植物分子标记研究

植物分子标记研究（共8篇）

植物分子标记研究 篇1

分子标记是20世纪80年代初发展起来的遗传标记, 它是DNA水平的标记能够对发育时期的生物个体、组织器官、甚至细胞进行检测, 不受环境基因表达与否等因素的限制, 同时具有数量丰富、多态性强及操作简便的特点, 分子标记为遗传育种提供了方便快速的途径, 目前已有RFLP, RMAPD, SSR, RAPD, AFLP, IS-SR, STS, SCAR等分子标记。目前主要应用于基因定位, 构建分子图谱, 种质资源分类与遗传多样性研究以及辅助育种。本研究着重探讨几点对分子标记技术有影响的实验条件。

1 RAPD: (Random Amplified Polymorphism DNA, 随机引物扩增多态性)

是由美国杜邦公司的Williums和加利福尼亚生物研究所的Welsh领导的两个小组于1990年同时提出的一种快速、简单、多态性高的一项DNA分子标记技术。RAPD是基于PCR的分子标记方法。基本步骤包括:提取植物个体的总DNA;以人工合成的10~15个核苷酸序列为引物, 在Taq聚合酶的催化下, 通过PCR技术扩增DNA片段;利用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳分析扩增产物的多态性。所有能够影响PCR的因素都会影响RAPD:

1.1 模板DNA对RAPD结果的影响

经本实验室对RAPD条件的摸索实验数据表明:利用CTAB法提取的样品基因组DNA即可满足模板纯度上的要求, 但在25μl反应体系中, 模板的量应为15~25μg, 模板量过高会导致不显多态或假阴性, 模板量过低同样会出现假阴性。

1.2 Mg2+浓度对RAPD结果的影响

Mg2+是taq酶的辅助因子, Mg2+浓度的增加会使RAPD产生的非特异性带增加, Mg+浓度过低会降低Taq酶的活性, 经摸索在种质资源多样性分析中, RAPD体系中Mg2+浓度为2.0m M时效果时最好。

1.3 d NTP浓度对RAPD结果的影响

d NTP包括四种脱氧核糖核苷三磷酸 (d ATP、d TTP、d GTP、d CTP) 利用100m M的四种脱氧核糖核苷三磷酸的母液各取等量混合配成10m M的d NTP混合液, 在种质资源多样性分析中, RAPD体系中加入10m M的d NTP混合液0.5μl最好, d NTP的量过多会导致错误碱基的掺入率过多, 太低则不能满足DNA合成的需要。

1.4 Taq聚合酶对RAPD结果的影响

Taq聚合酶是一种从嗜热菌中分离得到的耐热的taq聚合酶, 目前本实验室不能自己分离, 只能从Ta Ka Ra、promega、invitrogen等公司购买, 每个公司都有不同价格不同特性的taq聚合酶, 在植物种质资源和遗传多样性分析中, 综合实验效果和实验成本选用Ta Ka Ra公司的r Taq聚合酶可满足要求, 25μl反应体系加0.5μl。

1.5 引物浓度对RAPD结果的影响

RAPD用的扩增引物是美国opern公司设计的10~15bp长的短引物, 他们并不能和各物种的模板DNA严谨配对, 在RAPD扩增反应中只加入一个随机引物, 靠这个随机引物在模板中的两条链上有互补的位置是扩增出产物, 在扩增体系中, 引物的量过少会使RAPD多态性降低, 引物量过多会导致扩增出现弥散。经摸索25μl扩增体系中采用15~30ng的引物量产生多态性效果最佳。

1.6 扩增反应过程中的温度与时间对RAPD结果的影响

对RAPD反应来说有其特定的变性、退火、延伸的温度和时间。常规PCR反应得变性温度为90~95℃, 变性时间一般为30~60s, 变性温度过低, 时间过短会导致taq聚合酶活力下降, RAPD结果不佳。另外由于RAPD扩增反应一般要采用40个以上的循环, 酶活性降低导致RAPD结果不佳的问题较为明显, 在分析植物遗传多样性的过程中, 发现采用94℃预变性4min, 94℃变性15s, 一方面DNA的解链情况满足实验需要, 另一方面节省了完成全部循环的时间, 克服了由于长时间的高温给taq酶带来的负面影响。RAPD退火温度和时间也与普通PCR反应不同。由于所采用的是10~15bp的随机引物与模板DNA严谨配对的可能性较小, 所以退火温度为35℃~40℃之间, 退火时间为30s~60s。72℃, 1min延伸即可满足分析要求。RAPD具有快速、安全、简便、灵敏的特点。RAPD技术目前已经被广泛应用于植物类群的划分、遗传多样性分析及遗传作图和基因定位中。

2 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism, 扩增片段长度多态性)

AFLP是1993年由荷兰科学家Zabeau和Vos发展起来的一种基于PCR和RFLP技术的分子标记技术, 它兼有RFLP技术的可靠性, 也具有PCR技术的高效性。现在已被广泛用于遗传图谱构建、遗传多样性研究、基因定位及品质鉴定等方面。AFLP的原理是通过限制性内切酶对样品基因组DNA进行酶切, 产生分子量大小不等的限制性片段, 这些限制片段都带有粘性末端。将人工合成短的双链接头连接在这些DNA片段的两端, 形成带接头的特异片段 (这些接头一端具有同样的内切酶识别粘性末端) 。用专用引物对这些特异片段进行扩增, 专用引物有三部分组成:核心碱基序列 (core sequence CORE) , 该序列与人工接头互补;特异性内切酶识别序列 (enzyme specific sequence, ENZ) ;引物3'-端选择碱基 (selective extension, EXT) ;引物3'-端加了1~3个选择性碱基, 选择性碱基延伸到酶切片段, 这些选择性碱基使得引物选择性地识别具有特异配对顺序的内切酶酶切片段并与之结合, 实现特异性扩增。在扩增程序中, AFLP的扩增与常规PCR反应不同的是退火温度, AFLP的PCR开始与高温复性 (65℃) , 比常规PCR反应的复性温度高10℃左右, 已获得最佳的选择性, 以后循环的复性温度逐步降低, 一直降到复性效果的最好温度56℃, 然后在这个复性温度下完成PCR循环。

结语

分子标记的问世和发展为定向的对作物进行遗传操作和改良提供了可能, 成为分子生物学和植物遗传学研究中的有力手段。分子标记的实验进程快速高效, 结果稳定可靠, 各种分子标记之间互相结合互补不足, 一方面可以提高检测结果的准确性和可靠性, 另一方面也可以构建饱和的遗传图谱, 与分群分析法BSA (bulked segregant analysis, 简称BSA) 结合, 可以找到与目的基因紧密连锁的分子标记, 定位克隆某些重要基因。在过去几年里, 利用定位克隆方法已克隆了许多基因。分子标记也是数量性状基因 (QTL) 研究的有效工具便于在育种中对有关的QTL的遗传动态进行跟踪, 从而大大增强人们对数量性状的遗传操纵能力, 提高育种中对数量性状优良基因型选择的准确性和预见性。分子标记在在物种的起源和进化、遗传多样性、遗传疾病的诊断、基因表达等遗传和育种有关的研究领域中有着广阔的应用前景。

植物分子标记研究 篇2

摘要:简述了植物抗病基因的结构特点,介绍了利用RGA法克隆的抗病基因同源序列及其应用,对RGA法的应用前景进行了展望。

关键词:RGA;抗病基因;结构域

中图分类号:Q78文献标识码: A 文章编号:1006-6500(2009)01-0010-03

Research Advance on Disease-resistant Gene of Plant by RGA Labeling

ZHANG Rong,CHEN Ou,WANG Zhen-ying

(Tianjin Key Lab of Cyto-genetical and Molecular Regulation,College of Chemistry and Life Science,Tianjin Normal University,Tianjin 300387,China)

Abstract:The structure characteristics about plant disease-resistant gene was summarized, the same sequences of cloned disease-resistant genes by RGA and its applications were introduced. At last, the application prospect of RGA was expected.

Key words: RGA;resistance gene;construction domain

植物在长期的发展进化过程中,不可避免的会遭到各种病害的侵袭,在不断地抵抗其危害的过程中,植物本身形成了一套比较完整的抗病基因序列,然而在不同的植物品系之间,这类抗病基因之间存在着很大的同源性,这类基因被通称为植物抗病基因(Resistance gene,R基因),并在1992年被首次克隆成功[1]。针对作物、园艺等不同方面的需求,人们对大量植物种类进行了广泛的实验验证,均证明植物的抗病基因同源性确实存在且相对稳定,这逐渐成为实验研究的一种重要引证和新的实验方法的源泉。

1 植物抗病基因的结构特点

R基因是在植物抗病过程中抵抗病菌浸染及扩展的有关基因,也就是Flor经典遗传学的基因对基因(gene-for-gene)假说中所指的与病原菌无毒基因相对应的基因,存在于植物的特定品种中,在植物生长的整个周期或其中某个阶段表达的植物抗病品种所特有的一类基因。研究表明,这些抗病基因的氨基酸序列之间具有较高的同源性。

1.1 NBS-LRR结构域的特点

富含亮氨酸重复序列(Leucine Rich Repeats, LRR),与蛋白质之间的互作及信号的转导存在密切的联系,包括两种:一种存于细胞外,一种存在于细胞内。核苷酸结合位点(Nucleotide Binding Site, NBS)—真核生物中具有结合ATP和GTP活性的蛋白,含有三个保守的特征结构域,一是激酶la,即磷酸结合环(P-loop),二是激酶2,三是激酶3a,这两类保守的区域多同时存在,形成抗病基因的保守结构域,大多数已克隆得到的R基因都有NBS-LRR区域。2004年孙学辉等人利用HMM(Hidden Markov Model)对源于日本晴的粳稻基因组和9311的籼稻基因组的蛋白数据库进行了搜索,分别获得了325个和344个富含NBS-LRR类抗病基因的蛋白序列,并得到了与它们相对应的cDNA序列。它们的共同特点是:在它们编码蛋白的近N端存在NBS,而在它们的近C端则存在LRR[2]。

1.2 TIR、STK及LZ结构域的特点

与果蝇Tol1蛋白及哺乳动物白细胞介素-1受体的细胞外相似的区域(TIR),在植物内部免疫反应过程的信号转导中起作用。它们能够与相应的免疫反应的启动子相结合,从而使相关的基因表达,以达到对病原物的抗性作用[3]。此外,还包括丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶(Serine/ Threonine Kinase, STK)和亮氨酸拉链结构(Leucine Zipper, LZ)等结构域,其中STK包含两个特征结构域,即DaKXXN和GTaGYXAP(N/E)[4],在抗病过程的信号转导途径中,此种激酶借助磷酸化其它的信号分子而达到传递其抗性信息的目的。而LZ则是存在于蛋白质一侧的亮氨酸残基结构,每7个氨基酸形成一个重复,而在最后一位上则是亮氨酸或异亮氨酸,在形成二级结构的α-螺旋时,借助疏水作用两两相连而形成类似于拉链的结构[5]。针对这样的特点,RGA方法应运而生,通过R基因的保守结构域扩增分离RGA,目的是为了找到更接近于R基因的分子标记并得到更新的植物抗病基因。作为一种简便易行的分子标记方法,RGA逐渐被大家认可并广泛地应用于抗病基因的寻找过程中。

2 利用RGA法克隆的抗病基因同源序列及其应用

2.1 RGA技术原理及其特点

RGA分析主要是针对抗病基因的表达产物存在保守区域的特性,人工合成相应的简并引物,进而以植物的总体DNA或cDNA为模板进行PCR扩增,分离出与其他植物或本种类植物与抗病基因类似的序列,再以PCR扩增所得的产物作为探针,运用RFLP等其他的分子标记方法进行分析,将该克隆产物进行定位,通过在抗病的近等基因系文库内进行筛选,获得试验预期的抗病基因的克隆产物,或进一步明确这些新获得的基因与已知的抗病基因间的连锁关系,从而为接下来的克隆或转化该基因奠定了一定的基础。

RGA既可以是一种DNA 的分子标记,也可以是个体本身所携带的特异抗病基因,在植物中是普遍存在的,多以成簇的方式随机分布于植物基因组中。它与R基因间可能存在3种关系:第一,分离的RGA可能本身就是一种新的R基因;第二,分离的RGA可能是已经得到的某种R基因的紧密连锁;第三,还有一种可能就是分离的RGA与R基因根本没有关系,只是在某些非主导型序列上存在相似性而已,因此分离后期的连锁性鉴定就显得尤其重要了。早期的RGA主要是从基因组DNA 中得到的,不可避免地会受到DNA中大量存在的非表达区域和重复区域的干扰,进而影响克隆的效果而得到错误的结果。近些年来,研究者逐渐改为从cDNA中克隆得到RGA,再利用特异引物返回到基因组DNA 中获得基因全长。

虽然在之前的工作中采用RGA法已经在抗病基因克隆方面取得了较好的成绩,但是此种方法还存在自身的缺陷:(1)NBS、LRR和STK等保守序列并非只存在于抗性基因中,导致分离得到的RGA并不是都与R基因有关,使得克隆R基因的过程变得复杂;(2)克隆所需的引物在设计时要考虑到抗病基因中的较高同源性,引物设计的好坏严重影响PCR产物的实用效果;(3)因R基因在植物中多以成簇的方式存在,因此所得到的与其连锁的RGA,还要在基因簇中进行筛选,而不是全部接受整个基因簇的基因。

2.2 RGA方法的应用

RGA标记与一般的分子标记如RAPD或RFLP相比,存在其自身的优越性,不仅用于揭示品种的遗传差异,而且还可以反映品种的功能,有助于选择品种组合和控制病害。它的应用主要包括:首先,可以作为分子标记用于抗病基因的标记;其次,构建连锁的遗传图谱和辅助植物的抗病育种;再次,RGA也可作为探针用于基因组文库的筛选或抗病基因的克隆;此外也有直接应用RGA 的简并引物分析种质资源间的遗传关系的。

目前,RGA分子标记的方法已经在多种植物中广泛应用,分离得到的RGA在GeneBank上记录的已达到200多种。涉及的植物种类广泛,主要集中在水稻、麦类等粮食作物中。随着分子生物学技术的飞速发展,植物的抗病性逐渐被大量地应用于育种实践中,进而避免化学药物防治对环境和人类造成的破坏和危害。

首先,水稻作为我国的首要粮食类作物,针对其易感染的叶枯病[6]、稻瘟病[7]等主要病害而进行的抗病基因同源序列分析,目前已经成为许多研究者的实验重点,旨在获得更接近于R基因的抗病基因序列,从根本上提高其抗病性,进而提高水稻的产量和质量。

其次,小麦作为仅次于水稻的第二类主要作物,研究其抵抗病害的基因作用原理也具有深远意义。麦类作物普遍感染的叶锈病、白粉病[8],已经成为困扰广大科学家和全国粮农的首要病害,寄希望于找到更好的抗病基因从而较为彻底的解决此类问题。在麦类植物中应用抗病基因同源序列法,也已经在一定程度上取得了骄人的成绩。胡楠等人[9]针对抗白粉病基因Pm4b进行的RGA分析,获得了稳定的长度为1 321 bp的RGA序列的多态性条带。

另外,利用抗病基因同源序列法在拟南芥、番茄、大豆等的R基因中都成功地建立了特异的分子标记。几种典型植物的抗病基因同源序列见表1。

3 RGA研究展望

RGA法作为近些年发展起来的新型分子标记方法,凭借其简便的技术以及与抗病基因的较高相关性,已得到诸多科学工作者的认可和支持,获得了不同植物的大量RGA,为进一步的实用价值的创造提供基础。通过分离RGA的方法克隆R基因或得到与R基因紧密连锁的分子标记,特别是针对复杂的基因组来说,是相对简便的一种标记方法。在接下来的研究中应当努力克服其各方面的缺陷,结合其他更加先进的分子生物学技术,从植物体内获得更多的RGA,进而获得更加有效的植物抗病基因,为植物育种做出更进一步的探索。

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植物分子标记研究 篇3

关键词：新型DNA分子标记,RGAs标记,RMAPD,SRAP,TRAP

DNA分子标记技术研究始于19世纪80年代,是指能够反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段,是DNA水平上遗传多态性的直接反映,大多数DNA分子标记以电泳谱带的形式表现个体之间的DNA差异[1],是生物分类学、育种学、遗传学和物种起源与进化等研究的重要技术指标之一。DNA分子标记有以下优点: (1)具有较强的多态性;(2)直接以DNA为表现形式。不受环境、季节限制,不受个体发育阶段的影响,不存在基因表达与否的问题,没有组织及器官特异性;(3)许多分子标记表现为共显性;(4)数量的丰富性;(5)表现为“中性”;(6)经济方便和易于观察记录[2]。

根据北京农科院王军等[1],通过检测手段或相关技术,将分子标记划分为三代四类:

1 第一代分子标记技术

以Southern杂交为核心的分子标记技术。最具代表性的是发现最早的RFLP标记。

RFLP(Restriction Fragment Length Polymorp hism,限制性片段长度多态性)是由Grodzicker等于1974年创建,80年代中期发展起来的一种最早的分子标记。RFLP是由于DNA中限制性内切酶酶切识别序列中出现碱基的变异而导致酶切位点的增减所引起的限制性片段长度的差异。基本原理是:将DNA用已知的限制性内切酶消化后,产生大小不等的DNA片段,电泳分离、Southern印迹转移到硝酸纤维膜上,用放射性标记探针与膜上变性DNA杂交,放射自显影,显示出不同材料的多态性图谱。RFLP标记呈共显性遗传。该技术步骤繁杂,工作量大,且DNA的需要量大,在很大程度上限制了RFLP技术的应用[2]。

2 第二代分子标记技术

第二代分子标记技术主要分为两类。第一类为基于PCR的DNA分子标记。根据所用引物的差异,该类标记又分为随机引物PCR标记和特异引物PCR标记,随机引物PCR主要包括RAPD标记和ISSR 标记等,特异引物PCR包括SSR标记和STS标记等。第二类为基于PCR与限制性酶切技术结合的DNA标记。这类标记包括两种类型,一种是通过限制性酶切片段的选择性扩增来显示片段长度的多态性,如AFLP标记等,另一种是通过对PCR扩增片段的限制性酶切来揭示扩增区段的多态性,如CAPS标记等。

2.1 基于PCR的DNA分子标记

2.1.1 随机引物PCR标记 (1) RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA,DNA随机扩增多态性):RAPD是由Williams和Welsh两个研究小组于1990年分别研究提出的一种分子标记,是建立在PCR基础上的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的DNA分子标记技术。以样品DNA为模板,以一个人工合成的随机寡核苷酸序列为引物,通过PCR非定点扩增DNA片段,用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性[3]。RAPD具有技术简单、检测迅速、灵敏度高、特异性强、检测容易、DNA样品用量少的特点,但RAPD为显性遗传,存在共迁移问题,并且重复性较差。可将RAPD转化为SCAR标记,SCAR通常为显性标记,通过转化可以增加RAPD标记的稳定性和信息量[4]。(2)ISSR(Inter simple Sequence Repeats,内部简单重复序列): ISSR分子标记是由Ziet kiewiez E于1994年创建的,是在微卫星分子标记基础上发展起来的一种分子标记。ISSR基本原理与SSR相似,利用人工合成的16~18个核苷酸重复序列作为引物,对SSR之间的DNA序列进行PCR扩增。ISSR在引物设计上比SSR简单得多,不需知道DNA序列即可用引物进行扩增,又可以比RFLP、RAPD、SSR提供更多的遗传信息,现已在遗传作图、基因定位、遗传多样性、进化、系统发育等研究方面被广泛应用。但ISSR作为一种显性标记(部分共显性),多数情况下不能区别一个位点扩增的DNA片段,且不同物种SSR不同,造成引物在筛选上具有相对的不随机性[5]。

2.1.2 特异引物PCR标记 (1)SSR(Simple Sequence Repeats,简单重复序列):SSR分子标记由Litt M,等于1989年创建的。简单重复序列6~8个核苷酸的重复序列,分布于整个基因组的不同位置上。由于重复次数的不同及重复程度的不完全造成了每个位点的多态性。根据其两端的保守序列设计一对特异性引物,PCR扩增,再经聚丙烯酰胺凝胶电泳即可显示不同基因型个体在这个SSR位点的多态性[6]。(2)STS(Sequence tagged Site,序列标记位点):STS标记是由OlsonM于1989年创建的,是一种等位点的标记,在不同基因组间具有特异性,它是将RFLP标记技术转化为基于PCR的方法,通过设计一对长度约20bp的特异引物,对基因组DNA 进行扩增,该方法在设计引物时也需要测序,但是,一旦获得引物,STS 法就变得和RAPD 一样简单、迅速[1]。

2.2 基于PCR与限制性酶切技术结合的DNA标记

2.2.1 限制性酶切片段的选择性扩增来显示片段长度的多态性 (1) AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism,扩增片段长度多态性):1993年由荷兰科学家Zabeau等创建的AFLP分子标记技术,是利用PCR技术检测DNA多态性的一种方法[7]。AFLP的基本原理是对DNA限制性酶切片段进行选择性扩增。具体操作为基因组DNA经限制性内切酶双酶切后,形成分子量大小不等的限制性片段,再将双链人工接头(artificial adapter) 连接在这些DNA片段的两端,形成一个带接头的特异片段,并作为扩增反应的模板,扩增片段经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测[8]。

2.2.2 对PCR扩增片段的限制性酶切来揭示扩增区段的多态性 (1)CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence,放大剪切序列多态性):CARS标记是1993年由Paran在RAPD技术的基础上发展起来的。基本流程是:先作RAPD分析,回收RAPD片段,克隆和测序,再根据该序列设计特定引物,进行PCR扩增,可以鉴定出与原来的RAPD片段相对应的单一位点。该标记为共显性遗传。由于CARS标记使用的引物长,因而实验的可重复性高,因此比RAPD和其它利用随机引物的方法在基因定位和作图中的应用要好[2]。

3 基于单核苷酸多态性的DNA分子标记

第三代分子标记是基于单核苷酸多态性的DNA分子标记,如SNPs标记。(Simple Nucleotide Polymorphisms,单核甘酸多态性)

同一位点的不同等位基因之间常常只有一个或几个核苷酸的差异,从分子水平上对单个核苷酸的差异进行检测具有重要意义。随着计算机和DNA芯片技术引入分子生物学领域,研究者可同时对成千上万个克隆测序,用计算机分析数据和显示最终结果。目前,检测SNPs标记最常用的方法有两种,①随机扩增DNA(RAPD)法,②DNA芯片(DNAchip)检测法[1]。

4 几种新型分子标记

4.1 RGAs标记(Resistance Gene Analogs,抗病基因类似物)

RGAs是用基于抗病基因保守序列设计的引物扩增基因组得到的抗病基因类似序列的新型的分子标记。尽管基因间整个序列的同源性不足于用RFLP杂交检测,但抗病基因中存在的这些保守区域为在其它植物中进行PCR扩增和分离RGAs提供了机会[9]。

4.2 RMAPD标记(random microsatellite amp lify polymorphic DNA,随机微卫星扩增多态)

利用RAPD引物和微卫星上游或下游引物结合,对基因组DNA进行扩增,探索更有效的揭示所有微卫星及其他DNA遗传多态性的方法,以期获得研究DNA多态性的新的分子标记方法。因该方法同时利用随机引物和微卫星引物进行扩增,暂时定名为随机微卫星扩增多态DNA[10]。

4.3 SRAP(Sequence Related Amplified Polymorphism,相关序列扩增多态性)

SRAP标记是基于PCR技术的新型分子标记技术,其原理是利用基因外显子里G、C含量丰富,而启动子和内含子里A、T含量丰富的特点设计两套引物,对开放阅读框架进行扩增。此技术具有简便、稳定、中等产率和容易得到选择条带序列的特点,在基因组中分布均匀,适合于不同作物的基因定位、基因克隆和遗传图谱构建[11]。

4.4 TRAP标记(Target Region Amplified Polymorphism,靶位区域扩增多态性)

TRAP是由HUJG等于2003年从SRAP技术改进而来的新型分子标记技术,其原理是借助大规模测序技术产生的庞大生物序列信息,利用生物信息学工具和表达序列标签数据库信息设计引物,对目标候选基因序列区进行PCR 扩增产生多态性标记。此标记具有操作简单、重复性好、稳定性好、效率高的特点。目前已经成功应用于许多植物的遗传图谱构建、重要性状基因标记、种质资源的多样性研究及分子标记辅助育种等方面[11]。

分子标记作为新的遗传标记,具有比形态标记、细胞标记和同工酶标记显著的优点,因此自分子标记诞生短短20多年间,已发展了许多种分子标记技术,并已被广泛应用于动植物遗传育种、连锁图谱构建、基因定位与克隆和物种鉴定等方面。尽管分子标记有许多优势,但目前发现的任何一种分子标记均不能满足作为理想的遗传标记的所有要求,但可以预见,在不久的将来,分子标记技术会产生深远的影响。

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杜鹃分子标记的研究进展 篇4

近年来随着分子生物学的迅猛发展, 分子标记技术广泛应用于杜鹃研究。分子标记是揭示碱基序列变异的遗传标记, 与细胞学标记、形态学标记、生物化学标记相比, 不受环境、发育阶段等影响, 且检测手段迅速简单、多态性高、稳定准确, 是形态学分类的重要补充。文章综述了近年来分子标记技术在杜鹃研究中的应用, 以期为日后杜鹃花系统分类、合理开发利用杜鹃种质资源提供参考。

1 分子标记的发展动态

分子标记是植物DNA水平上遗传多样性的体现, 新型分子标记技术的大量涌现大大缩短了植物常规育种的周期, 分子标记已广泛应用于植物遗传结构检测、亲缘关系鉴定、遗传图谱构建、遗传多样性分析及转基因研究等方面[1,2]。目前分子标记种类繁多, 根据不同的核心技术可分为3类:第一类以Southern杂交为核心, 如RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) ;第二类以PCR反应为核心, 包括多位点标记方法RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 、DAF (DNA Amplification Fingerprinting) 、SSCP (Single Strand Conformational Polymorphism) 、SSR (Simple Sequence Repeats) 、小卫星DNA (Minisatellite DNA) 等, 位点特异的PCR标记方法IS-SR (Inter-Simple Sequence Repeat) 、AP-PCR (Arbitrary Primer PCR) 、STS (Sequence Tagged Site) 等及PCR与酶切相结合的方法AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) 、CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) 等;第三类以单核苷酸多态性或m RNA为核心, 主要以SNP (Single Nucleotide Polymorphic) 技术和EST (Expressed Sequence Tag) 技术等为代表[3,4,5,6,7]。

分子标记技术能够更深层次的解释生命现象本质, 使我们认知范围从宏观表型到微观世界[8]。分子标记直接反映DNA水平上的遗传多样性, 能够反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段[9]。因此, 在形态分类学基础上结合分子标记技术进行物种鉴定与分类对物种的种质资源研究及品质创新具有重要的意义。

2 主要分子标记的研究

2.1 杜鹃ISSR分子标记的应用

ISSR (简单重复序列间多态性) 分子标记技术由Zietkiewicz等[10]提出, 在SSR基础上发展起来的分子标记, 属于位点特异的PCR标记。ISSR标记具有实验成本低廉、实验操作简单、引物适用广泛等优点[11,12]。

目前国内学者在杜鹃属植物种群间的遗传多样性和种间亲缘关系分析研究中运用最多的分子标记是ISSR标记。刘旭颖等[13]将ISSR用于9种杜鹃花的亲缘关系分析, 扩增出522条带, 其中有90.63%是多态性的。遗传距离从0.1833到0.7236, 表明种间具有较丰富的遗传多样性。郑宇等[14]研究了11个杜鹃栽培品种的遗传多样性, Shannon多样性指数为0.4742, 表明遗传多样性水平较高。彭婵等[15]、赵芯等[16]及罗清等[17]学者都利用ISSR分子标记技术分别对不同的野生杜鹃属植物种群进行遗传关系研究, 结果都表明种群遗传多样性处于较高水平, 种群间的基因交流频率很高, 能较好的适应当前环境。孔刚[18]对福建旗山2个马银花 (R.ovatum (Lindl.) Planch.ex Maxim.) 种群研究, 2个种群的基因流Nm=0.2627<1, 表明种群基因交流较少, 可能由于种群所处的生境与外界联系甚少, 被周围环境的高山与溪流所阻隔。钟容等[19]对筛选出13条引物进行PCR扩增, 研究表明4种杜鹃花遗传背景既有相同之处又有一定差异。陈春福[20]以九仙山上的鹿角杜鹃 (R.latoucheae Franch.) 与满山红 (R.mariesii Hemsl.et Wils.) 6大类为实验材料, ISSR分子标记分析表明, 在不同海拔处的株系呈现出较大的遗传差异, 可能与植株所处的环境条件、气候等因素有关。赵冰等[21]对秦岭地区美容杜鹃 (R.calophytum Franch.) 的5个野生种群通过ISSR分子标记技术分析其遗传多样性, 表明不同种群间的美容杜鹃遗传多样性水平差异大, 遗传分化的程度与地理距离无相关性。而赵凯等[22]学者研究群居的都支杜鹃 (R.shanii Fang) 遗传多样性较低, 但是遗传距离却与地理距离显著相关, 可能是都支杜鹃高度一致性的生境及异交的生活特性所导致。王刚[23]对黄山杜鹃 (R.maculiferum Franch.) 5个种群利用ISSR标记进行研究, 种群间遗传水平不高, 需对幼苗进行混合繁殖, 加大居群间迁移和交流使居群间的遗传基因重组, 以此提高黄山杜鹃种群的遗传多样性水平。

2.2 杜鹃AFLP分子标记的应用

AFLP (扩增片段长度多态性) 由荷兰科学家Pieter Vos等[24]提出, 是3’端具有选择性的双引物PCR标记, 属于PCR与酶切相结合的方法[25]。AFLP分子标记具有重复性好、多态性强、分辨率高及样品适用性广等优点, 在构建遗传图谱、遗传育种、基因表达与调控、物种分类和进化等方面有着广泛的应用前景。

AFLP标记一次单个反应可检测到大量限制性片段, AFLP是最有效的分子标记, 由于实验结果数据统计量庞大, 因此运用在杜鹃属植物上较少, 仅有几个学者采用AFLP标记对杜鹃遗传多样性进行分析。纵丹等[26]采用AFLP标记对马缨杜鹃 (R.delavayi Franch.) 5个居群进行检测与分析, 居群内83.12%发生遗传变异, 基因流为2.4624, 居群遗传多样性较高。赵冰等[27]研究秀雅杜鹃 (R.concinnum Hemsl.) 种群的遗传分化程度及遗传多样性, 结果表明秀雅杜鹃无论在种群水平还是物种水平上遗传多样性都比较高, 遗传变异主要在种群内部, 且遗传距离与地理距离相关性不显著。吴富勤[28]对2个居群的大树杜鹃 (R.protistum Balf.f.et Forrest var.giganteum (Tagg) Chamb.ex Cullen et Chamb.) 利用AFLP分子标记来研究遗传结构与遗传多样性, 研究显示2个居群间的遗传分化程度低, 基因流较高, 遗传多样性在物种水平上较高。其研究结果印证了“狭域分布的小种群亦能维持较高的遗传多样性”的假说。

2.3 杜鹃RAPD分子标记的应用

RAPD (随机扩增多态性DNA标记) 是由Williams等[29]提出, 是基于PCR技术对未知序列的基因组检测DNA多态性的方法。RAPD分子标记具有操作简单易行、易于程序化、所需DNA样品量少、退火温度低、实验周期短等优点, 因此被广泛应用于遗传学、系统发育学与分子生药学等领域。

张春影等[30]对不同海拔牛皮杜鹃 (R.aureum Georgi) 种群利用RAPD标记进行遗传多样性分析:产地不同的种群遗传多样性高, 可能与气候因子、环境因子及地理因子等因素综合影响有关;产地相同的遗传多样性水平低, 可能是由于分生境狭小产生地理间隔的生殖屏障, 阻断基因交流。姬文秀等[31]利用RAPD标记鉴定出6份大字杜鹃 (R.schlippebachii Maxim.) 的亲缘关系。刘雁飞[32]对长白山居群牛皮杜鹃进行研究, 借助RAPD分子标记分析, 发现遗传多样性与遗传结构受地理环境的影响, 遗传多样性水平高, 说明牛皮杜鹃适应环境的能力较强。

2.4 杜鹃SSR分子标记的应用

SSR (简单序列重复) 由Moore[33]提出, 是重复单位 (含有1~6个核苷酸) 组成的基序串联重复而成的DNA序列, 为单引物PCR标记。SSR长度的高度变异性是SSR标记产生的基础。SSR分子标记具有等位基因变异多、多态性高、信息量丰富、重复性好、结果可靠及呈共显性等优点, 具有巨大的应用价值, 因而该技术被用于目标基因的标定、分子辅助选择育种、遗传机制、品种测定和遗传连锁图谱构建等的研究中。

虽然目前最接近理想的分子标记是SSR标记, 但引物开发要建立在已知的DNA序列上, 由于杜鹃植物DNA序列信息相对缺乏的情况下, 使得杜鹃SSR标记引物的开发相对较少, 因此国内学者在杜鹃属植物上对SSR标记的应用不多[34,35,36]。周泓[37]运用Dendauw等开发的SSR引物对130个杜鹃花进行SSR分子标记实验, 所用引物呈现的多态性都比较高, 聚类结果与传统分类系统基本吻合。吴富勤[28]运用SSR标记对居群大树杜鹃进行保护遗传学研究, 结果表明大树杜鹃历史基因流高, 经过多年演变现已不能维持足够的等位基因丰富度, 近代基因流低, 濒临极危的状态, 建议加强基因交流, 就地保护与迁地保护相结合, 扩大有效居群地。

2.5 杜鹃SRAP分子标记的应用

目前在杜鹃属上应用的还有SRAP分子标记。该分子标记由于2001年美国加州大学Li和Quiros[38]博士提出的, 是基于PCR的一种新型的标记系统。SRAP分子标记具有高共显性、重复性好、方便测序和简单高效等优点, 应用于重要性状基因标记、比较基因组学、遗传多样性分析及遗传图谱构建等研究领域。

苏家乐等[39]运用SRAP分子标记鉴别了10份杜鹃属植物, 遗传分化明显, 遗传多样性高, 分类结果与传统形态学基本一致。吴月燕等[40]以24个西洋杜鹃为实验材料, 优化建立了适合西洋杜鹃的SRAP-PCR反应体系, 并利用该体系对供试材料进行了遗传多样性分析, 结果显示SRAP分子标记可以很好用于该实验材料的鉴定。

3 总结与展望

分子标记技术已广泛应用于杜鹃遗传育种中, 在遗传多样性分析、亲缘关系研究与种质资源鉴定等方面开展了一系列工作并获得了一些成果。多态性信息的统计分析可以从分子水平提供杜鹃遗传变异的证据, 为全面掌握现有杜鹃资源的遗传多样性提供参考。从基因组DNA水平上的差异研究杜鹃亲缘关系, 结果客观准确, 为选育杂交优势强、性状优良的杜鹃品种提供理论支撑。杜鹃品种繁多、市场混乱, 分子标记技术以品种间变异的可识别性与稳定性成为传统植物鉴别方法的有效补充。

杜鹃分子水平研究仍处于起步阶段, 遗传图谱构建与辅助选择育种等研究未见报道。遗传图谱是遗传育种及分子克隆的理论基础, 高密度遗传图谱的构建可有效开展质量、数量性状定位、分子标记辅助育种及比较基因组学等研究。分子标记辅助育种可对目标性状进行早期选择, 从而缩短育种周期。

水稻分子标记辅助育种研究进展 篇5

1 分子标记辅助育种技术的四大优点

1.1 针对质量性状的选择

常规杂交育种通过对其表现型常年多次重复的观察是可以获得其纯合植株的。但周期一般要七八年甚至是十多年。在常规育种的基础上借助分子技术的辅助手段可以将质量性状准确地定位,大大地降低了回交的次数,也缩减了所需要的年限。

1.2 针对数量性状的选择

常规杂交育种仅仅是透过对表现型的观察来选择基因型,在此过程中环境等因素会引发极大的误差,而且是完全不能避免的。而借助分子标记辅助手段,是直接对基因型进行选择,不但精准而且效率高。植物大多数的农艺性状都是由多个基因联合调控的,所以单纯的常规育种在针对数量性状的选择上已经达到了瓶颈。

1.3 分子标记辅助育种不存在安全隐患

因为在整个育种过程当中完全不需要引入外源基因。与转基因育种有本质的区别。这项技术极大地发挥了种群内部遗传多态性的优势,是将种群内部优良性状整合的一个过程。

1.4 分子标记辅助育种是直接在DNA水平上选择差异

是DNA遗传变异的直接反映,它能够根据植物体的各个时期进行选择,不受环境及表达的限制,数量多,多态性高,并且遗传稳定。

2 几种常用的分子辅助技术

2.1 RFLP(Restriction Fragment Length Poly-morphism)

RFLP是Botstein等于1980年提出的分子生物学最早的遗传标记技术。它指的是基因型之间限制性片断长度的差异,这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或者点突变引起的。1994年沈革志等[1]利用28个RFLP标记为探针测定了IR8及其亲本在9种限制性核酸内切酶酶切条件下的反应,从中寻找到很多标记所在染色体片段的来源。2006年王松文等[2]通过对19个水稻品种的RFLP分析又以RZ906为例进行了籼粳特异性及其序列分子生物学解析,为全面揭示水稻籼粳分化奠定了新的基础。同时对研究籼粳分化和开展籼粳品种分类研究具有方法学意义。

2.2 RAPD(Random Amplified Polymor-Phic DNA)

RAPD是1990年由Williams[3]和Welsh[4]领导的2个研究小组发展起来的,建立在PCR基础之上的一种DNA分子标记技术。它采用任意的非特异性单一引物,对研究对象基因组DNA进行PCR扩增,扩增产物通过电泳、染色来显示扩增DNA片断的多态性。2000年李云海等[5]应用RAPD技术对24个籼稻不育系3个保持系和3个恢复系,从100个RAPD引物中筛选出了14个重复性比较好的引物。它可以区分遗传背景极为相近的不育系,以此手段解决重大种子纠纷案的技术积累。2001年刘俊峰等[6]在对稻瘟病毒性研究中应用RAPD技术获得了一个大小约为1 000bp与基因连锁的RAPD标记,且两者的遗传距离为3.7cM。2002年高东迎等[7]在以RAPD对抗水稻白叶枯病基因(Xa-25)的研究中获得了两个新的RAPD连锁标记Sl269和Sl327。2011年黄雯雯等[8]在对安徽省的32个水稻纹枯病和立枯丝核菌的RAPD分析表明其DNA的多态率高达98.2%。

2.3 AFLP(Amplified Fragment Length Poly-morphism)

AFLP由荷兰科学家Vos等[9]人创建,并于1993年获得了欧洲专利局专利,1995年以论文的形式发表出来。AFLP是在RFLP和PCR的基础上发展起来的,利用了RFLP的可靠性和PCR的高效性。高风华等应用cDNA-AFLP技术调查了干燥胁迫条件下全基因组转化的转录本调控,表明90%的基因在两种稻作基因型中不受干旱胁迫的影响[10]。姬生栋等以19对引物对具有不同表现型的4种T5代变异株系及其对照进行AFLP分析,结果表明,变异株系基因组较香稻1号发生了明显的变化[11]。近期还有很多试验证明了AFLP技术在特异基因克隆中具有广阔前景

2.4 ISSR(Inter-simple Sequence Repeat)

ISSR由加拿大蒙特利尔大学的Zietkiewics等[12]于1994年提出来的。它是利用PCR扩增进行检测的一种DNA标记,所用引物根据简单序列重复设计而成,长度一般为14~20个碱基的寡核甘酸引物,用来检测两个SSR之间的一段短DNA序列的差异。具有重复性好、稳定性高、多态性丰富等优点。李进波等利用ISSR和SSR技术建立了24个水稻温敏核不育系的DNA指纹图谱,平均每个ISSR引物检测到13.38个多态性片段,远远高于SSR引物的频率[13]。王金花等利用36个ISSR引物分析了33个来源亚洲10个国家的香稻品种的遗传多样性,获得了181个多态性片段[14]。

此外,还有很多种分子标记技术在水稻的亲缘关系鉴定、优良的农艺性状识别以及抗病抗逆基因指示上发挥着重要的作用。然而,各种分子标记技术都不是十分完美的。陈宏等[15]在对RAPD稳定性的研究中指出,DNA模版的质量、DNA的浓度、引物的选择,甚至是稳重熟练的操作技术才能保证RAPD扩增产物的重复性以及稳定性。武波等[16]在对抗稻飞虱的研究中,先应用RAPD技术进行标记,之后再转成SCAR(Sequence-characterized Amplified Region)标记大大地提高了标记的稳定性。樊颖伦等[17]在对抗白叶枯病基因Xa23中指出虽然RFLP的标记数量大可以区分纯合还是杂合,但是其工作量大、费用高。而在RFLP测序后根据序列信息设计引物将RFLP转化成STS标记确实解决了这个问题。由此可见,各种分子标记技术之间的互相协作才能使水稻育种真正达到高效率、低成本、容易操作的最终目的。

3 借助分子标记辅助育种手段培育的水稻品种(系)

3.1 增加产量

由国家杂交水稻工程技术研究中心[18]以超级稻亲本9311为受体和轮回亲本,与马来西亚普通野生稻杂交和连续回交,利用分子标记辅助选择,育成了携带野生稻增产QTL yld1.1和yld2.1的新亲本R163,与自选广适性光温敏不育系Y58S配组,育成两系杂交中稻新组合Y两优7号,生育期限35d左右,有效穗数225万株·hm-2,穗粒数180~220粒·穗-1,结实率80%以上,千粒重26~29g,中低水肥条件下产量达9.75~10.50t·hm-2,超高产条件下产量达12t·hm-2。并于2008年通过了湖南省农作物品种审定委员会的审定。

3.2 改良品质

通过分子辅助育种着重改良杂交稻的食味品质。由浙江大学原子核农业科学研究所[19]培育的不育系浙农3A于2009年通过浙江省品种审定委员会审定,大大降低了直链淀粉含量,稻米品质得到了改良。在向明恢63品种导入来自中国香稻的alk和fgr等位片段中,获得的改良品系,其稻米糊化温度显著降低,胶稠度升高,具有了香味,并且心白粒率得到了降低[20]。外观品质、蒸煮食味品质得到了显著的改善。在改良特青、汕优63等超高产品种的品质中都采用了分子标记辅助手段并且取得了良好的效果[21,22]。

3.3 提高抗病虫性

由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室、国家农作物分子育种中心[23]通过分子标记辅助选择的方法将稻瘟病抗性基因Pi-1、Pi-2从供体BL6中回交聚合到在我国广泛应用的两系杂交稻光温敏核不育系培矮64S中,并筛选得到10株改良株系,既改良了该系的抗瘟性,又保存了长日低温条件下的高不育率。官化忠等[24]利用与Pi-9紧密连锁的分子标记SRM22为选择标记,也成功地将水稻品系75-1-127中的稻瘟病抗性基因Pi-9导入优质水稻雄性不育系金山B-1,显著提高了该不育系对稻瘟病的抗性。李仕贵等[25]利用与稻瘟病抗性基因Pi-d(t)紧密连锁的分子标记RM262对含有稻瘟病抗性基因Pi-d(t)的地方品种地谷与江南香糯及8987的F2群体进行辅助选择,选择准确率达98%以上。Liu等[26]利用Pi-1的连锁标记对珍汕97B进行稻瘟病抗性改良,获得17株含Pi-1的“珍汕97B”近等基因系纯合株系。陈学伟等利用该技术将3个抗稻瘟病基因Pi-d(t)1、Pi-b、Pi-ta2聚合到优良保持系冈46B[27]。Hittamani等将稻瘟病抗性基因Pi-5、Pi-1和Pi-ta聚合到同一品系BL124中。倪大虎等利用分子标记辅助选择技术将白叶枯病抗性基因Xa21和稻瘟病抗性基因Pi-9聚合到同一水稻品系,获得了同时高抗稻瘟病和白叶枯病的稳定株系[28]。陈英之等[29]对来源于普通野生稻的5个抗稻褐飞虱(BPH)基因通过杂交、回交和分子标记辅助选择,转育和聚合BPH抗性基因到杂交水稻亲本中,获得了与抗BPH基因紧密或较紧密连锁的SSR分子标记,成功地获得5个杂交水稻亲本抗性基因聚合系。其苗期和成株期表现对BPH高抗性。杨子贤等[30]利用分子标记辅助选择改良93-11恢复系对白叶枯病和螟虫的抗性取得了良好的效果。在回交的后代家系中筛选得到了抗白叶枯病的Xa21基因和Bt基因。

4 展望

自20世纪80年代分子生物学起步经历了90年代的快速发展,直到21世纪分子生物学时代的飞速发展。人们可以从对植物原始的表象观察深入到分子水平的本质差异。这其中不单单激发了人类与生俱来的好奇心,同时隐藏的巨大经济利益也是不能忽略的。转基因大豆、转基因玉米早已不是什么新鲜的话题。2009年中国生物安全网上公布了华恢1号和Bt汕优63两个转Bt基因水稻品种获得了安全证书。至今为止通过分子手段商业化的品种都是以转基因的方式引入外援基因,为该品种增加额外的优良性状。转基因是为物种导入外源基因,而分子标记辅助选择技术则是充分地发挥了物种内部基因多态性的资源,将优良性状标记整合的一个过程。可以说不存在安全隐患问题,但是随着科学、经济、法律和意识形态的发展变更,以分子标记技术整合的优良性状,培育出的完美品种是否和转基因品种一样存在专利权的问题?由于水稻很多优良性状是由多基因控制,在通过分子辅助手段整合多个大片断基因来改良水稻性状对提高水稻生产水平将起到非常重要的作用。使水稻育种进入一个由表及里、由里及表的崭新时代。也可以说是生物技术时代的一个光辉里程碑,它将在遗传育种的历史上留下不可磨灭的印记。

摘要：为充分挖掘水稻分子标记辅助育种的潜质,分析了分子辅助育种较常规育种方法的优点,常用的分子辅助育种技术(RFLP、RAPD、AFLP、ISSR)及优点和不足,同时阐述了通过分子标记辅助选择育种方法培育或改良现有水稻品种的产量、品质以及抗病虫性等成果。

分子标记在茶叶研究中的进展 篇6

1 遗传多样性

基因型不同的品种,或不同亲缘关系的物种,基因组内核苷酸序列存在差异。当使用同一随机引物对不同基因组体外扩增时,基因组上与引物互补的DNA片段(模板)的数目、位点是不同的,因而其扩增产物(DNA片段)的大小、数目也不同,亦即扩增产物表现出多态性。当使用一系列不同的随机引物扩增时,这种多态性更加丰富。这种扩增产物的多态性反映了被测材料的遗传多样性。目前,RAPD、RFLP、AFLP、ISSR等多种分子标记已经广泛应用于分析茶树DNA水平的遗传多样性,并取得了非常重要的进展。

SC Roy等[5](2009)应用RAPD和ISSR标记对三大类无性系品种:中国种、阿萨姆种、柬埔寨种进行亲缘关系和遗传多样性进行了分析,结果表明RAPD测得的多态性为77.77%;ISSR测得的遗传多态性为88.54%。类群间的平均多态性为0.38;类群内的平均多态性为0.27.并且中国种(sinensis)的多态性最高(HS=0.285-0.291),柬埔寨种(assamica ssp.lasiocalyx)的多态性最低(HS=0.193-0.207),而阿萨姆种(assamica)的多态性居中(HS=0.223-0.241).并且结果显示,各类群之间只有有限的遗传交流。此结果与T.Balasaravanan等(2003)、W achira (1995)等[13,14,15,16,17]的结论相符。Paul S等(1997)最先应用AFLP技术检测了印度和肯尼亚茶树群体的遗传差异,在群体间检测出79%的多态性,群体内的遗传差异为21%,通过主要成分分析表明,肯尼亚茶树源于印度种,中国类型茶树具有更广泛的遗传差异[13]。Wachira等(2001)同时采用RAPD与AFLP两种方法,对来源于世界各地(印度、斯里兰卡、中国及中国台湾省、日本、越南、肯尼亚等)的40个茶树品种进行遗传多样性研究,结果还表明,各种群内均存在明显的变异,其变异程度按如下顺序递减:野生茶树>印度品种>中国品种>肯尼亚品种>斯里兰卡品种>越南品种>日本品种>中国台湾品种。统计分析表明,种群内个体之间的变异最大,变异程度达72%。对遗传距离的计算结果也表明,来自不同国家的茶树品种,在种群内都存在丰富的遗传变异[17]。金惠淑等(2001)利用RAPD技术研究了中国、韩国和日本茶树遗传多样性,结果表明中国茶树品种的遗传多样性高于韩国茶树品种[24]。Balasaravanan等(2003)运用AFLP标记技术对南印度49个栽培品种的遗传多样性进行分析,阿萨姆型与禅叶型之间的遗传距离最大为0.946,研究结果表明,目前南印度普遍栽培的茶树品种的遗传多样性小于37.76%[20]。各研究中得出各类群之间的遗传多样性的结果较为一致,众多学者的分析研究表明中国茶树资源的DNA遗传多样性远远高于日本、韩国、肯尼亚和印度等国茶树资源[13,14,15,16,17]。

除了类群之间的遗传多样性研究,品种的遗传多样性也研究较为广泛。陈常颂等(2006)采用RAPD分子标记技术对8个“奇兰”品种的遗传多样性进行分析。测得多态性为88.9%[9]。宁静等(2010)利用ISSR分子标记对珍稀地方种质资源“黄金茶”的110个株系进行遗传多样性分析,多态性比率达91.22%,反映了黄金茶群体基因组DNA多态性较高[8]。陈勋等(2009)采用ISSR分子标记法对湖北省12份茶树品种进行了分子鉴定,供试品种间的相似系数介于0.54-0.74,多数品种显示出较近的亲缘关系,遗传基础相对单一,可见湖北省内茶树无性系品种的遗传多样性不高[35]。黄福平、粱月荣等应用AFLP技术检测45份乌龙茶种质资源种群内遗传多样性差异,结果表明:组内遗传多样性以武夷山最高,其次为安溪的种质资源,台湾的品种资源间的多样性最小,Shamnon指数分别为01452、01397、01330、01128[15]。Rajan KumarMishra利用AFLP技术对印度大吉岭茶树遗传多样性进行研究,结果表明大吉岭茶树品系间的遗传相似性达70%。在中国类型品种中变异程度较大,在三个种质类型(Viz China,Assam and Canbodtype)之间及内部的变异程度分别是63%和36%[16]。陈亮等(2004)采用RAPD标记方法对“国家种质杭州茶树圃”保存的2700多份茶树种质资源中的15份进行了遗传多样性研究,通过对国外类似研究结果的比较,在DNA层面佐证了我国是茶树的原产地和起源中心[35]。

2 亲缘关系和分类

遗传物质的本身是DNA分子,因此,任何物种,即使其亲缘关系很近,其DNA指纹都具有不同程度的个体特异性,故可以用作品种的鉴定。而RAPD技术是进行品种(系)鉴别的有效方法。陈海军等(2002)通过对10个品种的RAPD结果进行聚类分析发现浙农121和浙农113间遗传距离最小,说明了虽然它们都是云南大叶种和福鼎大白茶的杂交后代,但其细微的变异就可以通过RAPD测定结果反映出来[18]。金惠淑等(2001)利用RAPD技术结合类平均法聚类分析研究了中国、韩国和日本46个样品的基因组DNA,结果表明,46个供试品种可分为4个类群,韩国茶树品种和日本的薮北种与浙江的鸠坑种具有较近的亲缘关系[19]。Wachira等(2001)采用RAPD和AFLP两种分子标记,对来源于印度、斯里兰卡、中国及中国台湾省、日本、越南、肯尼亚等48个品种划分为阿萨姆变种、中国变种和包含栽培型和野生型茶树品种三个类型[17]。Balasatavanan T应用AFLP分子标记技术将49个茶树品种资源划分为阿萨姆、中国和阿富汗过渡型三个类型[20]。黄福平,梁月荣等(2004)以银染AFLP分子标记技术将来自福建武夷山市、安溪县、台湾省和广东潮安县的45份乌龙茶品种划分为二大类型:福建类型和广东潮安类型[15]。黄建安(2004)用银染AFLP技术对40个茶树品种进行遗传距离分析,将其分为四个类群。类群I包括15个品种(株系),类群Ó包括10个品种,类群Ó包括13个品种,类群Ó包括2个单株[21]。陈常颂等(2006)采用RAPD分子标记技术对8个“奇兰”品种通过UPGMA类平均法聚类,绘制出基因组DNA之间的遗传关系树状图。它们的GS值在0.4一0.95之间,赤叶奇兰与白奇兰关系最近,它们之间的遗传相似性系数为0.95[9]。陈勋等(2009)采用ISSR分子标记法对湖北省12份茶树品种进行了亲缘关系分析,供试品种间的相似系数介于0.54-0.74,多数品种显示出较近的亲缘关系,遗传基础相对单一[34]。

3 分子鉴别

在茶树种质资源收集、保存和利用过程中首先需要对目标种质进行有效鉴别,以防止重复收集和保存。分子标记是一种灵敏且稳定的检测技术,可有效鉴别茶树种质资源种内或种间的遗传差异。无论是种间还是种内的茶树品种,分子标记都可以通过建立DNA指纹进行有效鉴别。金惠淑等(2001)利用RAPD技术分析区分出已知亲缘关系密切的广东水仙2个有性繁殖后代单株广东水仙—1和广东水仙—2[19]。黎星辉等(2001)利用RAPD标记技术对云南大叶茶与汝城白毛茶人工杂交获得的N代植株进行亲子鉴定,结果表明3个供试杂交后代确实来源于供试亲本云南大叶茶和汝城白毛茶[23];Matsumoto等(2001)运用RFLP技术,以苯丙氨酸解氨酶(PAL)作为DNA标记,对日本绿茶栽培种和463个本地茶树的遗传分化进行分析,表明绿茶栽培种和本地茶树具有相同的起源[24]。刘本英等(2009)利用ISSR分子标记技术对134份云南茶树资源进行了分子鉴别研究,用3种独立的方法对茶树种质资源进行了鉴别:特殊标记、特异的谱带类型和不同引物提供谱带类型组合。结果表明,UBC807等12个引物扩增的10个特异标记的存在和15个特异标记的缺失,可以为香竹箐大山茶等21份资源提供鉴别依据。引物UBC811扩增的54种谱带类型可以为海南大叶茶1等35份资源提供鉴别依据。UBC811、UBC835、ISSR2、ISSR3等4个引物带型的组合可以鉴别所有的134份茶树资源[22]。Jou Ann Lai等(2001)应用RAPD及ISSI技术分析台湾地区引进的品种和台湾野生茶树共37个样本,结果表明RAPD不能区分所有样本,而ISSR可以区分所有样本[25]。姚明哲等(2005)对ISSR在茶树品种分子鉴定的适用性进行分析,利用特殊ISSR标记的存在或缺失以及不同的标记组合可以鉴定不同品种[26]。Hu,C.Y (2005)应用ISSR技术对台湾茶树种质资源进行了分析。研究表明ISSR能有效用于茶树种质资源鉴定,茶树ISSR反应具有较高的稳定性[27]。陈勋等(2009)采用ISSR分子标记法对湖北省12份茶树品种进行了分子鉴定,通过构建指纹图谱、品种间的遗传关系树状图和相似系数、特殊标记的存在或缺失和标记组合来可将它们区别开[35]。

4 遗传图谱构建

利用DNA分子标记构建分子遗传图谱,对提高茶树育种效率,缩短育种周期加速育种进程具有重要价值。茶树是多年生作物,不可能利用近交系或高世代群体来构建遗传图谱,但茶树的多年生特性允许在较长的一段时间内对同一材料进行作图研究,可陆续把更多新增标记定位在连锁图上,不断增加连锁图谱密度。目前包括茶树、林木、果树在内的多数木本植物大都采用“双假测交”法构建遗传图谱[31,32,33]。Hackett等(2000)利用RAPD或AFLP标记构建包括126个标记、15个连锁群的遗传图谱,该图谱覆盖了基因组全长1349.7cM,平均图距为11.7cM。黄建安等(2005)利用AFLP标记构建了茶树AFLP分子连锁图谱,母本图谱长度2457.7cM,208个标记,包括17个连锁群,平均图距为11.9cM,父本图谱长度2545.3cM,200个标记覆盖了16个连锁群,平均图距为12.8cM[21]。谭和平(2006)采用100个ISSR引物对32个茶树资源的DNA进行PCR扩增反应,初步建立32个茶树资源的ISSR分子指纹图谱[28]。黄福平等(2006)以62个标记(含43个RAPD标记和19个ISSR标记)构建了长度为1180.9cM的分子连锁图谱,位点间的平均遗传距离为20.1cM。由于受作图群体、标记种类和数目的影响,目前茶树连锁图的标记密度还比较低,难以对其重要性状的基因进行定位[30]。刘本英等[22][11](2009)(2011)利用ISSR分子标记技术对134份云南茶树资源构建了可以相互区别的DNA指纹图谱。并以20个云南无性系茶树良种为材料,ISSR引物对茶树良种进行分析。使用品种的国家地区代码、育种单位英文缩写、核心引物名称和分子数据组成云南无性系茶树良种的DNA指纹图谱,不仅包含了品种的重要信息,而且其中的分子数据可用作茶树品种的真伪鉴定和遗传关系分析,为茶树品种的知识产权保护提供有效的科学依据。陈勋等(2009)采用ISSR分子标记法对湖北省12份茶树品种构建了指纹图谱[34]。

5 辅助茶树育种

分子标记选择作为一种辅助育种手段加以利用,需与外部形态、解剖结构、内部生化成分等其他遗传标记相结合,才能达到准确、高效、缩短育种过程的目的。建立包含形态标记、生化标记、细胞标记、分子标记的综合遗传标记辅助选择体系是今后茶树早期鉴定的研究方向。黄建安(2004)通过PCR-RFLP分析检测得出:PPO基因中的Hpa酶切位点与品种适制性有明显关联,适制红茶的,该位点可被Hpa内切酶完全酶切;适制绿茶与乌龙茶的,不能被酶切或不能完全酶切。可作为茶树品种适制性的早期鉴定标记。利用分子标记跟踪基因的转移情况,使之与要选择的基因紧密连锁,可在早期筛选分离群体中含有目的基因的植株[21]。张俊等(2004)用RAPD技术分析了云南大叶茶和福鼎白毛茶及其F1代的42品系的茶氨酸含量,挑选出茶氨酸含量高的5个材料与茶氨酸含量低的5个材料,筛选出OPB07、OPB20等引物与高茶氨酸呈正相关的多态性,OPB03、OPB04、OPB05、OPB08、OPB10等引物表现出与高茶氨酸呈负相关的多态性,说明与茶氨酸相关的基因为数量性状[36]。王会等(2008)对12份来源不同和咖啡碱含量不同的茶树种质资源进行RAPD分析,筛选出品种(株系)唯一扩增的RAPD位点16个,并对其中的S43-04序列进行测序,该序列为752bp的核苷酸序列,具有编码40个氨基酸的开放阅读框,其相同氨基酸残基与β-半乳糖苷酶的同源性为72%[37]。

6 问题与展望

大豆抗胞囊线虫的分子标记研究 篇7

1 材料与方法

1.1 材料

以对大豆胞囊线虫3号生理小种表现为抗性和感性的大豆品种, 即抗线4号 (高抗) 、哈98-4598 (抗病品系) 、合丰25 (高感) 以及3个亲本的杂交后代为供试材料 (见表1) 。于田间采集供试材料的新鲜叶片, 放在冰壶内保存。

利用已经报道的与SCN有关的SSR引物:Satt301、Satt130、Satt309和Satt082作为引物对供试材料进行扩增 (见表2) 。

1.2 方法

试验于2013年在黑龙江省农业科学院大豆研究所进行。

1.2.1 基因组DNA的提取

利用改良的SDS法提取供试材料的基因组DNA, PCR扩增用Taq DNA聚合酶、10×PCR buffer、MgCl2、dNTP, 这些试剂均购自上海生工生物工程有限公司。SSR引物由北京奥科生物技术有限公司合成。SSR扩增反应体系为20μL (见表3) 。PCR反应在PCR扩增仪PTC-225 (Peltier Thermal Cycles) 上进行。

1.2.2 数据统计

SSR扩增结果按0/1系统, 即有带记为1, 无带记为0, 进行统计。利用NT-sys聚类软件计算遗传距离, 以非加权类平均法 (UPGMA) 进行聚类分析, 建立树状聚类图。遗传相似性系数 (Similarity) 的计算公式为Sxy=2Nx y/ (Nx+Ny) , Nx代表在材料x中某一引物扩增的条带数, Ny代表在材料y中同一引物扩增出的条带数, Nxy代表在x和y中扩增出片段长度相同的条带数。遗传距离GD (genetic distance) :遗传距离=1-Sxy。当D=0, Sxy=1时, 物种x和物种y的扩增片段完全相同, 二者有高度同一的DNA序列;当D=1, Sxy=0时, 二者扩增片段完全不同, 具有高度相异的遗传性Sxy和GD可定量地反映各种群的遗传分化程度。

2 结果与分析

2.1 利用与大豆胞囊线虫有关的SSR引物对供试材料进行抗病性验证

SSR引物对供试材料的扩增结果表明, Satt130无扩增结果, Satt301没有多态性, Satt309和Satt082表现出多态性 (见图1、图2) 。其中Satt082存在3个等位变异, 供试材料2、3、5、7、8、10在第一个等位变异上有扩增条带, 4、5、6、9、11、12在第二个等位变异上有扩增条带, 1、3、12在第三个等位变异上有扩增条带。在两个等位变异上均有扩增条带的供试材料有3、5、12。其中3号等位变异全部为感病材料, 推测该等位变异与感病基因相关, 3、5、12为杂合基因型, 后代抗病性会产生分离, 2号等位变异纯合基因型的4份材料全部为抗病表型, 推测该等位变异与抗病基因相关。

Satt309有两个等位变异, 1、3、5、9、10、11和12在第一个等位变异上有扩增条带, 2、3、4、7、8、11在第二个等位变异上有扩增条带, 3和11号材料在两个等位变异上均有扩增条带。6号材料未出现扩增条带。其中1号等位变异纯合基因型除9号材料外全部为感病材料, 推测该等位变异与感病基因相关, 2号等位变异纯合基因型全部为抗病材料, 推测该等位变异与抗病基因相关。

2.2 聚类分析

利用NTsys对供试材料进行聚类分析, 结果见图3。

从聚类图可以看出, 所有供试材料被分成3大类, 其中抗病亲本抗线4号与材料7和材料8被聚为一类, 并且7、8号材料田间鉴定表现均为抗病。感病亲本合丰25与感病材料3被聚为一类, 抗病品系哈98-4598与其余的抗感杂交后代材料6、11、9、12、5、10被聚为一类。

3 结论与讨论

以揭示DNA等位区域遗传多态性为基础的分子标记技术已逐渐成为作物遗传育种中对目的基因进行早期辅助选择的重要技术手段, 它对提高育种选择效率具有重要的作用。SSR分子标记技术为大豆胞囊线虫抗病育种提供了有利条件。寻找与抗SCN基因紧密连锁的分子标记, 是进行分子标记辅助选择的基础。该研究利用已报道的与SCN相关的SSR引物Satt301、Satt130、Satt309和Satt082对不同大豆材料进行验证, 其中在合丰25×抗线4号正反交组合中, 抗病亲本抗线4号与 (抗线4号×合丰25) F2、 (合丰25×抗线4号) F3抗病后代抗-221、抗-131聚为一类, 存在相似的变异位点。感病亲本合丰25与感病材料3被聚为一类, 在这个区域将感病材料分开。而其它后代材料则聚为一类, 并没有将抗感材料区分开, 分析原因可能由于该研究采用的引物较少, 未能充分揭示供试材料间的遗传变异, 也有可能是这些杂交后代仍存在对大豆胞囊线虫3号生理小种的抗性分离, 导致后代个体有来自亲本抗感基因的混杂。还有待于在今后的工作中加大引物数量, 进行验证, 用以寻找与抗性紧密连锁的遗传标记, 进而利用标记进行育种辅助选择以及控制抗性基因的定位和分离。

随着一些具有更高信息量的分子标记技术的发展和应用, 大豆基因组内缺乏大量遗传多态性的限制将被克服, 分子标记技术在大豆种质遗传多样性、系统发育、品种鉴别、遗传图谱构建及目的基因定位等方面研究将发挥越来越重要的作用, 从而为拓宽今后育成品种的遗传基础, 进一步为加速大豆的遗传改良打下更坚实的基础。

摘要：为了在分子水平验证大豆材料的抗病性, 以对大豆胞囊线虫3号生理小种表现为抗性和感性的大豆为试材, 利用已经报道的与SCN抗病基因连锁的SSR标记引物, 对供试的大豆材料进行指纹图谱鉴定。结果表明:引物Satt130无扩增结果, Satt301没有多态性, Satt309和Satt082表现出多态性。聚类分析结果表明, 所有供试材料被分成3大类, 其中在合丰25×抗线4号正反交组合中, 抗病亲本抗线4号与 (抗线4号×合丰25) F2、 (合丰25×抗线4号) F3抗病后代抗-221、抗-131聚为一类;感病亲本合丰25与感病材料 (合丰25×抗线4号) F2感-121被聚为一类, 在这个区域将感病材料分开。而其它后代材料则聚为一类, 并没有将抗感材料区分开。

关键词：大豆,大豆胞囊线虫,分子标记

参考文献

[1]Matson A L, Willams L F.Evidence of genes for resistance to the soybean cyst nematode[J].Crop Sci., 1965, 22:581-590.

植物分子标记研究 篇8

1 分子标记分类

分子标记发展至今已有几十种, 主要有以分子杂交为主的分子标记, 如限制性片段长度多态性 (RFLP) 、可变数目串联重复 (VNTR) 、原位杂交等。以PCR技术为基础的分子标记, 如随机扩增多态性 (RAPD) 、酶切扩增多态性序列 (CAPS) 、扩增片段长度多态性 (AFLP) 、DNA扩增指纹分析 (DAF) 选择性扩增DNA片段 (SADF) 、特定序列扩增区段 (SCAR) 等。以重复序列为基础的分子标记, 如简单序列重复 (SSR) 、简单序列重复区间 (ISSR) 等。此外还出现了许多基于高通量检测技术的分子标记技术, 如表达序列标签 (EST) 、单核苷酸序列多态性 (SNP) 、多样性芯片技术 (DArT) 、限制性内切酶位点标签 (RAD) 等[1]。在家蚕研究中应用较多的分子标记技术主要有RAPD、RFLP、AFLP、SSR等, 已广泛应用于遗传图谱构建、种质资源鉴定、基因定位及连锁分析、遗传多样性和亲缘关系分析、生物进化和系统发育等方面。

2 家蚕遗传育种研究中分子标记技术的应用

2.1 家蚕的分类、进化及遗传多样性分析

家蚕在长期驯养过程中, 由于地理隔离产生了不同的地理系统, 而地理系统内的品种又各具经济和生态特征。研究家蚕不同地理品种分类、进化、遗传变异和亲缘关系是种质资源鉴定、评价、保存和利用的依据, 也是育种中亲本选择和杂种优势预测的重要基础。分子标记反映DNA水平上的差异, 这些差异相比表型差异更为丰富, 而且基于此的家蚕分类、进化和遗传多样性分析不受环境因素影响, 结合传统分析结果更为准确可靠。

夏庆友等[2]利用RAPD标记对不同系统、化性和眠性共6类59个家蚕品种及野蚕之间的遗传差异进行研究, 结果表明中国一化性四眠种最早从野蚕中分化出来, 中国一化性三眠种和中国一化性四眠种进化上有显著差异。鲁成等[3]以AFLP分子标记技术对33个代表性的不同地理家蚕品种及来自不同地区的10个野桑蚕和5个柞蚕品种进行了DNA多态性分析和分子系统学研究。结果从分子水平上证明家蚕起源于野桑蚕, 中国家蚕二化种在进化上介于一化种和热带多化种之间。李竞等[4]以家蚕C108和C100为材料, 用25个SSR标记对中国5个地区的野桑蚕和2个家蚕品种进行多态性分析, 共产生58个等位基因, 平均每个位点多于2个等位基因。Li等[5]用19个ISSR引物对42个品种的家蚕进行扩增, 其中的12条引物能扩增出清晰条带, 重复性较好, 共扩增出108条带, 其中85个有多态性, 聚类分析将这些品种分为7个亚群结果表明IS-SR标记能够很好用于家蚕遗传多样性分析。

2.2 遗传图谱构建和基因定位

2.2.1 遗传连锁图构建

分子遗传图借助分子标记技术研究家蚕分子水平的遗传规律, 确定标记及基因在连锁群上的线性关系。家蚕高密度遗传图谱是重要功能基因克隆和经济性状定位及家蚕育种研究应用的理论依据和基础。

Goldsmith等[6]利用两个家蚕近交系P50和C108原种、F1、BC1或F2群体绘制了家蚕第一张分子连锁图, 筛选得到60个RFLP标记, 其中13个是分布在已知的10个基因座位上的标记, 还有9个是反转录转座子, 60个标记除8个无连锁外, 其余52个标记分布在16个连锁群上。Yasukochi[7]用RAPD构建了一张含1018个遗传标记的高密度家蚕连锁图, 覆盖了家蚕27条常染色体和Z染色体, 标示了8个已知基因和5个突变基因, 28个连锁群中的7个已与经典连锁图对应, 标记间平均图距为2cM。Miao等[8]以大造和C108的BC1M回交群体用518个SSR分子标记构建了一张家蚕的遗传连锁图, 该连锁图包含28个SSR连锁群, 利用可见标记和由以前的构图基因、cDNA序列和克隆RAPD得到的CAPS将连锁群进一步分配到了相应的28个染色体上。通过整合可见突变P和29个昆虫保守基因到这个连锁图上, 形成的连锁图每个连锁群有7-40个标记, 总图距达到3 431.9cM。谭远德等[9]以782和od100为亲本构建的47个后代个体构成的回交群体构建了家蚕的第一张AFLP遗传连锁图。该连锁图含356个标记, 分配在30个连锁群上, 每个连锁群的图距为37.4到691.0cM不等, 总图距为6 512cM。同一连锁群上临近的两个标记间平均距离为18.2cM。性连锁基因od定位在第3连锁群的P1T3B40和P3T3B27两个标记之间, 表明第三连锁群对应于Z染色体。张烈等[10]以C108和大造的回交一代用AFLP进行作图, 构建了含814个标记, 36个连锁群的连锁图谱。连锁图总长13005cM, 连锁群平均长度361.25cM, 标记间平均图距15.98cM, 有两个连锁群分别与经典图谱15连锁群和W染色体连锁群相对应。Zhan等[11]利用SSR标记整合以前的数据构建了两个新的连锁图, 新连锁图覆盖了27条染色体, 包含了692个唯一的SSR位点, 使以前的图谱的密度由平均6.3cM缩小到4.8cM;在相应的低多态性位点区域有497个标记, 其中244个有多态性。利用构建的新图谱, 定位了一些单基因、QTL位点和许多核糖体蛋白基因。Yamamoto等[12]以家蚕品种p50T和C108为材料构建了SNP连锁图, 覆盖了家蚕全部的28个连锁群, 总图距为1 035cM, 后又进一步将标记数增加到1 755个, 使其密度达到平均每0.81cM一个SNP位点;通过用不同的限制性内切酶消化3个BAC文库产生的指纹克隆构建了6 221个重叠群, BLAST搜索BAC末端序列和表达序列标签作为探针的高密度BAC滤膜杂交在这些重叠群上找到724个单拷贝基因, 经RFLP分析非重组的雌性回交群体在连锁群上标示了另外964个表达序列标签。

2.2.2 基因定位

基因定位是借助紧密连锁的分子标记确定目标基因在染色体上的位置, 高密度的遗传连锁图使得基因定位更加方便。分子标记相比传统遗传标记在家蚕重要突变性状及经济性状基因定位研究中更为高效, 定位精度更高。随着分子标记技术及分析方法的日益成熟和完善, 今后在家蚕基因定位特别是QTLs定位分析中将得到更大的发展。

Dai等[13]通过SSR连锁定位结合候选基因筛查, 证实家蚕暗化型 (mln) 为乙酰转移酶基因Bm-iAANAT突变所致。Wei等[14]以家蚕正常斑纹品种P50和限性斑纹品种H9为材料, 利用SSR标记将控制家蚕斑纹的+P基因定位在离标记S0206 3.0cM处, 结合家蚕基因组精细图分析认为包括+P基因的最近的两个标记之间的物理距离为995kb, 有三个候选基因靠近+P基因, 其中最近的一个距离仅19.1kb。王修业等[15]利用BC1M群体构建了关于无鳞毛翅nlw基因的遗传连锁图, 连锁图的遗传距离为125.7cM, 与nlw基因最近的引物为STS标记cash2p, 图距为11.4cM。Ogoyi DO等[16]以易感品种C124和耐受品种902为亲本构建BF1群体用于对浓核病抗性基因nsd-2连锁分析。结果表明该基因与第17连锁群上的基因连锁, 构建的17连锁群连锁图图距为30.6cM, nsd-2被定为在24.5cM处, 鉴定了临近的3个连锁cDNA标记。谭远德等[17]将茧长和茧层量的主基因Q (1) -q (1) 及Q (w) -q (w) 分别定为在Z染色体的两个形态标记基因sch和od两侧, 其中Q (1) -q (1) 距sch74.25cM, Q (w) -q (w) 距od 54.78cM, 另外控制全茧量的1个主基因Q (wc) -q (wc) 与sch未发生交换, 故与sch有同一位点。Mase K等[18]以C108和Sawa-J构建BC1群体利用rflp对Sawa-J品种中的偏食基因进行了鉴定连锁分析和定位结果证明摄食行为主要受一个定位在RFLP连锁图的9连锁群20.2cM处的一个隐性基因控制, 发现了距离4.2cM处的一个新的分子链锁标记e73。

2.3 家蚕DNA指纹分析和品种鉴别

蚕业生产中常需要对家蚕品种真伪及纯度进行鉴别, 传统方法依据形态特征或经济性状, 但形态特征区分度不高, 经济性状大多是数量性状, 受环境影响较大, 鉴别准确性差, 效率低下。分子标记技术多态性丰富, 重复性高, 准确可靠, 通过建立典型品种的指纹图谱, 适于对品种快速有效的鉴别。

钟伯雄等[19]对6个家蚕品种秋丰×白玉、丰一×54A、菁松×皓月、春蕾×镇珠、薪杭×白云、夏7×夏6 (正反交) 用AFLP分子标记技术进行分析, 筛选到5对引物, 在6个品种中扩增得到157条带, 其中54条具有多态性, 据一些特异性的条带能够准确地将6个家蚕品种区别开来。程道军等[20]利用RFLP标记技术构建了家蚕9个现行品种的标准DNA指纹图谱, 可以可靠区分鉴定不同的家蚕品种。廖富蘋等[21]以RAPD技术对家蚕“932”×芙蓉、“7532”×湘辉杂交原种和四元杂交种 (“932”×芙蓉) × (“7532”×湘辉) 的纯度进行检测, 得到可做鉴别的分子标记, 结果表明应用RAPD技术进行检测家蚕多元杂种的纯度是可行的。

2.4 分子标记辅助选择

家蚕的经济性状大多为数量性状, 易受环境影响, 常规方法难以获得较好的选择效果。1991年Goldsmith提出“国际蚕分子育种计划”, 将分子标记技术引入到家蚕育种工作中来。该计划分两步, 第一步是绘制家蚕的分子基因图, 第二步是数量性状定位分析。最后利用分子标记在DNA水平上进行重要经济性状的选择、固定, 短时间内育成高抗、强健、丝质优、易扩繁等特性的新品种。分子标记辅助选择 (Molecular marker-assisted selection, MAS) 是借助与目标性状或基因紧密连锁的分子标记在育种过程中对育种材料进行淘汰、选择, 与传统育种相比, 分子标记辅助选择不受时间限制, 可以进行早期选择, 提高选择强度并缩短年限, 使育种效率得到极大提高。

赵巧玲等[22]发现RAPD标记S-24724与粗纤度茧丝基因连锁, 汪琳等[23]筛选到一个与家蚕龙角基因K连锁的RAPD标记OPV-10700。姚勤等[24]以高抗NPV材料NB和敏感材料306组配近等基因系, 以RAPD技术获得标记再转换成SCAR标记进行辅助选择, 以平均死亡率作为抗性评判标准, 通过比较常规添毒选择和SCAR分子标记辅助选择选育抗NPV品种效果发现, 分子标记选择的效果相当, 甚至优于常规育种。陈克平等[25]以含有耐氟主效基因的家蚕品种T6和敏感品种733新及其近等基因系NF733新为材料, 用200个RAPD引物扩增得到与耐氟性有关的标记OPB-10900, 在各回交世代的耐氟个体中都能检测到特异片段, 证实了分子标记的可靠性。Ashwath SK等[26]为改良日系品种的消化能力和生命力, 由供体亲本将淀粉酶Amy d (iv) 和d (v) 等位基因导入到轮回亲本建立近等基因系, 在包括供体亲本、轮回亲本和近等基因系的6个家蚕品种以27个RAPD引物进行分析, 结果在这些引物中6个引物的扩增产物与近等基因系中供体亲本的淀粉酶基因连锁, 而在各自的轮回亲本中不存在, 3个扩增片段, 分别为1584bp、1904bp和1232bp, 在淀粉酶等位位点Amy d (iv) 特异扩增, 1个1776bp片段与Amy d (v) 连锁, 两个PCR产物 (2628bp和1375bp) 与d (iv) 和d (v) 都相关。Srivastava PP等[27]为了鉴定家蚕的热耐受性, 选择了15个多化性品种, 以15条引物对其基因组进行ISSR-PCR分析, 聚类结果形成5个类群和1个隔离群;通过逐步多重回归分析鉴定的5个条带经T检验和显著性分析表明和热处理后的化蛹率相关, 其中标记8083000在家蚕品种中与化蛹率相关性最高, 经鉴定的标记被用来发展用于以分子标记辅助选择热耐受性家蚕品种的DNA标记。

3 家蚕遗传育种研究中分子标记技术应用展望

分子标记技术作为一种强有力的技术手段, 已全面渗入到家蚕遗传育种研究领域的各个方面, 主要有高密度遗传连锁图谱的获得和重要质量性状及数量性状QTLs的精细定位;不同家蚕品种的鉴定和亲缘关系分析;家蚕种质资源评价和分子标记辅助选择育种。分子标记育种是将现代分子生物学技术和传统遗传育种结合起来的新的育种手段, 在其它动植物育种中已得到许多成功应用, 由于家蚕的许多生态性状和经济性状大多为数量性状, 在家蚕中还处于探索阶段。今后需要解决的问题主要是发展分子标记的技术手段和分析方法, 增加遗传连锁图谱的标记密度, 整合分子遗传图、形态标记连锁图和基因组精细图, 提高分子标记与质量性状和QTLs的关联度以及定位和效率估算的精度, 提高多位点、高通量检测技术的准确性和可靠性, 降低育种技术成本。虽然目前取得的成果还不多, 还存在着许多问题, 我们仍相信分子标记技术随着技术手段和分析方法的的日益成熟, 在家蚕遗传育种研究中将有极大的应用前景。

摘要：介绍了分子标记的类型, 简述了分子标记技术在家蚕的分类、进化及遗传多样性分析、遗传图谱构建及基因定位、品种鉴别和分子标记辅助选择方面的应用进展, 并对分子标记技术在家蚕遗传育种研究领域的应用前景进行了展望。