微生物鉴定（精选12篇）
微生物鉴定 篇1
腐蹄病是指以牛、羊、猪的蹄间皮肤和组织的腐败、恶臭为特征的一种疾病。引起腐蹄病的病原很多, 细菌、病毒均可导致该病的发生。2008年12月份, 河北省某奶牛场发生了以蹄部溃烂为主要症状的疾病, 一部分未成牛死亡, 大部分育成牛耐过, 但有的牛仍表现为蹄部溃烂、泌乳停止, 经多方治疗仍不见好转, 遂进行了病原的分离鉴定。
1 材料与方法
1.1 材料
MDBK细胞, 购自中国兽药监察所细胞室;SPF小白鼠, 购自河北医科大学。
1.2 病料的采集及处理
无菌采集病牛蹄部的脓汁, 一部分作细菌分离, 涂片、革兰染色、镜检, 另一部分按比例加入双抗, 15 000r/min离心20min, 取上清液备用。
1.3 细菌的分离
将患病牛的脓汁分别接种于血液琼脂培养基和普通琼脂培养基, 37℃培养24h。
1.4 分离菌的鉴定
1.4.1 动物试验
在培养基上选择单个菌落接种于普通斜面培养基进行纯培养, 勾取纯培养物接种于肉汤培养基培养24h, 肉汤浑浊时接种小白鼠3只, 每只腹腔注射0.2mL。
1.4.2 运动力检查
勾取纯培养的细菌涂于加入1滴生理盐水的载玻片上, 加盖玻片, 在油镜下观察细菌的运动性。
1.4.3 生化试验
对分离到的菌株分别进行触酶试验、糖发酵试验、硝酸盐还原试验、V-P试验、凝固酶试验等。
1.4.4 药敏试验
采用纸片扩散法进行试验。
1.5 病毒的分离
将离心好的上清液接种MDBK细胞, 37℃吸附1h, 弃去接种液, 加入维持液, 37℃培养, 逐日观察细胞病变, 当80%的细胞出现病变时收毒传代。
1.6 分离株生物学特性的鉴定
病毒组织培养半数感染量 (TCID50) 的测定:将F3代毒用Hank's液稀释成浓度为1×10-11×10-7, 吸取每个稀释度的病毒液20μL加于96孔板内已长满单层的MDBK细胞中, 每个稀释度的病毒液接种12个孔, 37℃静置培养, 逐日观察。
1.7 分离株理化特性的鉴定
1.7.1 氯仿敏感试验
向病毒液内加入分析纯的氯仿, 使其终浓度为4.8% (对照病毒液各加入同等剂量的Hank's液) , 置4℃震荡混合10min, 500r/min离心5min, 然后吸取液体层测定毒力。对照做同样处理。
1.7.2 耐酸性敏感试验
将病毒悬液3 000r/min离心20min, 取上清液等量分装于4个小瓶中, 用0.1mol/LHCl将2个小瓶中的病毒液pH值分别调至3.0和5.0, 并在另2个小瓶中的病毒液内加入相同于用酸量的Hank's液作为对照。置室温感作2h, 再用56g/L的NaHCO3将pH值调回至7.2左右, 测定毒力。对照做同样处理。
2 结果
2.1 细菌的分离和检测结果
2.1.1 分离结果
在普通培养基和血液培养基上均长出圆形、隆起、光滑、灰白色、不透明的小菌落, 涂片、镜检可见革兰阳性球菌。
2.1.2 动物试验结果
2只小白鼠在36小时左右死亡, 剩余1只精神沉郁, 但几天之后转为正常, 估计已耐过。对死亡小白鼠进行剖检, 其症状为肝脏肿大, 腹腔内有胶胨样物质, 胸腔内有腹水。取死亡小鼠的肝脏、脾脏、肾脏、心脏、肺脏做涂片, 均可见和接种菌形状一致的革兰阳性球菌。
勾取死亡动物的上述5种组织接种于普通琼脂培养基, 24h之后观察, 可见圆形、隆起、光滑、灰白色、不透明的小菌落。涂片、镜检发现与注入小鼠体内的细菌外形一致。
2.1.3 运动性检查结果
分离细菌无运动性。
2.1.4 生化试验结果见表1。
2.1.5 药敏试验结果见表2。
mm
注:抑菌圈直径≤8mm为不敏感, 8~12mm为较敏感, ≥12mm为敏感。
2.2 病毒的分离和检测结果
2.2.1 分离结果
将病料接种于MDBK细胞, 46小时左右使细胞圆缩并脱落
2.2.2 TCID50的测定和计算结果
经计算该病毒的TCID50为1×10-5.749/0.1mL。
2.2.3 理化特
该病毒经氯仿、pH 3.0、pH 5.0处理后, 其TCID50与对照组相比均低2个效价。
3 讨论
(1) 在病牛腿部所采的脓汁中分离出1株革兰阳性球菌, 经动物试验证明该分离菌有很强的毒力, 为该病例的主要致病菌。该分离菌生化试验结果与微球菌的一致, 因此该分离菌应属于微球菌属。以前的研究结果表明, 引起动物腐蹄病的主要病原是坏死杆菌, 与本试验结果有所不同。笔者认为微球菌是引起该牛场发生腐蹄病的主要病原菌。微球菌一般不致病, 但在机体抵抗力较低时可引起软组织脓肿等。该牛场的卫生管理水平和饲料品质等较差, 致使牛抵抗力较低, 在细菌侵入时无法抵抗, 使其在体内大量增殖, 最终导致牛发病。而用于动物试验的小白鼠生长在正常环境中, 接种分离菌后使小白鼠死亡, 故该菌可能是微球菌的1株变异株。
(2) 药敏试验结果表明, 该菌对强力霉素、多利平、头孢喹啉钠、呋喃妥因、头孢喹啉等药物敏感, 故可将上述药物作为治疗本病的首选药物。
(3) 分离病毒经无菌处理后接种MDBK细胞, 在一定的时间内出现病变, 说明可能有病毒存在。将该细胞培养液在MDBK细胞上传3代, 发现在细胞接毒后46小时左右出现病变。再对分离毒进行理化特性检查, 发现其对氯仿、酸均敏感。所分离病毒的种类有待于进一步鉴定。 (009)
微生物鉴定 篇2
我是一个对理想有着执着追求的人，坚信是金子总会发光。我为人热情、活泼大方、兴趣广泛、适应力强、脚踏实地、吃苦耐劳、勇于迎接新挑战。有较强的组织能力、活动策划能力和公关能力，在大学期间曾多次参与组织体育赛事、文艺演出，并取得良好成绩。
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卤素离子的鉴定及生物学效应 篇3
关键词：无机含氧酸盐；分解产物；教学质量
周期表中第ⅦA族元素，包括F、Cl、Br、I、At，其中，At为放射性元素，总称为卤素。卤素希腊原文为成盐元素的意思，因为这些元素是典型的非金属，它们都能与典型的金属—碱金属化合生成典型的盐而得名。
一、卤素离子的分离和鉴定
1.利用沉淀反应
Cl-、Br-、I-都可与硝酸银反应，生成不溶于稀硝酸的沉淀：
Cl-+Ag+=AgCl↓（白）
Br-+Ag+=AgBr↓（淡黄）
I-+Ag+=AgI（黄）
它们的溶解度积按AgCl、AgBr、AgI的顺序依次减小，因此AgCl易溶于氨水形成银氨配离子：
AgCl+2NH3=[Ag（NH3）2]++Cl-
而AgBr微溶于氨水，AgI不溶于氨水。
因碳酸铵水解产生低浓度的氨：
（NH4）2CO3+H2O=NH4HCO3+NH3·H2O，故可用碳酸铵代替氨水以便控制氨的浓度，鉴别Cl-和Br-离子。能溶于（NH4）2CO3溶液中的卤化银沉淀是AgCl，不溶的是AgBr。
AgBr易溶于Na2S2O3溶液中：
AgBr+2S2O2-3=[Ag（S2O3）2]3-+Br-
而AgI易溶于KCN溶液中：
即从AgCl→AgI，在NH3中溶解的平衡常数K值逐渐减小。
2.利用氧化还原反应
卤素离子的还原性按Cl-、Br-、I-的顺序递增。氯水可将Br-、I-氧化，利用Br-和I-还原性差异可鉴别它们。向含有Br-、I-的混合溶液中加入少量CCl4，然后滴加氯水，边加边搅拌。开始CCl4层出现紫色，表示有I2生成。随后褪为无色，又变为黄色，表示有Br2生成。
氟是人体必需的微量元素，它以F- 形式结合在牙齿和骨骼等硬组织中。适量的氟对维持牙齿和骨骼的化学稳定性和机械强度有一定的作用，但摄入氟过量时会出现氟中毒。有关氟的作用，有的认为是，F-在骨骼和牙釉质中能使羟基磷灰石转变成氟磷灰石，氟磷灰石的晶格结构比羟基磷灰石紧密，而且它的热力学稳定性大于羟基磷灰石，所以能提高抗龋齿能力，增加骨骼的硬度。缺氟时，儿童发生龋齿。如果长期摄入较多，牙釉质能出现黄色、褐色或黑色斑点，易于破碎或脱落，形常氟斑牙；骨骼能畸形发育，关节强直，腰腿疼痛，出现氟骨症。这是一种地方病，即地方性氟中
毒症。
氯离子是体液中存在的主要阴离子，大多分布在细胞外液，是人体必需的宏量元素。它与Na+、K+、HPO2-4等离子共同维持体液的渗透压和酸碱平衡。
溴在人体各组织中都有存在，在体内的含量比碘还高，但它在体内的生理功能还不清楚，尚未确定它是人体的必需元素。已知溴化物，如NaBr和KBr，能加强大脑皮层的抑制过程，有镇静和催眠作用，常用于治疗神经衰弱。
碘是第二个被发现的必需微量元素，它浓集于甲状腺内，参与甲状腺激素的合成，是甲状腺激素的组成成分，每一个甲状腺分子中含有四个碘原子。甲状腺激素的生理功能都与碘有关。由于地区水、土壤等原因造成人摄入碘不足或过多时都会引起甲状腺肿大，这是一种地方病，称为地方性甲状腺肿。
三、常用的含卤素药物
1.盐酸 药用HCl含量9.5%～10.5%（g/ml），可内服补充胃酸的不足，治疗胃酸缺乏症。
2.氯化钠 用于配制生理盐水（浓度0.9%），大量用在出血过多，严重腹泻等所引起的缺水病症，也可用来洗涤伤口。
3.氯化钾 是一种利尿药，用于心脏性或肾脏性水肿，也用于缺钾症。
4.氯化铵 用作祛痰剂。
5.碘化钠、碘化钾 用于配制碘酊。碘化钠、碘化钾都能促进细胞的新陈代谢，故用作变质剂。此外，对甲状腺肿大、慢性关节炎、动脉血管硬化等症也有疗效。
6.溴化钠、溴化钾、溴化铵 三种溴化物称为三溴片，或单独使用，作为镇静剂。
7.碘 在医药上配制碘酊，外用作消毒剂。内服复方碘溶液治疗甲状腺肿。
8.漂白粉 其有效成分是Ca（ClO）2，具有消毒作用。
参考文献：
[1]北京师范大学等编.无机化学，3版，高等教育出版社，1992.
[2]天津大学无机化学教研室编.无机化学，3版，高等教育出版社，2002.
[3]北京师范大学等编.无机化学，4版，高等教育出版社，2003.
[4]戚冠发.无机化学选论.辽宁教育出版社，1989.
微生物鉴定 篇4
食品检测中鉴定微生物的常规方法
微生物鉴定是食品微生物检测实验室的一项基本工作, 也是实验室能力验证考核的一项基本内容。目前市场上微生物鉴定平台主要采用经典的生化反应方法。主要产品涉及法国生物梅里埃的手工API系统, 自动化的ATB系统及全自动的Vitek2Compact系统。美国BD公司的Phoenix100系统及美国Biolog公司的微生物鉴定系统。
法国生物梅里埃的手工鉴定系统AP
API是公认的微生物鉴定金标准方法, API无需专用仪器, 采用标准化手工方法完成细菌的生化鉴定, 为低成本替代传统手工细菌生化鉴定的最佳产品。
API系统特点:
完整的鉴定谱:15种试条, 可鉴定550余种细菌;
简单方便:标准化方法, 成本低廉, 判读结果简单
快速高效:4~24小时可获得鉴定的结果。
该系统主要用于刚刚开始组建的食品微生物检测实验室, 只需要API鉴定试剂盒, 菌库软件及孵箱就可以具备标准的微生物鉴定能力了。
法国生物梅里埃New ATB系统
New ATB系统是半自动化的微生物鉴定系统, 该系统可鉴定由环境、原料及制成品分离导致的细菌, 同时也可以进行药物敏感性试验 (包括肠杆菌、非发酵G (-) 杆菌、葡萄球菌、链球菌、酵母菌、厌氧菌) 。可鉴定770种细菌, 进行近80种抗生素药敏实验分析。
ATB还具备快速鉴定模式, 可以在4小时内进行大多数细菌的快速鉴定。
New ATB系统原理:鉴定试条包含风干底物的反应孔, 经标准浊度的菌液活化, 于指定温度培养4小时/24小时后即可进行读数鉴定。计算机根据阅读器检测到的结果自动调用相应试剂条数据库, 得出生化/同化结果和药敏试验结果。系统将所得编码跟数据库的典型菌株生化谱比较, 以客观的2个参数 (鉴定百分率及T-值) 计算鉴定结果。
New ATB系统特点:
速度快捷;
提供自动化接种, 阅读及分析试条结果;
准确可靠的结果I D 32及快速I D32试条由金牌标准API试条改良而成, 配合自动化概念, 结合成完整的细菌鉴定系统。
法国生物梅里埃全自动微生物鉴定系统Vitek2Compact
Vitek2Compact系统是目前市场上广泛采用的完全自动化系统, 基于金标准的API方法, 采用全自动设计, 从细菌接种到真空填充, 全自动孵育, 判读打印报告。该系统具有以下特点:
(1) 采用经典的微生物生理生化反应原理, 是真正意义上的微生物生化鉴定系统;
(2) 真正意义上的完全自动化系统, 操作简单, 耗材成本低;
(3) 具有完整的鉴定谱, 可对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、酵母菌、芽孢菌、奈瑟氏菌、嗜血杆菌、厌氧菌进行鉴定, 菌库超过600种;
(4) 快速报告试验结果, 平均鉴定时间5小时;
(5) 经典的方法及自动化的操作, 保证了鉴定结果的准确性, 该系统具有超强的鉴定性能;
(6) 广泛的认证认可, 包括FDA, SFDA, AOAC及GB 4789等。
美国BD公司的Phoenix100系统
Phoenix100系统自上市以来已经超过10年时间, 采用的基本原理为生化反应原理, 在医院市场得到一定程度的应用。客观的讲该系统使用维护成本过高, 耗材主要是鉴定药敏复合板, 需要另配肉汤及指示剂, 导致耗材成本过高。另外采用荧光加比色指示生化反应, 对于细菌鉴定而言灵敏度过高, 经常出现不能鉴定的情况, 导致耗材的浪费。
美国Biolog公司的Microstation和Omnilog自动微生物鉴定系统
Microstation和Omnilog自动微生物鉴定系统基于9 5种碳源或化学敏感物质的利用进行微生物鉴定。该系统并非基于经典的伯杰手册的鉴定方法, 在业界有学术方面的争议, 主要是对碳源同化鉴定方法存在异议, 认为该方法可以用于科研, 但是实际鉴定报告的运用上, 没有方法可以对比。该方法要求操作人员比较专业, 一般定位是科研用途。
食品微生物鉴定技术的发展
以上列出的是目前经典的微生物鉴定技术, 随着国际上微生物鉴定技术的发展, 新的技术不断出现, 希望能够更快, 更准确, 更全面的进行微生物鉴定, 相关的技术平台主要有飞行质谱快速微生物鉴定法及分子水平上的快速微生物鉴定方法。
细菌快速鉴定飞行质谱方法
Maldi-TOF (基质辅助激光解析飞行时间质谱仪) 用于理化方面蛋白质的分析, 是一种成熟的分析方法。近年来, 随着技术地进步, 科学家们发现可以通过分析细菌核质体不同大分子蛋白的组成来进行细菌的鉴定, 于是该方法很快在细菌快速鉴定方面得到了广泛使用, 该技术也数次获得诺贝尔奖。
质谱法进行快速微生物鉴定具有以下特点:
(1) 鉴定速度快:常常在数分钟内就得到鉴定结果;
(2) 鉴定准确:同常规微生物生化鉴定方法比较符合率高;
(3) 操作简便:只需要简单的操作就可进行复杂的微生物鉴定;
(4) 菌库大:相比生化鉴定方法, 质谱法建立菌库更快, 可鉴定的微生物种类更多, 对于一些用常规方法难鉴定的微生物鉴定效果较好。
该技术一经微生物鉴定运用, 就得到了多方面的关注, 甚至很多专业人士认为该技术在未来5年内将大规模装备于中国的微生物实验室。
目前市场上可进行快速细菌鉴定的质谱产品只有法国生物梅里埃和德国布鲁克可提供。两种产品均有其优势, 梅里埃的质谱鉴定产品VITEK MS强项在于其菌库及建库方法, 具有菌库标准, 建库方法被认可, 菌库容量大, 鉴定结果准确。德国布鲁克产品具有硬件方面的优势, 是专业生产质谱的厂家。
微生物16S测序方法及全基因组测序方法
生物细胞DNA分子的一级结构中既具有保守的片段, 又具有变化的碱基序列, 保守的片段反映了生物物种间的亲缘关系, 而高变片段则能表明物种间的差异。这些保守的或高变的特征性核苷酸序列是不同分类级别生物 (如科、属、种) 鉴定的分子基础, 因此可根据r DNA (核糖体DNA) 序列设计用于某一种、属、科甚至更大类群范围的微生物检测或鉴定的探针。细菌中r RNA (即r DNA) 高度保守, 以16S r RNA为聚合酶链式反应 (PCR) 扩增靶分子的细菌快速分类鉴定标准方法已经成功建立, 该方法可以应用于细菌种、属和科的鉴定及系统进化分析等。与其它细菌鉴定方法比较, 16S r RNA测序技术鉴定细菌具有高效、准确、简便、特异性强的优点.随着基因组学的迅猛发展, 细菌16S r RNA间隔区序列数据库不断扩大, 运用16S r RNA序列分析技术对微生物进行分类鉴定, 确定微生物在进化中的位置, 已成为微生物鉴定中至关重要的方法。
另外对于微生物鉴定方法研究还集中在微生物全基因组测序, 可以预计, 在未来几年, 基于各种测序平台的微生物鉴定仪器将装备市场, 为微生物鉴定提供更多的手段。
生物系学生实习鉴定 篇5
一年的实习期马上就要结束了，通过一年的工作和学习，本人积累了丰富的经验，为不断提升自己的专业技能，打下了夯实的基础。通过向同事们请教学习，通过和学生逐步深入的接触，不断的体会到从事教育工作的重要意义，以一颗热爱教育事业的心，把自己的激情倾注于光荣的教育事业。
在这个过程当中，本人不断的提高自己的职业修养，加强自身的师德建设，本文由本网站提供yjbys.com/shuzhibaogao/树立起良好的教师的形象，通过自己的言谈举止，在潜移默化当中，让自己的学生受到教育，让学生懂得自己的责任。不但要提高师德的水平，同时还要让自己的职业道德在教育工作中发挥重要的作用，用自身的道德水平去影响学生。同时在和学生的接触过程中，不断的反思自己工作的得失，注意发现自身存在的`不足，针对自己的这些缺点，不断的加强自己的职业道德修养，提高自身素质水平，在将来的工作中，取得更加优异的成绩。
在工作中，本人积极的和同事交流，充分利用自己的时间多去听经验丰富的老教师的课，在听课中不断的向老教师学习请教，提高自身的素养，把教学理论在实际中灵活应用，不断的在工作中积累经验。在这一年的工作当中，和同学的感情是越来越深，工作开展的也是非常顺利，同时在各项活动中取得了不菲的成绩，这是和同学们的努力和其他老师的大力支持和帮助是分不开的。
不要努力成为一个成功的人，要努力成为一个对社会有用的人。我并不是反对不断追求自身幸福的人，相反，我认为的幸福应该是建立在为社会贡献自己力量的基础上的。我学的师范专业，自己又这么热爱它，所以我决定做一名教师，希望我的努力是有意义的。
微生物鉴定 篇6
关键词 钙离子 铁离子 锰离子 锌离子
中图分类号：G633.8 文献标识码：A 文章编号：1002-7661（2013）01-0070-02
在高中《生物》新教材中，增设了《鉴定生物组织中的糖类、脂肪、蛋白质》实验。对于这三大物质的鉴定，已有很多学者提出了相关的简易方法。生物组织中还含有钙、铁、钠、铜、镁等多种无机盐离子，但生物教材中对于无机盐离子的鉴定缺少鉴定方法。本课题通过对鉴定钙、铁、锰、锌离子的研究，尝试在常见的蔬菜水果中选择出含钙、铁、锰、锌较高的作为实验材料，选择特定的化学试剂，摸索出最佳的浓度，得到方法简易、鉴定效果明显的适合中学生的实验方法，为中学生物教师实验教学提供案例，同时为中学实验教学的拓展提供实验方法。
一、反应机理
（一）钙的鉴定 钙离子Ca2+可以与草酸溶液作用，产生白色的细小结晶沉淀。
（二）铁的鉴定 三价铁离子Fe3+可以与硫氰根离子SCN- 形成可溶于水及乙醚的深红色化合物。
（三）锰的鉴定 锰离子Mn2+在硝酸溶液的酸性作用下，可以与铋酸钠固体NaBiO3产生紫色。
（四）锌的鉴定 锌离子Zn2+可以与双硫腙溶液反应，反应后溶液呈红色。
二、材料
（一）鉴定钙材料的选择
豆芽、白菜、牛奶、黄豆等食物中钙的含量都较高，其中用豆芽茎或者白菜叶片研磨后的汁液作为实验材料，结果明显，且两种材料容易处理，但要注意，白菜组织液必须临时制备，放置时间过长易变黄。而豆芽茎的组织液不会有这种情况出现，组织液制好后，可在冰箱中保存一周。牛奶本身呈乳白色，这种鉴定方法产生的沉淀易被遮掩，故不可采用。
（二）鉴定铁材料的选择
菠菜、红豆、猪肝、茄子等食物中铁的含量都较高，用菠菜叶片做实验材料，进行徒手切片，实验结果明显，猪肝本身呈红色，研磨后的组织液颜色较深，与反应后产生的颜色相同，该材料不能选用。红豆和茄子做实验材料，进行徒手切片，实验结果不明显。
（三）鉴定锰材料的选择
榛子、花生、干姜、瓜子等食物中锰的含量都较高，其中用榛子和花生做实验材料的结果很明显。反应前需将熟的榛子和花生放入冷水中加热浸泡10-15分钟以上，然后挑取果肉进行反应。选用干姜和瓜子作为实验材料，进行切片染色的实验效果不明显。
（四）鉴定锌材料的选择
花生、豆芽（豆瓣）、生姜等食物中锌的含量都比较高。其中花生要放入冷水中加热浸泡10-15分钟以上，用研磨得到的汁液参与反应。豆芽和生姜要取用新鲜的材料，以便研磨取得汁液。选用豆芽作为实验材料时，豆瓣比豆芽茎的实验效果更明显。
三、试剂
（一）钙的鉴定
选择0.1%、0.2%、0.3%三个浓度的草酸溶液。
（二）铁的鉴定
硫氰酸铵容易潮解，直接取用硫氰酸铵晶体参与反应。
（三）锰的鉴定
选用铋酸钠固体NaBiO3和10%的硝酸HNO3溶液。
（四）锌的鉴定
选择浓度为0.01%的双硫腙溶液作为锌离子的鉴定试剂。
四、方法与结果
（一）钙的鉴定
用研钵研磨黄豆芽的茎，获得豆芽茎的组织液。取4支干燥洁净的试管，分别标号1，2，3，4。在每个试管里先加入15滴豆芽茎的组织液，再在1号试管里加入5滴蒸馏水，2号试管里加入5滴0.1%的草酸溶液，3号试管里加入5滴0.2%的草酸溶液， 4号试管里加入5滴0.3%的草酸溶液。静置10分鐘后，1号试管底部没有沉淀，溶液澄清，2号、3号、4号试管中有沉淀生成，并且2号试管底部沉淀量最少，4号试管底部沉淀量最多。实验结果表明：豆芽茎中含有钙，与浓度为0.3%的草酸溶液反应产生白色沉淀最明显。
（二）铁的鉴定
取一片干燥洁净的载玻片，在载玻片的中央加一粒硫氰酸铵晶体，待潮解后，将菠菜切片置于载玻片中央的硫氰酸铵潮解液中，盖上盖玻片，制作成一张临时装片。用解剖针的背面轻轻敲打盖玻片，使得临时装片里的菠菜细胞分散开。在显微镜下观察，此时，只能看到绿色的菠菜叶片细胞。将制作好的临时装片放置8小时后，用显微镜观察。可以看到在绿色的菠菜叶片细胞中，有红色颗粒出现。实验结果证明菠菜细胞中有铁离子存在。
（三）锰的鉴定
取一张洁净干燥的载玻片，在载玻片的中央滴一滴浓度为10%的硝酸溶液，将熟的榛子放入冷水中加热浸泡10-15分钟以上，用解剖针挑取少许果肉放入载玻片中央的硝酸溶液中，再用解剖针挑取少许铋酸钠固体，放入中央的硝酸溶液中。盖上盖玻片，制作成一张临时装片。用解剖针的背面轻轻敲打盖玻片，使榛子细胞分散开。在显微镜下观察，可以看到淡黄色的榛子细胞。将制作好的临时装片放置1.5小时后，在显微镜下观察，可以看到榛子细胞的细胞质中，有紫色颗粒，并且随着实验时间加长，紫色颗粒逐渐连接成紫色区域。实验结果证明榛子细胞中有锰离子存在。
（四）锌的鉴定
取20粒豆瓣，放入研钵中加水充分研磨，纱布过滤，取其滤液备用。取一干燥洁净的比色板，在比色板的凹槽中各滴上一滴豆瓣研磨液，从左往右，第一凹槽滴上一滴清水，第二凹槽滴上1滴双硫腙溶液，第三凹槽滴上2滴双硫腙溶液，第四凹槽滴上3滴双硫腙溶液。反应后，第一凹槽没变化，其它均反应为粉红色。且随着双硫腙溶液量的增加，反应产生的红色逐渐加深。一般实验10分钟以后，反应的红色都会褪去，溶液呈现黄色。实验结果证明豆瓣中含锌离子。
参考文献：
微生物鉴定 篇7
微生物常规鉴定法主要根据《伯杰氏细菌鉴定手册》[8]对微生物形态学和生理生化水平及蛋白水平的鉴定,其包括对菌种进行革兰氏染色、芽孢染色、形态观察、碳源检测、吲哚试验、NaCl生长试验等。《伯杰氏细菌鉴定手册》是最常用的、经典的分类鉴定指标,也是现代化分类鉴定的依据,由美国布瑞德(Breed)等人主编。1923年第1版,后于1925年、1930年、1934年、1939年、1948年、1957年、1974年相继出版了第2版至第8版,每个版本都反映了当时细菌学发展的新成就。第9版(1984年,1986年)中实质性的变化,象征着细菌分类学的发展进入新的阶段[9]。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料为城市污水处理厂处理过的生活污水的污泥。取新鲜湿润的污泥10 g左右,在同一地方间隔7 d分别取3次作为对照。
1.2 试验材料
1.2.1 微生物分离纯培养。
将新鲜污泥于37℃、160 r/min振荡富集培养24 h后,取1 g至10 mL无菌水,于37℃、160 r/min振荡培养24 h后,取1 mL至10 mL PBS缓冲液中制成菌液,然后制备10-7~10-1的稀释液,在牛肉膏蛋白胨培养基中划单菌落,重复3次,最后挑选最多的5种,分别编号为A、B、C、D、E,将菌落进行纯培养后,于4℃冰箱保存以备后面使用。
1.2.2 微生物初步归类鉴定。
对挑选出的污泥中的主要菌种,分别通过细菌形态的观察、革兰氏染色、芽孢染色、荚膜染色、简单碳源利用鉴定等试验过程,获得这几个主要菌的基本性质,然后对照《伯杰细菌鉴定手册》的目录来进行大的分类,运用排除法和其他菌株特征在大的科目中进行属的对比鉴定,最后将菌株归结到最有可能的属中[9]。革兰氏染色、荚膜染色、芽孢染色按照传统方法进行。碳源利用主要进行淀粉的利用研究。
2 结果与分析
2.1 微生物分离纯化
将污泥倍比稀释后,涂布于牛肉膏蛋白胨培养基,37℃培养48 h,观察平板中各菌落的颜色、菌落形态、透明度、粗糙度等特征,记录各菌落的形态特征,并挑选5种主要的优势菌群。各菌落形态特征如表1所示。
2.2 革兰氏染色结果
将获得的5种优势菌分别进行革兰氏染色、芽孢染色和荚膜染色鉴定,结果如表2所示。
2.3 污泥微生物的初步归类鉴定
2.3.1 A、B、C菌的鉴定。
由于A、B、C菌革兰氏染色为阳性,都有芽孢,B菌有荚膜,A、C菌均无荚膜,C菌2次为阳性1次为阴性,故可以先根据伯杰氏细菌鉴定手册在大的分类上进行鉴定,到后面再细分。首先根据伯杰氏细菌鉴定手册,由于A、B、C菌3种菌均有芽孢,故分到芽孢杆菌和球菌这个大目录中去,里面分为芽孢杆菌科。芽孢杆菌科有:芽孢杆菌属,芽孢乳杆菌属,梭菌属,脱硫肠状菌属,芽孢八叠球菌属。
注:+表示阳性,-表示阴性。
(1)芽孢杆菌属。本属菌体杆状,直或接近直,多数运动,鞭毛典型侧生,形成抗热内生孢子,在一个孢子囊细胞中,孢子不多于1个。革兰氏染色反应为阳性,仅在生长早期为阳性、阴性。有机化能营养,利用多种底物进行严格呼吸代谢,严格发酵代谢或呼吸和发酵二者兼有的代谢。在呼吸代谢中,最终的电子受体是分子氧,一些种可以用硝酸盐代替氧,大多数种产生接触酶。严格好氧或兼性厌氧。发现各项特征与A、B、C菌株特征差别不大,故A、B、C菌暂时定为该属。
(2)芽孢乳杆菌属。本属细胞直杆状,单个,成对,很少呈短链。多数为不多的长周生鞭毛运动,形成内生孢子,革兰氏染色阳性。有机化能营养,发酵代谢已糖是通过仅仅产生乳酸的典型的同型发酵途径,不含有血红素化合物、乳接触酶或细胞色素,微好氧。10℃以下和45℃以上不生长,15~40℃生长良好。最适生长温度为35℃,最适发酵温度30℃。由于微好氧,与A、B、C菌种在大量氧气中生长环境差别很大,故排除。
(3)梭菌属。本属杆状,一般以周生鞭毛运动,很少不运动。形成卵圆到球形孢子,一般孢子使杆状菌体膨大。通常革兰氏染色为阳性,至少在生长的早期如此。有机化能营养,有些种是分解糖的,有的是分解朊的,有的二者兼备,有的两者皆否。发酵糖、多元醇、氨基酸、有机酸、嘌呤和其他有机化合物,均不还原硫酸盐。虽然有些种可在大气压下,在存在空气的情况下生长,但绝大多数菌株是严格厌氧的。通常发现于土壤、海水和淡水的沉淀物中,以及人和动物的肠道中。由于大多数菌株是严格厌氧的,故排除。
(4)脱硫肠状菌属。本属为直的或弯的杆菌,端圆,一般单生,有时呈链。以周生鞭毛运动,孢子卵圆到球形,端生到次端生,孢子使细胞轻度膨大。革兰氏染色阴性,在含有亚铁盐的乳酸盐,硫酸盐洋菜种产生黑色菌落。有机化能营养,呼吸代谢,生长要求含有还原性硫化合物和有机生长因素的特殊培养基,严格好氧,最适合温度为35~55℃,最高70℃。一般发现于土壤、淡水、地热带、某些腐败的食物、昆虫肠道中。革兰氏染色为阴性,与菌种革兰氏阳性不符合,故排除。
(5)芽孢八叠球菌属。本属细胞球形,呈规则四联或八叠。运动或不运动,形成内生孢子,革兰氏染色阳性。有机化能营养,产生能量的代谢是严格的呼吸型代谢,氧是最终电子受体,据报道仅在复杂的培养基中生长,最低营养要求尚不明确,严格好氧,为球菌,直接忽略。
2.3.2 D号菌种的鉴定。
由于D号球菌革兰氏染色为阳性,根据伯杰氏细菌鉴定手册故将其分到革兰氏阳性球菌这个大目录中,本目录下分为微球菌科,链球菌科,消化球菌科。
(1)微球菌科。细胞球状,运动或不运动,无休眠期,革兰氏染色为阳性,化能异养菌,呼吸或发酵代谢,当分解葡萄糖时产酸不产气,营养要求是可变的,好氧或兼性厌氧。
(2)链球菌科。细胞圆形或卵圆形,成对或成不同长度的链,或成四联球状。不动或很少运动,不形成芽孢,革兰氏染色阳性,化能异养菌,发酵代谢,利用碳水化合物生成乳酸、醋酸、甲酸、乙醇和二氧化碳。好氧或兼性厌氧。
(3)消化球菌科。球菌,单个成对,四联和不规则堆团排列,无鞭毛,运动型和内生孢子,革兰氏阳性,厌氧的化能异养菌,具有复杂的营养要求。
前2个科为好氧或兼性厌氧球菌,最后1个为厌氧球菌,故排除消化球菌科,链球菌科最低营养要求一般都是复杂的,并可能包括有氨基酸、嘌呤、嘧啶、肽、维生素,偶尔需要脂肪酸和高的二氧化碳张力度,故在牛肉膏蛋白胨培养基中一般很难生长,因此只在微球菌科中寻找。微球菌科分为微球菌属,葡萄球菌属,动性球菌属。
(4)微球菌属。细胞球形,单生,对生和特征性的向几个平面分裂而形成不规则的堆团,四联或立方堆,常常不运动,革兰氏染色呈现阳性,化能异养菌,代谢为严格的呼吸型,通常利用的含碳化合物为丙酸盐、乙酸杨、乳酸盐、琥珀酸盐、谷氨酸盐和碳水化合物,葡萄样氧化主要生成乙酸盐或完全氧化为水和二氧化碳。营养要求不一致,好氧,最适合生长温度为25~30℃,常见于土壤和淡水,也常见于人和其他动物的皮肤。
(5)葡萄球菌属。细胞球状,单个,成对排列及其特征性的多于一个平面分裂,形成不规则的堆团,不运动,革兰氏染色反应呈现阳性。化能异养菌,呼吸代谢和发酵代谢。特别在有空气时,许多碳水化合物可被利用,可以产生酸。在好氧条件下生长的更快和丰富,最适合生长温度为35~40℃。
(6)动性球菌属。本属为球菌,单个,成对,3个或四联排列。细胞具有鞭毛,运动,不形成芽孢,革兰氏染色反应呈现阳性,化能异养菌,呼吸代谢,从不发酵代谢,在标准培养基中葡萄糖、乳糖、蔗糖中不产生酸和气体。好氧,在20~37℃生长良好,见于海水中。
其中动性球菌属主要见于海水中,葡萄球菌属通常不分解淀粉并且部分为致病菌故都不在讨论范围内,因此D号菌为微球菌属。
2.3.3 E号菌种的鉴定。
E为革兰氏染色阴性球菌,无荚膜,无芽孢。先根据伯杰氏细菌鉴定手册目录可以清楚地找出有两大类:革兰氏染色阴性好氧杆菌和球菌;革兰氏阴性球菌和球杆菌。其中革兰氏好氧杆菌和球菌分为5个大科,下面分别列出各科的特征来进行粗选。
(1)假单胞菌科。本科为直的或弯曲的杆菌,以极生鞭毛运动,革兰氏染色为阴性,有机化能异养菌,呼吸代谢,永不发酵,有些是兼性化能自养菌,除了能利用反硝化作用作为厌氧呼吸的一些种外都是严格好氧菌,与D菌为球菌不符合,排除。
(2)固氮菌科。本科细胞大,革兰氏染色阴性,随着时间和生长条件的改变,细胞形态会发生剧烈变化,细胞成对排列,以周生或极生鞭毛运动或者不运动,不产生内生芽孢,异养,严格好氧,生长在土壤、水和叶表面。
(3)根瘤菌科。本科细胞无芽孢,通常为杆状,运动,好氧,革兰氏染色为阴性,能利用多种碳水化合物。与D菌球菌不符合,故排除。
(4)甲基单胞菌科。本科细胞单个,直、弯曲或分枝杆状,但不是螺旋状,异单极生鞭毛运动,革兰氏染色呈阴性,有机化能营养,呼吸代谢,用分子氧作为末端电子受体,甲烷和甲醇是已知的唯一碳源和能源,不需要有机生长素,严格好氧,生长温度为20~35℃,因为仅利用单碳有机化合物作为碳源,如甲烷或甲醇,故排除。
(5)盐杆菌科。盐杆菌科分为盐杆菌属和盐球菌属。盐杆菌属生长需要高浓度的氯化钠,细胞单个生长,极生丛毛运动或不运动,虽然生长需要高盐浓度,单革兰氏反应为阴性。化能异养菌,呼吸代谢,从不发酵,从氨基酸中获得能量并且在含糖的培养基中部产酸,含类胡萝卜素。专性好氧,生长在暴露到空气中的固体表面上,浅层的液体培养基,在30~50℃生长好,最适合温度为40℃,主要见于有足够的NaCl和其他需要的离子的地方。
盐球菌属:球状,成对,四联球菌状和不规则的成丛的四联状,不运动,革兰氏染色阴性。仅在2.5 g分子或更高的NaCl浓度存在的情况下生长,化能异养菌,呼吸代谢,从不发酵,好氧,故排除。
(6)革兰氏阴性球菌和球杆菌。这个目录下的细菌为球菌,呈对或成堆团,且相邻的一面扁平,或为成对或成短杆的杆状菌,无鞭毛,有些种表现为抽搐式运动,革兰氏染色阴性,有些种形成叶黄素色素,有些种在刚分离后有复杂的生长需求,但是后来可能在简单的合成培养基上生长,大多种产生接触酶和细胞色素氧化酶,好氧,最适温度为32~37℃,一般生长在哺乳动物的黏膜上,可以看出这个目录的菌株对生长环境要求都比较高,故这个目录下的都排除。因此,通过排除法大致可以确定D号菌为固氮菌科。
固氮菌科:本科有4个属分别为固氮菌属、氮单胞菌属、拜叶林克氏菌属和德克斯氏菌属,但是由于拜叶林克氏菌属和德克斯氏菌属都为杆菌,故首先排除。
固氮菌属:本属细胞为大卵圆细胞,细胞单个,成对或不规则堆团,罕见4个以上的细胞链,不形成芽孢,以周生鞭毛运动或不运动,革兰氏染色为阴性,一些菌株可产生荧光性荧光色素,在紫外光下呈绿色,生长培养基中含有水化合物(一般为葡萄糖)、醇类或有机酸,可以用钒代替,好氧条件下生长良好,最适温度为20~30℃,常见于土壤和水中。
氮单胞菌属:本属大的卵圆形细胞,细胞长短不一,可能是球状,细胞单个,成对或不规则堆团,不形成芽孢或孢囊,以极生或周生鞭毛运动,革兰氏染色阴性或可变,产生一种水溶性荧光色素,在紫外光下呈白色,生长培养基通常含有葡萄糖和蔗糖。有氧情况下生长良好,最适合生长温度为20~30℃,见于土壤和水中。
通过以上鉴定过程可以大概确定E号菌为氮单胞菌属。
3 结论与讨论
通过3次在同一地点的重复取样来进行相同的后续试验进行总结对比以提高试验的准确性,在3次试验组中选取数量最多的5组菌株为目标菌株首先进行细菌形态、菌落形态的观察和革兰氏染色、芽孢染色、荚膜染色、简单碳源利用鉴定,再对比《伯杰细菌鉴定手册》可以初步得出:A、B、C菌为芽孢杆菌属,D菌为微球菌属,E菌为氮单胞菌属。
《伯杰细菌鉴定手册》是一本有代表性的、参考价值极高、比较全面系统的细菌分类手册。对系统内的每一属和种都做了较详细的属性描述。近年来,由于细胞学、遗传学和分子生物学的渗透,大大促进了微生物分类学的发展,出现了多种现代化分类方法[10,11]。一是化学分类鉴定法。20世纪50年代中期,Cummins和Harris建立起来的化学分类鉴定法主要通过微生物细胞壁化学成分即氨基酸和糖的分析进行分类鉴定[12],属的分类主要测定各种氨基酸组分,种的鉴定主要是对糖的分析。另外,还有全细胞水解液糖型分析、脂肪酸分析、磷酸类脂成分分析、枝菌酸分析、醌类分析和光和色素成分分析等,常使用红外光谱等新技术。二是分子遗传学分类鉴定法。此法包括对微生物染色体DNA(G+C)摩尔百分含量的测定、核酸杂交技术、限制性核酸内切酶分析法、质粒图谱分析法、脉冲场凝胶电泳分析法、PCR技术、16srRNA序列和16S-23SrRNA间区序列分析法、微生物全基因组测序等。特别是16S RNA基因序列分析技术的出现,使微生物进化与否可以通过试验研究来证实,这是微生物分类史上的一次革命[13]。三是数值分类法。数值分类法是近20年来发展起来的微生物分类理论,它应用大量已知菌对相关生化试验反应出现的频率得出数据进行分析,优化组合数10项生理生化指标集合成套试剂,根据相似系数大小判断微生物种属间的亲源性。自动化微生物鉴定系统即采用数值分类原理。目前应用较多的自动化鉴定系统主要有API细菌数值鉴定系统(适用细菌有700多种),Biolog全自动微生物鉴定系统[14],Enterotube系统,MIDI等鉴定系统[15]。
展微生物学杂志,,():
摘要：微生物处理污泥是目前污泥处理中较先进的方法,但常受到微生物来源菌株的限制。污泥里的微生物是处理污泥的很好内源菌群。为了考察污泥中的微生物分布,同时获得污泥中的优势菌群,本研究通过对污泥进行划线培养,选取数量最多的5组菌株为目标菌株,进行细菌形态、菌落形态的观察和革兰氏染色、芽孢染色、荚膜染色、简单碳源利用鉴定,再对比《伯杰细菌鉴定手册》对获得菌株进行种属鉴定。初步得出:A、B、C菌为芽孢杆菌属,D菌为微球菌属,E菌为氮单胞菌属。
微生物鉴定 篇8
1材料与方法
1.1 材料
XK型自动微生物鉴定药敏分析系统及其配套肠杆菌、非发酵菌、葡萄球菌、链球菌等鉴定和药敏试剂盒由山东鑫科生物科技有限公司生产。VITEK32全自动微生物鉴定药敏分析系统及其配套GNI/GNS、GPI/GPS试剂卡购买自法国生物梅里埃 (济南代理) 公司。
1.2 标本来源
101株新鲜纯培养菌株, 其中98株临床新鲜纯培养的菌株均来自聊城市人民医院门诊及住院患者;3株质控菌株购买自卫生部临检中心 (大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、金黄色葡萄球菌ATCC29213) 。
1.3 方法
对98株临床标本常规接种、分离按《全国临床检验操作规程》[3]进行。所得菌株分别用XK型自动微生物鉴定药敏分析系统和VITEK32全自动微生物鉴定药敏分析系统鉴定到种, 按各自的操作说明进行, 对于两者结果不一致的菌株要进行重复测试, 如还不一致则用手工法予以确认。
2 结果
XK型自动微生物鉴定药敏分析系统、VITEK32全自动微生物鉴定药敏分析系统对101株细菌鉴定, 菌种一致的98例占97.0%, 菌属一致的2例占2.0%, 不符合的1例占1.0%。见表1。药敏分析2系统的MIC符合率为:大肠埃希菌为100.0%, 肺炎克雷伯菌为83.3%, 黏质肠杆菌为87.5%, 普通变形杆菌为100.0%, 铜绿假单胞菌为100.0%, 洋葱伯克霍尔德菌为83.3%, 嗜麦芽窄食单胞菌为85.7%, 人葡萄球菌为100.0%, 金黄色葡萄球菌为100.0%, 表皮葡萄球菌为90.0%, 屎肠球菌为100.0%, MIC总符合率为93.6%。
3讨论
与VITEK32全自动微生物鉴定及药敏分析系统比较, XK型自动微生物鉴定药敏分析系统鉴定总符合率为99.0%, 其中菌种鉴定符合率为97.0%, 菌属鉴定符合率为2.0%, MIC符合率为93.6%。
本次实验在XK型自动微生物鉴定药敏分析系统的结果鉴定过程中将“铜绿假单胞菌”鉴定为“睾丸酮从毛菌”, 其原因可能是:在接种试剂盒过程中由于暴露时间过长污染所致。
本结果显示, XK型自动微生物鉴定药敏分析系统和VITEK32全自动微生物鉴定及药敏分析系统对非发酵菌的鉴定出现不符合的情况。其原因可能是此两法都属于生理学与生物化学鉴定分析法, 细菌的生理生化特征是其鉴定的主要依据。而影响细菌生理生化反应特性的因素有:细菌的生长阶段不同, 生理生化反应能力不同;某些长期使用抗生素的患者, 其病原菌有可能失去了典型的生理生化特性等, 可能影响鉴定结果的一致性[4]。通过综合分析, 鉴定和药敏结果是可靠的。
摘要：目的 评价XK型自动微生物鉴定药敏分析系统的适用性。方法 通过XK型自动微生物鉴定药敏分析系统和VITEK32自动微生物鉴定及药敏分析系统分别对101株新鲜纯培养菌株进行鉴定及药敏分析, 并对结果 进行比较。结果 2种微生物鉴定药敏分析系统的鉴定总符合率为99.0%, 其中菌种鉴定符合率为97.0%, 菌属鉴定符合率为2.0%, MIC符合率为93.6%。结论 XK型自动微生物鉴定药敏分析系统与VITEK32全自动微生物鉴定药敏分析系统鉴定及药敏分析结果 有较好的一致性, 且操作简便、快速, 值得推广应用。
关键词：XK型自动微生物鉴定药敏分析系统,性能,菌株
参考文献
[1]李慧.一种新的细菌药敏试验方法的探讨[J].医药世界, 2006, 8 (9) :63-64.
[2]冯莉, 王建海.KONT真菌显色MIC药敏与ROSCO药敏纸片的对比研究[J].实用医技杂志, 2006, 13 (22) :4102-4103.
[3]叶应妩, 王毓三.全国临床检验操作规程[M].3版.南京:东南大学出版社, 2006:10.
微生物鉴定 篇9
本实验利用体外筛选模型[9]从土壤中筛选到一株产α-葡萄糖苷酶抑制剂的菌株UN-8[10],其代谢产物对α-葡萄糖苷酶有较强的抑制作用,经分离鉴定,活性物质的分子量在1 000 Da以上。目前未见有相关文献报道,为课题后续研究提供了拓展空间。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料:
菌株UN-8由作者实验室保藏。
1.1.2 试剂:
4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷,美国Sigma公司;α-葡萄糖苷酶,美国Sigma公司。
1.1.3 仪器:
J2-21高速冷冻离心机,美国Beckman公司;UV-1601紫外分光光度计,日本SHIMADIU公司;RE-52A型旋转蒸发器,上海亚荣生化仪器厂;中空纤维超滤系统,Pharmacia公司;Sephadex G25凝胶自装柱与Superdex Peptide 10/300GL预装柱,Bio-Rad公司;LC-10AVP型高效液相色谱仪,日本岛津公司。
1.1.4 培养基
①初始发酵培养基(g/L):
可溶性淀粉 20,酵母膏 10,K2HPO4 1,KNO3 0.5,NaCl 0.5,MgSO4·7H2O 0.5,FeSO4·7H2O 0.01,蒸馏水1 000mL,pH值7.2～7.4;
②优化后发酵培养基(g/L):
木薯淀粉 20,黄豆粕粉 10,K2HPO4 1,KNO3 0.5,NaCl 0.5,MgSO4·7H2O 0.5,FeSO4·7H2O 0.01,蒸馏水1 000mL,pH值8.0。
1.2 方法
1.2.1 种子培养方法
无菌条件下,刮取一环斜面孢子于50 mL种子培养基(250 mL锥形瓶)中,28 ℃、160 r/min培养24 h,得种子液。
1.2.2 发酵培养方法
无菌条件下,用移液枪移取2 mL种子液于装50 mL发酵培养基(250 mL锥形瓶)中,置于摇床中,28℃、160 r/min发酵培养3 d,得发酵液。
1.2.3 α-葡萄糖苷酶抑制剂活性测定
采用PNPG-紫外分光光度计法[11],即取100 μL待测样品(用去离子水稀释10倍)于玻璃试管中,依次加入400 μL磷酸缓冲液(pH 6.8),100 μL α-葡萄糖苷酶,混匀,置于37℃恒温水浴锅保温15 min,加入400 μL 5 mmol/L底物PNPG,混匀,于37℃恒温水浴锅中反应15 min,加入2 mL 0.5 mol/L Na2CO3溶液终止反应,对照组以蒸馏水代替样品,最后采用紫外分光光度计在405 nm波长处测定各管溶液的吸光值。
1.2.4 发酵液预处理
将发酵液置于4℃高速冷冻离心机,除去菌体及发酵液中其他大颗粒物质,收集上清液。上清液浓缩5倍,加入2倍体积冰乙醇,密封,于4℃冰箱中静置1～2 h,离心,收集上清液,除乙醇,经活性炭脱色,过滤,于4℃冰箱保藏,备用。
1.2.5 采用透析袋判断活性抑制剂的分子量范围
分别选取截留分子量为3 500 Da和1 000 Da两种透析袋对发酵液进行透析试验。将大约1/2透析袋体积的发酵液装入袋内,置于装有去离子水的烧杯中,于磁力搅拌器上边搅拌边透析,每隔4 h换一次水,透析完毕,将透析内液与透析外液浓缩至原体积,分别测定各溶液对α-葡萄糖苷酶的的抑制率。
1.2.6 中空纤维超滤
采用0.45 μm有机滤膜对脱色后发酵液进行过滤,去除颗粒性杂质,澄清液经截留量为3 000 Da的中空纤维超滤系统超滤,收集分子量小于3 000 Da的流出液,置于4℃冰箱中保存,备用。
1.2.7 采用Sephadex G25凝胶柱层析分离纯化活性抑制剂[12]
量取步骤1.2.6中滤液3 mL,上柱,超纯水洗脱,洗脱流速控制在0.5 mL/min,每管收集1.5 mL,共收集75管。分别测定各管溶液对α-葡萄糖苷酶的抑制活力。
1.2.8 采用Superdex Peptide 10/300GL进一步分离纯化活性抑制剂
将步骤1.2.7中抑制活力最高的一管样品浓缩,经0.2 μm微孔过滤膜过滤除去样品中气泡,采用Superdex Peptide 10/300GL凝胶柱进一步分离纯化。
1.2.9 紫外分光-可见光度分析
将活性抑制剂用超纯水稀释一定的倍数,以超纯水作对照,采用酶标仪在波长190～1 000 nm范围内进行紫外扫描,确定活性抑制剂的吸收峰。
1.2.10 高效液相色谱检验样品纯度
检验活性抑制剂的高效液相色谱条件为:所用分析柱为C18柱(规格4.6 mm×250 mm,5 μm),检测器为紫外检测器,检测波长为200 nm,以甲醇:水(V/V)=3:7的混合溶液作为流动相,进样量10 μL,控制流速为0.5 mL/min。
1.2.11 傅里叶变换红外光谱仪定性分析[13]
将样品溶液置于真空旋转蒸发仪浓缩干燥,得到固体样品,然后将样品与KBr压制成透明薄片(直径约13 mm,厚度约1 mm),在波数400～4 000 cm-1 范围内,扫描样品信号,经傅里叶变换干涉信号即得到样品的红外光谱图。
1.2.12 质谱检测
取样品0.5 μL,采用AB 4800 MALDI-TOF-TOF 质谱仪测定其分子量。
1.2.13 硅胶薄层色谱分析活性抑制剂
本实验所用展开剂系统为:乙酸乙酯:吡啶:无水乙醇:水(V/V/V/V) =8∶1∶2∶2,显色剂系统为:苯胺-二苯胺-磷酸显色剂系统,配方比例为:苯胺(2%,m/v):二苯胺(2%,V/V ):磷酸 (85%,V/V )=5∶5∶1。
2 结果与分析
2.1 分离纯化
2.1.1 发酵液预处理所得α-葡萄糖苷酶抑制率
2.1.2 Sephadex G25凝胶柱层析分离纯化结果
取经脱色处理的样品3 mL,沿柱壁缓缓加入已装好凝胶柱中,用超纯水洗脱,流速控制在0.5 mL/min,每管收集1.5 mL,共收集75管。测定每支管中的液体对α-葡萄糖苷酶的抑制能力,实验结果如图1所示。
由图1可知,经过Sephadex G-25凝胶柱分纯后,活性抑制剂主要分布在第40～61管之间,而活力最高管为第47号和48号管,因此将这两管样品合并浓缩,为后续实验做准备。
2.1.3 Superdex Peptide 10/300GL分离纯化结果
经过Superdex Peptide 10/300GL柱子分离后,共收集40管,图谱如图2所示。
测定每管溶液对α-葡萄糖苷酶的抑制率,活性抑制剂主要集中在第A4～A9管之间,而活力最高的为第A8管,因此将第A8管用于结构的初步分析。
2.2 初步鉴定
2.2.1 紫外可见光谱分析结果
由图3可知,样品溶液在200 nm处有最大紫外吸收峰,因此,选择200 nm作为样品的紫外检测波长。
2.2.2 高效液相色谱检测样品纯度结果
由图4 显示,样品经 HPLC分析呈现单一对称峰,可见其α-葡萄糖苷酶抑制剂活性物质是一种均一成分。
2.2.3 傅里叶变换红外光图谱
由图5可知,样品在4 000 cm-1到400 cm-1之间的主要特征吸收峰有3 394.61 cm-1、2 946.15 cm-1、1 651.93 cm-1、1 402.71 cm-1、1 149.60 cm-1、1 035.82 cm-1、526.44 cm-1,其中3 600 cm-1～3 200 cm-1和1 665 cm-1～1 635 cm-1之间的两组峰,表明该活性抑制剂可能是糖类物质。在3 394.61 cm-1处有宽的强吸收峰, 证明是分子间氢键O-H的伸缩振动峰,2 946.15 cm-1处为C-H的伸缩振动峰,1 651.93 cm-1处为C=C、N-H或者C=O的伸缩振动峰,1 402.71 cm-1处为C-N伸缩或者C-H弯曲振动,1 149.60 cm-1和1 035.82 cm-1处为醚的伸缩振动峰。
2.2.4 质谱检测结果
由图6可知,质谱图中呈现一个明显的离子峰,[M+H+]=1 229.8,因此该活性抑制剂的分子量为1 228.8。
2.2.5 硅胶薄层层析结果
由图7可知,通过苯胺-二苯胺-磷酸显色后,活性抑制剂得到了一定程度的纯化,并且显示了糖的特性,因此,活性抑制剂应属于糖类物质,在硅胶板上具有与糖相同的性质。
3 讨论
目前有很多学者采用化学合成法来制备α-葡萄糖苷酶抑制剂[14],但步骤繁杂,副产物多。也有学者从中草药植物中筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂[15],但由于原料有限,活性物质纯度低,至今未工业化生产。倪孟祥等人从海洋微生物的代谢产物中分离得到α-葡萄糖苷酶抑制剂[16],但没有给出明确的成份鉴定。
由于活性物质分子量为1 228.8,而每个葡萄糖分子量为180,若假设活性抑制剂是由若干个葡萄糖或(和)其他单糖连接而成的,则推测该物质应是一种由7～8个单糖组成的天然寡聚糖。寡聚糖具有很多独特功能,比如低聚异麦芽糖、低聚果糖、低聚半乳糖等,不仅能能显著增加人体肠道益生菌(比如双歧杆菌、乳酸杆菌)数量,还能抑制腐生菌生长,从而改善肠道微生态,有益于人体健康。此外,此类寡聚糖还具有抗龋齿、进食后不会出现血糖升高、不引起肥胖等优势。而阿卡波糖是一种假性四糖,虽然在结构上与寡糖非常相似,但不具备低聚寡糖的这些独特优势,而且在降血糖过程中患者还会出现腹胀、腹泻、腹部不适等不良症状。因此,该活性抑制剂具有很大的研究意义及探索价值。
4 结论
作者从土壤中筛选到产α-葡萄糖苷酶抑制剂菌株,首先通过层析等方法对发酵液中抑制剂进行分离提纯,然后通过质谱鉴定显示活性物质分子量为1228.8,最后结合紫外-可见光光谱扫描、傅里叶红外光谱扫描以及硅胶薄层层析对物质结构做了初步分析,结果表明活性物质应属于寡糖,其精确结构还有待进一步研究。
摘要：目的:分离纯化发酵液中的α-葡萄糖苷酶抑制剂,并对其结构进行初步鉴定。方法:通过预处理发酵液、活性炭脱色、中空纤维超滤、Sephadex G25葡聚糖凝胶层析以及Superdex Peptide 10/300GL预装柱层析等方法对发酵液中的活性抑制剂进行了分离纯化,通过质谱鉴定确定其分子量,结合紫外-可见光光谱扫描、傅里叶红外光谱扫描以及硅胶薄层层析对该物质的结构进行初步分析。结果:经分离纯化,该物质的高效液相色谱图呈单一对称峰,通过质谱确定其分子量为1 228.8,经初步鉴定该抑制剂应属于寡糖类物质。结论:提取了发酵液中的α-葡萄糖苷酶抑制剂,其分子量为1 228.8,目前未见有文献报道,为糖尿病新药研发奠定了基础。
微生物鉴定 篇10
1. 资料与方法
1.1 一般材料:
纳入2013年5月至2015年2月我院临床多科室采取的患者的排泄物作为临床标本, 以其中分离出的45株革兰阳性菌、48株非重复革兰阴性菌, 同实验室中保存的40株革兰阳性菌和40株革兰阴性菌为参考菌种。选用仪器为Vitek 2 Compact全自动微生物鉴定药敏分析仪, 在选择标本时排除超出该分析仪器鉴定范围的菌种。
1.2 方法:
挑取单个菌落传代1次, 所用培养基为哥伦比亚琼脂+5%羊血培养基, 35˚C条件下培养18~24h, 使用Vitek 2 Compact全自动微生物鉴定药敏分析仪中随机附带的0.45%的无菌盐水3m L, 制备成0.50~0.63Mc F菌悬液, 将其滴入试管内与药敏卡一同放置在Vitek 2 Compact的卡架上, VITEK®2 COMPACT采用动力学方法, 每15min判读卡片1次, 将Vitek 2 Compact卡架置于孵育仓内进行药敏测定和细菌孵育。
1.3 鉴定标准:
对于菌株的鉴定均以API细菌鉴定范围为参考[3]。
1.4 统计学分析:
用SPSS17.0统计软件分析, 计量资料采用率 (%) 表示, 统计学软件来源于网络资源, P<0.05为差异有显著性意义。
2. 结果
2.1 全动微生物鉴定药敏分析仪鉴定结果:
鉴定的菌种有肠杆菌属、非发酵糖菌、微球杆菌以及链球菌属。革兰氏阴性菌由非发酵糖菌和肠杆菌组成共88株鉴定出85株, 占比为96.6%。革兰氏阳性菌由微球杆菌和链球菌属组成共85株, 鉴定出80株。占比率为94.1%。两组数据对比差异无统计学意义 (P>0.05) , 见表1。
2.2 鉴定时间:
革兰氏阳性菌鉴定有82株在6小时内鉴定完成, 占95.3%, 在9小时内完成的占4.7%。革兰氏阴性菌鉴定均为6小时内完成, 占100%。
3. 讨论
多种病原微生物所致的传染病遍布临床各个科室, 患者接触的细菌较多, 其疾病主要由细菌感染所引起最为常见。抗菌药物被广泛用于临床, 抗菌药物能够挽救和治愈了患者的生命, 但如果使用不当如药物的计量和种类选择错误, 会增加患者的不良反应, 增长细菌的耐药性等, 危机患者的健康甚至生命。所以为了减少病患的痛苦能够及早的对症治疗, 需要及时准确的对细菌进行鉴定。
何文秀[4]在对全自动微生物鉴定药敏分析仪的临床应用价值分析中, 显示菌鉴定的准确率为95.00%, 对革兰阴性菌鉴定的准确率为96.08%。证明采用Vitek 2 Compact全自动微生物鉴定药敏分析仪对实验菌株进行鉴定选取的革兰氏阳性菌由微球杆菌和链球菌属和革兰氏阴性菌由非发酵糖菌和肠杆菌检出率分别为94.1%和96.6%, 具有较高的检出率, 可有效及时的鉴定致病菌, 全自动微生物鉴定药敏分析仪不仅提供灵活方便的标准板和用户定制板, 还适合各规模的实验室[5]。王瑶等[6]根据临床和实验室标准协会 (CLSI) 规定的药敏折点, 对Vitek 2 Compact和Etest法测得的药敏结果进行解释, 在全部的1626株细菌一抗生素组合中, Vitek 2 Compact药敏测定的标准符合率 (CA) 为90.83%, 严重错误 (VME) 为4.91%, 重大错误 (ME) 为2.09%, 一般错误 (MIE) 为6.40%。90%以上的肠杆菌科菌、非发酵糖菌、微球菌科菌和链球菌科菌分别在11、13、11和12h内完成测定。32株ESBL阳性菌以Vitek 2Compact检测均为阳性。认为Vitek 2 Compact能够对临床相关革兰阴性菌和革兰阳性菌的药物敏感性进行准确、快速的测定, 对ESBLs检测的敏感性、特异性高, 是临床微生物实验室的有利工具。可见, 先进的荧光检测技术, 应用于微生物鉴定及药敏测试, 灵敏度高, 检测方便, 但本实验为小样本评估, 进一步的检测及鉴定性能还需要更大样本量的评估。
综上所述全自动微生物鉴定药敏分析仪对临床细菌的鉴定能够获得准确结果, 值得临床推广。
摘要：目的:探索全自动微生物鉴定药敏分析仪在临床中的应用价值。方法:随机选取2013年5月至2015年2月我院临床多科室采取的患者的排泄物作为临床标本, 以其中分离出的45株革兰阳性菌、48株非重复革兰阴性菌, 同实验室中保存的40株革兰阳性菌和40株革兰阴性菌为研究对象, 应用全自动微生物鉴定药敏分析仪对其进行鉴定, 和所需鉴定时间。结果:全自动微生物鉴定药敏分析仪的革兰氏阴性菌由非发酵糖菌和肠杆菌组成共88株鉴定出85株, 占比为96.6%。革兰氏阳性菌由微球杆菌和链球菌属组成共85株, 鉴定出80株。占比率为94.1%。两组数据对比差异无统计学意义 (P>0.05) 。兰氏阳性菌鉴定有82株在6小时内鉴定完成, 占95.3%, 在9小时内完成的占4.7%。革兰氏阴性菌鉴定均为6小时内完成, 占100%。结论:全自动微生物鉴定药敏分析仪可准确鉴定临床细菌, 方便了临床医生为患者制定合理用药发案, 缩短的治疗时间。
关键词：全自动微生物鉴定药敏分析仪,革兰阴性菌,革兰阳性菌
参考文献
[1]娄立革.全自动微生物鉴定药敏分析仪的临床应用价值分析[J].中国医疗器械信息, 2015, 21 (2) :90.
[2]谢世营.分析全自动微生物鉴定药敏分析仪的临床应用价值[J].现代养生, 2014, 35 (6) :750-751.
[3]谢世营.分析全自动微生物鉴定药敏分析仪的临床应用价值[J].国际检验医学杂志, 2014, 35 (6) :750-751.
[4]何文秀.对全自动微生物鉴定药敏分析仪的临床应用价值分析[J].当代医药论丛, 2015, 13 (5) :48.
[5]刘杰, 赵满仓, 周海峰.VITEK-Ⅱ全自动微生物鉴定系统在室间质评中的应用研究及对策[J].医学综述, 2014, 20 (17) :3215-3217.
微生物鉴定 篇11
关键词：物质鉴定；改进建议
中图分类号：G427 文献标识码：A 文章编号：1992-7711（2014）02-088-1
“鉴定生物组织中的糖类、脂肪、蛋白质”是高中生物苏教版《分子与细胞》中一个重要的学生实验，也是学生进入高中接触的第一个生物实验。高一新生的思维方式正以形象思维为主向抽象思维为主过渡，通过教师对实验原理的讲解，他们迫切希望通过自己的实际操作进一步认识生命的本质。精心组织该实验，会较好地培养学生的基本实验技能，如徒手切片技术、制作临时装片、显微镜操作、水浴加热等，激发学习生物的兴趣。该实验内容与学生的实际生活密切联系，整体操作难度较小。为了增强实验效果，同时加强实验的探究性和实用性，结合本人的教学实际经验，现对实验材料及实验步骤提出如下建议：
一、还原性糖的鉴定
雪梨、苹果、白萝卜、白萝卜组织液都可以作为实验材料，但是也各有特点和区别。苹果组织液必须新制，否则因为苹果多酚氧化酶的作用，使之很快氧化呈褐色，影响后面实验颜色的观察，尤其是根据实验正常进度，本实验一般在气温较高的初秋进行，氧化酶的作用速度更快，组织液很易被氧化成褐色，将反应产生的颜色掩盖，这样给实验材料的制备增加了麻烦。经实验，一般雪梨、白萝卜、白萝卜组织液实验效果较好，不仅本身原液无色较透明，而且放置时间较长而不变色，但是其中梨的成本也比较高。所以从实验效果和经济条件来看，选择廉价易得的白萝卜，用其制备的组织样液如果当天用不完，可以储备起来第二天使用，不变色而且仍然能取得良好的实验效果。
例如，选择较便宜的白萝卜做实验材料。将白萝卜切成小块，放入简易的手压式榨汁机中，通过旋转挤压制备组织样液，一般一组只需一块白萝卜，一节课10个实验小组只需23个白萝卜，而且要求每组学生自己动手制备组织样液，提高了学生的动手能力和合作能力。增加对照组：A组：5%葡萄糖2mL+斐林试剂2mL；B组：白萝卜组织样液2mL+斐林试剂2mL；水浴温度为90℃左右，实验现象即可较快出现，节约时间，和沸水浴相比，危险性较小。A、B组对照说明白色萝卜中富含可溶性还原糖。
二、脂肪的鉴定
核桃、蓖麻、花生、松子种子脂肪含量较高，理论上都可以作为鉴定脂肪的实验材料。但是核桃果皮坚硬、取材不太方便、细胞中脂滴多，蓖麻种子又比较少见。花生种子常见，而且种皮柔软、脂滴少一些，干燥的花生种子需要在实验的前一天晚上开始浸泡，所以比较而言，选择花生种子比较适宜。松子的脂肪含量要比花生还丰富，实验现象更明显，可供有条件的学校选择使用。定性实验中只要有特异的颜色反应，就能确定某种物质是否存在。为了增强实验的对照性和说服力，建议让学生从家里带一些植物油来，使油滴漂浮于水面，再滴加一滴苏丹Ⅲ染液，马上就可清晰地看到被染成橘黄色的油滴。
例如，在选择花生作为实验材料时，最关键的是徒手切片这一步。建议在实验前对学生进行详细指导：切片时应臂部用力，而不是腕部用力。3个手指捏住花生种子时要注意食指低于种子，拇指低于食指，然后水平拉片，这是保证不伤手指的关键。切下的材料愈薄愈好，拉片时刀片与种子切面最好有一点角度，这样在切下的材料最薄的一侧就只有一两层细胞了，观察这个部位的材料细胞中橘黄色脂滴非常明显。
三、蛋白质的鉴定
豆浆、牛奶、鸡蛋清等都是常用的材料，但是豆浆、牛奶都有严重的白色浑浊，影响后面实验颜色的观察。鸡蛋清无色、清澈透明，蛋白质含量也比较高，实验颜色反应显著，但是如果用鸡蛋清，必须按要求稀释，否则影响实验效果，而且实验后易粘住试管壁不易洗刷。
建议将实验材料改为熟鸡蛋清（蛋白质变性后虽然空间结构被破坏了，但是肽链之间的肽键依然存在，使学生进一步理解双缩脲试剂是与肽键发生反应），为了使反应充分，可对熟鸡蛋清进行研磨，课前将鸡蛋煮熟，剥取出蛋白，磨成小颗粒。向试管内加入少量的鸡蛋白颗粒。加入双缩脲试剂A液1mL，震荡片刻。再滴加双缩脲试剂B液5滴，震荡。静置2min后，可观察到溶液变为紫色。用鸡蛋白做检测实验，既消除了蛋白质变性后不能与双缩脲试剂生成紫色的误解，又避免了蛋清稀释、反应后试管难以清洗的麻烦。实验操作方便，材料准备简单。调动了学生的积极性，提高了实验效率，也降低了实验的难度。
通过学生实验结果和操作过程表明，改进后的实验效果从总体来讲是优于原实验设计的，减少了实验器材的使用，缩短了实验时间，使实验操作更加简便易行，体现了实验的科学性与实用性。改进后由于实验时间充足，还可以让学生自己探究生活中感兴趣想探究的材料。
“鉴定生物组织中的糖类、脂肪、蛋白质”在医药、化工和食品加工等方面有广泛的应用。建议教师在研究性学习中纳入有关课题，例如利用课余时间，组织实验小组去附近医院，调查尿糖、尿蛋白的鉴定方法及其鉴定原理；为糖尿病患者推荐几种可日常饮用的饮料；鉴定奶粉等食品中蛋白质的含量等等。这就把书本上的知识真正运用到了实际生活中去，符合学生发展的需求，也符合新课程理念中理论与实际相结合的观点。
微生物鉴定 篇12
以中国著名木材科学与技术专家、中国工程院院士李坚教授为首的专家委员会, 听取了项目负责人、技术负责人的成果汇报, 对该项技术成果给予了充分肯定和高度评价。
“生物质材料的环境友好型高效阻燃技术”是在科技部国际科技合作项目的支持下取得的。
该技术在阻燃三聚氰胺改性脲醛树脂制备技术和阻燃木质表面装饰层积材制备技术方面取得重要突破。开发的阻燃三聚氰胺改性脲醛树脂胶粘剂集胶合与阻燃功能于一体, 其胶合性能达到国家标准要求的Ⅱ类 (室内应用) 水平, 甲醛释放量符合国家标准E1级;开发的阻燃木质表面装饰层积材集阻燃和装饰功能于一体, 可使木质材料获得良好的阻燃性能。贴覆到未阻燃处理的胶合板、刨花板和中密度纤维板表面, 工艺简便可行。阻燃木质表面装饰层积材阻燃等级达到了GB8624的B级, 利用阻燃木质表面装饰层积材开发的阻燃胶合板 (厚度15mm) 达到了GB8624B (B1) 级。
该成果在胶合板、地板等企业进行了应用, 结果表明, 该成果技术成熟、先进, 具备了工业化生产条件, 应用前景广阔。该成果已取得发明专利2项, 发表论文10篇, 出版专著1部, 起草国家标准1项。