7505—7511
[2] 汪江山, 孔宏伟, 许国旺.代谢组学中的分离分析科学.化学进展, 2009;21 (11) :2388—2396Wang Jiangshan, Kong Hongwei, Xu Guowang.Metabonomics in separation science.Progress in Chemistry, 2009;21 (11) :2388—2396
[3] Porsolt R D, Bertin A, Jalfre M.Behavioural despair in mice:a primary screening test for antidepressant.Arch Int Pharmacodyn Ther, 1977;229:327—336
[4] Hoekstra R, Fekkes D, Bruijn J A, et al.Effect of electroconvulsive therapy on biopterin and large neutral amino acids in severe, medication-resistant depression.Psychiatry Res, 2001;103 (2/3) :115 —23
[5] Shimomura Y, Harris R A.Metabolism and physiology function of branched-chain aminoacids:discussion of session.J Nutr, 2006;136 (1) :232S—233S
[6] Liu Y R, Huang R Q, Liu L J, et al.Metabonomics study of urine from Sprague-Dawley rats exposed to Huang-yao-zi using 1H NMR spectroscopy.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2010;52:136—141
[7] Zhou Y Z, Lu L L, Li Z F, et al.Antidepressant-like effects of the fractions of Xiao-yao-san on rat model of chronic unpredictable mild stress.Journal of Ethnopharmacology, 2011;137:236—244
[8] Liu X J, Li Z Y, Li Z F, et al.Urinary metabonomic study using a CUMS rat model of depression.Magn Reson Chem, 2012;50:187 —192
[9] Sahlin K, Tonkonogi M, Sderlund K.Energy supply and muscle fatigue in humans.Acta Physiol Scand, 1998;162 (3) :261—266
[10] Gao X X, Zheng X Y, Qin X M, et al.Metabonomic study on chronic unpredictable mild stress and interventioneffects of Xiaoyaosan in rats using gas chromatography coupled with mass spectrometry.J Ethnopharmacol, 2011;137 (1) :690—699
代谢组学在微生物领域的应用 篇4
【摘要】代谢组学、基因组学和蛋白质组学是系统生物学研究的重要组成部分。本文在文献和作者本人研究的基础上，对代谢组学的产生和技术平台及其在环境微生物领域的研究进展进行了评述。
【关键词】代谢物 代谢组学 环境微生物 生物降解 评述
1引言
代谢组学(metabolomics)诞生至今不到10年，但发展非常迅速（图1），现已成为系统生物学研究的一个重要组成部分［１］，在诊断及功能基因组研究中发挥出日益重要的作用[2]。随着基因组学研究的深入，至2005年底，以metabolome, metabolomic, etabolomics, metabonome, metabonomic以及metabonomics为关键词，或出现在文提或摘要内，检索Web of Science以及Pubmed。所得文献经整理删除重复数据(to the end of 2005, by searching titles/abstracts/keywords of Web of Knowledge and Pubmed using „etabolome‟ or „metabolomic‟ or „metabolomics‟ or „metabonome‟ or „metabonomic‟ or „metabonomics‟ as the search term）。功能基因组开始研究基因组、转录组以及蛋白组的数据与表型之间的关系；而细胞内的全部代谢物最接近于表型，从而产生了研究全部代谢物的要求，代谢组(metabolome)的概念由此诞生 [3]。Fiehn等在2000年以拟南芥叶为模型的工作标志着代谢组学成为功能基因组研究的一个重要组成部分[4]。
目前，代谢组学的研究可分为以下３个层次［１，５～７］：（１）目标代谢物分析(metabolite target analysis)。利用特定方法研究难分析化合物(difficult analytes)，如植物激素等；（２）代谢谱分析(metabolite profiling)。对一系列预先设定的目标代谢物（如某特定代谢途径中所有代谢物，或者一组由多条代谢途径共享的代谢物）进行定量研究；（３）代谢组学。定性和定量特定条件下生物样品内的全部代谢物。然而，由于代谢物组成复杂、含量不一，样品制备过程的偏差，以及检测设备的量程及通量等问题，目前还难以分析全部的代谢物。因此，在现阶段代谢组学更多地被视为“非目标性”代谢物研究［７］。与代谢组学相关的概念还有代谢指纹分析(metabolic fingerprinting)，即对粗提代谢物进行高通量的定性分析，通过谱型比较将样品进行快速分类，或者寻找差异峰从而揭示生物对疾病或有毒物应答的生物标记物。另一个重要的概念是代谢产物组学(metabonomics)［８］，多指以核磁共振（NMR）手段研究与疾病相关的代谢物。Nicholson等认为代谢产物组学是综合地研究某一时间点对细胞内全部代谢物的影响［８，９］。不过，上述有关代谢组学的各种概念仍在发展和完善中。代谢组学会也将代谢组学的定义视为学会亟待解决的重要问题［９］。
代谢组学与其它组学的研究对象的最大区别是其研究代谢组的变化。代谢组的变化是生物对遗传变异、疾病以及环境影响的最终应答［６］。代谢组学受进化的影响较小，在不同物种间其检测方法比其它组学方法更为通用。以果糖二磷酸化酶检测为例，基因组或蛋白组研究需要掌握不同物种内该酶的编码基因或蛋白序列，并根据该信息设计相应芯片或质谱检测技术；代谢组则不管在何种生物内，该酶的底物和产物（1,6二磷酸果糖和6磷酸果糖）
都是一致的，因而其检测方法可适用于所有物种 ［７］。
与其它“组学”研究类似，代谢组学的突破在于将传统的代谢途径扩展为代谢网络的研究。通过“非目标性”地识别全部代谢物，定量它们在生物体系内的动力学变化，从而揭示传统方法无法观测到的代谢网络中不同途径之间的关系［１］。因而，代谢组学成为系统生物学研究的重要组成部分［１０］。
２代谢组学的技术平台及进展
由于代谢物的多样性，许多分析技术得到广泛应用[11]。图2所示为各种代谢组学研究中常用的技术平台［７］。根据样品的属性和研究目的来选择并综合利用多种技术平台。例如研究植物与微生物常使用质谱检测代谢物，而在动物样品的研究中则更多地采用了核磁共振（NMR）技术［１２］。目前，应用最广泛、最有效的技术是气相色谱质谱（GCMS）和液相色谱质谱（LCMS）［３］。这两种技术可以检测包括糖、糖醇、有机酸、氨基酸、脂肪酸以及大量次级代谢物在内的数百种化合物。GCMS具有较高的分辨率和灵敏度。因此，与GCMS相关技术的发展很快，如采用GCGCMS技术增加单次分析可分离代谢物的种类［１４］；利用GC与飞行时间质谱（TOFMS）联用可以进行高通量分析：由于TOF检测时间短，一个月可分析1000个以上样品；而且，利用升级的解析方法可以从植物叶片提取物的GCTOF图谱中一次解析出1000种以上化合物［１５］。但是GC分离样品分子量范围有限，不能分离大分子及难挥发物质，同时热不稳定性物质在GC条件下容易分解。尽管衍生化过程会降低样品的通量，将样品衍生化后再进行GC分离，仍然是解决上述问题的一条有效途径。
LCMS具有强大的分离能力，广泛应用于难挥发性物质的分析。目前，反相LC技术应用较普遍，但常规LC在分离极性较强物质时仍然具有重要作用。Tolstikov等［１３］开发出一种亲水作用色谱技术(hydrophilic interaction chromatography ,HILIC)，采用
(monolithic C18 silica)长柱提高了分离效率，并且更易于与MS对接，检测到许多极性物质。此外，HPLCMS、毛细管HPLCMS、UPLCMS以及多维色谱等技术逐渐应用到代谢物组学研究，明显提高了分辨率、灵敏度和通量［１６］。毛细管电泳在代谢物分离方面是一个新的发展方向，其效率优于LC和GC［７］。
检测器是代谢物组分析关键因素之一。傅里叶变换离子回旋加速器质谱(FTMS)技术在代谢物组领域具有良好的应用前景。借助高分辨率质谱(>106)，FTMS可以进行精确的质量分析，并根据同位素间分布直接得出经验分子式［１８］。核磁共振NMR技术多用于代谢物指纹图谱分析和寻找样品间的显著差异代谢物，更多地用于哺乳动物样品的检测。NMR技术是代谢产物组(metabonomics)研究最有力的工具，具有较好的重复性[１９]。拉曼以及傅里叶红外等振动光谱的灵敏度虽然相对较低，但是，傅里叶红外在生物样品的高通量筛选分类方面非常有效。Ellis等［２０］利用该方法研究了肉类在变质过程中的代谢谱，发现该过程的主要生化指标为蛋白质降解。一种新的发展趋势是样品不经色谱分离直接进样，采用低分辨率电喷雾质谱分析，根据获得的指纹图谱进行高通量筛选［２１］。Allen等［２２］采用该方法成功地区分开仅仅一个基因差异的酿酒酵母。
生物体内的代谢物随时间和空间的变化而不断地发生变化，所以时间动力学与空间分布的变化是代谢物组学研究的重要课题。虽然可以通过连续取样的方法来研究时间动力学，但是该方法费时费力。利用NMR及FTIR等技术进行非介入性研究是一个新的发展方向。此外，利用分子生物学手段的研究也有新的进展。Fehr等利用GFP融合葡萄糖结合蛋白，通过荧光强度来监测胞内的葡萄糖浓度。结果发现，在COS7细胞胞浆内的葡萄糖浓度的变化范围高达两个数量级［２３］。
一个普通的细胞内可能含有或产生的代谢物种类远远超出人们最初的预想。Fiehn等［１２］从拟南芥叶片中鉴定出326种代谢物，通过对数据深入分析，发现最初的图谱能够解析出1000种以上的代谢物。因此，随着硬件平台的发展，代谢组学研究将获得海量的数据；而如何解析、储存这些数据并从中提取有用的信息则非常重要。因此，代谢组学数据的处理已经成为生物信息学的一个新的重要分支［２４］。
代谢组学原始数据的解析可分为如下３个基本步骤：（1）提取出色谱分离（如GCMS）后未能有效分开的代谢物峰并得出其相应浓度；（2）根据其保留时间及质谱图等信息鉴别有效峰所代表的化合物；（3）根据代谢数据建立代谢网络模型［１２］。目前已经开发出界面友好的公开软件，如Sumner等［２５］开发的MSFACTS(metabolomics spectral formatting, alignment and conversion tools)，可以输入如GCMS原始数据，输出代谢物清单。Johnson等［２６］设计了一种新的算法，可进行图谱的快速比对。
根据图谱鉴别结构问题相对进展较慢。不能识别图谱中的大多数代谢物峰成为代谢组学研究的瓶颈之一。在标准数据库中，多数数据都来源于有机化学领域，而天然代谢物的结构信息相对较少。以植物为例，80%以上的代谢物在标准谱库中找不到对应的化合物。解决该问题应该更多地依赖于一些新的算法进行自动推算，而不是寻找相应的标准参照物。目前，关于NMR的自动化谱图结构推测有一定的进展［２７］，而关于MS图谱的分析相对落后。关于代谢数据的可视化及建模，不少文献中都有介绍［５，８，２８］，在此不再赘述。与其它组学研究类似，代谢组学数据的标准化及存储也是一个重要的问题。目前，一些相关的数据库已经建立，例如拟南芥代谢组数据库以及包含各种代谢途径的KEGG数据库等等［２４，２９］。但是，类似基因组研究中Genbank作用的代谢物数据库尚未建立，未来的发展方向是建立综合、关联基因组、蛋白组及代谢组数据的大型数据库［２４］。３代谢组学在微生物领域的研究进展
目前，代谢组学应用领域大致可以分为以下６个方面：（1）植物功能基因组研究，主要以拟南芥为研究模型，也包括一些转基因作物的研究［４，３０，３１］；（2）疾病诊断，根据代谢物指纹图谱诊断肿瘤、糖尿病等疾病［９，３２］；（3）制药业，主要通过高通量比对预测药物的毒性和有效性，通过全面分析来发现新的生物指示剂［３３］；（4）微生物领域；（5）毒理学研究，包括利用代谢组学平台研究环境毒理及药物毒理［１９，３４］；（6）食品及营养学，即研究食品中进入体内的营养成分及其与体内代谢物的相互作用［３５］。以下着重介绍在微生物领域的代谢组学研究及其最新进展。
3.1微生物分类，突变体筛选以及功能基因研究
经典的微生物分类方法多根据微生物形态学以及对不同底物的代谢情况进行表型分类。最近，随着分子生物学的突飞猛进，基因型分类方法如16S rDNA测序，DNA杂交以及PCR
指纹图谱等方法得到了广泛应用。然而，某些菌株按照基因型与表型两类方法分类会得出不同的结果。因此，根据不同的分类目的联合应用这两类方法已成为一种趋势。BIOLOG等方法在表型分类中应用较为广泛，但是，代谢谱分析方法(metabolic profiling)异军突起，逐渐成为一种快速、高通量，全面的表型分类方法。采用代谢组分类时，可以通过检测胞外代谢物来加以鉴别。常用的胞外代谢物检测方法为样品衍生化后进行GCMS分析、薄层层析或HPLCMS分析，最后通过特征峰比对进行分类［３６，３７］。Bundy等［３８］采用NMR分析代谢谱成功地区分开临床病理来源以及实验室来源的不同杆菌(bacillus cereus)。除了表型分类外，代谢组学数据可以应用于突变体的筛选。在传统研究中的沉默突变体（即未发生明显的表型变化的突变体）内，突变基因可能导致了某些代谢途径发生变化，通过代谢快照(metabolic snapshot)可以发现该突变体并研究相应基因的功能［３９］。Soga等用CEMS系统研究了枯草杆菌在芽孢发生过程中的代谢谱的变化过程，识别出胞1692种代谢物，并鉴别出其中的150种［１７］。
3.2发酵工艺的监控和优化
发酵工艺的监控和优化需要检测大量的参数，利用代谢组学研究工具可以减少实验数量，提高检测通量，并有助于揭示发酵过程的生化网络机制，从而有利于理性优化工艺过程 ［１０］。Buchholz等［４０］采用连续采样的方法研究了大肠杆菌在发酵过程中的代谢网络的动力学变化。他们在葡萄糖缺乏的培养液培养的大肠杆菌中加入葡萄糖，并迅速混匀，按每秒4～5次的频率连续取样。利用酶学分析、HPLC/LCMS等手段监测样品中多达30种以上的代谢物、核苷以及辅酶，从而解析了葡萄糖以及甘油的代谢途径和底物摄取体系。通过统计学分析建模，发现在接触葡萄糖底物后的15～25 s范围内,大肠杆菌体内发生的葡萄糖代谢物变化与经典生化途径相符，但随后的过程则与经典途径不符，推测可能存在新的未知调控步骤。Takors认为，通过上述代谢动力学研究，掌握代谢途径及网络中的关键参数，将直接有利于代谢工程的优化，包括菌株的理性优化以及发酵参数的调控。Dalluge等利用LCMSMS方法监控发酵过程中的氨基酸谱纹，实现对整个发酵系统的高通量快速监控；而接下来的研究将考虑缩小氨基酸监测范围，通过少数几个关键氨基酸的监测实现对整个发酵系统状况的监控［４１］。
3.3环境微生物研究
微生物降解是环境中去除污染物的主要途径。深入了解污染物在微生物内的代谢途径，将有助于人们优化生物降解的条件，从而实现快速的生物修复。这些代谢中间体大都通过萃取、分析方法进行逐个研究，并借助专家经验拟合出代谢途径，其动力学过程亦很少触及。代谢组学方法的采用有可能改变这一现状。Boersma等［４２］采用代谢组学方法研究氟代酚的微生物降解途径。氟代化合物具有特殊的19F核磁共振属性，19F的核磁共振灵敏度与1H核相近；由于生物体内无内源性19F核磁信号，因而无本底干扰。所有19F核磁信号均可归结于异生素及其代谢物。19F核的化学位移值宽，约为700ppm（1H为15ppm，13C为250ppm）。较宽的化学位移导致19F在不同取代物的峰图不易产生重叠。因此，借助核磁共振技术可以更方便地研究含氟化合物的代谢中间体。Boersma等根据总代谢物的核磁共振图谱，推测出红球菌内羟化酶在不同的取代位（1，2，3三种不同的取代数量）
羟基化氟代酚，然后再通过儿茶酚内位双加氧酶开环形成氟代粘糠酸的代谢过程。此外，他们还首次检测到开环后的下游代谢物，即通过氯粘糠酸异构酶生成氟代粘糠酸内酯以及氟代马来酸等中间代谢物。
根际(rhizosphere)空间在植物微生物相互作用中发挥着重要的作用。Narasimhan等
[43 ]利用根际代谢物组(rhizosphere metabolomics)方法，阐释了植物分泌物对根际微生物降解多氯代酚(PCB)的作用机制。采用HPLCESI/MS法分离鉴定拟南芥根际代谢物，发现野生型拟南芥根际次级代谢物中84%以上均为phenylpropanoids。因此能利用
phenylpropanoids生长的PCB降解假单孢菌能够快速在根际区域增殖（比相应营养缺陷型突变菌株高100倍以上），并且在两周内去除超过90%的PCB。然而，在采用拟南芥突变体（产生较少的phenylpropanoids）的对照组中，降解菌的数量较低，降解率也仅达50%。结果表明植物根际分泌的次级代谢物促进降解菌的繁衍增殖，从而促进了污染物的降解。本课题组在近期的工作中建立固相微萃取衍生化技术与GCMS联用同时测定多种多环芳烃（PAHs）代谢产物的分析方法，开展了细菌和微藻降解PAHs的降解机理和代谢物动力学变化等研究[44～47]。从单一菌和混合菌液培养基中及细胞体内，同时检测到PAHs多种单氧化和双氧化及其开环代谢物产物，发现多种PAHs降解过程中存在复杂的代谢物动力学过程；通过研究标志性代高等物组成力学变化，揭示代谢物水平上的微生物共代谢PAHs的降解机制［４４～４６］。共代谢过程中的代谢物动力学过程有非常独特的特点，一方面它属于胸内生命合成过程，因为微生物降解生长基质ＰＡＨs时提供能源和碳源促进微生物的生长；另一方面它又属于胞外代谢处程,非生长基质PAHs对于微生物是一种环境胁迫，微生物分泌降解酶通过在胞外降解非生长基质PAHs以减弱其对自身的危害。因此,共代谢过程是胞内外代谢相互作用的过程。
此外，微生物代谢组学还应研究如何改进样品的制备方法。例如，在代谢组研究中，为了中止细胞代谢反应采用冷淬火(cold quenching)方法，将细胞样品迅速置于低温（液氮或-70℃甲醇中），这会导致许多微生物发生冷休克(coldshock)，释放出大量的胞内物质，引起代谢组学定量研究发生偏差[48, 49]。
4展望
代谢组学尚处在萌芽期, 它综合了分析化学、基因组学以及信息科学的最新进展，在功能基因组研究中居于核心地位[12]。未来主要发展方向包括发展更为灵敏的、广谱的、通用的检测方法，鉴定各种谱峰对映的化合物结构，以及与其它虚拟模型的整合。这将更有助于全面阐释各种细胞功能的分子基础。
植物代谢组学研究 篇5
1 材料与方法
1.1 样品收集
于广东药学院附属第一医院收集口腔癌患者血清样本10例和健康人血清10例(收集时间:2011年11月~2012年4月),置-80℃超低温冰箱贮存。
1.2 样品预处理
采样前,将所有血清样本解冻,在4℃下,10000 g离心10 min。取400μL上层血清加至5 mm NMR测试管中,后加入100μL 0.2 mol/L磷酸缓冲溶液(0.2 mol/L Na2HPO4-0.2 mol/L Na H2PO4,pH=7.4)和50μL重水,振荡混匀。
1.3 NMR实验
每一个样品均采集Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CP-MG,relaxation delay-90-(τ-180-τ)n-acquisition)氢谱,总回波时间为100 ms,3 s延迟时间,64k数据点,采集次数为128。化学位移定标为乳酸甲基双重峰δ1.33。
1.4 数据预处理
采用软件TOPSPIN 2.0对所有1H CPMG谱进行自动积分,积分区间δ0.5~4.6,积分间隔0.01。主成分分析前对每一个谱的积分值进行归一化处理,后将归一化值导入软件Simca-P 12.0(Umetrics,Sweden)中进行主成分分析。
1.5 统计学方法
采用SPSS(Version 13.0,SPSS Inc.,USA)软件对正常人和口腔癌患者血清代谢物的归一化积分值做独立样本检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 健康人与口腔癌患者血清CPMG1H谱比较
由图1可清楚地观察到亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、乳酸、丙氨酸、糖蛋白、谷氨酸、乙酰乙酸、谷氨酰胺、甲胺、二甲胺、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、胆碱和葡萄糖等信号峰。对比健康人与口腔癌病人血清CPMG 1H谱,可以发现胆碱、葡萄糖和乳酸有明显的变化[7]。为了能够筛选出具有显著性差异的代谢标志物,将利用主成分分析和统计分析对两组样本的血清代谢组数据进行分析。图1为代表性的健康人与口腔癌患者CPMG 1H谱。
2.2 多变量分析
为了筛选出口腔癌患者血清代谢标志物,本文采用代谢组学常用的多变量分析-主成分分析方法对上述得到的CPMG1H的归一化积分数据进行分析。主成分分析方法能够根据样本代谢图谱的特征给出样本间的分类,同时还可以筛选出对区分有较大贡献的代谢物(即化学位移区间)。对健康者(○)和口腔癌患者(●)血清CPMG 1H谱的主成分分析结果见图2(PC1比PC2,R2=82.5%)。可以得到口腔癌患者血清中氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸),谷氨酸、糖蛋白、甲胺和二甲胺、葡萄糖的含量是升高的,而乳酸和胆碱的含量降低。
3 讨论
通过得分图(图2a)可以看到,健康人和口腔癌患者血清样本在PC2维可以完全区分开,通过对PC2值进行统计分析,结果表明这两类样本在PC2维具有显著性差异(P<0.01)。负载图(图2b)给出了两类样本中主要的代谢物变化,口腔癌患者血清中氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸),谷氨酸、糖蛋白、甲胺和二甲胺、葡萄糖的含量是升高的,而乳酸和胆碱的含量降低。进一步通过统计分析发现这些代谢物均具有显著性差异(P<0.05)。
口腔癌患者血清中乳酸含量是降低的,这可能表明在口腔癌患者血清代谢中无氧糖酵解过程减少,这与鼻咽癌血清代谢中乳酸变化一致[8]。磷脂胆碱和胆碱是存在于细胞膜上的磷脂,而口腔癌患者血清胆碱含量的降低可能与细胞膜破坏,细胞凋亡过程出现了失衡状态有关。
此外,亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和组氨酸在口腔癌患者血清中含量是明显增加的。糖蛋白和谷氨酸对免疫功能的维持有重要作用,如提高机体代谢和改善机体免疫状况等。糖蛋白和谷氨酸含量的增加表明其代谢过程受到调控,相应的调控功能受到影响[9]。
总之,通过对口腔癌患者血清代谢组的研究,并结合主成分分析方法筛选出了口腔癌患者血清代谢标志物,这将为口腔癌诊断提供可靠的分子水平上的代谢证据。
摘要：目的 应用核磁共振代谢组学方法研究口腔癌患者血清代谢组的特征及其变化。方法 健康人血清(健康组,10例)和口腔癌患者血清(口腔癌组,10例)样本,采用BRUKER 500 MHz超导核磁共振波谱仪进行检测,运用PCA分析方法,研究口腔癌患者血清代谢组的特征,探讨相关生化过程的改变。结果 健康组与口腔癌组患者血清代谢谱有不同的代谢特征。口腔癌患者血清中氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸),谷氨酸、糖蛋白、甲胺和二甲胺、葡萄糖的含量是升高的,而乳酸和胆碱的含量降低。结论 根据血清代谢物的变化可以区分健康人和口腔癌患者。这种基于核磁共振氢谱的代谢组学方法可为口腔癌的诊断提供可靠代谢依据。
关键词：口腔癌,代谢组学,核磁共振
参考文献
[1]Brandwein GM,Teixeira MS,Lewis CM,et al.Oral Squamous CellCarcinoma:Histologic Risk Assessment,but Not Margin Status,IsStrongly Predictive of Local Disease-free and Overall Survival[J].Am J Surg Pathol,2005,29(2):167-178.
[2]杨永霞,杨生义,梁敏锋,等.基于核磁共振波谱的乙肝患者血清代谢组研究[J].第二军医大学学报,2010,31(3):288-291.
[3]高岗,杨根金,娄子洋.肾虚证大鼠尿液的核磁共振谱代谢组学研究[J].第二军医大学学报,2009,30(5):565-568.
[4]Lehnhardt FG,Bock C,Rohn G,et al.Metabolic differences be-tween primary and recurrent human brain tumors:a 1H NMR spec-troscopic investigation[J].NMR Biomed,2005,18(6):371-382.
[5]陶晓峰,杨根金,王晓钧,等.离体眼眶肿瘤及正常组织超高场磁共振波谱特点的比较[J].第二军医大学学报,2006,27(8):882-884.
[6]杨永霞,陈阿丽,梁敏锋,等.慢性乙肝与重症乙肝患者血清代谢组比较[J].中国医药导报,2010,7(18):27-28.
[7]杨永霞,梁敏锋,陈阿丽,等.应用核磁共振代谢组学方法分析食管癌患者血清代谢物[J].江苏医药,2010,36(16):1867-1868.
[8]符方方,姜苗苗,王希成,等.基于核磁共振波谱的鼻咽癌患者血清代谢组研究[J].广东药学院学报,2011,27(3):312-315.
植物代谢组学研究 篇6
代谢组学诞生于20世纪末,由英国伦敦帝国大学吉尔·尼克森教授创立[3],之后得到迅速发展并渗透到多个领域,如疾病诊断、医药研制开发、营养食品科学、毒理学、环境学、植物学等与人类健康护理密切相关的领域,为生命科学的发展提供了有力的现代化实验技术手段。代谢组学的主要研究是各种代谢路径的底物和产物的小分子代谢物。其样品有尿液、 血浆或血清、唾液、脑脊液、精液等生物体液,以及细胞提取物、细胞培养液和组织等。
从某种意义上来说,机体内的每项生命活动都会受代谢产物的调节和影响。因此,研究代谢组学可以了解及探索各项生命活动的整体代谢状况,从而帮助人们更好地理解生命的活动。
本文就代谢组学平台组成及近年来在兽药检测中的应用作一综述,目的是使人们进一步认识到代谢组学及其技术在兽药检测分析中的重要性,同时为兽药的新药选择、药物毒性评价、不良反应监测等提供一定导向性。
1代谢组学平台简介
目前,常用的代谢组学分析平台主要为: 核磁共振谱( NMR) 技术、气相质谱( GC - MS) 联用技术、液相质谱( LC - MS) 联用技术和代谢物芯片,它们都具有样品需求量小、预处理简单、高通量性等特点。
1. 1 NMR技术
NMR技术主要是利用核磁共振技术和模式识别方法对生物体液和组织进行系统测量和分析,对完整的生物体( 而不是单个细胞) 中随时间改变的代谢物进行动态跟踪检测、定量和分类,然后将这些代谢信息与病理生理过程中的生物学事件关联起来,从而确定发生这些变化的靶器官和作用位点,进而确定相关的生物标志物[4]。
NMR技术从最初的一维氢谱发展到碳谱、氮谱、 磷谱和二维核磁共振谱等高级谱图,核磁共振技术解析分子结构的能力也越来越强,进入20世纪90年代以后,发展出了依靠核磁共振信息确定蛋白质分子三级结构的技术,使得蛋白质分子结构的精确测定成为可能。
NMR技术在代谢组学中的应用越来越广泛,它具有如下优点: 无损伤性,不破坏样品的结构和性质; 可在一定的温度和缓冲范围内进行生理条件或接近生理条件的试验; 与外界特定干预相结合,研究动态系统中机体化学交换、运动等代谢产物的变化规律; 试验方法灵活多样。
1. 2 GC - MS联用技术
GC - MS联用技术是利用气相色谱作为质谱的进样系统,使复杂的化学组分得到分离; 利用质谱仪作为检测器进行定性和定量分析,主要是用于定性和定量分析沸点较低、热稳定性好的化合物。GC - MS联用技术综合了色谱法的分离能力和质谱的定性长处,可在较短时间内对多组分混合物进行定性分析。
GC - MS联用技术的优点在于可以选用高灵敏、 通用性或专一性强的检测器,检测限一般为 μg /kg级,并且分析时间短,备受代谢组学研究者的青睐,常用于动植物和微生物的代谢指纹分析。它能够提供较高的分辨率和检测灵敏度,并且有可供参考、比较的标准谱图库,可以方便地得到待分析代谢组分的定性结果,但是GC - MS联用技术不能直接得到体系中难挥发的大多数代谢组分的信息[5]。
1. 3 LC - MS联用技术
LC - MS联用技术的基本原理与GC - MS联用技术类似,但它是利用液相色谱作为质谱的进样系统的。目前,LC - MS联用技术已经被广泛地应用在生物样品分析中,主要可解决如下几方面问题: 不挥发性化合物分析测定,极性化合物的分析测定,热不稳定化合物的分析测定,大分子量化合物( 包括蛋白质、多肽、多聚物等) 的分析测定[5]。
LC - MS联用技术经济实用,适用于那些热不稳定、不易挥发、不易衍生化和分子质量较大的物质。 质谱多通道监测的功能和色谱卓越的分离能力,使LC - MS联用技术对检测样品的浓度和纯度要求,与NMR技术相比明显降低,甚至对含量极低的物质,也能通过优化质谱的扫描模式给出可视化响应。同时, LC - MS联用技术又有较好的选择性和较高的灵敏度,得到了越来越广泛的应用。液相色谱技术强大的分离能力和高灵敏度使人们认识到它也可以用于生物体液指纹谱[6]。
2代谢组学平台在兽药检测中的研究应用
2. 1 NMR技术
J. K. Nicholson等[7]最早将NMR技术与模式识别技术结合起来检测代谢表型中的动态变化,用于药物毒理标示物的研究,由J. M. Nicholson等人主持的、 五大医药公司参与的Consortium for Metabonomic Tox- icology ( COMET) 项目是利用代谢组学方法预测化学品毒性最有影响和代表性的研究,该研究利用NMR技术分析了约150种药物( 或化学品) 对啮齿动物尿液、血液和部分组织代谢的影响,证明代谢组学方法应用于研究药物毒理的可行性和稳定性,并建立了用于临床前候选化合物的肝脏和肾脏毒性预测筛选的专家系统[8 - 9]。
L. Li等[10]利用NMR技术研究中药制品黑顺片对雄性大鼠的毒理效应,结果发现: 尿液中的牛磺酸和三甲胺氧化物与对照组相比明显减少,而柠檬酸盐戊酮异二酸琥珀酸盐和马尿酸盐的含量相对增加; 此外,毒性效应具有剂量依赖性和积累效应。
李建新等[11]以生物核磁共振结合模式识别技术和主成分分析法探讨雷公藤甲素口服给药对大鼠尿液内源性代谢产物的影响,结果发现,大鼠尿液的代谢物谱与雷公藤甲素对肾脏造成损害作用密切相关。
姚凤云等[12]利用NMR技术分析畜禽抗感染主导药物———盐酸恩诺沙星的制备及结构确证,结果表明,盐酸恩诺沙星的体外抑菌效果与恩诺沙星一致, 即成为酸式盐后没有对恩诺沙星的抑菌效果产生影响。
李金贵等[13]利用X射线粉末衍射( XRD) 和核磁共振氢谱(1H NMR) 技术研究了青蒿素- β - 环糊精包合物的表征,结果表明,不同剂量青蒿素预防鸡感染柔嫩艾美耳球虫指数均低于160,说明其防治效果不佳。
雷红涛等[14]利用甲硝唑与琥珀酸酐反应,合成半抗原甲硝唑半琥珀酸酯,再用1H NMR技术进行鉴定,结果表明,成功合成全抗原,为进一步制备甲硝唑抗体治疗鸡、火鸡组织滴虫病及牛毛滴虫等病奠定了基础。
2. 2 GC - MS联用技术
GC - MS联用技术发展已相当成熟,应用相对较多。L. M. He等[15]通过该方法对饲料中的莱克多巴胺( RAC) 和克伦特罗( CLB) 进行检测,其最低检测限RAC为4 μg /kg,CLB为2 μg /kg,可进行确证性检测及消除应用高效液相色谱方法可能带来的假阳性。
刘琪等[16]应用GC - MS联用技术测定动物组织及尿液中克仑特罗残留,分析了操作中衍生化、质谱参数的设定、溶剂的干扰、进样及谱库的检索等因素对测定结果的影响,结果表明,所建立的方法达到了缩短检验周期、降低检测成本的目的。
R. W. Fedeniuk等[17]利用GS - MS联用技术检测发现,牛血清中17β - 雌二醇和17β - 三氨乙基胺水平可达到pg /m L级,其检测水平分别为5 ~ 500, 25 ~ 500 pg / m L,从而展现了GS - MS联用技术对检测激素水平的敏感性和特异性均较高。
彭莉等[18]利用气相色谱法测定牛奶中氯霉素的残留量,结果表明,回收率、批间变异系数、检测限和定量限均达到了欧盟的规定要求,适合牛奶中氯霉素残留分析。
田苗[19]利用GC - MS联用技术建立了猪组织( 肉组织、肝脏和肾脏) 中10种 β - 兴奋剂类兽药残留量的检测方法,结果显示,10种 β - 兴奋剂类兽药的检出限、回收率和精密度等技术指标能满足国内外对 β - 兴奋剂类兽药残留量的检测要求。
2. 3 LC - MS联用技术
P. Scherpenisse等[20]利用LC - MS联用技术检测孔雀石绿( MG) 在鱼体内代谢后其代谢产物白孔雀石绿( LMG) 水平,结果表明,检测范围达0. 11 ~ 0. 18 μg / kg,检测效果明显高于其他检测方法。
P. Scherpenisse等[21]再次运用LC - MS联用技术对鳟鱼、鲑鱼和罗非鱼等水产品中的兽药间氨苯酸乙酯甲磺酸盐( tricaine mesilate) 进行检测,其检测限达0. 50 ~ 0. 68 μg /kg,表明此种方法可用于部分水产品低水平兽药残留的检测,也证明了LC - MS联用技术对低剂量浓度样品检测的敏感性较强。
乔华林[22]运用高效液相色谱- 质谱联用技术, 通过优化前处理选择合适的色谱条件,实现了向水产品中添加痕量阿维菌素、氯霉素和硝基呋喃类兽药后,代谢物多组分的同时检测。
孙雷等[23]建立了猪肉组织中7种氟喹诺酮类药物残留检测的高效液相色谱- 串联质谱方法,结果表明,该方法特异性强、回收率高、变异系数小、检测限和定量限低。
李勇[24]运用液相色谱- 串联质谱的方法检测了蛋鸡服用兽药喹烯酮后,血浆、肝脏和肉组织中内源性代谢物的作用。张丽芳等人利用该技术测定鸡组织中喹啉类兽药残留标示物喹啉- 2 - 羧酸和3 - 甲基- 喹啉- 2 - 羧酸的残留含量。
曹莹等[25 - 26]运用液质联用仪先后对中兽药中非法添加的氟喹诺酮类药物及禽蛋中苏丹红的含量进行检测,结果表明,该方法特异性强、回收率高、检测限和定量限效果较灵敏。
3结语
植物代谢组学研究 篇7
代谢组学是20世纪90年代中期由英国学者Nicholson等[1]基于磁共振分析的基础上提出并发展起来的学科,是研究生物体系在受到内在和外在因素刺激时产生内源性代谢变化的一门科学。代谢组学在短短几年内取得了迅速发展,每年发表的相关科学文献和综述的数量都在不断增加,而目前国内应用代谢组学进行动物医学的研究仍处于初级阶段。
与其他“组学”相比,代谢组学更加直接地表现了生命的代谢过程。研究对象通常是相对分子质量小于1 000 Kd的内源性小分子,反映的是外界刺激或遗传修饰的细胞或组织的代谢应答变化[2]。由于代谢物处于生物系统生化活动调控的末端,包含着反映生理表型的直接而全面的生物标记物信息,因此,代谢组学技术日益成为整体性研究生命体系功能变化的非常有力的分析手段[3,4,5]。
根据研究的对象和目的的不同,Fiehn等[6]将代谢组学分为4个层次,即:①代谢物靶标分析(metabolite target analysis):对某个或某几个特定组分的分析;②代谢轮廓(谱)分析(metabolite profiling analysis):对少数所预设的一些代谢产物的定量分析;③代谢组学(metabonomics):对限定条件下的特定生物样品中所有代谢组分的定性和定量;④代谢指纹分析(metabol i te fingerprinting analysis):不分离鉴定具体单一组分,而是对样品进行快速分类。
1 代谢组学的研究方法
完整的代谢组学一般包括样品的采集、预处理、数据的采集和数据的分析及解释等流程[7]。其研究平台主要包括分析技术平台和数据分析平台。实际的研究对象不同,样品采集及预处理技术也不尽相同。代谢组学力求分析生物体系(如体液和细胞)中的所有代谢产物,所以整个过程中都强调尽可能地保留和反映总的代谢产物的全面信息。
1.1 分析技术平台
核磁共振(NMR)是代谢组学中最早应用也是最常用的技术[8],目前较常用的有氢谱(1H-NMR)、碳谱(13C-NMR)和磷谱(31P-NMR),其中以1H-NMR更为广泛[9]。应用最广泛、最有效的代谢组学研究技术是气相色谱-质谱(GC-MS)[10,11]和液相色谱-质谱(LC-MS)[12]。前者适宜分析小分子、热稳定、易挥发、能气化的化合物;而后者能分析更高极性、更高相对分子质量及热稳定性差的化合物。而且,大多数情况下不需要对非挥发性代谢物进行化学衍生化处理。
1.2 数据分析平台
通过上述分析技术手段可产生海量的元数据,需要借助于生物信息学平台对所得的数据进行解释分析。一般常采用无监督的主成分分析(PCA)[13]、非线性映射(NLM)[14]、簇类分析(HCA)[15]等和有监督的偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)[16]、人工神经元网络(ANN)[17]分析等数据分析方法。然而近年来支持向量机(SVM)[18]方法已逐渐应用于代谢组学后期数据的判别分析中,其预测精度明显优于传统的PLS-DA方法。
2 代谢组学在动物医学上的应用
2.1 疾病诊断
新陈代谢是生命的基本特征。机体发生病理变化必然会导致代谢产物也发生某种相应的变化。对代谢产物的变化进行数据采集、分析,寻找疾病的生物标记物,有助于临床对疾病的诊断与分型[19]。对这些由疾病引起的代谢产物的变化进行分析,即代谢组学分析,能够帮助人们更好地理解病变过程及机体内物质的代谢途径,有助于发现疾病的生物标记物及辅助诊断疾病。
Mayr等[20]联合应用蛋白质组学和代谢组学技术研究小鼠动脉平滑肌,通过两种技术手段将细胞蛋白质变化和其功能改变联系起来,多角度地揭示了动脉粥样硬化的形成机制。赵剑宇等[21]研究关木通染毒后大鼠尿液的代谢表型改变及其与组织病理和尿液、血浆生化指标的相关性。结果发现大鼠肾脏出现不同程度的炎症坏死,尿样中氧化三甲胺、枸橼酸、牛磺酸、肌酐、甜菜碱等代谢物均有不同程度的下降,而醋酸、丙氨酸则显著上升。PCA表明,给药组与对照组的代谢谱有明显差异,可以被区分。而造成组间差异的主要影响因素是醋酸和氧化三甲胺的变化,这些代谢物的变化说明动物尿液代谢组学分析能够较好地反映关木通的肾毒性特征。随着现代分析手段和计算机技术的迅速发展,代谢组学必将在动物疾病诊断领域发挥更大的作用。除在疾病诊断中发挥作用外,代谢组学技术也已经被用于机体健康状况的评价,特别是营养水平对健康的影响[22]。
2.2药物的毒性评价
Nicholson研究小组利用基于NMR的代谢组学技术在药物的毒性评价方面做了大量颇具成效的工作。其工作涵盖分析平台的建立、方法的重现性、基因改变及相应代谢响应的特性研究、相应化学计量学方法等。Nicholson教授等[23]最早将NMR与模式识别技术结合检测代谢表型中的动态变化,并应用于药物毒理标示物的研究。
Kleno等[24]通过大鼠肝给药,使用'H-NMR技术测定给药后48 h内内源性代谢物的变化,得出单剂量的肼引起的变化与糖代谢和脂代谢密切相关的结论并找出了生物标记物,从而研究了肼毒性与糖代谢和脂代谢的关系。Elaine Holmes等[25]研究了以NMR为基础的代谢组学技术在神经毒性研究中的应用,通过高分辨率的NMR技术对血浆、脑脊液和尿液产生的可解释的代谢指纹分析,发现与病理状态存在潜在的关系。这项技术已成功地应用于神经退行性疾病的临床研究,如亨廷顿氏病、肌肉萎缩症和小脑性共济失调。这种技术的扩展,魔角旋转1H-NMR光谱,可用于产生代谢信息。Mortishire-smith等[26]研究脂肪酸代谢与毒性关系:给大鼠服用肝毒性化合物并用多元统计分析处理尿液NMR数据,分辨给药组和空白组代谢物组的区别,并进一步确定这种区别来源于三羧酸循环中间体的损耗及尿液中链状二羧酸的出现。Holmes等[27]以肼作为肝毒性模型药物,以氯化汞作为肾毒性模型药物,采用SD和Wistar两种品系大鼠为试验动物,用代谢组学方法同时比较种系间代谢物组差异和毒性对代谢物模式的影响,通过大鼠尿液代谢物组数据的前3个主要成分对各组大鼠进行分类,98%的测试样本得到了正确的分类。Robertson等[28]采用四氯化碳和α-萘基异硫氰酸盐作为肝毒性建模药物,2-溴乙胺和4-氨基酚作为肾毒性药物进行了类似研究,用PCA处理结果表明代谢物组方法可以方便地区分毒性的发生和逆转。通过代谢组学进行毒价评价可以帮助人们更好地了解生物系统对环境和遗传因素变化的反应。从而对动物的健康做出正确评价,有助于动物医学事业的发展。
2.3 在兽药检测中的研究应用
随着兽药在畜牧生产中的广泛应用以及人们对肉、奶、蛋安全的要求,对兽药的分析技术的需求也更加迫切并取得较大的发展。雷红涛等[29]用甲硝唑与琥珀酸酐反应,合成半抗原甲硝唑半琥珀酸酯,用1H-NMR等方法进行鉴定。结果成功合成全抗原,为进一步制备甲硝唑抗体从而治疗鸡、火鸡组织滴虫病、牛毛滴虫等病奠定了基础。彭莉等[30]利用气相色谱法测定牛奶中的氯霉素残留,结果表明,回收率、批间变异系数、检测限和定量限均达到了欧盟的规定要求,适合牛奶中氯霉素的残留分析。田苗等[31]利用GC-MS检测技术,建立了猪组织(肉组织、肝脏和肾脏)中10种β-兴奋剂类兽药残留量的检测方法,结果显示,10种β-兴奋剂类兽药的检出限、回收率和精密度等技术指标能满足国内外对β-兴奋剂类兽药残留量的检测要求。孙雷等[32]建立了猪肉组织中7种氟喹诺酮类药物残留检测的高效液相色谱-串联质谱方法,分析结果表明,该方法特异性强、回收率高、变异系数小、检测限和定量限低。
通过代谢组学研究可以在兽药的新药遴选、药物毒性评价、不良反应监测方面提供一定的向导性,对动物的健康起到了举足轻重的作用。
3 结论
代谢组学技术可以应用于生命系统的多项研究中,尤其在诊断动物疾病中的应用对人类社会的发展起到了不可或缺的作用。但在广泛应用的同时也存在很多问题,如分析技术有限,不能应用于全部代谢物,仪器昂贵对操作技术要求较高,尚无有效的数据分析手段将所得到的全部信息进行分析和解释,数据库很不完善。另外如何把代谢组学数据和转录组学、蛋白质组学、遗传学、酶学、代谢途径和表现型分析的数据整合在一起,并给出生物学功能的解释将是最大的挑战。
4 展望
植物代谢组学研究 篇8
中药复方是中医临床用药的基本形式,病证结合作为中现代医学结合研究的重要模式对中药复方的临床应用产生深远影响。基于病证相关概念的中药复方研究日渐增多,但在研究过程中仍存在诸多困境,一方面中药复方成分多而复杂,另一方面中药作用机制复杂且靶点众多,因而传统的研究方法难以实现全面、有效的研究及观察。代谢组学作为系统生物学的一个分支,其所特有的整体观、 动态观与中医复方研究中的指导思想相吻合,在病证相关研究中具有独特优势,逐渐成为中药复方研究领域内的新热点。
1病、证、病证结合相关内涵
病症是指机体一定条件下,由病因与机体相互作用而产生一个损伤与抗损伤斗争的有规律的过程,患者体内发生一系列形态、功能、代谢的改变, 临床表现出多种不同的症状和体征,是机体与外界环境间的协调发生障碍［4-5］。
病证是中医特有概念,是指在疾病发生发展过程中,某一阶段病因、病位、疾病性质及正邪斗争消长变化的病理概括,是机体对内外环境变化、致病因素作出反应的一种功能状态,临床表现为一组相互关联的症状和症候群［6］。
病证结合,即指现代医学辨病与中医辨证相结合,是借助于现代医疗检测手段、现代医学理论及思维方法对患者做出疾病诊断,在此基础上应用中医辨证思维进行临床辨证,指导治法、组方、用药, 最终达到提高临床疗效的目的［7］。病证结合的临床诊疗与研究思路体现了疾病共性规律与患病个体个性特征的有机结合,病证结合的临床模式为在科学层面开展中医药学的研究提供了可能［8］。
2代谢组学在中药复方研究中的优势
代谢组学属于系统生物学研究范围［9］,是一门检测、鉴定、量化、评估一个生物整体内代谢物质随时间变化的规律以反映其在内在和外在因素影响下所发生的某种病理或生理过程的学科［10］。
中药复方是中药临床用药的主要形式,而“方从法出,法随证立”则是中医重要的组方思路,可见 “证”是临床遣方用药的基础。随着病证结合诊疗观念的提出,中药临证组方思路亦发生了深刻的变化。在临证用药时,不仅强调针对证的病机进行整体调节,同时强调结合某种疾病的特定病理变化进行针对性治疗,以取得在临床治疗上的最佳效果［7］。用现代科学方法研究中药复方已久,但在中药作用机理研究方面仍存在困境［11］。
代谢组学作为系统生物学领域内研究生物体在不同因素影响下整体功能状态变化的一门科学, 其所特有的整体观、动态观与中医复方研究中的指导思想,如整体观念、系统生物学的思考模式、复杂性科学等观念［12］相契合。通过采集证候样本或模型动物生物标本进行代谢产物谱分析,找出特异的标志性代谢产物,可比较中药复方在治疗相应证候或疾病前后机体内代谢产物的变化,即用反证的方式验证方药的作用机制以及进行方证相关性的研究。因而,代谢组学是研究病证本质和药效机制适宜的技术手段［13］。
3代谢组学在病证相关中药复方研究中的应用
代谢组学在病证相关中药复方研究中的应用主要集中在针对中医证候、现代医学病种、病证结合相关中药复方三方面的研究。
3. 1中医证候相关中药复方研究
应用代谢组学评价中药复方作用于中医证候的研究逐年增多。代谢组学的介入,一方面为解释中医传统定义下的“证”引入了“现代语言”,即用直观数据归类“证”的本质; 另一方面也为中药复方作用于“证”的疗效提供了客观评价指标及作用研究基础［14］。
Zheng Xiaofen等［15］基于1H-NMR技术和PCA分析方法,研究补中益气汤在脾虚证大鼠模型中的 “补益”机制,发现补中益气汤通过调节缬氨酸、亮氨酸、O-乙酰糖蛋白、乳酸等内源性代谢物以影响能量、蛋白质、糖酵解等代谢,从而发挥“补脾”之用。Wang Ping等［16］应用UPLC-HDMS技术、OPLS- DA分析方法,探讨六味地黄丸对于由甲状腺素和利血平联合诱导的肾阴虚证的治疗效果,在研究发现20种差异代谢物基础上,证实应用六味地黄丸治疗肾阴虚证较分开应用“三补”“三泻”治疗与对照组相比具有更为相近的代谢轮廓,为应用代谢组学研究中药复方的整体效应提供了有力证据。
李伟霞等［17］基于UPLC /Q-TOF MS技术、PLS- DA分析方法,研究佛手散干预血虚证小鼠模型血浆的代谢指纹图谱变化,发现佛手散养血补血的作用机制可能是基于对硫胺代谢、鞘脂代谢、花生四烯酸代谢、烟酸和烟酰胺代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、组氨酸代谢、色氨酸代谢、酪氨酸代谢、糖代谢和柠檬酸循环等11条代谢通路的调节。王穆等［18］采用NMR技术及PCA分析方法,研究四物汤干预环磷酰胺所致血虚证小鼠血清、组织提取物的代谢谱变化,发现四物汤治疗血虚证的机制可能与调节脂肪酸 β 氧化和糖酵解功能、维持细胞内外渗透压平衡相关。
3. 2现代医学疾病相关中药复方研究
凭借代谢组学技术研究中药复方治疗现代医学定义下“疾病”的作用机制是目前研究的主要热点,一方面是由于相较于“病证”来说“病症”的概念在一定层面上更具有普识度,另一方面也是由于在基于“病症”的概念下更易于将代谢组学与中医药的临床研究相结合。
3. 2. 1循环系统疾病目前代谢组学较多应用于循环系统相关疾病的研究。Liu Yuetao等［19］基于UPLC / Q-TOF MS技术和OPLS-DA分析方法,研究发现心可舒胶囊通过调节脂肪酸 β 氧化通路、鞘脂代谢、甘油磷酸酯代谢及胆汁酸的生物合成以发挥对动脉粥样硬化的干预效果。Liang Xiaoping等［20］应用UPLC /TOF-MS技术及PCA、PLS-DA分析方法,研究双龙胶囊治疗心肌梗塞大鼠的尿液代谢差异,发现双龙胶囊通过影响心肌能量代谢中的柠檬酸循环和磷酸戊糖途径以改善心肌损伤。于晓红等［21］将代谢组学与临床研究相结合,基于LS /MS技术、PCA及PLS分析方法,研究养心汤对不稳定型心绞痛患者血浆代谢谱的影响,证实其通过调节神经酰胺、甘氨胆酸、别胆酸、石胆酸、白三烯B4等代谢标志物以发挥生物效应。Dai Weidong等［22］基于UFLS /MS-IT-TOF技术及PCA分析方法,对通心络胶囊干预血管内皮功能障碍大鼠的尿液进行代谢组学研究,发现相较于斯伐他汀仅显示调节1条代谢通路,通心络胶囊通过调节脂肪酸氧化、胶原蛋白水解、腺嘌呤、苯基丙氨酸、卟啉等多种代谢通路对血管内皮功能障碍起到改善作用。
3. 2. 2消化系统疾病同时,代谢组学在消化系统相关疾病的研究亦有较多应用。彭树灵等［23］应用GC / MS技术、PCA及PLS-DA分析方法,研究维胃方作用于胃溃疡模型大鼠的胃黏膜匀浆代谢物谱的变化,发现维胃方通过调节能量代谢、氨基酸代谢及脂类代谢以促进胃溃疡的愈合。Gou Xiaojun等［24］采用GC /MS技术、PCA及PLS-DA分析方法, 研究下瘀血汤作用于肝纤维化大鼠的尿液代谢组特征,发现下瘀血汤通过影响能量代谢、微生物菌群代谢、氨基酸代谢和脂肪酸代谢以发挥治疗效果。邱云平等［25］基于GC /MS技术及PCA、PLS-DA分析方法,研究发现金复康口服液对于二甲肼诱发的大肠癌癌前病变有一定的逆转作用,其可能机制为通过影响三羧酸循环、色氨酸循环、多胺代谢及肠道菌群代谢等代谢过程。
3. 2. 3其他系统疾病此外,代谢组学还应用于免疫系统疾病、妇科疾病及精神心理疾病等方面的研究中。Zhang Huawei等［26］采用LC /Q-TOF-MS技术、PLS-DA分析方法,证实黄连解毒汤及其主要成分通过调节能量代谢、氨基酸代谢及氧化应激以实现对于胶原诱导性关节炎的治疗作用。Xue Liming等［27］应用1H-NMR技术、PCA和PLS-DA分析方法, 通过研究去卵巢大鼠尿液及血浆中的代谢物差异, 发现二仙汤通过调节脂质代谢、能量代谢、氨基酸代谢及提升抗氧化能力以实现对绝经后骨质疏松症的良好的治疗效果。Liu Pei等［28］凭借UHPLC / Q-TOF-MS技术手段、PLS-DA分析方法,研究香附四物汤作用于原发性痛经模型大鼠血浆中代谢物的差异,发现香附四物汤通过调节溶血磷脂从而影响鞘脂代谢以发挥生物效应。
Liu Xiaojie等［29］基于1H-NMR技术、PLS-DA分析方法,选用慢性轻度不可预知应激抑郁( chronic unpredictable mild stress,CUMS) 模型研究逍遥散的抗抑郁机制,发现逍遥散通过调节N-氧三甲胺、丙氨酸、β-羟丁酸、缬氨酸、亮氨酸/异亮氨酸、N-乙酰糖蛋白等代谢物以发挥抗抑郁的作用。Gao Xiaoxia等［30］则是通过GC /MS技术、PCA分析方法研究逍遥散作用于CUMS模型大鼠血浆的代谢物质变化, 研究发现氨基酸代谢、能量代谢和糖代谢参与逍遥散的抗抑郁机制。Su Zhiheng等［31］应用UPLC /Q- TOF-MS技术和PLS-DA分析方法,选用慢性可变应激( chronic variable stress,CVS) 模型研究柴胡疏肝散的抗抑郁机制,发现柴胡疏肝散发挥抗抑郁机制的物质基础可能是通过改善能量代谢、色氨酸代谢及骨质流失、肝脏解毒功能。
3. 3病证结合相关中药复方研究
无论是对于中医证候的研究还是对于西医病症的研究,将两者有机结合即基于病证结合的研究将是今后中医药研究的主要方向。目前应用代谢组学技术探寻中药复方干预病证机制的相关研究较少,却也为今后代谢组学更广泛地应用于中药复方领域的研究提供了更多的可能。
黎莉等［31］基于UPLC /Q-TOF-MS技术及PCA、 PLS-DA、OPLS-DA分析方法研究白香丹胶囊干预经前期综合征肝气逆证模型大鼠血清内源性代谢物变化,发现白香丹胶囊通过调节糖皮质激素、雌激素、神经递质、氨基酸等代谢标志物,从而达到治疗目的。Sun Shujun等［32］应用GC /MS技术及PLS-DA分析方法研究不同证型乙型肝炎后肝硬化内源性代谢物差异,并证实扶正化瘀片对脾虚湿盛证、肝肾阴虚证患者的疗效优于肝胆湿热证、 血瘀证。
4讨论
代谢组学研究小分子物质的产生和代谢,是一系列生命活动事件的最终结果,在研究复杂生物体系中提出一种“由上而下”的整体观念,是基因组学和蛋白质组学的延伸和终端,因而被认为是“组学” 研究的最终方向［33］。随着精准医疗( precision med- icine) 概念的提出,基因组学、蛋白质组学、代谢组学、信号组学等高通量分析技术,作为寻找疾病驱动分子( molecular diver) 的研究手段,为实现精准的诊断、治疗创造了条件,并逐渐成为研究热点［34］。
代谢组学作为一种基于全局观点的整体性研究方法,适用于中医药的整体效应评价,基于代谢组学研究中药复方不仅局限于相关中医证候、西医疾病、病证结合等方面,同时代谢组学亦可应用于研究中药复方自身药效机制的探寻以及配伍规律、 复方毒理、煎煮方法等方面的研究［35-38］。
功能性疾病,其中以功能性胃肠病( functional gastrointestinal disorders,FGIDs) 为代表,临床以存在消化系统症状、但经传统检验手段证实无相关器质性病变或不能用器质性病变解释相关症状为特点,在临床诊断、疗效评价等方面尚缺乏特异性评价指标,因而在开展临床研究、动物实验等方面存在评价困境。随着功能性胃肠病研究的逐渐深入以及系统生物学等相关概念的提出,很多学者认识到应从整体系统生物学角度认识疾病以及病证的发生与转归,通过借助高效高通量分析技术,以基因组、蛋白质组、代谢物组等整合的多层次网络方式表征各种病理、生理状态,揭示疾病、病证本质, 一方面实现评价在中医药理论指导下的病证结合药理模型的合理性,另一方面依据系统生物学所揭示的相关特异性指标建立系统水平的药理评价方法［39］。目前,以蛋白质组学为代表的系统生物学研究手段已被应用于功能性胃肠病的相关中药复方研究中。如魏玮教授等［40］开展功能性消化不良的蛋白质组学研究,发现中药复方胃康宁能够上调谷胱甘肽S-转移酶Pi2、超氧化物歧化酶-2、α-烯醇化酶及电压依赖性阴离子通道-1的表达,推测胃康宁通过改善抗氧化能力、能量代谢及线粒体的功能从而发挥生物效应。吕宾教授等［41］应用蛋白质组学技术开展肠易激综合征相关研究,发现痛泻药方通过上调Transgelin蛋白、乙醛脱氢酶2及下调角蛋白8,从而降低大鼠内脏敏感性。代谢组学与蛋白质组学、基因组学相较,具有放大基因及蛋白质表达变化从而简化检测、代谢物种类较少、物质分子结构相对简单、技术可通用等优势［42］。因此在今后的研究中,可将代谢组学技术与功能性胃肠病研究相结合,在探寻疾病、病证本质及机理的同时,提供以此为依据的科学评估方法,一方面可作为发展诊疗手段、制定诊疗方案的基础,另一方面可为开展相关研究提供科学的评价依据。国内已有学者提出中医方证代谢组学( chinmedomics) 这一概念［43］,即将 “中医证候生物标记物-方剂体内直接作用物质-药效生物标记物”研究有机结合,建立血清中外源性中药成分与内源性标记物群2组变量相关( plottin of correlation between marker metabolites and serum constituents,PCMS) 分析方法,形成方剂整体药效生物评价体系,推动中医方-证相关研究应用策略,为中药复方即方剂相关研究的关键问题带来方法学的创新。
植物代谢组学研究 篇9
关键词：2型糖尿病,葡萄糖氧化代谢,关键酶,测定,代谢
糖尿病是一种以胰岛素分泌或代谢缺陷, 或者两者同时存在而引起的以慢性高血糖为特征的代谢异常综合征, 发病率逐年上升, 且T2DM的发生率显著高于1 型糖尿病。文献报道[1], T2DM的发生可能与遗传易感、胰岛素抵抗及功能缺陷及血糖调节受损等关系密切, 一旦患病患者需终身服药, 且药物的长期应用导致的肝肾功能损伤不容忽视, 对人体健康造成严重威胁。因此, 对于具备可能引发T2DM的高危因素的人群应做好一级预防, 控制T2DM的发生。但由于目前对糖尿病的发病机制还没有完全阐明, 导致对于糖尿病的防治无法取得突破性进展。本研究通过分析健康人群及T2DM各时期人群的代谢酶和生化代谢谱, 研究是何种生物标志物引起了代谢缺陷, 对T2DM的发病机制进行阐明, 对具备高危因素的人群进行及早的行为干预, 使高危人群减少发病率或不发病, 具体报告如下。
1 资料与方法
1.1一般资料2012年7月~2015年7月的150例入组研究对象, 分为五组:T2DM高危人组29例;T2DM前期即葡萄糖调节受损 (IGR) 组31例;T2DM早期 (无慢性并发症) 组31例;T2DM中后期 (合并慢性并发症) 组29例;对照组 (健康人) 30例。选择符合WHO糖尿病诊断标准[1]。五组受检人员一般资料比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。
1.2方法
1. 2. 1 采集血标本嘱参与研究人员第1 次采血, 于晨起空腹安静状态下进行, 使用带有分离胶的真空采血管, 采集血液2 ml ;第2 次采血, 第1 次采血后嘱参与研究人员将75 g无水葡萄糖溶于300 ml水中口服, 2 h后采集静脉血2 ml。将血标本密封置于深冻冰箱 (-70℃ ) 内保存, 待检。
1. 2. 2 仪器与试剂选择仪器:全自动生化分析仪 ( 日立717OS) , 全自动免疫、生化/ 特定蛋白分析仪 (ADALTIS eclectica) , 自动多功能酶标仪 (KHB ST-360) , 低温冰箱 (-70℃ ) , 超速离心机。 选择试剂:CS试剂盒 ( 产品编号:Catalog No.E1661h) ; ICD试剂盒 ( 产品编号:Catalog No.E1403h) ; α-KGDHC试剂盒 ( 产品编号:Catalog No. E1923h) 。
1. 2. 3 测定采用ELISA法对糖代谢关键酶进行测定, 包括CS、ICD、α-KGDHC, 采用自动多功能酶标仪进行3 次检测;胰岛功能等生化指标测定采用磁微粒分离免疫分析法进行测定[2]。
1. 3 统计学方法将研究所得数据采用SPSS16.0 统计学软件进行统计分析。计量资料以均数 ± 标准差 ( ±s) 表示, 两组间比较采用t检验, 多组间比较应用方差分析;计数资料以率 (%) 表示, 采用 χ2检验。P<0.05 表示差异具有统计学意义。
2 结果
各组血清糖代谢关键酶测定及胰岛功能比较:CS、α-KGDHC各组间比较差异无统计学意义 (P>0.05) 。ICD、胰岛素敏感指数 (ISI-Stumvoll) 、胰岛素抵抗指数 (HOMA-IR) T2DM高危人组、T2DM前期组、T2DM早期组和T2DM中后期组与对照组比较, 差异有统计学意义 (P<0.05 或P<0.01) 。其中ICD活性最低的是T2DM高危人组和T2DM前期组, 且两组差异无统计学意义 (P>0.05) 。ICD活性略有增强的是T2DM早期组和T2DM中后期组。见表1。
注:与对照组比较, aP<0.05, bP<0.01 ;ISI-Stumvoll= 空腹血糖 (FBG) × 空腹胰岛素 (FINS) , HOMA-IR=FINS×FBG/22.5
3 讨论
TCA具有参与蛋白质、糖、脂肪的分解代谢作用, 是人体三磷酸腺苷 (ATP) 产生的主要途径[3]。本研究显示, 在TCA循环中ICD是其关键限速酶, ICD的活性与TCA循环的代谢流量具有一定的相关性。对照组的ICD活性高于T2DM高危人组、T2DM前期组、T2DM早期组和T2DM中后期组 (P<0.05 或P<0.01) , 其中ICD活性最低的是T2DM高危人组及T2DM前期组, 两组比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 显示T2DM高危人组及T2DM前期组人群的ICD活性已经被抑制。ICD活性略有增强的是T2DM早期组及T2DM中后期组, 但均低于对照组 (P<0.05 或P<0.01) 。显示T2DM早期组及T2DM中后期组患者部分酶活性可能恢复, 这与患者开始用药有关。
α-KGDHC不但是TCA的关键酶, 也是产生活性氧家族 (ROS) 的基本位点, 研究显示:神经元的坏死是由于KGDHC酶活性受到抑制而导致的[4]。
从本文研究结果可见, HOMA-IR增高和ISI-Stumvoll逐渐降低的顺序是对照组、T2DM高危人组、T2DM早期组、T2DM前期组、T2DM中后期组, T2DM高危人组与对照组比较差异具有统计学意义 (P<0.05) , T2DM前期组、T2DM早期组、T2DM中后期组与对照组比较差异具有统计学意义 (P<0.01) , T2DM前期组与T2DM早期组比较可见:HOMAIRT2DM前期组较T2DM早期组高, ISI-Stumvoll T2DM前期组较T2DM早期组低, 这一结果说明糖尿病药物的应用促使糖尿病早期的患者恢复了部分胰岛素的敏感性, 因而胰岛功能优于未使用药物的糖尿病前期患者。由此可见, 对具备高危因素的人群进行及早的行为干预, 进而使高危人群减少发病率或不发病。
线粒体功能障碍是糖尿病一个主要诱因[5]。CS、ICD和 α-KGDHC的活性影响的TCA速度的代谢流量是不同的。ICD是TCA循环中的关键限速酶, 它的活性与TCA的代谢流量具有一定的相关性。
参考文献
[1]周爱儒.生物化学.第6版.北京:人民卫生出版社, 2004:72-104.
[2]平静, 关心, 吴丽霞, 等.糖尿病及高危人群三羧酸循环关键酶的测定与生化代谢谱的研究//第九届全国药物和化学异物代谢学术会议, 2009:118-120.
[3]沈朋, 曾真, 程翼宇, 等.乳腺癌血清蛋白质组和代谢组协同分析研究.中华检验医学杂志, 2005, 28 (7) :710-712.
[4]钱燕宁, 屠伟峰, 王灿琴, 等.手术应激后红细胞糖代谢限速酶活性的改变.医学研究杂志, 2006, 11 (35) :47-48.