次生代谢（精选3篇）
次生代谢 篇1
植物次生代谢物 (plant secondary metabolites) 是指植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物, 其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。植物次生代谢物种类繁多, 化学结构迥异。现在, 已知大约有10000种次生代谢物, 包括酚类、黄酮类、香豆素、木脂素、生物碱、糖苷、萜类、甾类、皂苷、多炔类、有机酸等, 可分为酚性化合物、萜烯类化合物、含氮有机物3大类。植物次生代谢是植物在长期进化中对生态环境适应的结果, 对植物在其生态系统中的生存起作用, 如抗虫、抗病、异株相克、吸引昆虫授粉、与共生微生物相互作用等。
近年来, 植物细胞大量培养以提取有用次生代谢产物的研究, 并没有像人们所预计的那样广泛地进入工业化生产, 主要是发现细胞培养物的成本太高;越来越多的研究者已把工作重点转移到以细胞生物学和分子生物学为基础的次生代谢物的产量提高及成本的降低, 主要表现在以下几个方面:
1 植物组织、细胞培养生产次生代谢产物
次生代谢物是药用植物重要有效成分, 但由于野生资源日益减少和栽培品种品质退化, 给临床使用和质量控制带来许多困扰。利用生物技术生产有效成分, 能缓解药用植物资源压力。对于那些生长条件要求严格、生长缓慢、产量小、采集困难、价值贵重的植物药, 用这种方法更具有重要意义。利用植物组织、细胞培养生产次生代谢产物能克服以上缺点。天然抗癌药物紫杉醇在红豆杉植物中含量很低, 即使现在公认含量最高的短叶红豆杉树皮中也仅有0.069%。周忠强等 (2004) 通过采用固定化植物细胞培养技术可以克服细胞大量培养中的许多困难, 以小规模的培养细胞大量生产胞外目的产物。因为包埋于惰性基质的固定化提供了适于细胞分化的条件, 结果提高了次生物质的产量, 如李承森等 (1998) 报道熏衣草细胞的固定化培养, 辽宁紫草细胞的固定化培养等都取得了很好的效果。次生化合物的合成需要相当多的代谢酶 (包括同工酶) 基因参与, 这些基因的遗传变异直接影响药材的功效。目前已有不少调控次生化合物代谢的关键酶基因被研究。例如, 苯丙烷类代谢酶系是目前了解最清楚的植物次生代谢物合成途径, 其中许多酶基因已被克隆。利用黄酮、水杨酸等的生物合成都由此途径合成, 这个途径的关键酶是本丙氨酸解氨酶 (PAL) 、肉桂酸-4-经化酶 (CA4H) 和4-香豆酸CoA连接酶 (4CL) 。
在植物组织培养研究中, 发现培养细胞中含有各种特殊的代谢产物、药用成分和各种香精等。其中有些是微生物;有些是人工所不能合成的物质;有些是整体植物中含量甚微或整株植物十分缺乏, 而培养细胞中的含量却很高, 如柠檬叶、鸡眼藤的培养细胞中蒽醌含量比完整植株中高10倍。因此, 以培养细胞生产这些有用成分已受到生物学、医学及商业界人士的极大关注。目前用于以次生代谢产物生产为目的的组织培养和细胞培养的药用植物已有许多种。从细胞培养物中分离得到的有用物质有:酶类 (α-淀粉酶、淀粉酶、蛋白水解酶、过氧化氢酶、酸性磷酸化酶、β-糖苷酶、I-AA氧化酶、细胞色素氧化酶等) ;生物碱 (莨菪生物碱、利血平、吲哚生物碱、麦角碱等) ;甾体 (地奥甙元、山革皂甙元、育努皂甙元等) ;萜类 (角鲨烯、羊毛甾醇、环阿屯醇、人参三醇、人参二醇、油烷酸、人参甙等) ;色素等。1964年, 中国科学院上海植物生理研究所首先成功地进行了人参的组织培养, 随后我国和其他国家的一些学者将人参的组织培养过渡到工业化生产。目前我国学者已经建立了长春花、人参、丹参、三七、三尖杉、忍冬、红花、黄连、西洋参等几十种药用植物的液体培养系统, 并实现了人参的10L体积的大规模培养。胡之璧等 (1998) 对其培养细胞进行化学成分和药理活性比较分析, 表明与种植人参无明显差异, 并已作为美容保健品投放市场, 这是我国药用植物生物技术产品商品化的第一个范例。
通过筛选高产细胞系、改进培养条件和技术以及设计适合植物细胞培养的发酵罐, 人们已对包括紫草、长春花、毛地黄、黄连等在内的多种药用植物细胞进行大规模生产试验, 有的已成商品投入市场。为了加速植物细胞培养技术商业化生产进程, 各国科学家们一方面不断改进培养技术, 如控制培养的气相环境, 加入刺激剂, 加入大孔树脂吸附剂等;一方面发展新的培养方法, 如高密度培养、连续培养和固定化培养等, 以期得到一种适合于植物细胞工业生产的培养方法。随着研究的不断发展, 植物细胞大规模培养成为一种成熟的工业化生产方式已经为期不远了。同时, 代谢产物生物合成的基础研究越来越受到重视, 特别是有关酶的确定和分离, 不仅为控制代谢途径提供了科学依据, 而且为利用基因工程手段操纵代谢途径打下了重要基础。
直接从植物体内提取次生代谢产物含量太低, 例如, 用东北红豆杉生产紫杉醇, 全世界每年需250kg紫杉醇, 需要2500t干树皮, 相当于75万株树龄60a以上的红豆杉树皮的总量, 而红豆杉属植物生长十分缓慢, 仅靠自然资源远远不能满足需要。但利用组织培养技术进行次生代谢物的生产, 产量明显增加, 如紫草根中的紫草宁含量为干重的1%~5%, 而培养细胞积累的紫草宁在l4%左右, 人参培养细胞产生的皂甙可达11.2%, 已经进入用发酵罐生产的工厂化生产阶段。而现在主要采用两步培养技术、固定化细胞培养技术和两相培养技术来提高药用植物次生代谢产物的产量。姜广备 (1994) 报道丹参悬浮培养采取两步培养法时, 在整个培养期间, 可以连续产生隐丹参酮和铁锈醇。吕华等 (1995) 报道在硬紫草固定化培养过程中, 培养30d的紫革色素产量达到4.2mg/g鲜重, 相对色素分泌量达到70%。
2 发状根培养生产次生代谢产物
传统的中药材含有的有效成分绝大部分是次生代谢产物, 它们的合成途径非常复杂, 往往有几十个酶参与反应, 因此寻找出形成特定产物的关键酶就成为利用基因工程技术生产传统有效成分的关键步骤之一。发根培养技术的应用, 利用植物细胞培养技术生产次生代谢物真正实现商品性工业化生产的还为数甚少, 其主要原因在于培养的植物细胞生长缓慢, 次生代谢物含量太低, 以及生产能力不稳定等, 因而工业化生产成本太高。由发根农杆菌Agrobactedun rhizogenes感染双子叶植物形成的毛状根, 在近十几年中已发展成继细胞培养后又一新的培养系统。发根 (hair root) 是整体植株或其某一器官、组织 (包括愈伤组织) 、单细胞甚至原生质体受发根农杆菌 (Agrobacterium rhizogenes) 的感染所产生的一种病理现象 (形成多分枝的不定根) 。据不完全统计, 目前已有400多种植物建立了组织和细胞培养体系, 并从中分离出600多种代谢产物。
由于发根农杆菌及其Ri质粒转化产生的发状根比较容易再生出新植株, 而且很多植物的发状根在离体培养条件下都表现出原植株次生代谢产物的合成能力, 因此发状根培养又被称为转基因器官培养, 是一条利用生物技术生产次生代谢产物的新的有效途径, 很适用于有价值的次生代谢产物的生产。目前国内学者将发根培养技术应用于药用植物方面的研究, 先后成功地对绞股蓝、甘草、丹参等24种药用植物进行发状根诱导, 应用到的菌株有R1600、ATCCl5834、A4、LBA9402、TR105、R1000和Rri2659等, 得到的次生代谢产物有生物碱类 (莨菪生物碱、吲哚类生物碱、喹啉类生物碱等) 、苷类 (人参皂苷、甜菜苷等) 、黄酮类、醌类 (紫草宁等) 以及蛋白质 (天花粉蛋白等) 。刘俊等 (2005) 用A4、R1601菌株对盾叶薯蓣的根在1/2M液体培养基和28℃弱光条件下培养, 建立发状根快速繁殖技术, 转基因获得的发状根其薯蓣皂甙元的含量分别是微块茎、愈伤组织和植物体合成量的5.68倍、6.12倍和2.68倍。
毛状根生长迅速, 遗传性稳定和生化特性不易改变的特点, 越来越受到人们的重视。这一培养系统对传统药材来讲更为重要。因为约1/3的传统药材是植物的根部。刘涤 ( (1997) 报道目前已在长春花、烟草、紫草、人参、曼陀罗、颠茄、丹参、黄花、甘草和青蒿等40多种植物中建立了毛状根培养系统。大规模培养使用的发酵罐有多种类型, 其中以气升式效果为佳。在提高毛状根中次生物质数量的研究中, 发展了培养基连续流动、双液相发酵等新的培养技术;利用大孔树脂做为吸附剂的培养方法也有报道。
孙敏等 (2005) 用A4和R100对长春花叶片在MS培养基黑暗的条件下培养, 结果发状根中的总生物碱高于长春花的原植株和愈伤组织。目前世界上许多国家如美国、英国、日本、韩国及中国等都对中药植物和农用植物进行了大量深入的发根培养的基础理论研究。实验证明, 转化的发状根大部分都能检测到与原植株含量相当或高于原植株含量的次生代谢产物, 有些发状根中的药物成分甚至大大高于原植株的含量。Furuya等利用20t规模的反应器进行人参毛状根培养成功。在提高毛状根中次生代谢产物产量的研究中, 发展了培养基连续流动、双液褶发酵等新的培养技术。Hu和Alfermann在中国传统药材丹参毛状根培养中发现, 7种丹参酮存在于毛状根组织中, 约40%分泌到培养基中。同时, 还发现丹参毛状根中含水溶性酚酸类化合物, 其中丹酚酸A的含量超过原植物的2.17倍。在另一重要传统药材黄芪毛状根培养的研究中, 我们发现粗皂甙与可溶性多糖的含量明显超过黄芪干燥根。此外, 还成功地进行了黄苠毛状根大规模培养实验, 在10L体积的容器中经过21 d的培养, 其产量可达到10 g (干重) /L。中国科学院植物研究所的紫草细胞大规模培养。华中理工大学的红豆杉细胞大规模培养, 上海中医药大学胡之璧 (2002) 的黄芪毛状根大规模培养等。
生物技术的发展给制药业带来了新工艺, 例如各种层析技术特别是亲和层析技术, 已用于制药生产, 并带来了明显的收效。应用细胞工程技术已培养成功了多种菌类中草药, 周斌 (2004) 报道冬虫夏草、灵芝等, 使一些名贵的中草药可以用发酵的方法生产出来。细胞培养不仅可以保存和繁殖濒临灭绝的野生药用植物资源, 还可以大量生产临床上急需的紧缺的中药材, 而且还可以改进现有药材的品质。高山林等 (1992) 研究了培育优质品种的新途径, 他们用秋水仙碱诱导出丹参四倍体, 经染色体鉴定为同源四倍体, 试管苗移栽后, 发现其主要化学成分含量大大高于原 (二倍体) 植株。张荫麟等 (1995) 用根癌农杆菌感染丹参无菌苗获得冠瘿组织, 并发现B5和MS培养基有利于冠瘿组织的生长, 而6, 7-V和WP培养基则有利于丹参酮的合成。Chen (1999) 等用发状农杆菌的ATTC15834株系转化丹参胚细胞产生发状根, 发状根可产生丹参酮类和酚酸类两类化合物。
3 植物细胞生物反应器在药用植物次生代谢物生产中的应用
雷光富等 (1998) 认为, 药用植物细胞生物反应器技术以药用植物细胞或组织的大规模培养为基础, 它根据“植物培养细胞次级代谢全能性”的理论, 将药用植物细胞培养技术引入有用化学物质生产, 把细胞作为一个“活的工厂”, 通过对细胞进行固体或液体悬浮培养, 大量生产次生代谢产物。我国药用植物细胞培养的大规模研究是在20世纪70年代中期以后, 大量培养直接生产药用物质的研究工作取得了很大的成绩。一些重要的药用植物如人参、西洋参、黄连、长春花等植物细胞培养都十分成功, 经过筛选, 产生出相对几倍或几十倍于该植物完整植株所产生的代谢产物。据统计, 有40余种化合物在细胞培养中的含量超过了原植物。目前, 已建立适于不同植物组织培养及大量生产的新型生物反应器并进行优化控制。
邢建民等 (1997) 在2000L搅拌式生物反应器上进行了人参根组织培养生产人参细胞, 随后又在20000L生物反应器上成功地进行了每月100kg的人参愈伤组织的培养。采用20L气升式生物反应器培养西藏红豆杉, 反应器中紫杉醇总量 (细胞内+细胞外) 最高达20.84mg/L (第23天) , 约为摇床培养 (10.37mg/L, 第28天) 的2倍。刘涤等 (1997) 报道熊果甙是人类皮肤中黑色素合成的有效抑制剂, 利用毛曼陀罗、长春花和蛇根木的培养细胞进行的生物转化取得了成功, 其产量分别为3天7.1g/L、4天9.2g/L、7天18g/L, 已经达到化学合成的产量, 也有希望成为商业化的产品。但由于多数生物转化反应的效率较低, 能够达到工业化和商业化的例子还不多见, 这方面仍有待进一步研究。
4 小结
今后研究的主要方向集中在价值大且濒危的药用植物的组织细胞培养, 对次生代谢产物的产生进行调控, 一些重要中药化学成份的生物转化。植物组织培养这一技术在中草药方面应用的前途是无限广阔的, 它不仅有利于探讨和阐明药用植物生理、遗传和成分生物合成等一系列理论问题, 而且一旦工业化生产问题得到解决, 将可以为防病治病做出很大的贡献。利用组织培养生产药用成分, 探索天然药物生产工业化的途径是当前药物生产的一个新方向, 随着大规模人工培养技术的成功, 就有可能用组织培养法来代替全植物提取有效成分, 这项工作将是未来研究植物药的中心课题之一 (张永乐, 2005) 。
摘要：综述了近年来生物技术在我国药用植物次生代谢产物方面的应用进展, 包括植物组织、细胞培养产生次生代谢产物, 发状根培养生产次生代谢产物, 植物细胞生物反应器在药用植物次生代谢物生产中的应用概况, 并提出了该领域存在的问题和发展方向。
关键词：生物技术,药用植物,次生代谢产物,应用进展
次生代谢 篇2
作 者：齐凤慧 詹亚光 景天忠 QI Feng-hui ZHAN Ya-guang JING Tian-zhong 作者单位：齐凤慧,詹亚光,QI Feng-hui,ZHAN Ya-guang(东北林业大学生命科学学院)
景天忠,JING Tian-zhong(东北林业大学林学院,哈尔滨,150040)
次生代谢 篇3
1 材料与方法
1.1 供试菌株
供试花脸香蘑由贵州省生物研究所菌种室馈赠子实体, 分离, 纯化菌种, 编号为Lps-93001。
1.2 试验方法
发酵提取物样品制备:将菌种Lps-93001 接于液体培养基中, 液体培养基为土豆200 g, 酵母膏4 g, 蔗糖20 g, KH2PO43 g, Mg SO41.5 g, p H=6, 配制1 000 m L。转速为120 r/min, 24 ℃条件下培养14 d, 过60 目筛, 蒸馏水洗3 次, 培养液用150 m L CH2Cl2提取2 次, 蒸干, 备用。
对照样品制备:液体培养基, 土豆200 g, 酵母膏4 g, 蔗糖20 g, KH2PO43 g, Mg SO41.5 g, p H=6, 配制1 000 m L。液体培养基用150 m L CH2Cl2提取2 次, 蒸干, 备用。
1.3 仪器及分析条件
试验所用的仪器为日本SHIMADZU (岛津) 公司生产的GCMS-QP2010。 采用OV-1701 型色谱柱, 柱的长度为30.0m, 内径250 μm, 膜厚0.25 μm。载气为氦气, 恒流方式, 流速0.5 m L/min。初始温度为50 ℃, 以10 ℃/min的速度将温度上升到260 ℃, 维持这个温度20 min。进样口的温度保持在260 ℃, 采用流进样的方式进样, 分流比为20∶1。毛细管柱与质谱的接口温度为230 ℃。进样量1 μL, MS离子源温度200℃, 质谱延长时间5 min, 电压1.20 k V。从10~550 质量扫描, 数据分析采用提取离子方式。数据库为NIST147.LIB。
2 结果与分析
发酵液提取物中共分离了19个主峰, 如图1所示, 对照品培养基提取物中气相色谱共分离了16个主峰, 如图2所示。根据质谱图谱分析和NIST147标准质谱图库并结合人工解析[6,7], 确认了发酵液提取物中确定了16个成分, 对照品培养基提取物中的14个成分。已鉴定出的各成分的名称见表1、2。
3 结论与讨论
试验结果表明, 在发酵液提取物与对照培养基提取物不同组分为Pyrrolo[1, 2-α]pyrazine-1, 4-dione, 1, 2-Benzendicarboxylic acid, 2-Chloro-4, 5-dimethoxybenzaldehyde, 1-Decanol, 5-Chloro-2-methoxybenzoic acid, 2, 6-Dichlorophenylisothiocyanate, 1-H-3α, 7-Methanazulen-5ol, Benzenemethanol, Geranic acid, Cyclo- (1-leucyl-1-phenylalanyl) , 这些物质为该菌株发酵的次生代谢产物, 其中组分2, 6-Dichlorophenylisothiocyanate, Pyrrolo[1, 2-α]pyrazine-1, 4-dione, 5-Chloro-2-methoxybenzoic acid, Geranic acid, Cyclo- (1-leucyl-1-phenylalanyl) 相似度小于80, 解析可能有一定误差。对照品培养基提取物中的桉油精Eucalyptol, Benzylmalomic acid, Benzoic acid, Diethl Phthalate, 1, 2-Benzenedicarboxylic acid, 3-Benzyl-6-isopropyl-2, 5-piperazinedione, 1- (Decylsulfonyl) -1-deoxy-d-mannitol被菌丝体吸收利用。对照品培养基提取物与发酵液提取物相同的组分为2-Piperidinone;dlAlanyl-1-leucine;1, 2-Benzendicarboxylic acid;Piperazine-3, 5-dione;Pyrrolo[1, 2-α]pyrazine-1, 4-dione;2, 5-Piperazinedione, 在发酵液提取物中13和14是同一组分, 为2, 5-Piperazinedione, 可能是计算机根据质谱与相似度得出的分析结果, 其中可能还会有其他的组分, 有待于今后进一步的分离纯化。