沙棘总黄酮

2024-07-17

沙棘总黄酮（共7篇）

沙棘总黄酮篇1

沙棘 (Hippophae rhamnoides L.) 为胡颓子科沙棘属灌木或小乔木, 其干燥成熟的果实是我国蒙医、藏医传统习用药材, 1977 年沙棘首次收载于《中国药典》, 具有止咳祛痰、消食化滞、活血散瘀的功效[1]。近年来沙棘作为天然药食两用原料, 广泛应用于食品、保健品、药品、化妆品等行业。沙棘中含有200多种化学成分, 沙棘黄酮为其重要的生物活性成分, 在其药用开发中占有重要的地位。具有抗心肌缺血、抗心率失常, 提高耐缺氧能力、降低血清胆固醇、抑制血小板聚集、抗溃疡、抗肿瘤、抗炎、抗过敏、抗氧化、抗衰老、抗辐射和抗菌、抗病毒及增强免疫等广泛的药理作用[2]。

沙棘黄酮类化合物主要包括异鼠李素、槲皮素、山奈酚及其苷类芦丁等成分[3], 广泛存在于沙棘植物的各个部位, 其中沙棘叶中总黄酮含量明显高于果实和籽中[4], 叶中总黄酮含量分别是果肉和果皮的2.3 倍和3.1 倍[5]。目前, 国内医药工业上沙棘黄酮类物质主要从沙棘果、果渣和籽中提取而得, 从沙棘叶中提取总黄酮的报道较少。而沙棘叶中总黄酮含量又与产地、采收期、沙棘雌雄株等因素有关, 为了充分利用沙棘优势资源, 分别对山西沙棘主产地同一产地不同采收期、不同产地相同采收期的沙棘各种果色类型植株叶及其雌雄株叶中总黄酮的含量进行测定研究, 可为合理评价和利用山西沙棘叶资源提供科学参考依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器与设备

290SCS电子天平 (瑞士PRECISA) , GZX-9076MBE电热恒温鼓风干燥箱 (上海博迅) , HH-4恒温水浴锅 (常州国华) , SHB-Ⅲ循环水式真空泵 (郑州长城) , RE5298A旋转蒸发器 (上海亚荣) , UV757CRT紫外可见分光光度计 (上海精科) 等。

1.2 材料与试剂

沙棘叶分别采自山西古交市石千峰林场、沁源县鱼儿泉乡、隰县下李林场、方山县积翠乡和交城庞泉沟的野生沙棘林, 经干燥、粉碎过20 筛;芦丁对照品 (供含量测定用, 批号: 100080-200707) 购于中国药品生物制品检定所;其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 样品预处理

分别将2010年5~10月份采自古交的各类沙棘橙黄果叶、桔红果叶、雄株叶和2010年9月份采自上述五个产地的各类沙棘黄果叶、橙黄果叶、桔红果叶、红果叶、雄株叶经过去刺除杂, 自然干燥后粉碎, 过20 目筛, 药粉密封, 分类标记, 放入干燥器中备用。

2.2 总黄酮含量测定

参照《中国药典》2010年版一部沙棘项下总黄酮含量测定方法进行。

2.2.1 对照品溶液的制备

精确称取在120℃下干燥至恒重的芦丁对照品20.08mg, 置于50m L量瓶中, 加入适量60%乙醇, 置水浴上微热使其溶解, 放冷, 加60%乙醇定容至刻度, 摇匀。精确量取25m L, 置50m L量瓶中, 加水稀释至刻度, 摇匀, 即得对照品溶液 (每lm L含芦丁0.19mg) 。

2.2.2 标准曲线的制备

精确量取对照品溶液1m L、 2m L、 3m L、4m L、5m L、6m L, 分别置于25m L量瓶中, 各加30%乙醇溶液至6m L, 加5%亚硝酸钠溶液lm L, 摇匀, 放置6min;再加10%硝酸铝溶液lm L, 混匀, 放置6min;加氢氧化钠试液l0m L, 再加30%乙醇至刻度, 摇匀, 放置15min, 以相应试剂为空白, 按照紫外可见分光光度法, 在500nm波长处测定吸光度, 试验结果见表1。以吸光度为纵坐标, 浓度为横坐标, 绘制标准曲线见图1, 对表1 中数据进行计算得直线回归方程:A=12.089C+0.0031 (r=0.9999) 。

注:芦丁标准品含量为92.5%

2.2.3 供试品溶液的制备

首先分别将沙棘叶用石油醚进行脱脂处理。准确称取各类沙棘叶粉10.0g, 分别用石油醚 (沸程60~90℃) 脱脂两次, 第1 次将称量好的沙棘叶粉加入80m L石油醚, 安装回流提取装置, 水浴75℃加热提取1h, 放冷, 布氏漏斗过滤;第二次加入60m L石油醚, 回流提取1h, 过滤, 合并两次石油醚提取液, 另器保存。将石油醚提取后的沙棘叶粉倒回原250m L圆底烧瓶中, 敞口置于通风橱中挥干石油醚, 备用。

分别将上述脱脂后的沙棘叶粉原料, 用50%乙醇回流提取三次, 第一次向盛有脱脂沙棘叶粉的烧瓶中加入12 倍量50%乙醇120m L, 水浴85℃加热回流提取1h, 放冷后用布氏漏斗抽滤, 收集醇提液;第二次加入10 倍量50%乙醇100m L, 第三次加入8 倍量50%乙醇80m L, 同法回流提取各1h, 放冷滤过, 合并三次醇提液。分别将各样品醇提液用50%乙醇定容至350m L, 摇匀, 作为供试品溶液, 每个样品重复三次试验。

2.2.4 样品的测定

参照中国药典收载的沙棘药材总黄酮含量测定方法, 以芦丁对照品进行标定, 检测波长500nm。分别量取3m L上述各类供试品溶液于25m L容量瓶中, 各加50%乙醇3m L至6m L, 照标准曲线制备项下的方法, 自“加5%亚硝酸钠溶液1m L”起, 以相应试剂为空白对照, 采用紫外分光光度法测定吸光度。按上述直线回归方程, 分别计算各供试品溶液的浓度, 利用公式:总黄酮含量ω%=提取的总黄酮质量/沙棘叶粉质量×100%=CV/W×100%, 即可求出各样品的总黄酮含量, 每个样品重复测定3 次, 测定结果见表2和表3。

3 讨论

(1) 从表2 可知, 在同一产地不同生长期内各类沙棘叶中总黄酮含量存在一定差异, 5~7月份沙棘叶中总黄酮含量相对较高, 6 月份沙棘叶中总黄酮含量最高, 9 月份总黄酮含量最低。同时看到, 沙棘雌株叶总黄酮含量高于雄株叶, 并且除10 月份外, 普遍沙棘桔红果叶总黄酮含量高于橙黄果叶。说明5-7 月份最适宜采集沙棘雌株叶。从表3可以看到, 在相同采收期不同产地各类沙棘叶中总黄酮含量存在一定差异, 在上述五个产地沁源的沙棘叶中总黄酮含量最高, 其次是方山和古交, 交城地区最低。同时表明, 在上述不同产地相同采收期内, 同一产地的沙棘雌株叶总黄酮含量高于雄株叶。

注: *各类沙棘叶均采自山西古交石千峰林场野生沙棘灌木丛。

(2) 在用乙醇提取之前先用石油醚预处理沙棘叶原料, 这样石油醚提取液中即可提出沙棘油, 又可同时除去油脂、色素等杂质, 以免影响后续沙棘叶黄酮的提取与测定。沙棘叶石油醚回流提取液经HPLC检测, 未见有相应的黄酮吸收峰出现, 所以认为石油醚回流提取没有将沙棘叶黄酮成分提出。由于石油醚是油溶性物质的良好溶剂, 所以用石油醚可以提取油脂、色素等低极性物质, 起到除杂的作用。紫外分光光度法能直接测定样品中黄酮的含量, 不需要加显色剂, 相对简便快速, 是一种较理想的测定方法。

(3) 本文研究分析了山西境内沙棘主产地中国沙棘亚种的各种果色类型植株叶及其雄株叶中总黄酮的含量, 结果表明, 不同产地、不同采摘时间、不同果色类型、雌雄株沙棘叶中总黄酮含量有差异。造成这一结果的原因可能与沙棘植株的生长环境不同有关, 如:光照、降水、土壤、气候、海拔等不同条件。同时, 可能还与沙棘雌雄异株、沙棘果的类型不同等因素有关, 另外, 还可能与沙棘植株中含有的其他成分有关, 有待进一步深入研究。

(4) 山西是我国沙棘资源大省, 此项研究结果可为今后该省发展人工栽培沙棘及确定沙棘叶的适宜采收期提供必要的基础数据, 具有重要的指导意义。从沙棘叶中提取总黄酮, 不与其它沙棘加工项目争原料, 黄酮含量更高, 成本却更低, 还能为不结果的雄株找一条合理利用的出路, 因此, 是很值得研究的一个课题。沙棘叶富含黄酮类物质, 且资源充裕, 所以, 合理利用沙棘叶资源, 变废为宝, 促进无废料沙棘的开发, 制备高含量沙棘叶黄酮将会产生巨大的经济效益和社会效益。目前我国对沙棘叶的利用率很低, 如果能利用沙棘叶作为原料, 进行化工及保健品的开发, 沙棘的应用前景将会更加广泛。

参考文献

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].2010年版一部.北京:化学工业出版社, 2010:171-172.

[2]刘风云.沙棘总黄酮的药理研究概况[J].中药材, 2004, 27 (2) :145.

[3]高锦明, 张鞍灵, 李芸生, 等.沙棘黄酮化学研究的进展[J].沙棘, 1998, 11 (2) :34-37.

[4]葛孝炎, 史国富, 马翠英.沙棘化学成分的研究概况[J].中草药, 1986, 17 (8) :42-44.

[5]李春英, 王微, 赵春建, 等.沙棘不同部位总黄酮含量的测定及比较[J].植物研究, 2005, 25 (4) :453-456.

水浸提沙棘果渣总黄酮工艺研究篇2

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

沙棘果渣:新采沙棘果榨汁后的果渣

芦丁标准品:成都思科华生物技术有限公司生产。无水乙醇、石油醚、氢氧化钠、冰乙酸、亚硝酸钠、硝酸铝均为分析纯。

721型分光光度计(上海浦东物理分析仪器厂);电热恒温干燥箱(上海跃进医疗仪器厂);电子天平(上海上平仪器厂);电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司);高速离心机(北京医用离心机厂);粉碎机(天津市华鑫仪器厂);旋转蒸发仪(上海虹昕电子仪器仪表厂)。

1.2 方法

1.2.1 原料预处理试验

处理一:新压榨出的果渣,冷水入锅,煮沸浸提;处理二:新榨出的果渣湿粉碎20～30目,沸水入锅,煮沸浸提。处理三:新榨出的果渣于65℃烘干,粉碎20～50目,沸水入锅,煮沸浸提。

1.2.2 水浸提试验

先进行料液比、浸提温度、浸提时间、浸提次数对浸提效果影响的单因素试验。实际操作中,提取效果往往受到多因素的交叉影响,为了全面考察提取效果,根据因素的影响力进行料液比、浸提温度、浸提次数3个因素的正交试验,来确定最佳浸提工艺条件。其方案见表1。选用L9(34)正交表。

1.2.3 洗脱实验

对水提液进行洗脱,选用因素乙醇浓度(%)、乙醇用量(V/V)、洗脱温度(℃)对洗脱率(K)的影响,进行正交实验。其方案见表2。选用L9 (34)正交表。

1.2.4 总黄酮测定方法(分光光度法测定)

标准曲线的制备:精确称取一定量干燥至恒重的芦丁标准品,加少量乙醇溶解,蒸馏水定容至10ml容量瓶中,摇匀,配成标准液。分别吸取0、0.01ml、0.02ml、0.03 ml、0.04 ml、0.05ml、0.06 ml标准液至10ml容量瓶中,加入5%NaNO2溶液0.4ml,摇匀,静止6min,加入10%Al(NO3)3溶液0.4ml,摇匀,静止6min,最后加入10%NaOH溶液4ml,摇匀,蒸馏水定容至刻度,静止15min,在510nm处测定吸光度,制作标准曲线得回归方程:Y=21.223X-0.024;r= 0.9987

总黄酮含量的测定:移取适量黄酮提取液于10ml容量瓶中,加入5%NaNO2溶液0.4ml,摇匀,静止6min,加入10%Al(NO3)3溶液0.4ml,摇匀,静止6min,最后加入10%NaOH溶液4ml,摇匀,蒸馏水定容至刻度,静止15min,在510nm处测定吸光度,根据回归方程计算提取液中黄酮的含量。

1.2.5 工艺路线

沙棘果渣→湿粉碎→沸水浸提→过滤→滤液调pH值→沉淀→水洗至中性→乙醇淋洗→滤液浓缩→沉淀→过滤→干燥→TFH产品

2 结果与分析

2.1 原料预处理试验结果

实验中进行的3种预处理对沙棘果渣黄酮提取率的影响情况见图2。从图2可见,对原料进行不同的预处理其提取率有差别,其中以处理二的提取效果最佳,达到94.8%。

2.2 水浸提试验结果

2.2.1 固液比对提取效果的影响

固液比越大,吸光值越大,但当固液比≥1∶15时,吸光值增加不大,可能是随着溶剂量的增加已将果渣中的有效成分基本溶出。

2.1.2 浸提温度对提取效果的影响

一般说来温度升高,分子运动速度加快,渗透、扩散、溶解速度加快,使黄酮类物质更易从细胞中转移到溶剂中。但温度过高,提取液的颜色会逐渐加深,黄酮类物质被氧化破坏而导致得率不再增加,甚至下降。结果表明,提取温度应控制在80～90℃比较适宜。

2.1.3 浸提时间对提取效果的影响

在相同条件下,浸提时间对浸提效果影响不大,考虑到提取效率,可将浸提时间确定为45min。

2.1.4 浸提次数对提取效果的影响

浸提次数越多,得率越大,但当提取4次后,吸光值增加不大,应该是随着提取次数的增加沙棘果渣中黄酮类物质已基本溶出。

2.2.5 正交试验结果

由表3实验数据及极差R的大小可判断出影响黄酮提取效果的因素主次顺序为:提取温度>提取次数>固液比,并可得到最佳提取工艺为A3B2C3的组合,即提取温度为90℃,固液比1∶10,提取次数4次。其结果与单一试验的结果也是吻合的。

2.3 洗脱实验

由表4可见,影响黄酮洗脱效果的因素为乙醇浓度、乙醇用量和洗脱温度。最佳工艺组合为A3B3C3,即乙醇浓度为40%,8倍量,25℃洗脱效果最佳。

3 结论

(1)原料预处理最佳方法是将新榨出的果渣湿粉碎20～30目,沸水入锅,煮沸浸提,可获得94.8%提取率。

(2)沙棘果渣黄酮提取的最佳工艺是提取温度为90℃,固液比1∶10,提取次数4次,浸提时间为45min。

(3)采用水提法提取的沙棘黄酮洗脱最佳工艺组合乙醇浓度为40%、乙醇用量为8倍量,洗脱温度为25℃。

(4)水提法要获得高提取率,应采用多次交替浸提与层析精制结合的方法。

(5)沙棘黄酮的性质不稳定,因此对提取液要边提取边测试,冷链隔氧保存。

参考文献

[1]黄铨、于倬德主编,沙棘研究[M].科学出版社2006,550-558.

[2]冯颖、王建国、孟宪军,等.无梗五加果黄酮的提取及抗油脂氧化性能的研究[J].食品研究与开发,2006,3:35-36.

[3]何文珊,李炎,等.生姜提取物在油脂中抗氧化特性分析[J].华南理工大学1999,(5):84-88.

[4]彭芳.黄酮类化合物的生物学作用[J].大理医学院学报,1998,7(4):52-54.

[5]梁亦龙,戴传云,李标,舒坤贤.荠菜总黄酮提取工艺的研究[J].食品研究与开发,2006,5:73-75.

[6]杨洋.生姜黄酮的提取物及其抗氧化火星的研究[J].食品科学,2002,23(4):45-50.

沙棘总黄酮篇3

1 TFH在卒中一级预防中作用探讨

1.1 TFH能够降低血压, 高血压是脑卒中最重要的独立危险因素, 血压越高, 卒中风险就越大

高天林[4]等认为, TFH是一种天然的, 副作用小的降压药, 能够治疗高血压, 其作用机制与卡托普利这一类药物相似[5], 也有论述TFH的降压速度较依那普利慢, 但降压水平相当于依那普利[6], 其作用机制主要包括:抑制血管紧张素转换酶活性, 即扩张血管;对钙离子通道的影响;对血管内皮细胞的保护作用等。程嘉艺[7]等认为, TFH能够对抗H202所致的血管内皮细胞的凋亡, 并降低Caspase-3的表达。总之, TFH在降压方面发挥了它的优势, 即作用时间长, 不良反应少, 对正常血压无明显影响[8], 不仅可以作为治疗的药物, 同时可以作为保健品, 安全性可靠。

1.2 TFH具有降血脂的作用, 已有研究表明, 降胆固醇的药物能够降低卒中危险, 并且能够改善颈动脉粥样硬化

乔春萍[9]对98例患者, 经过3个月的临床观察显示:醋柳黄酮能有效地降低TC, TG, LDL—C, 并升高HDL—C。TFH可显著降低实验性高血脂症大鼠的胆固醇, 甘油三酯, 以及肝组织中胆固醇的含量[10]。也就是说, TFH虽然没有以降血脂药物的身份出现在临床中, 但是在降血脂方面的作用已经突显出来, 并且在众多降血脂药物中, TFH的副作用最小, 是纯植物天然提取的成分, 安全性好。

1.3 TFH能够降低血糖, 糖尿病是卒中的独立危险因素之一, 糖尿病患者的卒中复发率较高[11]

杨桂珍[12]经过实验证实, 沙棘总黄酮对ICR小鼠具有降血糖的作用, 其降糖效果与二甲双胍无明显差别。曹群华[13]等研究表明, 沙棘总黄酮能降低正常小鼠的血糖水平, 对血糖代谢的影响可能与控制糖异生有关。

1.4 TFH在心脏病的治疗及预防方面有积极的作用, 心脏病是

脑卒中重要的预测因子, 心脏的损伤是脑卒中公认的第三位危险因素

戈升荣[14]等曾报道, 沙棘总黄酮能够治疗冠心病心绞痛, 缺血性心脏病, 心肌炎及心功能不全, 且效果显著。而且, 以沙棘总黄酮为主要成分的心达康片, 已经投入临床多年, 收到良好的临床疗效。沙棘总黄酮不仅作为药物, 对于正常人也有作用, 已有试验证明, 沙棘总黄酮能增强正常人心肌的收缩力, 并增强心脏的泵血功能, 还能降低外周阻力, 增加血管弹性[15]。

2. TFH在卒中二级预防中的作用探讨

2.1 TFH对脑缺血再灌注的损伤有保护作用

徐晓军[16]等从对大鼠脑缺血再灌注的试验中得出结论:不同剂量的TFH可显著减轻缺血一侧脑组织的水肿程度, 促进血管再通, 缩小梗死面积, 血清中CK含量, LDH的活性及MDA含量显著降低, 而血清中SOD的活性显著提高, 考虑其抗脂质过氧化作用可能是脑保护作用的机制之一。同时亦有研究表明, TFH对缺氧缺血新生大鼠脑损伤亦有保护作用。

2.2 TFH对神经细胞的损伤具有保护作用

王华[17]等通过实验证明, TFH能抑制分别由Na2S2O4、KCl诱导PC12细胞产生的缺氧损伤和钙超载损伤, 改善经Na CN及缺糖损伤后的PC12细胞状态, 提示TFH可能通过多种机制保护神经细胞。

3. 结语

沙棘总黄酮篇4

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性Wistar大鼠, 体重200～240g, 由佳木斯大学实验动物中心提供。随机分为实验组和正常对照组。将链脲佐菌素 (STZ) 用枸椽酸缓冲液配成1%浓度, 腹腔单次注射 (60mg·kg-1) , 72h后测血糖, 凡随机血糖≥16.7mmol/L作为糖尿病大鼠, 3d后随机分为糖尿病组、氨基胍 (AG) 治疗组、沙棘总黄酮治疗组, 每组10只。氨基胍组灌服AG (100mg·kg-1·d-1) , 沙棘总黄酮组灌服沙棘总黄酮 (20mg·kg-1·d-1, 模型组、正常对照组灌服蒸馏水 (20mg·kg-1·d-1) 。14周后处死动物, 检测所需指标。

1.2 试剂和仪器

链脲佐菌素, 氨基胍 (Sigma公司) ; SABC免疫组织化学试剂盒, 武汉博士德试剂有限公司;One-Touch II血糖仪 (Lifescan. USA) ;YL3-A轮转式切片机, 上海仪表厂。

1.3 方法

1.3.1 血糖测定

取大鼠尾静脉血, 用美国Lifescan公司的One Touch II血糖仪及试纸条测定。

1.3.2 HE染色

取心肌组织, 切厚度为10μm冰冻切片, 常规HE染色、脱水、透明、封片。镜检并用BI-2000医学成像分析系统计算心肌间质纤维面积与全视野面积的比值。

1.3.3 冰冻切片Bax、Bcl-2 SABC免疫组化染色

①切片浸入4%多聚甲醇中固定30min。三蒸水洗3次, 每次3min。②30%H2O21份+纯甲醇50份混合物浸泡30min, 三蒸水洗3次。③滴加5%BSA封闭液, 室温20min。甩去多余液体。④滴加1∶150倍稀释的一抗, 于湿盒中, 4℃过夜。PBS洗2min, 3次。⑤滴加生物素化山羊抗小鼠IgG, 20min。PBS洗2min, 3次。⑥滴加试剂SABC, 37℃, 30min。 PBS洗5min, 4次。⑦DAB显色。⑧苏木素复染。脱水, 透明, 封片。显微镜观察:胞浆中有棕黄色颗粒者为阳性细胞。计数每例随机10个高倍镜视野 (HPF) 内Bcl-2、Bax阳性细胞数。

1.4 统计学处理

应用SPSS统计软件10.0进行数据统计与分析, 以均数±标准差undefined表示。组间比较采用单因素方差分析, 多组比较采用q检验。

2 结果

见表1～4。

注:*与对照组比较P<0.01, ▲与模型组比较P<0.01, △与沙棘总黄酮组比较P<0.01。

注:*与对照组比较P<0.01, ▲与模型组比较P<0.01, △与沙棘总黄酮组比较 P>0.05。

3 讨论

目前, 大多数抗糖尿病药物的研究工作主要集中在作用机制方面, 而对于活性成分的研究报道却很少, 黄酮类化合物是一类重要的高药理活性的天然多酚类化合物, 大量研究证明, 许多黄酮类化合物在治疗糖尿病及其并发症方面疗效显著, 如葛根、淫羊藿、黄芩、番石榴等植物黄酮提取物[3]。研究黄酮类化合物作为防治糖尿病及其并发症的活性成分对于开发新型抗糖尿病中药制剂, 寻找其作为新药研究开发的先导化合物具有十分重要的理论价值和现实意义。本研究采用大剂量一次腹腔注射链脉佐菌素, 参考血糖值及临床症状, 成功建立了大鼠糖尿病模型。组织形态学能直接客观反映病理损害情况, 是研究组织损伤规律的重要客观指标, 同时也是评价治疗方法的重要手段。本实验结果表明, 治疗组心肌纤维轻度肥大, 心肌纤维间局灶性、片状坏死及心肌间质纤维组织灶性增生均较模型减轻。提示沙棘总黄酮可明显减轻糖尿病大鼠心肌组织损伤程度 (与氨基胍相似) , 从而减缓糖尿病心肌病变的发生, 为临床上应用中医药防治糖尿病性心肌病, 保护心肌细胞结构和功能提供了科学依据。Bax, Bcl-2是Bcl-2家族中一对比较重要的成员, Bax为促凋亡基因, Bc1-2为抑凋亡基因, 它们位于线粒体膜两侧, 可以形成同源或异源二聚体, 影响线粒体膜阴离子通道的通透性, 调节细胞色素c从线粒体释放入细胞液来分别诱导和抑制细胞凋亡。Bcl-2和Bax的比例控制着细胞的生存和凋亡, 当Bax过量形成同源二聚体时, 诱导细胞凋亡;而Bcl-2过量时, 形成Bcl-2同源二聚体和Bcl-2/Bax异源二聚体, 减少了Bax同源二聚体含量, 便抑制细胞的凋亡[4]。本实验结果显示, 与模型组比较, 沙棘总黄酮可使Bax表达下降, Bcl-2表达上升, 可明显降低Bax/Bcl-2比值, 其作用效果与氨基胍相似。提示沙棘总黄酮的抗细胞凋亡的作用机制可能与抑制Bax表达和增强Bcl-2表达有关。上述结果表明, 沙棘总黄酮对糖尿病心脏病大鼠的心肌损伤有良好的保护作用, 从而为中医药防治糖尿病心肌损伤的临床应用提供依据。

关键词：糖尿病大鼠,沙棘总黄酮,心肌细胞

参考文献

[1]蒲自连.绿色黄金——沙棘[J].植物与健康, 1998, (4) :6-7

[2]马瑜红.沙棘的有效成分及药理研究进展[J].四川生理科学杂志, 2005, 27 (2) :75-77

[3]焦晶晶, 张英.黄酮类化合物在防治糖尿病及其并发症方面的最新研究进展[J].中国药学杂志, 2006, 4 (41) :481-484

沙棘黄酮药理作用的研究进展篇5

1 对心血管系统的作用

1.1 抗心肌缺血

沙棘黄酮能增加受试小鼠的心肌营养血流量,改善心肌微循环,降低心肌氧耗, 能对抗垂体后叶素所致的急性缺血性心肌损伤[2]。沙棘黄酮能增强正常人心肌的收缩性能和心脏泵功能,还能降低外界阻力,增加血管弹性[3]。静注沙棘黄酮可明显增强心衰犬的心脏泵功能和心肌收缩性能,并可明显改善心肌舒张性能[4]。进一步研究发现,沙棘黄酮能明显减轻大鼠心肌再灌注损伤区超微结构病理改变的发生,对心肌缺血、再灌注损伤可产生明显保护作用[5]。沙棘黄酮对离体大鼠工作心脏缺血后心功能及血流动力学各指标有不同程度的改善作用,并且通过比较发现沙棘黄酮明显优于银杏总黄酮(TFG)[6]。

1.2 改善心肌细胞功能

沙棘黄酮有增加心肌细胞收缩力的作用,并且这种作用具有量-效关系;而与细胞内钙离子转运未显示出量效关系。因此,可以推断在小剂量范围内,沙棘黄酮是一种不依赖钙离子内转运而增加心肌细胞收缩力,从而有效改善心衰的中药[7]。沙棘黄酮也可使培养大鼠心肌细胞动作电位时程(APD)缩短及4相除极斜率降低。还可抑制毒毛花甙G诱发豚鼠乳头状肌心律失常[8]。

1.3 抗心律失常

沙棘黄酮具有抗心率失常的作用,对离体大鼠心脏可显著延长缺氧性心率失常出现时间,提高室颤阈值,延缓房室传导;可轻度延长离体豚鼠左房功能不应期,明显对抗乌头碱诱发离体豚鼠右房节律失常的作用[9]。沙棘黄酮可使离体大鼠心脏心率明显减慢,对麻醉大鼠ECGP-R间期和心率具有明显延长和减慢作用,对急性心肌缺血所致心率减慢也有显著对抗作用,并呈良好的量效和时效反应关系,提示其负性肌力、负性频率和负性传导作用类似于钙拮抗剂[10]。沙棘黄酮可明显对抗培养心肌细胞团自发性搏动节律失常,还可使培养乳鼠心肌细胞搏动频率显著降低,搏动幅度下降,并可使异常自发搏动节律转为有规律的搏动,表明沙棘黄酮可能具有钙拮抗作用[11]。

1.4 改善心肌肥大

沙棘黄酮可通过抑制核转录因子NF-кB信号传递系统的激活,引起细胞内相关分子表达调控机制改变,从而发挥改善心肌肥大的作用,且抑制NF-кB的作用与沙棘黄酮间存在浓度依赖关系。NF-кB是细胞核内重要核转录因子, NF-кB的激活与抑制同心血管疾病的发生、发展和逆转有关。也因此从分子药理水平证实沙棘黄酮对高血压及慢性心力衰竭等疾病造成的心肌肥大有治疗作用[12]。

1.5 抗血栓形成

沙棘黄酮可明显降低大鼠高切变率下的血液粘度和血浆粘度, 改善血液流变性和血流动力, 抑制动静脉环路血栓的形成和发展[13]。沙棘黄酮对花生四烯酸诱发的血小板聚集有明显的抑制作用,并呈现一定的量效关系。沙棘黄酮静脉给药对动物体内血栓形成有显著的抑制作用,并有与阿司匹林相似的抑制血栓形成的作用[14]。沙棘黄酮可促进前列腺素I2(PGI2)的生成,抑制血栓素A2(TXA2)的生成,能提高大鼠血浆PGI2/TXA2的比值,且这一作用显著强于阿司匹林组。提示沙棘黄酮既能降低血液中脂质的含量,又能通过增加PGI2的分泌而改善PGI2与TXA2之间的动态平衡,也许可以取代副作用多的阿司匹林而用于防治血栓形成[15]。

1.6 降血糖

沙棘黄酮能有效的控制糖尿病大鼠血糖水平,纠正其物质代谢紊乱。能极显著地降低链脲佐菌素((STZ)糖尿病大鼠血糖、果糖胺、血脂水平[16]。而且对高浓度葡萄糖、果糖以及乙二醛引起的蛋白质非酶糖基化反应有极其显著抑制作用[17]。另外,沙棘黄酮对正常小鼠的血糖、血脂具一定的降低作用并可抑制糖异生[18]。

2 对免疫系统的作用

沙棘黄酮能增加小鼠血清溶菌酶和豚鼠补体的含量,促进小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬百分率和吞噬指数。能增加血液T细胞比例和脾特异玫瑰花形细胞(SRFC),同时可使辅酶A(ConA)激活的淋巴活性增强,明显保护环磷酰胺所致的抗绵羊红细胞(SRBC)溶血素生成减少,拮抗环磷酰胺引起的SRFC 减少,并且,低浓度时促进淋巴细胞转化。所以对于特异性或是非特异性的免疫,沙棘黄酮都具有增强作用[19],而且沙棘黄酮具有清除人体内自由基的作用,对体液免疫和细胞免疫具有明显的调节作用,因此能够提高机体的免疫功能[20]。

3 抗氧化作用

沙棘黄酮具有较强的抗脂质过氧化、清除自由基作用。沙棘籽渣黄酮(FSH)和沙棘果渣黄酮(FFH)能显著的抑制大鼠心、肝、肾组织匀浆自发性丙二醛(MDA)的生成或H2O2诱导的肝组织脂质过氧化,并明显的抑制H2O2诱导的红细胞溶血,说明FSH和FFH能清除·OH而抗脂质过氧化。对NaNO2产生的NO有直接的清除作用,说明FSH和FFH也是NO的良好清除剂[21]。不同浓度的沙棘黄酮对PMA刺激多形核白细胞产生的活性氧自由基、黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶系统生成的活性氧自由基、光照射核黄素产生的活性氧自由基有清除作用,并且沙棘黄酮对活性氧自由基清除作用明显强于维生素E[22]。

4 抗癌作用

章平等探讨了沙棘黄酮类化合物对人乳腺癌Bcap-37细胞凋亡的影响及其作用机制。通过观察发现沙棘黄酮在10~1000μg/mL浓度范围内可以诱导人乳腺癌细胞Bcap-37产生典型的凋亡形态学变化;1000μg/mL的沙棘黄酮处理24h、48h和72h后能使Beap-37细胞周期S期减少[23]。

5 抗过敏作用

沙棘黄酮能显著抑制小鼠的被动皮肤过敏(PCA), 说明沙棘黄酮具有抗过敏作用。据研究报道,沙棘黄酮组对小鼠PCA的抑制率为22.38﹪;肾上腺素加扑尔敏组对小鼠PCA的抑制率为69.25%;生理盐水组则无作用[24]。沙棘黄酮对豚鼠平滑肌的收缩无明显影响,也不能阻断组胺兴奋 H受体和乙酰胆碱兴奋M受体后平滑肌的收缩,说明其抗过敏作用环节可能不在于改善靶器官和细胞的反应性,也不像扑尔敏等竞争靶细胞受体,而可能在于抑制抗原的结合或抑制介质释放等环节而产生效应[25]。

6 抑菌作用

张益娜[27]采用滤纸片法对沙棘叶总黄酮的抑菌活性进行了测定,最小抑菌浓度(MIC)值分别为:金黄色葡萄球菌 0.625%,枯草芽孢杆菌 2.5%,大肠杆菌及根霉 5%。结果表明,沙棘叶总黄酮对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌有较好的抑菌作用。在相同时间内,总黄酮提取液的浓度越高,抑菌率越高;而且同一浓度的沙棘叶总黄酮作用时间越长,其抑菌率也越高[26]。

沙棘总黄酮篇6

1 仪器与材料

1.1 仪器

290SCS电子天平(瑞士PRECISA),GZX-9076MBE电热恒温鼓风干燥箱(上海博迅),HH-4恒温水浴锅 (常州国华),SHB-Ⅲ循环水式真空泵(郑州长城),UV757CRT紫外可见分光光度计(上海精科),RE5298A旋转蒸发器 (上海亚荣),HC-3518高速离心机(科大创新)。

1.2 材料

沙棘果于2008年10月采自山西省沁源县鱼儿泉产地,芦丁标准品购于中国药品生物制品检定所(批号100080-200707,含量92.5%),乙醇、石油醚(60～90℃)、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为分析纯,试验用水为蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 实验材料预处理

2.1.1 备料

取上述自然干燥的沙棘果洗净,置鼓风干燥箱60℃烘干,粉碎,过20目筛,药粉密封,放入干燥器中备用。试验开始前用感量0.1g天平准确称取沙棘果粉5.0g,设计16个正交试验组合,重复3次,共计称量48份实验材料。

2.1.2 脱脂

正交实验前先用石油醚(沸程60～90℃)脱脂两次,第1次:将称量好的沙棘果粉5.0g装入100ml烧瓶中加入40ml石油醚,安装回流提取装置,水浴加热70℃提取1.5h,取下烧瓶,过滤,分离原料与石油醚提取液。第2次:将上述石油醚提过一次的原料加入30ml石油醚,水浴加热70℃,回流提取1h,过滤,合并两次石油醚过滤液,放入另外的容器中保存备用。

2.2 正交实验

2.2.1 正交实验设计

根据单因素预实验结果,并参考文献资料报道[4],确定以80℃为乙醇提取温度,以沙棘总黄酮含量为评价指标,综合考察影响乙醇回流提取沙棘黄酮的主要因素,如:乙醇浓度、乙醇用量、提取时间、提取次数4个因素,每个因素分别设计4个不同水平,最后确定因素水平见表1、正交试验方案见表2。通过L16(45)正交试验筛选研究,最终优选出沙棘黄酮提取工艺的最佳条件。

2.2.2 样品溶液制备

分别取上述称量、脱脂后的沙棘果粉原料,按照表2 L16(45)正交表具体工艺条件,进行4因素4水平的组合实验,重复3次。分别收集每一组号的抽滤液, 离心5min(10000r/min),离心液加入250ml容量瓶中,以相应提取时的乙醇浓度定容,摇匀。分别精密量取25ml加入50ml容量瓶中,加蒸馏水定容,摇匀,作为供试品溶液。

2.3 含量测定

按照2005年版药典一部沙棘项下总黄酮含量测定方法进行。

2.3.1 对照品溶液的制备

精确称取在 120℃下干燥至恒重的芦丁对照品20.08mg,置于50ml量瓶中,加入适量60%乙醇,置水浴上微热使其溶解,放冷,加60%乙醇至刻度,摇匀。精确量取25ml,置50ml量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,即得(每1ml中含无水芦丁0.19mg)对照品溶液。

2.3.2 标准曲线的制备

精确量取对照品溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml与6ml,分别置于25ml量瓶中,各加30%乙醇溶液至6ml,加 5%亚硝酸钠溶液1ml,摇匀,放置6min,再加10%硝酸铝溶液1ml,混匀,放置6min,加氢氧化钠试液10ml,再加30%乙醇至刻度,摇匀,放置15min,以相应试剂为空白,照紫外可见分光光度法,在500nm的波长处测定吸光度,试验结果见表3。以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线见图1,计算得直线回归方程:A=0.4105C-0.0165(r=0.9967)。

注芦丁对照品含量为92.5%

2.3.3 样品溶液的测定

分别在上述2.2.2制备的50ml量瓶中量取3ml供试品溶液,置于25ml容量瓶中,各加30%乙醇3ml至6ml,照标准曲线制备项下的方法,自“加5%亚硝酸钠溶液1ml”起,以相应试剂为空白对照,依法测定吸光度。通过上述2.3.2得到的直线回归方程,分别计算出各实验组合的浓度。

总黄酮含量=提取的总黄酮质量/沙棘果粉质量=CV/W

即可求出各实验组合的总黄酮含量,结果见表2。分别对其进行极差分析和方差分析,结果见表4。

注 *P<0.05,有显著性意义。

3 讨论与小结

(1)目前从沙棘中提取总黄酮的方法一般有水浸提取、有机溶剂提取、超临界CO2流体提取、微波法提取和超声波法提取等,用水浸提取沙棘总黄酮提取率一般偏低,超临界CO2萃取适用于非极性化合物的分离,微波法和超声波法提取目前仅限于少量提取实验,还不具备工业化大生产,有机溶剂提取中甲醇和丙酮含有毒成分,因此,用乙醇提取沙棘黄酮是目前适合工业化大生产的安全适宜方法。

(2)在用乙醇提取之前先用石油醚预处理沙棘原料,这样提取液可生产沙棘油,同时可除去油脂、色素等杂质,以免影响后续黄酮的提取与测定。

(3)2005年版《中国药典》规定:沙棘果以干燥品计算,含总黄酮以无水芦丁计,不得少于1.5%。在本文的16个正交实验提取组合中,除15号、16号沙棘总黄酮含量低于1.5%外,其余14个组合沙棘总黄酮含量均高于1.5%,最高达2.94%,说明山西沁源沙棘果黄酮含量较高。同时,初步说明沙棘黄酮极性较大,不适宜高浓度乙醇提取,并且只用乙醇回流提取1-2次,沙棘黄酮含量较低。

(4)由表2中极差R值大小显示,沙棘总黄酮含量 RA>RC>RD>RB, 各因素作用主次为A>C>D>B,根据各因素水平均值可知,最佳工艺条件为A1B4C4D2;由表4方差分析结果表明,A 、C因素的影响具有显著性意义(P<0.05),B、D因素的影响无显著性意义(P>0.05)。根据制剂经验,结合生产实际,为了缩短生产周期,合理降低生产成本,最后确定沙棘黄酮最佳提取工艺条件为A1B3C3D2,即用50%乙醇提取沙棘果粉3次,第一次加药材质量的10倍乙醇量,提取2小时;第二次加药材质量的10倍乙醇量,提取1小时;第三次加药材质量的8倍乙醇量,提取1小时为佳。三批验证实验总黄酮含量为2.80%,结果表明该工艺稳定可行。

(5)山西省是我国沙棘药材的主要产区之一,沁源县是山西省沙棘资源产量最大的县区,并且通过本文研究证明,沁源沙棘总黄酮含量高出《中国药典》标准,有望在此地区建立沙棘GAP种植基地,更好地开发利用沙棘药材资源,促进沙棘产业化发展。

参考文献

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].2005年版一部.北京:化学工业出版社,2005,127-128.

[2]高锦明,张鞍灵,李芸生等.沙棘黄酮化学研究的进展[J].沙棘,1998,11(2):34-37.

[3]刘凤云.沙棘总黄酮的药理研究概况[J].中药材,2004,27(2):145-147.

沙棘总黄酮篇7

大孔吸附树脂是近年发展起来的一类有机高分子聚合物吸附剂, 它具有物理化学性质稳定、吸附选择性独特和再生简便等优点, 广泛用于生化物质的分离纯化。本研究选用4种不同类型的吸附树脂对沙棘籽及果皮渣黄酮的粗提物进行吸附和解析, 确定选择性高、吸附速率快、吸附容量大且易于解吸的树脂种类, 并采用单因素试验确定纯化的最佳工艺条件。

1 试验材料与方法

1.1 材料

沙棘籽及果皮渣是蛟河沙棘研究所提油榨汁后的副产物;试剂为无水乙醇 (AR) 、硝酸铝 (AR) 、亚硝酸钠 (AR) 、氢氧化钠 (AR) 、D101、D201、H103、AB-8和S-8型大孔吸附树脂。芦丁为sigma公司提供的标准品。

仪器为UV2000紫外分光光度计, 上海天美科学仪器有限公司;RE-52AA旋转蒸发器, 上海亚荣生化仪器厂;BSZ-160F电脑自动部分收集器, 上海精科实业有限公司;DZF-6050真空干燥箱, 上海精宏试验设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 沙棘籽及果皮渣黄酮样品液制备

取10g粉碎过80目筛的沙棘籽及果皮渣, 按料液比为1∶40加入60%乙醇, 70℃水浴, 提取2次, 每次2h, 然后过滤得滤液备用。

1.2.2 沙棘籽及果皮渣黄酮含量测定

以芦丁为对照品, 采用Al3+显色法测定黄酮含量。

(1) 标准曲线的制备。精确称取芦丁标准品, 按Al3+显色法测定不同浓度的芦丁标准液, 绘制标准曲线, 得回归方程:y=10.446x-0.0027, R2=0.9991。

(2) 沙棘籽及果皮渣黄酮含量测定。移取适量黄酮提取液于10mL容量瓶中, 采用Al3+显色法进行测定, 根据回归方程计算提取液中黄酮含量。

1.2.3 树脂预处理

大孔树脂用95%的乙醇浸泡24h充分溶胀后, 用蒸馏水洗尽乙醇, 浸泡于蒸馏水中备用。

1.2.4 静态吸附法筛选树脂种类

(1) 树脂静态饱和吸附量确定。在50mL烧杯中装入处理过的D101、D201、H103、AB-8和S-8型树脂各10mL, 并于烧杯中加入黄酮粗提液40mL, 于水浴中震荡8h, 过滤, 测定滤液中的总黄酮含量, 计算饱和吸附量, 比较各树脂吸附率。

(2) 树脂静态吸附洗脱率。将上述饱和吸附沙棘籽及果皮渣黄酮的树脂滤干水分, 置于50mL烧杯中, 加入40mL的60%乙醇溶液浸泡, 放置震荡水浴中8h, 过滤, 测得滤液中总黄酮的含量, 比较各树脂解吸率。

1.2.5 树脂动态吸附黄酮工艺条件的优化

(1) 上样浓度对总黄酮回收率的影响。将经过处理的大孔树脂装入 (2.2cm×50cm) 的玻璃层析柱中, 装柱树脂高为40cm (138.2mL) 。取总黄酮浓度分别为0.5、4、6、8和10mg/mL的粗提物液体各30mL, 以2.5mL/min的流速, 分别加入5根同样的树脂柱中, 吸附完全后, 用水冲至流出液无色, 再用350mL 60%乙醇洗脱, 测定黄酮回收率, 选择最佳上样浓度。

(2) 乙醇洗脱液浓度对总黄酮回收率的影响。取总黄酮为2mg/mL的样品液5份, 各30mL, 以2.5mL/min的流速, 分别加入5根同样的大孔树脂中, 吸附完全后, 用水冲至流出液无色。分别用浓度为40%、50%、60%、70%和80%的乙醇以2.5mL/min的流速洗脱, 乙醇用量为350mL, 测定其回收率, 选取最适洗脱浓度。

(3) 乙醇洗脱速率对总黄酮回收率的影响。取总黄酮为2mg/mL的样品液5份, 各30mL, 以2.5mL/min的流速, 分别加入5根同样的大孔树脂中, 吸附完全后, 用水冲至流出液无色。用浓度为60%乙醇分别以1、2、3、4和5mL/min的流速洗脱, 乙醇用量为350mL, 测定其回收率, 选取最适洗脱浓度。

(4) 洗脱剂用量的选定。取总黄酮为2mg/mL的样品液5份, 各30mL, 以2.5mL/min的流速, 分别加入5根同样的大孔树脂中, 吸附完全后, 用水冲至流出液无色。用浓度为60%乙醇, 以2.5mL/min的流速洗脱, 每20mL收集1管, 共收集20管, 测定每管的黄酮浓度。

2 结果与分析

2.1 各树脂静态吸附量与解析率分析比较

由表1可知:选用的大孔树脂中S-8型大孔树脂对沙棘籽及果皮渣黄酮的吸附效果最佳, 但从解吸率来看, 只有D101树脂的解析率较高, 因此综合考虑本试验选择D101型大孔树脂对沙棘籽及果皮渣黄酮进行分离纯化, 并采用单因素试验对其纯化工艺进行优化。

2.2 上样浓度对总黄酮回收率的影响

由图1可知:以6mg/mL的浓度上样时, 黄酮回收率最高。随着上样浓度的增加, 黄酮回收率增加, 到上样浓度超过6mg/mL后随着浓度的增加, 黄酮回收率下降。因为上样浓度过低, 树脂对黄酮没有完全吸附, 而上样浓度过高容易将树脂堵塞, 导致洗脱不完全, 因此本试验选择6mg/mL为最佳上样液浓度。

2.3 乙醇洗脱液浓度对总黄酮回收率的影响

由图2可知:乙醇浓度过低, 大部分黄酮洗脱不下来, 乙醇浓度为60%时黄酮回收率最高, 超过60%以后, 回收率下降, 可能由于沙棘籽及果皮渣黄酮的极性与60%的乙醇相似, 从而其洗脱效果最好, 因此选择60%乙醇为最佳洗脱浓度。

2.4 乙醇洗脱速率对总黄酮回收率的影响

由图3可知:乙醇洗脱速率对黄酮回收率的影响不大, 随着乙醇洗脱速率的增加, 黄酮回收率逐渐下降, 但不明显, 流速太慢导致试验时间延长, 效率下降, 综合考虑, 本试验选择乙醇洗脱速率为3mL/min。

2.5 洗脱剂用量对总黄酮回收率的影响

将黄酮粗提液吸附在树脂上, 用洗脱液进行洗脱, 洗脱曲线如图4所示。在第9管时溶液中含有的黄酮浓度最大, 洗脱全过程共耗用400mL乙醇洗脱液, 但是从第16管以后, 黄酮浓度几乎为零, 洗脱剂用量过多对后续浓缩、干燥工艺带来不便, 因此综合考虑本试验选择洗脱剂用量为300mL。

2.6 树脂纯化黄酮的最大回收率及纯度

洗脱液经旋转蒸发浓缩, 后真空干燥得浅黄色粉末, 准确称量, 测定结果显示:纯化前黄酮粗提液中黄酮含量为0.651mg, 纯度为40.75%;纯化后黄酮含量为0.593mg, 洗脱率为91.09%, 洗脱后黄酮纯度为76.4%, 比纯化前明显提高。说明此大孔树脂种类选择合适, 工艺条件优化合理。

3 结论

本试验结果表明:分离纯化沙棘籽及果皮渣黄酮的最佳树脂为D101型树脂, 最佳工艺条件:上样液浓度6mg/mL、洗脱浓度为60%乙醇, 乙醇洗脱速率为3mL min和洗脱剂用量为300mL。经树脂分离纯化后的沙棘籽及果皮渣黄酮洗脱率为91.09%, 纯度为76.4%。

参考文献

[1]李晓花, 孔令学, 刘洪章.沙棘有效成分研究进展[J].吉林农业大学学报, 2007, 29 (2) :162-167.