微生物代谢组学（共9篇）
微生物代谢组学 篇1
摘要：人类基因组测序工作完成后,代谢组学正成为后基因组时代生命科学研究领域的研究热点。代谢组学的兴起本身对分析方法提出重大挑战,本文介绍安捷伦的超高解析度的6500系列Q-TOFMS与功能强大的生物信息学软件Mass Proffler Professional(MPP)为多领域代谢组学研究提供的全流程解决方案。
关键词：Agilent 6500 Q-TOF MS,代谢组学,Mass Profiler Professional
前言
代谢组学是考察生物体系受刺激或扰动后(如将某个特定的基因变异或环境变化后)其所有小分子代谢产物的变化或其随时间的变化,来研究生物体系代谢途径的一种技术[1]。目前代谢组学在疾病诊断、毒理、植物、营养学等领域有着广泛的应用。代谢组学研究的流程主要包括代谢谱差异分析、潜在生物标记物鉴定及代谢通路分析。
在代谢组学分析的各种技术手段中,LC/Q-TOF MS作为一种先进的分离分析技术,在众多分析方法中脱颖而出,尤其对于非靶标代谢组学分析,其强大的定性分析能力使之被公认为最好的复杂样品分析技术之一,已经被广泛应用于代谢组学的研究领域中。代谢组学是一种系统研究手段,通过数据采集得到的是多维、大量的信息,必须应用化学计量学的手段对这些信息进行提取,进而找出有意义生理学信息。
1 安捷伦完整代谢组学解决方案简介
对于代谢组学分析,安捷伦科技可提供业内代谢物组学研究最完备的分析平台—包括GC、LC、CE、GC/MS、LC/MS和CE/MS等,同时可提供强大的数据处理及软件工具包用于代谢物鉴定、定量和统计分析。安捷伦6500系列Q-TOF MS质谱仪结合安捷伦全新推出的生物信息学软件Mass Profiler Professional(MPP)可以为代谢组学中生物标识物发现及确认提供最全线的解决方案,从而应对代谢组学对分析方法提出的重大挑战。本文将重点对6500 Q-TOF结合MPP软件方案进行详细探讨。
图1为安捷伦Q-TOF MS代谢组学研究平台的示意图。安捷伦代谢组学研究平台包括完整的硬件和软件解决方案,覆盖从样品的分离和检测、代谢物的特征提取、代谢谱的差异统计分析、潜在生物标记物的鉴定及到代谢通路分析的整个分析流程。
1.1分离和检测一6500系列超高解析度飞行时间质谱(Q-TOF MS)
1.1.1安捷伦质谱发展历程简介
安捷伦公司具有悠久的质谱研发历史,从1971年5930 A世界第一台单四极杆气质联用仪开始,近40年来安捷伦在质谱研究与发展的道路上不断开拓创新并推陈出新,在带给用户市场更好的技术及产品的同时,也积累丰富宝贵的质谱经验。过去10年中,安捷伦公司在液质领域中便有近200项技术专利,不但在数量及质量上居众多专业质谱厂家之首,也从而凭借事实及实力逐步成为液质市场的领导者。
在液质领域,目前安捷伦公司可提供全系列的四极杆及飞行时间质谱,如单四极杆液质、三重四极杆液质、飞行时间质谱、四极杆-飞行时间质谱等,根据不同的分析需求,上述质谱系统可为分析人员提供最佳的解决方案。目前安捷伦液质联用系统应用领域遍及药品研发、药代动力学、中药与天然产物分析、临床研究、食品安全监控、环境监测、法医与毒物分析、基因组学、蛋白组学和代谢组学等领域。
此外,安捷伦公司对用户的支持服务十分重视。拥有一批规模庞大、经验丰富的维修及应用支持队伍,为用户解决安捷伦分析仪器的应用操作及保修难题,使他们能充分发挥仪器的性能和效率。这也是安捷伦公司连续多年在市场调查中,名列最佳用户满意度公司的重要原因。由于安捷伦公司是唯一能提供从色谱分离、质谱检测、到数据采集处理的计算机工作站,打印机一体化设计的生产厂家,故更加能够有效保证系统的兼容性和维护服务。
2.1.2安捷伦超高解析度四极杆-飞行时间质谱(Q-TOF MS)简介
2006年,安捷伦液质联用平台全面整合至6000系列产品,其中6500系列四极杆-飞行时间串联质谱(Q-TOF MS)兼具高度的质量精确性和高分辨率、高灵敏度,以及远远超过其它四极杆-飞行时间串联质谱(Q-TOF MS)系统和轨道阱质谱仪的超宽谱图内动态范围。针对药物杂质定性、食品安全筛查、代谢组学和蛋白质生物标志物等复杂样品分析,6500系列四极杆-飞行时间串联质谱(Q-TOF MS)提供用户所需要的轮廓谱分析、鉴定、表征,甚至定量等各种先进功能。
2009年第57届美国质谱年会(ASMS)上,安捷伦公司隆重推出业内超一流性能的超高解析度高分辨质谱(Ultra High Definition(UHD)AccurateMass Q-TOF)。超高解析度飞行时间质谱采用全新设计理念,从独特的离子聚焦技术、离子光学系统、特殊材料的飞行管设计,到高速电路、双增益处理器以及4 GHz ADC离子检测器等独一无二的整体设计,使得该系统能够完美实现超高灵敏度(fg级)、超高分辨率(40000)、超高质量精度(500ppb)以及超快数据采集速度的最佳平衡,并以此建立高清质谱新标准。其BSA酶解产物检测灵敏度可至400 attomole。该系统可与UHPLC完美匹配,获取高品质MS和MS/MS数据而不会引起分辨率损失。其主要技术特点及优势如下:喷射流离子聚焦技术(Agilent Jet Stream Ion Focusing Technology):专利的喷射流离子聚焦技术实现质谱灵敏度的革命性突破。利用该技术,质谱灵敏度可实现数量级的提高,对于很多难以检测的化合物,其灵敏度更是突破fg级水平,从而对药物代谢与药代动力学、食品/环境安全监测、蛋白质组学/代谢组学等复杂基质中痕量化合物的精确定性定量分析提供强大的技术支持,喷射流离子聚焦技术为UHD Q-TOF MS的超一流灵敏度性能提供关键的技术基础。
Ion Beam Compression (IBC)和Enhanced Mirror Technology (EMT)技术:该专利的创新技术巧妙实现离子束的空间压缩、冷却及整形,使得质谱的精确度和分辨率在实现本质提高的同时,可依然保持台式布局。采用上述技术后,安捷伦6538/6540 Q-TOF MS(见图2)在不牺牲灵敏度(fg级)和动态范围(5个数量级)的情况下,分辨率及质量精度可分别达到40000ppb和500 ppb,尤其可确保低质量端的高分辨率及高质量精度,除传统的生物大分子分析外,对食品、药品及环境等小分子分析亦能进一步提高结果的准确性和可靠性。
4GHz高速检测器和模数转换离子采集模式(ADC技术):4GHz高速检测器和ADC技术源于Agilent电子测量部门领先全球的高速示波器技术,ADC技术使质谱检测器可检测并采集所有到达检测器的离子信息,相对于传统Q-TOF MS所采用的时间数字转换模式(TDC技术),ADC技术具有明显的优势并有效弥补TDC技术的固有缺陷,从而实现更宽的扫描内动态范围、更高的质量准确度和更高的质谱分辨率。
与最新芯片-液相色谱系统(HPLC-Chip)无缝联接:随着分离技术的快速发展,微流控技术已成为目前最为先进、高端、热门的分离手段之一,安捷伦芯片液相色谱成功地让上述理念成为现实。插拔式的色谱柱技术彻底消除传统纳流液相色谱/质谱的不足。从微量样品的多肽到小分子样品的定性定量分析,液相色谱-芯片/质谱技术提供
可靠、重现以及超高灵敏度的分析结果。该系统与MS联用,可在最小样品量的情况下使灵敏度水平达到2～3个数量级以上的飞跃;针对不同的分析领域安捷伦可提供10余种不同特点芯片供选择使用,使系统优势得到最大程度的发挥,并获得最佳的分析结果。HPLC-Chip与UHD Q-TOF MS技术联用具有许多传统LC/Q-TOF MS无法实现的优势,结合强大的软件及数据处理工具,已然成为复杂体系分析不可替代的利器。
1.2 特征提取-安捷伦MassHunteir质谱工作站
安捷伦的MassHunter质谱工作站软件包含专利的分子特征提取(Molecular Feature Extraction MFE)功能,可以自动化地实现对高分辨质谱LC/TOF MS及LC/Q-TOF MS数据的化合物特征提取。图3为MFE功能示意图。MFE归纳化合物在质谱图中所有的相关离子(加H+、Na+或K+等各种加合离子、多聚体及同位素离子等)并自动化的进行数据提取,最终实现背景过滤,将包含在总离子流图中所有的代谢产物尽可能全部提取出来,并生成后续代谢谱差异分析所需的包含m/z、保留时间及丰度信息的三维数据文件。
1.3 统计分析-鉴定-代谢通路分析——安捷伦生物信息学软件MPP
安捷伦全新的生物信息学软件MPP集成代谢谱的差异统计分析、潜在生物标记物的寻找、潜在生物标记物的鉴定(ID Browser)及代谢通路分析(Pathway Analysis)等诸多功能。MPP结合安捷伦优异性能的仪器硬件平台可以为代谢组学研究提供最全线的解决方案。MPP能够对来自大样本组的GC/MS、LC/MS及CE/MS数据中的保留时间和丰度进行标准化;用一系列实用的统计分析和图形化工具(包括1-way和2-way ANOVA、PCA,以及分类预测算法)进行数据分析;用内置的ID Browser功能采用METLIN和Fiehn等安捷伦代谢组学数据库进行检索及利用精确质量数进行分子式生成来实现代谢物的鉴定;用内置的代谢通路分析工具Pathway Analysis进行代谢途径中大小分子的相关性分析,并利用已有数据构建新通路;从而识别样品之间的差异和关联,最终实现快速发现疾病或药物毒性等研究中的生物标志物(见图4)。
1.4安捷伦特有的代谢物数据库及谱库介绍一METLIN,Fiehn库
在非靶向代谢组学实验中,代谢物的鉴定是关键步骤。用化合物的精确质量数进行代谢物数据库检索,可以缩小筛选范围,大大加快代谢物的鉴定过程。安捷伦METLIN代谢物数据库是当今世界上最全面的代谢物数据库之一,它包含23000多种内源性和外源性代谢物、二肽和三肽的精确质量数、化学式和结构信息。除可采用精确质量数进行检索外,还可以同时采用质量数和保留时间共同检索以增加检索的可靠性。此外,还可以根据关键词、分子式、化合物名称,或KEGG、CAS、HMP或METLIN编号进行信息查询。METLIN代谢物数据库可以支持单一化合物检索,也可以支持批处理文件检索。
目前安捷伦正在扩展METLIN代谢物数据库的谱库检索功能,可以利用代谢物的MS/MS质谱图进行谱图匹配检索。此外,安捷伦独有的保留时间锁定代谢物谱库Agilent Fiehn Metabolomics Retention Time Locked Library可灵活方面地用于GC/MS分析,该库为第一个代谢组学研究的代谢物标准商业数据库,包括内源性代谢物鉴定。
2 应用实例
采用安捷伦6500系列Q-TOF MS代谢组学研究平台可以为代谢组学各个研究领域提供解决方案,下面将从中医药代谢组学、疾病诊断代谢组学及植物代谢组学等几方面的应用进行介绍。
2.1 中医药代谢组学
将代谢组学用于中医药领域对实现中医药客观化、规范化和科学化研究有着重要的指导意义,新兴学科代谢组学的出现,给中医药复杂理论体系的研究、中医药现代化提供强有力的研究手段。中医病证引起代谢物组的共性分析和生物标记物的发现,可促进深层次理解中医脏象理论,预测疾病的发生,整体性评价中药复方综合疗效、安全性和作用机制[2]。专家认为,运用具有反映整体思想的、先进的代谢组学方法来研究中药,对搞清中药的物质基础、作用机理、作用靶标、药效作用、组方依据、配伍规律和毒副作用以及对中药种质资源等进行的研究都是十分必要的。
本实例采用安捷伦6500系列Q-TOF MS结合MPP软件进行生物学信息挖掘,研究代谢组学在中医“上火”证候模型复制中的应用。
动物实验:将附子、干姜、肉桂按照比例混合作为温热方剂“上火”阳性药物。雄性SD大鼠20只,随机分为空白组和模型组,每组10只。空白组给水,模型组给阳性药。检测体重、尿量、饮水量和肛温,每天收集尿液,连续监测2个月。尿液样本离心取上清-20℃保存,分析前室温融化,加水稀释,过滤膜进样。
数据采集:安捷伦1200 RRLC/6520 Q-TOF MS。数据分析:原始数据用MassHunter软件进行分子特征提取,生成的文件导入MPP进行化学计量学分析。
采用主成分分析方法(PCA)对样本数据进行分析,其中空白组、给药第1天、给药第20天及给药第35天的PCA分析结果(见图5)。
♦空白;■给药第1天;▲给药第20天;●给药第35天
从图5中可看出,4组不同时期样本在PCA空间可以清晰的分为4类,说明大鼠给温热方剂后,模型动物尿液代谢物组发生显著变化,与空白组比较明显被分类,暗示给予温热方剂后模型组大鼠正常生理代谢被干扰。模型组动物随着给药时间的增加,代谢产物的变化随之增强。其中给药后第一天,内源性代谢物即产生显著变化,与空白组区分明显。这种趋势到给药第35天,可以看出更加显著。代谢组学分析的结果和实验过程中肛温变化的趋势相吻合,实现对“上火”模型的复制研究。后续代谢通路分析表明,模型动物体内的尿酸循环发生代谢扰动。
通过本实验的研究,为中医模型建立的评判提供更为客观的科学支持,为推进中医药的现代化研究提供解决方案。
2.2 疾病诊断代谢组学
疾病诊断代谢组学通过分析体液组成,运用化学计量学方法对疾病组和正常组进行分类,获取因疾病诱导而发生变化的特殊代谢产物——生物标记物,帮助了解病变过程中机体代谢情况的改变,辅助临床诊断和治疗[3,4,5,6]。
本例以疟疾研究为例,探讨安捷伦代谢组学平台在疾病诊断中的应用。
疟疾(Malaria)是被疟蚊叮咬后感染疟原虫所引起的虫媒传染病,疟疾会导致体内红细胞感染疟原虫。为研究疟疾的发病机理及发病后对人体代谢的影响,采用代谢组学的研究手段研究空白组和感染组的代谢样本。采用PCA对两组样本进行分析,PCA的分析结果(见图6)。
图6中可看出,对照组与感染组样本在PCA空间可以显著的分为两组,用MPP内置的IDbrowser功能对潜在的生物标记物进行METLIN数据库检索及分子式生成,将鉴定的生物标记物进行代谢通路pathway分析,发现疟疾会导致尿素循环异常(见图7)。本实验的研究结果与文献报道一致。
2.3 植物代谢组学-食品真伪鉴定
利用代谢组学获取植物成分的指纹图谱,并利用模式识别比较样本的指纹差异,可以用于食品的真伪鉴定。
本实例选用葡萄酒为研究对象,利用代谢组学的研究手段鉴别不同的葡萄酒类型。
样本的获取:从市场上选购45瓶不同类型的葡萄酒,其中赤霞珠15瓶、梅洛16瓶、黑比诺14瓶。
数据采集:Agilent 1200 RRLC/6530Q-TOF MS,红酒样品无需样品前处理直接进样分析。
数据分析:原始数据用MassHunter软件进行分子特征提取,生成的文件导入MPP进行化学计量学分析。
采用偏最小二乘法PLSD随机将葡萄酒样本分为训练集及测试集进行建模和模型预测能力评价。图8是PLSD的分析结果,从图8中可看出,3种不同的葡萄酒样本实现显著的分组,进而可以用来区分不同品种的葡萄酒种类。通过精确质量数进行数据库检索和分子式生成,在发现的潜在的生物标记物中,鉴定出其中最为显著的潜在生物标记物为花青素,表明其中赤霞珠、梅洛及黑比诺葡萄酒中花青素的含量存在显著的差异。
红色:赤霞珠;蓝色:梅洛;褐色:黑比诺
3 结论
安捷伦6500系列Q-TOF MS保证代谢组学分析所要求的高质量精度、高重现性及高耐受性的要求,功能强大的MPP软件集成统计学分析、潜在生物标记物鉴定及代谢·通路分析完备的功能。从分离检测、数据处理、统计学分析到化合物鉴定、通路分析及生物学解释,安捷伦代谢组学平台可以为代谢组学各个研究领域提供全面、强大的解决方案。
参考文献
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微生物代谢组学 篇2
中医的“证”是辨证论治的起点和核心，本质的含义是指在疾病的发生、发展过程中,一组具有内在联系的、能够反映疾病过程在某一阶段的病理病机，是机体对体内外各种环境变化和致病因素作出反应的一种功能状态。如何从整体状态上来系统把握“证候”的病理生理学改变，一直以来都是困扰着中医证候质的研究，代谢组学的出现为中医证候实质的研究提供了可能。两者均是从机体的整体变化的角度进行分析。代谢组学属于全局系统生物学研究方法，这种思想与传统中医药强调人与社会环境的整体观，辨证施治等思想是十分吻合。代谢组学改变了单一标记物检验的传统思路，以一组代谢物群体作为标记物来诊断疾病，使得“证”的研究可以和系统生物学方法相结合，证候客观化研究得到了方法学上的.支持。代谢组学高通量、高灵敏性的检测及分析方法特，为从代谢网络变化的角度探究区分证型提供了方法学与技术支持 。
不同的中医证候，其代谢产物谱存在着显著的差异。在代谢组学的研究中，通过检测不同时间患者体液中的所有代谢产物，将能够确定不同的证所对应的代谢物的特征模式，使证得到客观、定量的描述，从而促进中医证候实质的研究 。
3 已开展的中医证候研究
蒋海强等采用1HNM结合主成分分析方法研究高血压病肝阳上亢证患者和健康志愿者的血液成分谱差异。研究发现与健康志愿者作比较，高血压病肝阳上亢组患者机体相关代谢发生显著变化，体内部分氨基酸代谢和葡萄糖代谢明显异于健康志愿者，为理解高血压病肝阳上亢证的证侯本质和诊断该类病证提供了科学依据[1]。华何与等对18例健康人、18例冠心病心绞痛血瘀证患者(6例气滞血瘀证、6例心血瘀阻证、6例气虚血瘀证)的血浆样本进行氢核磁共振检测。 通过偏最小二乘判别分析方法研究各组之间的血浆代谢产物谱差异。结果为各组血浆1H NMR谱的PLS-DA结果显示，心绞痛血瘀证患者与健康人相比有显著性差异。气虚血瘀证组与其他两个血瘀证组差别较大，而气滞血瘀证与心血瘀阻证差别不明显。实验表明代谢组学方法对于研究冠心病心绞痛中医证候具有重要价值[2]。
王伟明等用NMR波谱仪对肝气郁结证大鼠尿液检测，探讨肝气郁结证对大鼠体内尿液小分子内源性代谢物的影响，从整体的角度来阐述肝气郁结证的生物学本质。结果显示模型组大鼠尿液马尿酸、α-酮戊二酸等化合物的含量降低，肌酸酐、丙酮等谱峰相对积分面积明显增高，在尿液中的含量显著升高。从而初步得到肝气郁结证模型组与正常组大鼠的的代谢表型与差异性代谢物，阐述肝气郁结证的生物学本质[3]。简维雄等运用GC-MS法对32只大鼠(模型组、空白组、养心通脉方组、假手术组)进行血浆代谢组学研究。结果显示模型组全血黏度、血浆黏度指标高于其余3组,具有显著性差异;大鼠血浆样品散点图显示模型组与空白组、养心通脉方组、假手术组完全分离。养心通脉方干预后代谢物含量、血液流变学指标均不同程度的回调。研究表明,心血瘀阻证大鼠血浆代谢产物的模式变化与反映“血瘀”病理的血液流变学指标的改变具有一致性，提示发生改变的乳酸、丙氨酸等8种代谢物有可能作为心血瘀阻证代谢性生物标志物，将有助于彻底揭示心血瘀阻证候的本质[4]。
结语
代谢组学之父 Nicholson教授认为用代谢组学的方法来对比分析服用中药、采用中医疗法前后人的体液所存在的不同，证实中国传统中医中药的疗效，已成为系统生物学研究中医药的重要手段，并有可能成为中国传统医学走向国际化的通用语言。代谢组学与有着几千年历史的中医学在许多方面有相近的属性，如果代谢组学运用得当，可以挖掘中医学的内在规律，特别是对中医证候本质的研究将会更加客观化、标准化，使中医学得到真正的发展和继承。
参考文献
[1] 蒋海强，马斌，聂磊，等.高血压病肝阳上亢证患者血清样品的核磁共振谱代谢组学研究[J].药学实践杂志，,28(4)：258-261
微生物代谢组学 篇3
随着畜牧业的快速发展, 畜禽营养代谢病在养殖业出现了高发状态, 且因为其发病机理的复杂性以及治疗困难, 逐渐受到研究者们的重视。目前, 人们对动物营养代谢病的研究, 主要在表观的症状和防控治疗方面。如何更加深入地了解营养代谢病的发生和发展机制, 并应用于临床防治中, 成为了畜牧业有待攻克的难题。
代谢组学技术的出现, 将人们对病理表观的认识和代谢物分子动态变化联系在一起。代谢组学可从分子水平更系统全面地揭示疾病病理变化和发病机制, 发现由疾病过程引起的代谢异常, 以及各代谢性疾病之间的关联, 为疾病的预防和治疗提供理论基础, 还有助于疾病生物标志物的发现并辅助临床诊断与治疗的目的。代谢组学来源于代谢组[1], 是以组群指标分析为基础, 以数据处理为手段, 以信息建模整合为目标, 通过对机体代谢产物在时间上的定量和定性分析, 从总体上评价生命体的功能状况及其改变[2]。代谢组学所研究的是相对分子质量小于1 000 的代谢物[3], 与其他组学相比, 代谢物含量的微细变化与生物表型的大改变有直接相关性[4]。根据研究的对象和目的的不同, 2001 年Taylor等[5]将代谢组学分为4 个层次: (1) 代谢物靶标分析 (metabolite target analysis) :对某个或某几个特定的样品组分分析。 (2) 代谢轮廓 (谱) 分析 (metabolite profiling analysis) :定量的对少数所预设的目标代谢产物进行分析。 (3) 代谢组学 (metabonomics) :对限定条件下的特定生物样品中所有代谢组分的定性和定量。 (4) 代谢指纹分析 (metabolite fingerprinting analysis) :不分离鉴定具体单一组分, 而是对样品进行快速分类。鉴于代谢组学技术上述特征, 本文通过对近几年代谢组学在动物营养代谢病中的应用进行综合论述, 为今后动物营养代谢病的研究提供理论依据。
2 分析技术平台
根据研究目的和研究对象的不同, 代谢组学的技术程序和分析方法也各有不同, 但一般都包括以下几个流程:样品的采集和预处理、样品的配制与检测、数据的处理和分析、代谢标志物识别和生化途径分析等[6]。目前, 代谢组学中最为常用的是液相与质谱联用技术 (LC-MS) 、气相与质谱联用技术 (GC-MS) 和核磁共振技术 (NMR) 三种分析技术。通过这三种分析平台将代谢组学对小分子代谢物的分析分为目标分析和非目标分析[7]。
2.1 核磁共振技术核磁共振主要是由原子核自旋运动引起, 根据电子绕原子核运行所产生的屏蔽效应可作出NMR图谱。其中, 1H NMR是目前疾病监测研究中的主流技术手段, 人们通过目标质子与参照物质中相对应的质子之间共振频率的差异 (百万分之一) 来确定1H NMR的化学位移。
NMR分析技术具有多重优点:针对样品检测无偏向性, 且预处理简单、对样品损伤性小, 因此可较全面的对样品进行定性检测;但由于其灵敏度较低, 因此不适合分析大量低浓度代谢物。
2.2 气气相相色色谱谱-质谱联用技术气相色谱-质谱联用技术是将色谱仪与质谱通过适当的接口相结合完整的分析仪器[8]。其原理是样品主份不同, 各主份通过色谱柱进入质谱分析仪, 样品被离子化经过电场或磁场的筛选, 通过样品的质谱和相关信息, 可以得到样品的定性定量结果[9]。
气相色谱-质谱联用技术可提供较高的分辨率和检测灵敏度, 并且有可供参考、比较的标准谱图库, 可以方便地对相对质子质量小于800 的热稳定、易挥发性含羟基、羧基、氨基和亚氨基等基团的极性强的化合物或处理后具可挥发性的样品定性结果[10]。但由于GC-MS只能对其中的挥发性组分实现直接分析, 从而得不到体系中难挥发的大多数代谢组分的信息。而且样品准备工作比较繁琐, 因此, 常常作为其他的辅助检测技术。
2.3 液液相相色色谱谱-质谱联用技术液相色谱-质谱联用技术主要由液相色谱系统 (LC) 和质谱仪 (MS) 等部分组成。其基本原理是液相色谱对所检测物质进行分离, 然后通过质谱来鉴定, 具备LC的特性 (如分辨率高、灵敏度高) 和MS的特点 (如测序速快、精确度高) 。
液相色谱-质谱联用技术适用于那些热不稳定、不易挥发、极性更大、不易衍生化合分子量较大的物质。相对于其他组学, LC-MS具有较高的灵敏度和选择性; 多种柱效结合分析 (如C18, Amid, HILIC, T3, Phenyl) , 也使样品的分析范围广泛;善于定性定量分析。但LC-MS需要标准品以及独立的数据库, 致使其分析能力受到了限制。
通过代谢组学分析技术平台对样品进行一系列处理后, 需要对各种分析手段 (NMR、LC-MS和GC-MS) 各自的特点, 进行相应的算法对原始谱图的数据进行提取、峰对齐[11]、去噪[12]等处理。然后需要对这些数据进行分析, 挖掘隐含于其中的有用信息。数据分析包括无监督模式识别方法和有监督识别方法, 无监督模式识别:该方法用于从原始谱图信息或与处理后的信息中对样本进行归类, 并釆用相应的可视化技术直观地表达出来。该方法将得到的分类信息和原始信息进行比较, 建立代谢产物与原始信息的联系, 筛选与原始信息相关的一些标记物, 进而考察其中的代谢途径。由于该方法没有可供学习的训练样本, 成为无监督识别方法。主要有:主成分分析[13]、非线性映射[14]、族类分析[15]等, 其中应用最广泛的为主成分分析。有监督识别方法:在已有知识的基础上建立信息组, 利用己知的信息组对数据进行归类、识别和预测分析。由于建立模型时有可供学习利用的训练样本, 故称有监督方法。最常用是主成分分析 (Principal Component Analysis, PCA) 和偏小二乘法 (Partial least squares, PLS) 。PCA在不作任何介入和无任何假设的前提下给出待分析样品的内在区别, 而PLS则有一定的假设。对这些方法, 尤其是指导性方法的选择都是有—定条件的, 也正因为如此使用指导性分析方法时要格外注意假设的基础和成立性。
3 代谢组学在动物营养代谢病中的应用
3.1 在单胃动物营养代谢病研究中的应用肝脏是糖、脂肪和氨基酸代谢的主要场所, 在物质代谢和转运起到了举足轻重的作用, 肝脏发生代谢紊乱及损伤常常导致营养代谢病的发生, 而传统医学通过血液指标对肝脏及代谢过程的监测, 往往不能及时反映机体代谢状态, 而代谢组学通过对代谢物的检测, 为疾病的诊断和挖掘代谢通路提供有力的技术支持。Saitoh W等[16]使用液相色谱技术对小鼠肝脏急性损伤进行分析, 发现当小鼠肝脏受损时, 精氨酸到鸟氨酸代谢途径会受到影响, 并阐明血中精氨酸和鸟氨酸水平有可能成为肝脏急性损伤的潜在标志物。Matsuzaki K等[17]对过量摄入亮氨酸的大鼠血浆代谢组学分析表明, 尿素和小-酮异已酸可能是氨基酸过量摄入时的标识物。Bertram H C等[18]利用基于NMR的代谢组学的方法来探索分别以黑麦或小麦为主的富含纤维的饲粮对高胆固醇血症猪内源性生化效应的影响, 揭示了高胆固醇血症猪摄入高纤维黑麦饲粮后, 血浆碱含量增加, 并找出了评价血浆碱含量的标识物。李民等[19]进行了营养不良大鼠血浆小分子物质代谢组学的研究, 结果表明营养不良组大鼠与正常大鼠相比, 血浆中肉毒碱和色氨酸含量增加, 而甜菜碱、棕榈酰肉碱、亚麻酸、二十二碳六烯酸和花生四烯酸等含量均降低, 因此代谢组学可作为营养不良指标的筛选方法。Kowalski G M等[20]通过饲喂高脂肪日粮对小鼠骨骼肌动员葡萄糖代谢通路的气象色谱-质谱技术分析发现, 骨骼肌动员葡萄糖衍生碳进入三羧酸循环进行氧化, 是通过丙酮酸氢化酶派生的, 而不是通过丙酮酸羧化酶介导的。Noguchi Y等[21]表明用代谢组学的方法可以定量测定氨基酸代谢物, 可估计摄入适量的氨基酸与安全范围, 可研究某种代谢产物与摄入过量的蛋白质、氨基酸的相关性, 以此确定适量安全的氨基酸摄入量。
养殖场对日粮存放不当, 会使饲料组成成分发生改变, 而这对机体的伤害也会导致营养代谢病的高发。Solanky K S等[22]运用基于NMR的代谢组学研究发现, 表儿茶素 (EC) 使SD鼠内源代谢物水平发生明显变化, EC进入体内影响内源性物质的代谢途径, 代谢能力降低, 碳水化合物代谢水平下降, 还可能引起肝脏、肾脏功能改变等。Toue S等[23]通过基于NMR代谢组学技术研究蛋氨酸代谢的标识物, 揭示了高半胱氨酸是监测蛋氨酸是否过量的良好指标。施寿荣[24]利用代谢组学和转录组学共同揭示了脂类物质代谢在腹水综合征肉鸡上发生了异常, 二羟基丙酮可能是低温诱导腹水综合征肉鸡的潜在代谢标志物;甘油磷脂类物质氧化生产溶血甘油磷脂类物质是早期腹水综合征肉鸡发病的重要机制。两种组学研宄手段的结合为系统地阐释AS的代谢特征及其发生机制提供了更加全面的信息。谷类常常受到脱氧腐镰刀菌烯醇的污染, 而猪对其特别敏感, 常常导致猪发生氧化应激, 肠上皮细胞的凋亡, 同时会引起猪能量、脂肪和氨基酸代谢絮乱, 而通过对小猪补充谷氨酸发现, 谷氨酸可减少机体氧化应激, 促进肠上皮细胞的增值, 减少DON引起的代谢絮乱[25]。
另外, 代谢组学也可应用于饲料添加剂对动物的效果研究。He Q等[26]采用基于NMR的代谢组学技术对饲粮中添加精氨酸对生长猪的影响进行了研究, 发现增加饲粮中精氨酸添加量能改变机体脂肪和氨基酸的代谢过程, 提高骨骼肌中蛋白质的合成, 调节肠道微生物的代谢, 显著提高猪的生长性能。Avery L B等[27]对患有脂肪肝的大鼠饲喂丙戊醇发现, 丙戊醇是酰苷酸活化蛋白的新的活化剂, 它可减轻肝脏中脂肪的沉积。
3.2 在反刍动物营养代谢病研究中的应用反刍动物发生营养代谢病主要是由饲养管理不当引起。由于泌乳的需求, 反刍动物机体常常处于能量负平衡状态, 而如何掌控反刍动物对营养物质需求的量成为了当今世界性的难题。随着机体的病理变化, 体液和组织中的代谢产物也产生了相应的变化。代谢组学对这些由疾病引起的代谢产物的相应进行分析, 能够帮助更好地理解病变过程及机体内物质的代谢途径, 还有助于疾病的生物标志物的发现和辅助临床诊断的目的。目前, 已有大量的研究报道利用代谢组学技术来研究动物的各种代谢性疾病的发生过程和结果。Hailemariam D等[28]通过液相色谱质谱分析技术对围产前期和围产后期奶牛进行了分析, 发现肉毒碱、丙酰肉毒碱等三个化合物可能成为预防奶牛围产期疾病的生物标志物。孙玲伟[29]应用1H NMR与GC/MS联用技术, 获得了奶牛临床酮病和亚临床酮病的代谢差异物, 而其中有些代谢差异物可作为奶牛酮病诊断的生物编织物;并全景式地揭示了发生酮病时, 机体发生了广泛的代谢紊乱。Imhasly S等[30]通过液相色谱-质谱联用技术对脂肪肝奶牛代谢标志物进行了分析, 发现29 个差异代谢物。Bertram H C等[31]使用丙二醇诱导奶牛中毒, 使用NMR对奶牛血液和瘤胃液进行分析, 发现丙二醇诱导中毒后, 会导致奶牛呼吸困难血管收缩。肺部血管收缩, 血中血红蛋白氧饱和度显著下降。Saleem F等[32]通过基于代谢组学技术对奶牛饲喂高谷物日粮引起奶牛代谢病的紊乱增加的机制进行了研究, 表明泌乳早期饲喂高谷物日粮会使机体产生大量的炎性因子, 同时引起氨基酸代谢紊乱。李影[33]应用代谢组学的1H NMR技术筛选和确证了Ⅰ型酮病和Ⅱ型酮病的血浆差异代谢物, 不仅验证了奶牛酮病发生过程中糖、脂类和氨基酸的代谢紊乱, 也为今后进一步探究Ⅱ型酮病的发病机制和防治奠定理论基础。
4 小结
微生物代谢组学 篇4
药物毒性作用机制的研究是药物毒理学的首要任务之一。药物一般会直接或间接地使基因表达发生改变，这种改变在代谢物水平上进一步被放大，所以说药物的毒性作用与代谢物的变化紧密相关。代谢组学是在代谢物的整体水平上，利用高通量检测技术检测机体在药物作用后的各种生理生化指标，再结合传统的病理学终点，更深入地了解药物的毒性作用机制。Slim等利用基于核磁共振波谱分析技术的代谢组学方法研究炎症反应与磷酸二酯酶抑制剂（CI-1081）导致的血管损伤的关系时，发现CI-1081组和加入抗炎药的CI-1081组的谱图没有分开，得出是血管损伤而不是继发的炎症反应造成了CI-1081引起的尿代谢组图谱改变。王勇等在研究三聚氰胺影响儿童尿液代谢时也运用了代谢组学法，结果发现三聚氰胺利用肾结石导致的物理性损伤来干扰机体的柠檬酸代谢。因此，我们可将代谢组学应用于三聚氰胺导致的代谢异常的研究及三聚氰胺导致肾损伤的无创检测。
3.2代谢组学在药理学研究中的应用
药物可影响人体的代谢并导致代谢物出现差异，因此可利用代谢组学分析代谢物的组成研究药物的作用机制。药理学的任务主要是研究药效学和药动学，这两个过程在体内是同时进行的且紧密相连。药效学主要研究药物是如何作用于机体的，以阐明药物防治疾病的规律。Kaddurah Daouk等比较了精神分裂症患者经奥氮平、利哌利酮和阿立呢唑治疗前后的代谢谱，并评价这三种抗精神分裂药物对脂类生化代谢的调节作用，发现除了都可以调节脂质代谢外，还各有其特有的效应：机体经奥氮平和利哌利酮治疗后，游离脂肪酸减少，甘油三酯升高，而阿立哌唑却没有这种效果。皮子凤等研究五味子治疗糖尿病肾病的作用机制，发现五味子是通过影响肠内菌代谢、脂肪酸代谢、色氨酸代谢、嘌呤代谢等通路对糖尿病肾病发挥治疗作用，也是采用了基于UPLC-Q-TOF-MS技术的代谢组学方法来分析大鼠血清内源性代谢物的变化而得以实现的。
药动学主要研究机体对药物的处置的动态变化，可为临床合理用药提供科学依据。例如，由于个体间的差异对药物反应也存在差异，为了提高用药安全性和有效性，可根据患者的`个体特征实行个体化治疗。Clayton等曾提出利用“药物代谢组学”的方法来实现给药方案个体化，以大鼠给予扑热息痛做初步的动物实验，结果发现给药后大鼠的组织学检测结果与给药前其尿的生化代谢谱呈显著的统计相关。由此曹蓓等以为：“药物代谢组学”可以作为群体筛选的一个基础，根据个体的特殊情况来预测药物的作用结果，针对性地改变给药剂量或挑选某类药物进行治疗。
综上所述，代谢组学方法应用于药理学研究具有巨大的潜力，对药理学的深入研究有推动作用。
3.3代谢组学在中药研究中的应用
将代谢组学应用于中药研究中，对认识中药产生毒副作用的物质基础、药效作用的物质基础，正确认识用药剂量和疗程、配伍减毒，对中药质量控制和优选资源、实现资源的可持续发展等都很有意义。
中药成分复杂，表现出的低毒性往往会影响中药的使用，而研究药物低毒性的比较全面且灵敏的方法之一便是基于化学计量学的药物代谢组学。吕天等设置空白对照组和以柴胡总皂苷（SS）给药组大鼠，并于给药后的第3天和第5天取其尿液样本，运用UPLC-MS代谢组学技术进行分析检测，获得了以质荷比和保留时间为变量的矩阵数据。结果发现给药累积剂量和肝毒性之间呈正相关，有累积肝毒性和明显的急毒性。
此外，同一药材由于采收季节、生产环境及加工方式等的不同，其所含化学成分的差异可能很大，其药性和临床用途也会有所不同。吴宏伟等利用基于的代谢组学分析方法，建立了能够分析来源于不同地区的姜科植物姜黄（Curcuma.LongaL）块根（中药郁金）和根茎（中药萎黄）的次生代谢产物的方法，利用主成分得分图（Score plot）成功地区分了姜黄的块根和根茎样品，表明块根和根茎的次生代谢产物在表达上是有差别的；利用载荷图（Loading）和t检验（t-test）发现了14种可能是导致姜黄根茎与块根药性差异和临床用途不同的化合物。Yongli Hua等运用代谢组学方法研究了当归经不同方式加工后提取出的多糖的保肝作用机理，结果表明，尽管当归的加工工艺不同，但其提取出的多糖作用机制相似，都是通过干预脂质和氨基酸代谢来发挥护肝作用的。
由此可见，代谢组学在中药研究领域中的应用已取得了很多的重要成果，而且随着代谢组学体系的逐渐完善，将会与中药研究更加紧密。所以代谢组学在中药研究方面的应用前景是不可估量的。
4结束语
近年来，代谢组学发展迅速，在药学研究领域已逐步显示出其独特的优势，然而，作为一门新兴的学科，代谢组学存在很大的发展空间，需要逐步完善，例如在分析技术和研究领域方面都可以继续创新和拓展。在分析技术方面，代谢组学的每种分析技术都有其优势和不足，若将其整合进行优势互补，使分析结果能统一、交叉验证是代谢组学发展的一个趋势。就代谢组学自身而言，代谢产物的标准值数据库也将进一步完善，可参考的价值也越来越大，越可靠。在研究领域方面，代谢组学将广泛应用到药物作用靶点的发现、新药的开发、中药现代化研究等领域，甚至可以深入藏医药基础理论、维吾尔族医药理论及其临床诊疗现代化研究中。以上这些都说明代谢组学具有巨大的发展空间，值得我们去研究，并将其发展和完善。
HPLC在医学代谢组学中的应用 篇5
1 高效液相色谱
1.1 高效液相色谱的定义及发展
HPLC(High-performance liquid chromatography),即高效液相色谱法,是在经典色谱法的基础上,引用了气相色谱的理论;在技术上采用了高压液泵、高效固定相和高灵敏度检测器,因而具备分离效能高、选择性高、检测灵敏度高、分析速度快、操作自动化的特点[1]。这种方法克服了经典液相色谱法柱效相对较低,分离时间长等缺点,从而成为一种高效而快速的分离技术。
由于气相色谱对分析高沸点有机物具有一定的局限性,20世纪60年代,经典液相色谱重新引入了气相色谱的理论和方法,用于分离蛋白质、核酸等不易气化的大分子物质。科克兰(Kirkland)等人研制出世界上第一台高效液相色谱仪,标志着高效液相色谱的时代的开始。1971年,随着《液相色谱的现代实践》的出版,高效液相色谱法从此确立。高效液相色谱问世以来,经过近40年的发展,基础理论、装置仪器和色谱柱等方面的各种研究不断涌现,目前已经成为应用最为广泛分离分析方法之一。HPLC的应用范围广泛,能够用于分析绝大多数的化学和生物样品。据估计,有80%以上的已知化合物需要通过HPLC进行分离分析[2]。
UPLC(Ultra Performance Liquid Chromatogreaphy),即超高效液相色谱是在HPLC的理论和应用基础上发展起来的液相色谱技术。UPLC通过使用小粒径填料和小内径色谱柱提高柱效。2004年,世界首台超高效液相色谱仪由美国Waters公司推出,经过几年的发展和应用,使得液相色谱技术实现了突破[3]。
HPLC是目前最为常用的检测和分离手段,在化工、生物化学、食品科学、医学、药物开发与检测、商检和法检等方面都有广泛的应用,同时还促进了色谱理论、检测技术、数据处理技术以及固定相材料的发展[4]。
1.2 高效液相色谱结构及原理
HPLC主要包括高压泵、进样器、色谱柱和检测器四部分。其中,色谱柱中的柱填料对样品的分离具有重要作用,对于不同的被测样品可以选用相应的柱填料,以获得准确的测量结果[5]。
在高压条件下,溶质在固定相和流动相之间进行连续多次交换,借助溶质在两相间分配系数等区别所引起排阻作用的差别,达到分离不同溶质的目的。液相色谱柱的分离度用下列公式表示:
式中:R——液相色谱柱分离度
n——柱效率,用理论塔板数表示
a——溶剂效率,固定相对某两个混合物分离能力的表征
k——容量因子,平衡状态下组分在固定相与流动相中质量之比[6]
HPLC测定的一般过程为:高压泵使溶剂瓶内的流动相流经进样器、色谱柱、检测器后,成为废液排出;样品由进样器进入,随流动相进入色谱柱,各组分产生移动的速度在经过色谱柱时产生区别,从而得到分离,由流动相携带按照不同次序流出色谱柱,通过检测器转变成电信号,最终形成色谱峰[5]。
UPLC在HPLC的基础上减小了填料内径,其原理基于van Deemter方程[7]:
H=A+B/μ+Cμ (2)
式中:H——塔板高度
A——涡流扩散系数
B——纵向扩散系数
C——传质阻抗系数
μ——流动相流速
由于A与填料颗粒度(dp)成正比,C与(dp)2成正比,因此式(2)可表示为:
H=a(dp)+b/μ+c(dp)2 (3)
显然,塔板高度H与填料颗粒度dq呈正相关,色谱柱柱效(N)与颗粒度(dp)呈负相关,即粒径越小,柱效越高。
又由式(1)可知分离度R与柱效N的平方根成正比,可以证明减小填料粒径能够提高分离度和柱效。
高效液相色谱-质谱联用仪主要由HPLC、接口装置、质谱仪三部分构成。样品经过HPLC的色谱柱分离,不同成分依次通过接口装置进入质谱仪并离子化,根据质荷比分离后转变为电信号,形成质谱峰[8]。
2 HPLC在代谢组学中的应用
代谢组学(metabolomics)是通过分析生物的体液和组织内源性代谢产物谱的变化来研究整体的生物学状况和基因功能调节的分支学科[9]。代谢组学的主要研究对象是各种代谢途径的底物和产物(MW<1000)。利用代谢组学手段发现农兽药等在动植物的细胞和组织的提取液中发现相关生物标志物是一个重要领域。
在代谢组学的研究过程中,以高效液相色谱作为一种分离设备的联用技术被广泛的使用,其中以高效液相色谱质谱联用最为常见。高效液相色谱-质谱联用技术始于20世纪70年代,运用该技术所分析的化合物大多可以跳过衍生化处理阶段,直接在HPLC上进样使其得以分离,所获得的化合物在MS上进行分析,从而获得准确的定性和定量数据。这一技术的运用明显地缩短了分析时间,同时有效地提高了分析的灵敏度和准确性。由于高效液相色谱一质谱联用技术对高沸点、难挥发和热不稳定化合物的分离和鉴定具有独特的优势,因此广泛地应用于食品、医药、生化、环保等各方面[8]。
2.1 基于HPLC联用技术的药物代谢组学研究
抗生素的正常使用可以造福人类,但抗生素的滥用却可能导致一系列的问题产生,如食品安全问题。氯霉素是对革兰氏阳性、阴性细菌均有抑制作用的广谱抗生素。但是,氯霉素对生物体有一定的毒副作用,作为兽用药可能对畜禽产品的食用安全产生影响。王世成等研究了奶牛在经过氯霉素注射后所产出的牛奶,利用液相色谱-质谱(LC-MS)技术进行了分析,高效分离和鉴定了牛奶在氯霉素影响下具有差异的成分,从中筛选出氯霉素作用下影响牛奶成分的内源性生物标记物——单羟基十八碳二烯酸[10]。这项研究结果有助于阐明抗生素对畜禽类产品的食用安全影响机理。
环孢菌素是一种选择性免疫抑制剂,临床上主要应用于器官移植以及免疫发病机理介导疾病的治疗。在使用过程中,环孢菌素具有一定的副作用,可能引起蛋白尿、管型尿、肾小球血栓、肾小管受阻等肾毒性疾病。E.M. Lenz 等使用高分辨率的1H-NMR以及HPLC-TOF/MS法对环孢菌素的代谢组学进行研究[11]。实验中作者使用环孢菌素A制作了一个雄性Wistar大鼠肾毒素模型,每天收集尿液样本中的低分子量的有机分子排泄物,并利用H核磁共振光谱和HPLC-TOF/MS分别进行了研究。结果发现从实验的第七天起,使用核磁共振法检测到葡萄糖、醋酸、三甲胺的增多以及三甲胺- N -氧化琥珀酸的减少,而使用HPLC-TOF/MS则可以检测到犬尿酸、黄尿酸、柠檬酸以及核黄素明显减少。该研究表明,虽然两种方法识别的生物标志物不同,但均能有效的确定肾毒性疾病的产生。
除此之外,HPLC联用技术也可对中药的代谢组学进行研究。中草药中含有的化学成分往往种类众多、结构复杂、含量低,相当一部分稳定性差,采用常规的分离鉴定技术,难度较大。使用HPLC-MS联用技术分析这种相对难以处理的中草药样品,只需进行简单的预处理或样品衍生化,而且测试过程高效快速,检测结果灵敏度高,尤其适用于检测含量低、不宜分离或容易在分离过程中发生变化或损失的成分[8]。
六味地黄丸是应用中药复方治疗疾病的经典名方之一,自宋代创方以来,已有几百年的临床应用历史,其主要功能为滋阴补肾,用于肾阴亏损、头晕耳鸣、腰膝酸软、骨蒸潮热、盗汗遗精、消渴等。研究结果表明六味地黄丸在改善人体亚健康状态,提高免疫力,治疗肿瘤、糖尿病等复杂慢性疾病方面,具有比西药更为独特的优势[12]。Baogang Xie等建立了基于高效液相色谱-紫外检测器(HPLC-UV)联用技术的大鼠尿液指纹图谱方法,通过对该方法的优化后发现该方法具有较好的重复性[13]。结果表明给药组(六味地黄丸,50%乙醇提取物)和角叉菜致炎症模型组具有不同的代谢表型,说明此技术可用于代谢组学研究。
龙胆是一种典型、效果突出的寒性药。其性苦、大寒,具有清热燥湿、泻肝胆实火、清下焦湿热功能,现代药理研究已经发现,龙胆苦苷对肝脏保护、对抗炎症、抗病原微生物及健胃利胆等具有显著的作用。张启云等利用基于HPLC-MS/MS的代谢组学分析方法研究龙胆给药大鼠尿液的代谢物变化,寻找可能的生物标记物[14]。在大鼠给药33天后发现,实验组与对照组的大鼠尿样代谢成分有显著差异,这一成分差异在雄性大鼠中表现得更为明显。结果表明长期给予寒性中药会对实验动物的代谢产生影响,这为进一步阐释吴茱萸的药性研究工作提供依据。
2.2 基于HPLC联用技术的代谢组学在疾病研究中的应用
肿瘤细胞多药耐药(Multidrug Resistance, MDR)是癌症患者化疗失败的主要原因。目前 MDR的诊断主要使用mRNA的基因表达、P-gP免疫测定法以及细胞排染法等,但均不能整体反映肿瘤细胞MDR情况。代谢组学是新兴的前沿科学,运用代谢组学方法研究疾病的发生发展过程与药物作用,有可能促使药学研究产生突破性进展。许多研究发现,核苷及修饰核苷与肿瘤关系密切。为此,赵筱萍等使用离子对反相高效液相色谱法,同时测定人红白血病细胞株K562及耐阿霉素细胞株K562/A细胞内核苷类代谢物的含量,并以此基础对肿瘤细胞核苷类代谢物组进行比较研究[15]。研究结果发现应用该方法分析比较K562与K562/A细胞的核苷类代谢物,结果发现两者的代谢物组存在明显差异。这表明,通过代谢组学分析手段,可深入研究肿瘤细胞MDR,并用于筛选MDR逆转药物。
食物摄入过多或机体代谢的改变引起的体内脂肪积聚过多,能够造成体重过度增长,并引起人体病理、生理改变或潜伏。肥胖能够导致糖尿病的产生,在欧洲,肥胖的检测及治疗是人们经常遇到的难题。为此,Rebecca E. Williams等利用1H-NMR以及HPLC-MS技术对肥胖的代谢组学进行了研究[17]。试验中使用了(fa/fa) Zucker大鼠作为Ⅱ型糖尿病的模型。研究发现两种技术都能够发现雄性和雌性Zucker大鼠生物标记的变化,这些标志物包括牛磺酸、肌酸酐、尿囊素及α-酮戊二酸。结果表明使用HPLC-MS以及1H-NMR都能够有效的检测到Zucker肥胖小鼠与对照小鼠的变化,并提供了可能用于检测的代谢物标记[16]。
2.3 基于HPLC联用技术的其他代谢组学研究
烟草是一种重要的经济作物,卷烟燃烧过程中会产生多种有害物质,因此,吸烟会引起多种心血管疾病和肺部疾病。何智慧等利用高效液相色谱-质谱技术,从代谢组学的观点考察了吸烟对健康男性青年代谢状态的影响[17]。研究过程中有超过1300种代谢产物从尿样中得到检出,并发现和非吸烟人相比,吸烟后尿样的代谢组分种类和浓度发生了一定程度的改变,说明吸烟对人体的整体代谢状态会产生一定的影响。对于健康人群来说,这种影响还不能通过疾病或其他表观状态所感知,只有通过代谢组学手段才能予以区分。以多变量数据为手段进行处理后发现了一些能够体现这种差别的定性潜在生物标记物,其中多数是与脂肪酸和氨基酸代谢有密切关系的小分子物质,这一发现为利用代谢组学研究吸烟对人体代谢产生的影响提供了理论依据。
E. M. Lenz等使用HPLC-MS对由HgCl2造成的肾毒性疾病进行代谢组学的研究,研究发现对雄性Wistar大鼠给药三天后,犬尿酸、黄尿酸、泛酸以及7-甲基鸟嘌呤的量明显减少[18]。虽然E. M. Lenz等仅对由HgCl2造成的肾毒性疾病进行了研究,并未对Hg离子的致病机理进行进一步的探索,但由实验结果可以得出使用HPLC-MS技术可以对剧毒物质的代谢组学进行研究,并使得该技术在环境检测及保护上有较大的应用潜力。
3 HPLC代谢组学应用的问题探索
基质效应(matrix effect, ME)是样品中其他成分对目标分析物测定值的影响,尤其在进行生物样品的ESI-MS分析时,基质效应是评价样品处理方法和检测准确度的重要指标。进行代谢组学研究时,需要在不损失样品的情况下尽量提高检测灵敏度和准确性,因此基质效应是其样品处理方法的重要依据之一。陈艳华等利用一组保留时间分布在不同区域的标准品,考察了采用HPLC-MS方法进行代谢组学研究时,尿液经不同方法处理后的基质效应(绝对基质效应及相对基质效应),发现绝对基质效应的大小影响检测的灵敏度,而相对基质效应显示了方法的可靠性[19]。结果表明直接稀释法的相对基质较小,处理方法简单,不易造成样品损失。同时由于代谢组学研究具有高通量的特点,因此,尿液直接稀释法更加适合运用HPLC-MS方法的代谢组学研究。
目前,以LC-MS为基础的代谢组学的研究方法正处于起步阶段,因此很少有被发表的以LC-MS分析为基础的重复性方法,但这种证明代谢组学数据的严谨性的方法是不可缺少也是至关重要的。影响代谢组学数据重复性的原因有很多,如生物样品的复杂性、仪器的稳定性等[20]。为此,Helen G. Gika等使用标准样品对LC-MS的重复性进行了研究[21]。结果表明注射入该系统的前几针并不具有代表性,应当丢弃,此外还发现信号的重复性依赖于信号的强度。最终根据这些研究结果建立了人类尿液用于代谢组学的研究方法。因此通过对检测数据的质量控制可以使得LC-MS的数据重复性得到保障,尤其是分析某些更为复杂的生物样品如血浆时,虽然使用矩阵法控制的系统平衡调节能够实现一定的重复性,但这种方法并未得到广泛的使用。因此检测分析系统并尽可能的使其运行在较为理想的条件下依然具有重要的现实意义[22]。
4 展 望
高效液相色谱技术作为一种十分有效的分析分离手段,已经广泛应用于石油化工、生物化学、食品卫生、医药工业等领域。多种色谱技术的相互结合简化了实验步骤,缩短了样品准备时间和分析时间,解决以往传统液相检测器灵敏度低、选择性差的缺点,提供的分析结果更加可靠、精确。随着技术的不断进步和实验数据对于准确性和高效性的要求不断提高,超高效液相色谱技术(UPLC)应运而生。UPLC以HPLC的理论和原理为基础,通过低系统体积、小粒径填料及快速检测等全新手段,增加了分析的通量,提高了检测的灵敏度和色谱峰容量,从而有效的拓展了液相色谱在研究和应用过程中的范围,为科技工作者提供了一个更加高效和便利的技术手段[3]。
Onoue S等在研究尼古丁及其代谢产物对排尿功能障碍的影响时运用了UPLC/ESI-MS技术。这项技术成功确定了生物样品中的尼古丁及其代谢产物的水平,进一步揭示了尼古丁对于吸烟人群排尿功能障碍的影响[23]。研究发现,UPLC/ESI-MS的灵敏度高(最低检测限2.5 ng/mL;定量检测限 5 ng/mL),线性良好(r >0.998),准确度高(97.2%～102.8%),精度高(相对标准差小于8%)。表明UPLC技术拥有广阔的应用前景。
吡啶氨基酸异构体锁链素(DES)和异锁链素(IDES)是两种交联分子,用于将氨基酸高分子链结合成弹性蛋白。DES和IDES被发现于尿液中,是慢性阻塞性肺疾病(COPD)的标志。Shiraishi K等人的在分析人类尿液中的DES和IDES的研究中运用了UPLC-MS/MS技术。通过研究发现,UPLC-MS/MS技术运用于测定DES和IDES的过程中具有良好的重现性和稳定性,并且对样品的需求量小,是一种检测慢性阻塞性肺疾病的有效方法[24]。
随着技术的不断改进与发展,高效液相色谱必将在代谢组学的研究领域发挥更加重要的作用,而依托高效液相色谱发展产生的超高效液相色谱技术的继续完善和发展,将会进一步提高液相色谱技术在代谢组学研究中的重要地位。
摘要：代谢组学是20世纪90年代中期发展起来的一门新学科,是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后,系统生物学研究不可缺少的重要基础学科之一。高效液相色谱由于适用范围广、分离性能好等原因广泛应用于医学代谢组学的研究。本文从高效液相色谱的发展和原理入手,结合HPLC-MS和UPLC技术,着重讲述了HPLC在药物代谢组学、疾病研究等方面的应用现状。
半夏厚朴汤抗抑郁的代谢组学研究 篇6
代谢组学是在基因组学、蛋白质组学和转录组学之后发展起来的一门新兴组学[1], 能够对外界刺激或遗传修饰的细胞及组织的代谢反应变化做出灵敏反应, 动态观察机体的整体代谢变化, 这与传统中医药的整体理论有异曲同工之处, 所以利用代谢组学研究中药具有一定的可行性。
LC-MS具有高灵敏度、高精密度以及良好的重现性, 先已逐渐成为代谢组学研究的有力助手[2]。本文采用基于LC-MS的代谢组学研究方法, 研究对照组、模型组以及半夏厚朴汤给药组大鼠尿液的代谢组学差异, 结合代谢路径解析尿液代谢物信息, 探索给药组和抑郁模型大鼠的代谢变化, 从而为半夏厚朴汤的抗抑郁机制提供代谢组学实验依据。
1 实验材料
1.1 实验动物
Sprague-Dawley (SD) 大鼠, 雄性, 体重 (200±20) g, 由军事医学科学院实验动物中心提供。饲育温度: (20±2) ℃, 湿度: (30±10) %, 12 h昼夜交替, 自由采食、饮水。
1.2 实验药材
半夏厚朴汤按张仲景的《金匮要略》原方药物组成成分及剂量购药。半夏, 厚朴, 茯苓、生姜和紫苏叶药材购自亳州市奥淼贸易有限公司, 经鉴定所购半夏为天南星科植物半夏pinellia ternate (Thumb.) Breit.的干燥块茎, 厚朴为木兰科植物厚朴Magnolia of ficinalis Rehd.et Wils.的干燥干皮, 茯苓为多菌科真菌茯苓Poria cocos (Schw.) Wolf.的干燥菌核, 生姜为姜科植物姜Zingiber of ficinale Rosc.的新鲜根茎, 紫苏叶为唇科植物紫苏Perilla frutescens (L.) Britt.的干燥叶。
半夏厚朴汤全方 (半夏130 g, 厚朴45 g, 茯苓60 g, 紫苏叶30 g, 生姜75 g) , 加10倍量水浸泡过夜后, 煎煮1 h, 用纱布过滤, 第二次和第三次煎煮都是以8倍量水, 煮沸回流1 h, 合并三次滤液, 抽滤, 减压浓缩至浸膏状, 冷冻干燥成粉末, 得率为15.2%, 置于阴凉处, 备用。
1.3 实验试剂
Na N3 (叠氮化钠) , Na H2PO4 (磷酸二氢钠) , Na2HPO4 (磷酸氢二钠) , 福尔马林均为国产分析纯。D2O (重水) 购于北京腾达远科技有限公司, 为美国CIL光谱纯, 国内分装。TSP (3- (三甲基硅基) 氘代丙酸钠) 购自加拿大默克公司。蒸馏水, 购于广州屈臣氏食品饮料有限公司。乙腈为Fisher Scientific光谱纯。
1.4 实验仪器
1260-6410型高效液相-质谱联用仪 (Agilent technologies公司) , LDZ5—2型台式离心机 (北京医用离心机厂) , TGL—16B型高速离心机 (上海安亭科学仪器厂) , B—260型恒温水浴锅 (上海亚荣生化仪器厂) , SHZ—Ⅲ型循环水真空泵 (上海亚荣生化仪器厂) , RE52CS—2型旋转蒸发器 (上海亚荣生化仪器厂) 。
2 实验方法
2.1 动物分组及处理
适应5 d后, 将15只SD大鼠随机分为给药组, 模型组和空白组, 每组5只。大鼠单笼饲养, 除正常对照组外, 其余两组均实施造模程序, 造模时间为24 d。造模开始后同时灌胃给药, 模型组和空白对照组给予等体积生理盐水, 每两天1次, 至实验结束。给药组剂量参照人体有效剂量, 为6.32 g生药/kg体重, 每只大鼠给予1 m L半夏厚朴汤水提物的生理盐水药液。
除对照组外, 给药组和模型组每天束缚6 h, 除收集动物尿样, 连续束缚24 d, 期间禁食禁水。实验前进行一次行为绝望实验 (强迫游泳试验) , 之后实验过程中每隔一周进行一次, 至实验结束。
2.2 行为学观察
强迫游泳实验 (FST) , 基于Porsolt[3]的方法, 将大鼠放入水温为 (25±2) ℃, 水深约为30 cm (确保大鼠在水中处自然伸展状态时尾巴不触碰到缸底) 的透明圆柱玻璃缸 (高为50 cm, 直径为20 cm) 中强迫游泳6 min。实验过程中, 除观察面可见, 其余面均用黑布包绕, 并保持实验环境安静, 大鼠会在水里挣扎试图逃脱, 努力无效之后会放弃挣扎而漂浮在水面上不动的状态, 记为不动时间, 统计大鼠在后5min内的不动时间。
2.3 尿样收集及处理
实验前采集一次尿样, 之后每隔一星期收集一次尿样, 每次连续收集大鼠24 h尿样。将集尿器置于 (0~4) ℃条件下, 每12 h换一次冰, 集尿器中预先加入0.5 m L 1%的Na N3防腐。将收集的尿液3000 r/min离心 (5~10) min, 取上清液保存于-20℃条件下, 备用。
2.4 大鼠尿样LC-MS分析
2.4.1 尿样检测前预处理
于-20℃取出尿样, 室温下解冻, 12 000 r/min离心5min, 取上清液400μL, 加入等体积乙腈-水 (1∶9) 溶液稀释, 混匀, 过0.22μm微孔滤膜后移至进样瓶内, 进样LC-MS分析。
2.4.2 LC-MS数据采集与分析
样品采用梯度洗脱的方式进样, 以期使样品中的复杂成分得以很好分离, 有助于提高检测灵敏度。经过对色谱条件优化, 最终确定的色谱条件是:色谱柱为Hewlett Packard ODS Hypersil C18 (5μm, 10×4.6 mm) ;柱温为30℃;流动相为0.1%甲酸水溶液-乙腈系统;检测波长为254 nm;洗脱梯度 (起始为2%乙腈, 30 min内增加至98%乙腈, 在1 min内降至2%乙腈并维持4 min, 后运行时间设为5 min;流速为0.4 m L/min;进样体积为2μL。
对质谱的主要参数进行优化, 以获得更好的灵敏度和分辨率, 质谱的主要参数设定为:采用电喷雾离子源 (ESI) , 负离子MS2 Scan模式;质荷比 (m/z) 采集范围是 (50~1 000) ;N2干燥气流速为10 L/min, 干燥气温度为350℃;使用高纯氮作为辅助喷雾电离与去溶剂气体, 雾化器压力为50 psi;毛细管电压为4 000 v。
采用Mass Hunter软件处理数据, 提取质谱, 以Excel文件格式导出数据, 利用SIMCA-P11.5数据处理软件进行模式识别分析。
2.5 统计分析
采用SPSS 17.0软件对体重和不动时间数值进行ANOVA方差分析, 组间差异选用LSD法分析, 最终结果以mean±S.E.M表示。
3 结果
3.1 体重变化
随束缚模型建立的时间延长, 模型组和给药组大鼠体重增长率逐渐下降, 这两组大鼠体重与空白组相比具有显著统计学差异。
注:*p<0.05, **p<0.01, 与模型组相比。
3.2 行为学观察
抗抑郁药通常借助行为绝望抑郁模型进行快速筛选, 这归因于该模型的行为学改变可被几乎所有类型的抗抑郁药所逆转。大鼠强迫游泳不动时间在一定程度上反映出大鼠的抑郁状态, 见表2, 给药组、模型组和空白组的强迫游泳不动时间呈现出显著差异。
注*p<0.05**p<0.01与模型组相比。
3.3 尿样LC-MS分析
3.3.1 尿样总离子流图及部分色谱提取图
观察所得各组尿样总离子流图, 发现面积相对较大的色谱峰保留时间在11.621 min和4.206 min处, 分别为马尿酸和柠檬酸, 其他部分色谱峰因成分复杂不一一列举。
3.3.2 PLS-DA分析
采用PLS-DA建立数学模型, 对三组大鼠尿样代谢物进行模式识别, 在建立的模型中R2Y值为0.918, 表明该模型可信度较高, 模型组、给药组和对照组得到了较好的分离;PLS-DA模型中Q2值为0.849, 显示该模型稳定性较好。在PLS-DA得分图中, 模型组及给药组与对照组相比, 出现显著偏移, 说明与对照组相比其他两组大鼠代谢物发生较大改变。
3.3.3 潜在生物标记物
PLS-DA的载荷图中距离原点越远的变量, 变异量越大, 而这些大的变异量在样品分类起决定性作用[图2 (b) ]。结合分析模型的VIP数据, 寻找出这些出现较大变异的物质, 再根据化合物精确质量数, 借助HMDB以及METLIN在线数据库进行检索, 在5 ppm的差异范围内得到候选化合物, 综合精确质量数和二级质谱推测出可能的标记物。
4 结论
实验结果显示, 模型组在FST中不动时间显著增加, 表明造模有效。综合三组大鼠体重、行为学结果以及尿样中代谢产物分析, 证实半夏厚朴汤具有抗抑郁样作用。
注:↓为色谱峰面积增加;↑为色谱峰面积减少。
与空白组相比, 模型组苯丙氨酸含量升高, 亮氨酸和色氨酸均下降, 给药组与空白组差异相对较小。氨基酸代谢异常与抑郁症发病机制存在相关性, 色氨酸是神经递质5-羟色胺 (5-HT) 的前体物质, 色氨酸浓度的降低可能是由于机体5-HT耗竭, 大量色氨酸代偿转化所致。中枢5-HT缺乏可导致抑郁, 现临床首选抗抑郁药多为抗5-HT再摄取抑制剂, 以期增加脑部5-HT浓度。研究表明, 抑郁患者血浆中苯丙氨酸含量增加[4], 苯丙氨酸为必需氨基酸, 只能从食物中获取, 含量增加只能是代谢受阻所致。亮氨酸为支链氨基酸, 在模型组代谢物中含量明显低于给药组, 而支链氨基酸的减少反映了机体的中枢性疲劳, 这也可诱导抑郁状态产生的因素之一[5]。
柠檬酸、2-酮戊二酸均为三羧酸循环 (TCA) 的中间产物, 在能量代谢过程中扮演着重要角色, 一旦这些中间产物出现异常, 便可能引起TCA功能缺失或者出现紊乱。2-酮戊二酸是体内多种转氨酶的受体, 并且可以与体内代谢产生的氨结合, 在哺乳动物体内, 过量的氨会影响大脑代谢, 改变神经递质水平。因此模型组尿中2-酮戊二酸水平下降, 可能是由于大鼠体内氨水平上升所致, 氨极易通过血-脑屏障, 使得脑细胞中2-酮戊二酸水平下降, TCA减弱, 能量生成减少, 机体出现疲劳怠倦。TCA是机体内重要的循环代谢途径, 这种循环受到抑制也可能引起器官损伤[6—8]。模型组乳酸含量增加, 是有氧呼吸受抑制, 代偿性兴奋无氧呼吸所致。肌酸和磷酸肌酸代谢产物之一为肌酸酐, 肌酸和磷酸肌酸在细胞能量转移过程中起着至关重要的作用, 肌酸酐和磷酸肌酸浓度的减少是引起疲劳的重要因素[9]。能量不足、怠倦和疲劳均是抑郁症的典型症状[10]。半夏厚朴汤给药组在一定程度上可以逆转以上机体功能的异常改变。
胆碱是卵磷脂的组成成分, 同时也是神经递质乙酰胆碱的前体物质。胆碱可以调控机体内的转甲基代谢, 此外胆碱对于维持细胞的稳定性也有一定的作用[11], 模型组胆碱减少致使机体内胆碱参与的各项生理反应紊乱。给药组无此异常或异常较小。尿酸主要有肾小管分泌, 尿液中尿酸含量减少, 表明尿素排泄机制异常, 长期可致高尿酸血症, 对机体损害严重。
简而言之, 给药后, 半夏厚朴汤通过综合作用于各种途径, 产生抗抑郁样效果。此外, 有待进行更全面的研究, 以明确半夏厚朴汤确切抗抑郁作用机制。
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微生物代谢组学 篇7
1 代谢组学概述
代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后, 系统生物学的重要组成领域。Nicholson 1999年, 提出了代谢组学 (metabonomics) 的概念。代谢组指的是“一个细胞、组织或器官中, 所有代谢组分的集合, 尤其指小分子物质”, 而代谢组学则是一门“在新陈代谢的动态进程中, 系统研究代谢产物的变化规律, 揭示机体生命活动代谢本质”的科学。
与转录组学和蛋白质组学相比, 代谢组学具有以下优点: (1) 基因和蛋白表达的微小变化会在代谢物上得到放大, 代谢产物可视为基因和蛋白功能的“显示器”, 从而使检测更容易; (2) 代谢组学的技术不需建立全基因组测序及大量表达序列标签的数据库; (3) 代谢物的种类远小于基因和蛋白的种类; (4) 代谢产物在各个生物体系中都是类似的, 且样品方便易得, 故代谢组学研究中采用的技术更通用; (5) 营养代谢中很多代谢物来自食物成分, 食物本身不是单一的简单组分, 而是复杂的混合体系, 其作用对象是更加复杂的代谢体系, 代谢组学技术正是基于复杂系统的研究, 从而避免了常规方法不能很好地评价营养对人体综合影响的缺陷; (6) 很多疾病的治疗靶目标是针对代谢物组的, 而非基因和蛋白 (冉小蓉等, 2007) 。
常规的代谢组 (实际为代谢物组) 分析流程可分为生物分析和数据分析两大部分:生物分析的任务是产生数据, 主要包括生物样品收集、生物反应灭活、预处理、以及运用先进分析技术的代谢物整体性化学分析 (如代谢谱或代谢指纹分析) 等步骤;数据分析的目的是揭示出反映样品内在机理的、整体性差异的关键性生物标记物, 主要包括数据采集、原始数据前处理、以及通过现代化学信息学和生物统计学领域的新方法对获得的多维复杂数据进行降维和信息挖掘 (郭宾和戴仁科, 2007) 。当前, 代谢组学的发展目标还包括通过对生物标记物的功能分析和确认, 最终转化为整体认知和系统解析生化反应机理和生命现象的新的重要手段。
代谢组学研究所涉及的主要技术有核磁共振 (NMR) 、质谱 (MS) 、液质联用 (LC-MS) 和气质联用 (GC-MS) 等技术。最常用也是比较有效的识别方法是主成分分析法 (principal component analysis, PCA) , 它是一种将分散在一组变量上的信息集中到某几个综合指标 (主成分, PC) 上的探索性统计分析方法, 以便利用PC描述数据集内部结构, 实际上也起着数据降维的作用。其他的模式识别技术, 如聚类分析、辨别式功能分析、最小二乘法投影法等在代谢组学研究中亦有其重要的地位。
2 代谢组学在动物营养研究中的应用
代谢组学在20世纪90年代中期发展起来, 刚刚起步就已经迅速广泛地应用到了药物研发, 分子生理病理学, 环境卫生等多个领域。但是在动物营养领域, 代谢组学的应用还处在起步阶段。在不同摄食或营养干预下, 动物机体内这些小分子量的代谢产物的变化是代谢组学在动物营养研究中的主要目标, 这将有助于加深对营养素对动物生理机能影响、动物营养最适添加水平等方面认识。
代谢物组学技术可以用于研究稳态控制以及营养缺乏和营养过剩对这种代谢平衡的干扰 (Nicholson, 1984) 。营养的失衡导致体内正常的代谢平衡失调, 用某些单一的代谢生物标志物往往不能全面的反应这一过程, 而代谢物组学技术的采用则可以实现系统全面的分析以对此过程进行科学描述。某种氨基酸的大量摄取将表现为靶组织中累积高浓度的氨基酸或产生有毒的代谢物, 使正常的的代谢途径发生改变。氨基酸代谢物可以用代谢组学的方法进行定量测定。Noguchi等 (2003) 回顾分析了代谢组学技术在评价氨基酸摄入的适量与安全范围中的应用, 应用基于相关性的分析方法分析某种代谢产物与摄入过量的蛋白质、氨基酸相关, 以此确定适量安全的氨基酸摄入量。Noguchi等 (2006) 进一步研究发现氨基酸代谢谱可以有助于揭示特定生理状态, 揭示迄今最为全面的代谢关系。给大鼠饲以含2.4%蛋氨酸的日粮, 血液中丙氨酸、丁氨酸、硫醚/高半胱氨酸比例明显下降, 表明蛋氨酸代谢时, 自高半胱氨酸向丙氨酸、丁氨酸、硫醚转化时受限。因此, 高半胱氨酸是监测蛋氨酸是否过量的良好指标 (Toue, 2006) 。
Watkins等 (2003) 用定量脂质体代谢轮廓技术对脂质代谢轮廓进行了研究, 考察了胆酸磷脂酰乙醇胺-N-甲基移换酶 (PEMT) 以及食物中不同浓度胆酸对脂质代谢的影响。研究结果表明:与对照组老鼠相比, 补充的胆碱在肝脏恢复, 没有使血浆卵磷脂浓度恢复。补充的胆碱也使血浆甘油三酸酯的浓度恢复到通常水平, 但没有使胆固醇脂的浓度回复到对照组老鼠的水平。无胆碱的PEMT缺乏老鼠血浆中的二十二碳六烯酸和花生四烯酸水平显著降低。这说明补充胆碱可替代PEMT的部分而非全部功能, 也表明PEMT的功能并不仅仅是作为卵磷脂生物合成途径的一个补充, 而是和许多病理过程都相关的, 包括脂质在肝脏和血浆中流动和必需脂肪酸通过肝脏分化脂蛋白在血液和周边组织的传送。
Lamers等人 (2003) 研究了维生素C对骨关节炎的作用。用Hartley豚鼠喂以高、中、低三个不同的剂量的维生素C, 收集尿液进行NMR分析, 数据进行主成分判别分析 (principal component discriminant analysis, PCDA) , 基于各组代谢物浓度的变化, 高、中、低三个组别的老鼠明显的聚为三个独立的簇, 说明不同剂量的维生素C对骨关节炎代谢的影响有所不同。
随着代谢组学技术的成熟, 已能够测定及比较不同条件下代谢物浓度及流出量, 进而深入研究这些小分子物质的作用机制及代谢网络, 从而了解营养素对动物体生理和病理机能的影响, 从而指导实际动物生产和临床营养支持时营养物质的合理供给。
3 展望
代谢组学在动物营养研究中的应用必将拓宽动物营养需要、代谢与支持的研究领域与方法, 促进营养需要、代谢与支持的发展。在短期内代谢组学技术将有助于确定与摄入过多或不足常量营养素有关的代谢物, 帮助确定各种常量营养素的合适摄入量。从长远的观点来看, 代谢组学的研究将能够了解机体在给予过量或缺乏某一种营养物 (如一种氨基酸) 引起整体代谢改变的情况, 综合的个体代谢谱将会替代目前应用一种生物标记物作为疾病的判断指标, 从而为动物疾病的诊疗提供更多的信息。另外也可以在能够考虑到代谢的复杂性的情况下, 依靠科学方法最终建立一种评价动物微量营养素缺乏范围的策略。
参考文献
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微生物代谢组学 篇8
代谢组学是对生物系统内的内源性代谢产物的一个全面评估, 也是读取基因功能, 酶活性, 生理过程的一个所谓的“快照”。代谢组学也是对一系列不同方法整合的一个广义术语, 其一为代谢指纹或代谢轨迹的分析, 即是运用较少的代谢物的定量分析而通过多元频谱分析来衡量整个代谢轮廓, 如建立在核磁共振光谱NMR或质谱MS基础上的主成分分析;其二为代谢标记物的代谢组学分析, 在已知代谢物浓度的基础上由传统的统计方法及多元分析方法建立代谢产物的鉴定分析方法和代谢物含量的定量分析模式;其三为基于特定标记物的靶向代谢组学分析, 通过对某几个选定的在某一特定的生化途径中有贡献的代谢标记物进行分析, 来专注于研究整个代谢过程中的某一个阶段。
由于不同性质的化学品, 代谢物和分子间的相互作用, 代谢组学的分析需求造成了不同于基因组学和蛋白质组学分析的极其困难的挑战。先进的核磁共振波谱 (NMR) 和质谱 (MS) 的分析方法, 在过去的十年间为人类代谢组学的分析与研究取得了大规模的突破。这一研究理论唤醒了学者们对人类疾病中新陈代谢的重要性的关注度, 尤其是对癌症的重视程度。代谢组学具有对功能基因组学和蛋白质组学的功能读取作用, 现在已被应用于许多疾病的诊断当中, 主要是通过对代谢物谱的分析及对与代谢有关的生物标志物的发现, 这在药理研究和治疗中亦应用广泛。最新研究进展表明代谢组学的方法能够通过人体内的条块代谢网络明确地跟踪某个单个原子, 并有望以空前的速度破译人类代谢组的复杂性。这一研究方向将彻底改变我们对复杂的人类疾病、临床诊断、以及个性化疗法和药物反应的重新理解和认识。
2 代谢组学的研究方法
代谢组学的数据分析可以在光谱数据集或定量代谢数据集上使用的化学分析方法, 包括主成分分析 (Principal Component Analysis, PCA) 、偏最小二乘判别分析 (Partial Least Squares-Discriminant Analysis, PLS-DA) 、配对偏最小二乘判别分析 (Orthonal Partial Least Square-Discriminate Analysis, OPLS-DA) 等。化学光谱法只能给出光谱模式下的相关信息, 而往往无法提供有关代谢标记物的鉴定或分类信息, 但是光谱法结合代谢组学的多元统计分析手段 (PCA、PLS-DA和OPLS-DA) 依然是目前最常应用的手段, 因为它在不需要对代谢物做出精确评价的情况下能够对大量的代谢物数据集的结果做出解释。通过这种方法, 结合模式识别手段 (Pattern Recognition) 从特定疾病的角度来与对照组的代谢谱进行区分, 过滤掉可能与疾病无关的代谢物的“噪音”, 进而确定哪些特定的代谢标记物引起了模式的偏差。
在理想情况下, 一个代谢组学研究应包括以下三个主要步骤: (1) 数据采集。主要采集NMR谱图或MS谱图, 以“正常”与“异常”来进行模式识别区分。 (2) 光谱分析和相应代谢产物的标识及鉴定, 目的是找到标志性的反映组别差异的生物标记物。 (3) 特定代谢标记物的定量验证。然而, 方法中的第一步, 即化学光谱分析一般情况下可以忽略不计, 直接对代谢标记物进行识别和量化, 然后应用多变量分析到大量的数据集中。模式识别方法包含了对代谢轮廓及代谢产物可能发生微妙的变化的分析, 并始终随着时间的推移对代谢标记物的水平变化进行实时监测。除了识别多个特定的代谢标记物外, 通过参考已知的内源性代谢物数据库[1], 找出引起疾病发生或导致疾病加重的代谢物的变化或差异。随着时间的推移, 代谢标记物水平的变化有可能是对疾病的进展或药物毒性的一个预测。随后, 这些与疾病或毒性相关的代谢标记物的数据通过数据库被链接到相关的代谢通路, 最终, 相关的疾病作用机制的生成, 将带来药物作用或毒性的一系列假说。
3 代谢组学在药物毒性评价中的应用
作为一种评估毒性的新的方法, 基于核磁共振的代谢组学被用于尿液样本的分析实验[2], 相比传统的评价指标, 如AST, ALT, CK等, 代谢组学分析下的尿液代谢轮廓能够清晰地区分治疗前与治疗后治疗组与辛伐他汀组的毒性水平。通过多元统计分析鉴定了与毒性相关的毒性标志物。更重要的是, 治疗组被进一步归类分为两个亚组:低毒性组 (WT) 和高毒性组 (HT) , 这两个组别之间的差异亦被酶活性的改变和组织病理学检查所证实。随后的时间依赖性的实验研究表明, 10天的毒性通过代谢轮廓及代谢途径, 在6天内就能够被可靠地预测。Williams等利用高效液相串联质谱的分析方法从代谢组学的层面研究与D-丝氨酸引起的肾脏毒性相关的扰动规律, 在正负离子模式下的尿液代谢轮廓分析中, 发现色氨酸, 苯丙氨酸和乳酸表达水平有所升高, 而甲基琥珀酸和癸二酸的表达水平与对照组比较, 有降低的迹象, 说明丝氨酸对肾脏的毒性损伤与抑制色氨酸的分解代谢有关。赵剑宇[3]等利用代谢组学技术对关木通毒性大鼠的代谢改变及毒性靶器官肾脏毒性的作用机制进行了研究, 结果发现氧化三甲胺、牛磺酸、柠檬酸、肌酐、2-酮戊二酸等代谢产物均有不同程度的下降, 而乙酸、丙氨酸则出现显著的升高, 表明染毒大鼠出现了肾小管坏死, 这一结论与报道的肾脏病理组织学检查结果和血浆生化检测结果相一致。王喜军[4]等人采用UPLC-MS分析手段研究以CCL4诱导的肝损伤大鼠为实验对象, 研究肝毒性的代谢组学的变化, 同时对茵陈蒿汤干预后的肝损伤大鼠的代谢轨迹的回调趋势亦进行了相关研究, 结果表明, 与CCL4诱导的肝损伤相关联的Glycocholate等5个生物标记物在给予茵陈蒿汤后, 代谢标记物的表达水平与对照组比较未见明显的差异, 说明茵陈蒿汤对CCL4诱导的肝损伤有一定的预防作用。李建新[5]等利用代谢组学方法中的模式识别技术和主成分分析法来探讨雷公藤甲素对肾脏所致的毒性作用, 结果发现雷公藤甲素给药后, 大鼠尿液样品中的代谢产物甘氨酸、醋酸盐、甜菜碱、丙酮的表达水平均有显著的升高, 说明雷公藤甲素对大鼠产生的毒性首先是对肾脏皮层S1段造成损伤, 随后是肾乳头的损伤, 最后是对肾脏皮层S3段的损伤。
摘要：代谢组学技术作为一种评估毒性的新的方法, 已被广泛应用于药物的毒性预测、监测及药物的临床前安全评价中, 本文对代谢组学技术的研究概况、研究方法及应用进行简单的论述。
关键词：代谢组学,毒性评价,研究方法
参考文献
[1]Lewis GD, Asnani A, Gerszten RE.Application of metabolomics to cardiovascular biomarker and pathway discovery[J].J Am Coll Cardiol.2008, 52:117-123.
[2]吴泽明, 孙晖, 吕海涛, 等.代谢物组学研究进展及其在中医药研究中的应用展望[J].世界科学技术-中医药现代化, 2007, 9 (2) :99-103.
[3]赵剑宇, 颜贤忠, 彭双清.利用代谢组学技术研究中药关木通的肾毒性作用[J].世界科学技术:中医药现代化, 2007, 9 (5) :54-59.
[4]王喜军, 王萍, 孙晖, 等.茵陈蒿汤对ANIT诱导的急性肝损伤的保护作用[J].中医药学报, 2007, 35 (4) :17-21.
微生物代谢组学 篇9
代谢组学诞生于20世纪末,由英国伦敦帝国大学吉尔·尼克森教授创立[3],之后得到迅速发展并渗透到多个领域,如疾病诊断、医药研制开发、营养食品科学、毒理学、环境学、植物学等与人类健康护理密切相关的领域,为生命科学的发展提供了有力的现代化实验技术手段。代谢组学的主要研究是各种代谢路径的底物和产物的小分子代谢物。其样品有尿液、 血浆或血清、唾液、脑脊液、精液等生物体液,以及细胞提取物、细胞培养液和组织等。
从某种意义上来说,机体内的每项生命活动都会受代谢产物的调节和影响。因此,研究代谢组学可以了解及探索各项生命活动的整体代谢状况,从而帮助人们更好地理解生命的活动。
本文就代谢组学平台组成及近年来在兽药检测中的应用作一综述,目的是使人们进一步认识到代谢组学及其技术在兽药检测分析中的重要性,同时为兽药的新药选择、药物毒性评价、不良反应监测等提供一定导向性。
1代谢组学平台简介
目前,常用的代谢组学分析平台主要为: 核磁共振谱( NMR) 技术、气相质谱( GC - MS) 联用技术、液相质谱( LC - MS) 联用技术和代谢物芯片,它们都具有样品需求量小、预处理简单、高通量性等特点。
1. 1 NMR技术
NMR技术主要是利用核磁共振技术和模式识别方法对生物体液和组织进行系统测量和分析,对完整的生物体( 而不是单个细胞) 中随时间改变的代谢物进行动态跟踪检测、定量和分类,然后将这些代谢信息与病理生理过程中的生物学事件关联起来,从而确定发生这些变化的靶器官和作用位点,进而确定相关的生物标志物[4]。
NMR技术从最初的一维氢谱发展到碳谱、氮谱、 磷谱和二维核磁共振谱等高级谱图,核磁共振技术解析分子结构的能力也越来越强,进入20世纪90年代以后,发展出了依靠核磁共振信息确定蛋白质分子三级结构的技术,使得蛋白质分子结构的精确测定成为可能。
NMR技术在代谢组学中的应用越来越广泛,它具有如下优点: 无损伤性,不破坏样品的结构和性质; 可在一定的温度和缓冲范围内进行生理条件或接近生理条件的试验; 与外界特定干预相结合,研究动态系统中机体化学交换、运动等代谢产物的变化规律; 试验方法灵活多样。
1. 2 GC - MS联用技术
GC - MS联用技术是利用气相色谱作为质谱的进样系统,使复杂的化学组分得到分离; 利用质谱仪作为检测器进行定性和定量分析,主要是用于定性和定量分析沸点较低、热稳定性好的化合物。GC - MS联用技术综合了色谱法的分离能力和质谱的定性长处,可在较短时间内对多组分混合物进行定性分析。
GC - MS联用技术的优点在于可以选用高灵敏、 通用性或专一性强的检测器,检测限一般为 μg /kg级,并且分析时间短,备受代谢组学研究者的青睐,常用于动植物和微生物的代谢指纹分析。它能够提供较高的分辨率和检测灵敏度,并且有可供参考、比较的标准谱图库,可以方便地得到待分析代谢组分的定性结果,但是GC - MS联用技术不能直接得到体系中难挥发的大多数代谢组分的信息[5]。
1. 3 LC - MS联用技术
LC - MS联用技术的基本原理与GC - MS联用技术类似,但它是利用液相色谱作为质谱的进样系统的。目前,LC - MS联用技术已经被广泛地应用在生物样品分析中,主要可解决如下几方面问题: 不挥发性化合物分析测定,极性化合物的分析测定,热不稳定化合物的分析测定,大分子量化合物( 包括蛋白质、多肽、多聚物等) 的分析测定[5]。
LC - MS联用技术经济实用,适用于那些热不稳定、不易挥发、不易衍生化和分子质量较大的物质。 质谱多通道监测的功能和色谱卓越的分离能力,使LC - MS联用技术对检测样品的浓度和纯度要求,与NMR技术相比明显降低,甚至对含量极低的物质,也能通过优化质谱的扫描模式给出可视化响应。同时, LC - MS联用技术又有较好的选择性和较高的灵敏度,得到了越来越广泛的应用。液相色谱技术强大的分离能力和高灵敏度使人们认识到它也可以用于生物体液指纹谱[6]。
2代谢组学平台在兽药检测中的研究应用
2. 1 NMR技术
J. K. Nicholson等[7]最早将NMR技术与模式识别技术结合起来检测代谢表型中的动态变化,用于药物毒理标示物的研究,由J. M. Nicholson等人主持的、 五大医药公司参与的Consortium for Metabonomic Tox- icology ( COMET) 项目是利用代谢组学方法预测化学品毒性最有影响和代表性的研究,该研究利用NMR技术分析了约150种药物( 或化学品) 对啮齿动物尿液、血液和部分组织代谢的影响,证明代谢组学方法应用于研究药物毒理的可行性和稳定性,并建立了用于临床前候选化合物的肝脏和肾脏毒性预测筛选的专家系统[8 - 9]。
L. Li等[10]利用NMR技术研究中药制品黑顺片对雄性大鼠的毒理效应,结果发现: 尿液中的牛磺酸和三甲胺氧化物与对照组相比明显减少,而柠檬酸盐戊酮异二酸琥珀酸盐和马尿酸盐的含量相对增加; 此外,毒性效应具有剂量依赖性和积累效应。
李建新等[11]以生物核磁共振结合模式识别技术和主成分分析法探讨雷公藤甲素口服给药对大鼠尿液内源性代谢产物的影响,结果发现,大鼠尿液的代谢物谱与雷公藤甲素对肾脏造成损害作用密切相关。
姚凤云等[12]利用NMR技术分析畜禽抗感染主导药物———盐酸恩诺沙星的制备及结构确证,结果表明,盐酸恩诺沙星的体外抑菌效果与恩诺沙星一致, 即成为酸式盐后没有对恩诺沙星的抑菌效果产生影响。
李金贵等[13]利用X射线粉末衍射( XRD) 和核磁共振氢谱(1H NMR) 技术研究了青蒿素- β - 环糊精包合物的表征,结果表明,不同剂量青蒿素预防鸡感染柔嫩艾美耳球虫指数均低于160,说明其防治效果不佳。
雷红涛等[14]利用甲硝唑与琥珀酸酐反应,合成半抗原甲硝唑半琥珀酸酯,再用1H NMR技术进行鉴定,结果表明,成功合成全抗原,为进一步制备甲硝唑抗体治疗鸡、火鸡组织滴虫病及牛毛滴虫等病奠定了基础。
2. 2 GC - MS联用技术
GC - MS联用技术发展已相当成熟,应用相对较多。L. M. He等[15]通过该方法对饲料中的莱克多巴胺( RAC) 和克伦特罗( CLB) 进行检测,其最低检测限RAC为4 μg /kg,CLB为2 μg /kg,可进行确证性检测及消除应用高效液相色谱方法可能带来的假阳性。
刘琪等[16]应用GC - MS联用技术测定动物组织及尿液中克仑特罗残留,分析了操作中衍生化、质谱参数的设定、溶剂的干扰、进样及谱库的检索等因素对测定结果的影响,结果表明,所建立的方法达到了缩短检验周期、降低检测成本的目的。
R. W. Fedeniuk等[17]利用GS - MS联用技术检测发现,牛血清中17β - 雌二醇和17β - 三氨乙基胺水平可达到pg /m L级,其检测水平分别为5 ~ 500, 25 ~ 500 pg / m L,从而展现了GS - MS联用技术对检测激素水平的敏感性和特异性均较高。
彭莉等[18]利用气相色谱法测定牛奶中氯霉素的残留量,结果表明,回收率、批间变异系数、检测限和定量限均达到了欧盟的规定要求,适合牛奶中氯霉素残留分析。
田苗[19]利用GC - MS联用技术建立了猪组织( 肉组织、肝脏和肾脏) 中10种 β - 兴奋剂类兽药残留量的检测方法,结果显示,10种 β - 兴奋剂类兽药的检出限、回收率和精密度等技术指标能满足国内外对 β - 兴奋剂类兽药残留量的检测要求。
2. 3 LC - MS联用技术
P. Scherpenisse等[20]利用LC - MS联用技术检测孔雀石绿( MG) 在鱼体内代谢后其代谢产物白孔雀石绿( LMG) 水平,结果表明,检测范围达0. 11 ~ 0. 18 μg / kg,检测效果明显高于其他检测方法。
P. Scherpenisse等[21]再次运用LC - MS联用技术对鳟鱼、鲑鱼和罗非鱼等水产品中的兽药间氨苯酸乙酯甲磺酸盐( tricaine mesilate) 进行检测,其检测限达0. 50 ~ 0. 68 μg /kg,表明此种方法可用于部分水产品低水平兽药残留的检测,也证明了LC - MS联用技术对低剂量浓度样品检测的敏感性较强。
乔华林[22]运用高效液相色谱- 质谱联用技术, 通过优化前处理选择合适的色谱条件,实现了向水产品中添加痕量阿维菌素、氯霉素和硝基呋喃类兽药后,代谢物多组分的同时检测。
孙雷等[23]建立了猪肉组织中7种氟喹诺酮类药物残留检测的高效液相色谱- 串联质谱方法,结果表明,该方法特异性强、回收率高、变异系数小、检测限和定量限低。
李勇[24]运用液相色谱- 串联质谱的方法检测了蛋鸡服用兽药喹烯酮后,血浆、肝脏和肉组织中内源性代谢物的作用。张丽芳等人利用该技术测定鸡组织中喹啉类兽药残留标示物喹啉- 2 - 羧酸和3 - 甲基- 喹啉- 2 - 羧酸的残留含量。
曹莹等[25 - 26]运用液质联用仪先后对中兽药中非法添加的氟喹诺酮类药物及禽蛋中苏丹红的含量进行检测,结果表明,该方法特异性强、回收率高、检测限和定量限效果较灵敏。
3结语