转基因植物疫苗研究

转基因植物疫苗研究（共6篇）

转基因植物疫苗研究 篇1

1 转基因植物疫苗的作用机理

转基因植物疫苗是指把植物基因工程技术与机体免疫机理相结合,生产出的能使机体获得特异抗病能力的疫苗。由于口服疫苗到肠内黏膜诱导部位之前要经过胃内的不利环境,因此有效的口服疫苗经过这些不利环境时必须要受到保护,否则会失去免疫性。而植物细胞壁作为天然的生物胶囊,可使细胞内的疫苗抵抗消化道的酸性环境和各种酶类降解,使表达的疫苗在小肠内释放,引起消化道的黏膜免疫反应,刺激黏膜下B、T淋巴细胞产生的抗菌素到消化道、血液、呼吸道中,发挥对机体的全面保护作用,疫苗通过胃进入与淋巴组织相关连的肠道,从而刺激免疫球蛋白A1的产生,以达到防治疾病的目的。动物实验已经证实,转基因植物表达的抗原蛋白经纯化后仍保留了免疫学活性,注入动物体后能产生特异性抗体;用转基因植物组织饲喂动物,转基因植物表达的抗原呈递到动物的肠道淋巴相关组织(GALT),被其表面特异受体特别是M细胞所识别,产生黏膜和体液免疫反应。

2 转基因植物疫苗的生产方法

在目前的转基因植物疫苗生产领域里,存在着两种不同的疫苗表达系统。

2.1 稳定整合的表达系统

这一方法是将抗原基因构建在植物表达载体上,利用脓杆菌或基因枪介导的方法,将抗原基因转化到植物细胞中并与植物基因组整合,获得稳定表达的转基因植株。本方法具有以下优点:一是通过有性或无性繁殖的方法,可以很容易地获得大量的转基因植株;二是通过有性杂交的方法,可以获得生产多价复合疫苗的转基因植物;三是通过特异性表达启动子使抗原基因在器官或组织中特异性表达。

2.2 瞬时表达系统

本方法是应用植物病毒作为载体,将目的基因插入病毒基因组中,然后将重组病毒接种到植物叶片上,任其蔓延,外源基因随病毒的复制而高效表达。这一方法又分为两种方式:一种是将抗原基因置于病毒基因组启动子控制之下,另一种是将抗原基因与病毒外壳蛋白基因融合在一起。值得指出的是,抗原基因融合于病毒外壳蛋白的表达方式更具有免疫原性。目前用作载体的植物病毒主要是烟草花叶病毒(TMV)和豇豆花叶病毒(CMPV)。

本方法表达量高,而且一般认为植物病毒不会传染动物,无交叉感染,但缺点是不能稳定遗传。此外,尚有几个问题需要解决:一是抗原的纯化;二是弱毒株系的选择,即病毒对植物的浸染不会使植物生长异常,还要保证抗原基因的整合不会使病毒失去浸染和复制的能力;三是现有植物病毒载体浸染的植物宿主范围有限。

2.3 生产转基因植物疫苗的一般程序

(1)克隆特异中和抗原的编码基因;(2)构建植物表达载体,把基因整合到植物表达载体上,或利用重组病毒作为载体;(3)利用各种转基因方法将抗原基因转入植物体,使植物带有编码抗原的基因;(4)进行愈伤组织的诱导和分化及转基因植物的再生,使抗原蛋白基因在植物中表达;(5)进行表达水平的检测和免疫原性的测定;(6)进行安全性评价、检测。

3 转基因植物疫苗的发展历程

近年来的研究集中在转基因植物疫苗在人类及动物中的应用。到目前为止,已报道的转基因植物疫苗大致可分为4类:即细菌疫苗、病毒疫苗、寄生虫疫苗及避孕疫苗。

3.1 细菌疫苗

用转基因植物生产的细菌疫苗主要有大肠杆菌不耐热毒素B亚单位疫苗(LT-B)和霍乱肠毒素B亚单位疫苗(CT-B)。

3.1.1 LT-B疫苗

Mason等把编码LT-B的基因转化到马铃薯中,使得LT-B在马铃薯的叶片和块茎中得到表达。经分析表明,马铃薯来源的重组LT-B具有五聚体结构,能结合神经节苷脂。

动物实验表明,转基因马铃薯产生的LT-B能刺激小鼠产生体液和黏膜免疫反应,它诱导产生的抗体能中和LT的活性。之后,他们对此进行了深入研究,结果表明LT-B主要积累在叶片和块茎中。用含有重组LT-B的马铃薯块茎直接饲喂小鼠,每周1次,每次5 g(约含LT-B 20μg),共免疫3次,免疫后的小鼠产生了黏膜和血清抗体;同时,用5μg细菌来源的重组LT-B来免疫小鼠(采用管饲法),在第3次免疫结束后隔一周采血检测抗体水平,结果显示用马铃薯来源的重组LT-B免疫小鼠所产生的抗LT-B血清抗体和黏膜抗体水平比用细菌来源的重组LT-B免疫小鼠所产生的抗体水平高;然后用25μg的LT喂小鼠进行攻击感染,结果显示用高剂量转基因马铃薯LT-B疫苗比用源于细菌的重组LT-B疫苗更具保护作用。

3.1.2 CT-B疫苗

霍乱毒素B亚单位(CT-B)与肠道黏膜细胞表面的特异性神经节苷脂结合会引起腹泻。Arakawa等将该基因导入马铃薯中,用其块茎直接饲喂小鼠,而后在其血清和肠道内检测到了特异性抗体,当黏膜抗体水平下降后,用其块茎强化免疫,抗体水平又迅速提高。毒性中和实验表明,马铃薯口服疫苗诱导小鼠产生的特异性抗体可以中和CT的毒性。用CT接种经转基因马铃薯口服免疫后的小鼠,其肠道腹泻分泌液量与对照组小鼠相比减少了60%。以上结果说明,口服转基因植物疫苗有可能成为一种预防细菌内毒素疾病的有效手段。

3.2 病毒疫苗

3.2.1 乙型肝炎(HB)疫苗

Mason等首次报道了转基因植物HB疫苗的研究结果。乙型肝炎表面抗原(HBs Ag)可刺激机体产生针对HBV的保护性抗体,此抗体是现有商业疫苗的主要成分。他们将编码HBs Ag的结构基因导入烟草并获得了表达,在叶片提取液中检测到了HBs Ag及其特异性m RNA,并在电镜下观察到重组HBs Ag形成了直径为22 nm的球形颗粒,与其天然状态相似。用相当于商用疫苗3%有效剂量的转基因植物蛋白粗提液肌肉注射小鼠,发现能诱导较强抗体。来源于经植物疫苗免疫过的小鼠T细胞,在体外能被植物来源的重组HBs Ag、酵母来源的HBs Ag及合成的多肽激活,表明植物疫苗免疫的小鼠产生了T细胞免疫。这些结果说明,转基因植物中表达的HBs Ag具有正确的B细胞及T细胞识别表位。

刘玉乐等将人乙型肝炎病毒(adw亚型)表面抗原(HBs Ag)基因插入植物双元载体p ROKⅡ-HBs Ag的Ca MV35S启动子下游,构建重组质粒p ROKⅡ-HBs Ag,将此质粒导入脓杆菌LBA4404中,利用脓杆菌感染叶盘的方法转化烟草,经酶联免疫分析,发现转化植株及其后代均能产生具有免疫活性的HBs Ag;免疫吸附电镜观察表明,转化植株产生的HBs Ag呈典型的直径为22 nm的颗粒,显示了用植物生产HBs Ag的可行性。刘德虎等人利用所获得的转基因马铃薯饲喂小鼠后,在小鼠血液中检测到了乙肝病毒保护性抗体,其抗体滴度足以对人产生保护力。

3.2.2 兔出血症病毒(RHDV)疫苗

Vp60是RHDV的主要结构蛋白。Castanon等用编码RHDV Vp60蛋白的基因转化马铃薯,该转基因马铃薯植株产生了特异的m RNA和正确的Vp60蛋白,用此植株的叶片提取物免疫兔子,在兔子体内产生了高滴度的抗Vp60特异性抗体。攻毒试验表明,所免疫兔子完全避免了兔出血症的发生。

3.2.3 口蹄疫病毒(FMDV)疫苗

Wigdorovitz等用转基因苜蓿表达了FMDV结构蛋白vp1,用此转基因苜蓿的新鲜叶片饲喂小鼠后,小鼠体内产生了特异性抗体。攻毒试验表明,经免疫的小鼠能抵抗毒性FMDV的感染。

3.3 寄生虫疫苗

疟疾是世界性的严重寄生虫病。Turpen等将编码疟原虫抗原决定簇的基因片段插入到烟草花叶病毒(TMV)外壳蛋白的编码区中,构建了植物病毒载体,然后用它感染烟草,所产生的高水平重组融合蛋白经试验证明具有抗原活性。

3.4 避孕疫苗

哺乳动物受精过程中精卵细胞的结合具有种属特异性,这种特异性的结合是由精子表面的特异性蛋白与卵细胞透明带糖蛋白通过受体配体模式进行的,透明带是卵细胞膜外的一层非细胞结构,是精子与卵细胞识别和结合的部位,透明带具有多种糖蛋白,其中ZP3充当精子受体在受精过程中起着重要作用,而从避孕的角度来说它是免疫避孕的一个靶位。Fitchen等将小鼠ZP3蛋白的一个含有13个氨基酸残基的抗原决定簇转化到烟草花叶病毒的衣壳蛋白中,利用其作载体感染植物获得了转基因植物,用此转基因植物免疫小鼠,其体内产生了抗ZP3的特异性血清,还发现透明带聚集了抗ZP3抗体,证明利用转基因植物生产避孕疫苗具有可行性。

4 转基因植物疫苗的优点

4.1 利于大规模工业化生产

利用哺乳动物细胞表达系统的优点是可与人的内环境进行相似的复制、翻译、表达,但是哺乳动物细胞培养需要牛血清,成本花费大,而植物是能够大规模也是最经济的生产蛋白质的生产系统。在转基因植物中,只要将外源基因成功转入一个植株中,就可以通过种子遗传给下一代,从而大面积种植,成本很低。其次,动物细胞培养不利于大型工业化生产,它受很多因素制约,如温度、p H值、溶解氧浓度等,这些因素会影响细胞产出蛋白的量。当然,植物中蛋白质的密码子和哺乳动物的仍有差别,但是和微生物相比,这种差异较小。

4.2 使用安全

对免疫接种动物来说,表达系统中的非目的成分对动物无害,不存在其他动物病原体污染的可能;免疫接种时,不需要注射器和针头之类的设备,不存在通过注射接种而使动物感染病原微生物的可能,同时大大减少了免疫接种时动物的应激反应。关于转基因食品安全性的争论,美国食物安全和应用营养中心已经证明了卡那霉素抗性基因植物作为食物添加剂的安全性。对环境来说,转基因植物疫苗也是绿色环保产品,无论其生产过程还是生产成品都不存在污染环境的问题。转基因植物只表达亚单位疫苗,不含致病微生物或潜在的致病微生物,对人畜安全。

4.3 免疫效果好

植物细胞中的疫苗抗原通过胃内的酸性环境时可受到细胞壁的保护,直接到达肠内黏膜诱导部位,刺激黏膜和全身免疫反应。不仅如此,转基因植物口服疫苗还可诱导消化道相关淋巴样组织(GAL T)产生分泌性Ig A(s Ig A),并在病原体和宿主之间相互作用的起始部位直接诱发免疫反应,从而大大提高其免疫有效性。

4.4 植物细胞具有全能性

能够再生植株且易于成活,生长周期短,易于快速筛选出转基因阳性植株。不仅比构建动物生物反应器节省时间,而且构建植物生物反应器的技术更成熟,成功率更高。

4.5 能进行有效的翻译后加工

植物与动物一样,属真核生物,具有与之相似的翻译后加工过程,适合于动物病毒抗原的表达,病毒产物具有与之相似的免疫原性。

5 展望

转基因植物作为生物反应器生产转基因植物疫苗或其他转基因产品,为人和动物提供了一个最经济有效的生产系统,具有许多潜在优势,但这只能算是起步阶段,离实际应用还有很大一段距离,还面临着许多未知的和有待解决的难题,仍需做进一步的效力试验、稳定性试验以及免疫途径、免疫剂量等多方面的研究,关键问题是提高抗原表达水平。随着转基因技术和相应检测手段的逐步建立和优化,转基因植物疫苗在产业化生产中必将具有广阔的应用前景。

参考文献

[1]Stephen J,Streatfield,John A,et al.Plant-based vaccines[J].International Journal for Parasitology,2003,33:479-493.

[2]王景会.可食用植物疫苗的探讨[J].农产品加工,2005,(11):26-36.

[3]王宝琴,张永光,王小龙.转基因植物疫苗与转基因植物抗体的研究进展[J].中国兽医科技,2003,33(9):29-33.

[4]陈书明.转基因植物在免疫学研究中的应用进展[J].国外医学免疫学分册,1996,(5):269-271.

[5]Curtiss R,Cardineau G.Oral immunization by transgenic plants[P].W ashingtonUniversity,St,Louis,USA:Patent Cooperation Treaty,1989.

[6]Tacket C O,Mason H S,Losonsky G,et al.Immunogenieity in humans of a recombinant bac-terial antigen delivered in a transgenic potato[J].Nat.Med.,1998,4:607-609.

[7]Mason H S,Lan D M,Amtzen C J,et al.Exprsesion of hepatitis surface antigen in transgenic plant[J].Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1992,89:11745-11749.

[8]Glynis Giddings.Transgenic plants as protein factories[J].Current Opinion in Biotechnology,2001,12:450-454.

[9]陈章权.转基因疫苗的研究进展[J].国外医学免疫学分册,2002,(1):9-13.

[10]刘思言,江源王,王丕武.转基因植物疫苗的研究进展[J].生物技术通报,2006,(5):19-21.

转基因植物疫苗研究 篇2

近年来,随着生物技术和基因组学的`迅猛发展,对鸡马立克氏病病毒(MDV)的致病、致肿瘤基因和主要抗原基因的结构及功能有了更加深入的了解,特别是MDV感染性克隆的成功构建,为开发新一代MDV疫苗奠定了基础.本文对MDV基因工程疫苗的研究进展作简要综述.

作 者：李延鹏 丁家波 候绍华 崔治中 朱鸿飞  作者单位：李延鹏,候绍华,朱鸿飞(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,100081)

丁家波(中国兽医药品监察所,100081)

转基因植物口服疫苗的前景分析 篇3

一、转基因植物口服疫苗的获取

(一) 目标抗原的选择

要想生产转基因口服疫苗, 首先要选择合适的植物目标抗原, 当一些植物疫苗的结构比较清晰时, 可以直接运用这些植物来提取疫苗, 当植物的疫苗结构不是很清晰的时候, 就要通过微生物进行筛选, 选出适合的目标抗原。

(二) 受体植物的选择

受体植物是生产转基因口服疫苗的关键, 因此选择合适的受体植物是很有必要的, 合适的受体植物可以提高转基因口服疫苗的质量和产量。植物的叶片、幼苗、谷物的种子等等都可以作为转基因口服疫苗的受体植物。但是在新鲜的叶子中产生的蛋白需要快速的提取出来, 因为会被新鲜组织很快的吸收降解, 而在干燥的谷物中的产生的蛋白质可以长时间的保存, 因此在实际的操作中更倾向于使用干燥的种子作为受体植物。

(三) 转基因植物材料的获取

目前获取转基因植物材料应用的技术主要有核转化技术、叶绿体转化技术和病毒侵染技术。其中核转化技术是最长使用的一种技术手段, 该项技术是将编码抗体的外源基因注入带植物中, 利用植物的繁殖将遗传基因传给下一代。叶绿体转化技术也是借助植物的遗传。病毒侵染技术使利用植物病毒作为载体, 在植物中形成抗体。这三种方式均取得较好的效果。

二、转基因植物疫苗的加工处理及接种免疫

植物疫苗的接种方式有三种, 一种经过纯化技术处理后注射获取或者是直接口服获取。二是将植物疫苗加工成可以直接食用的状态, 让接种者直接使用。三是将植物疫苗添加到食品中, 接种者可以通过使用其他的食物从而接种疫苗。这种方式一般应用于家禽类动物疫苗的处理。

经过纯化处理可以将植物疫苗很好的浓缩和提纯, 但是一些植物的结构总有大量的酚类物质, 造成蛋白质很难很完全提纯, 并且需要的成本也比较高, 因此该方式的不能得到很广泛的使用。将植物疫苗加工成可食用的状态是疫苗的接种便的简单, 经过加工处理的植物疫苗可以直接口服, 使用效果较好。用于家禽类动物接种的疫苗的加工处理过程比较简单, 只需要将含有疫苗的植物稍作处理就可以, 在选择植物载体时要选用便于储存的食物, 例如玉米、谷物等等, 这样可以方便动物食用。

三、植物疫苗的应用前景及存在的问题

近年来, 动物传染疾病频发, 比如禽流感、疯牛病, 这些都是没有及时的接种疫苗造成的, 这些传染性疾病给养殖业者带来巨大的经济损失, 因此及时的接种疫苗是很有必要的。对于动物来说, 口服的植物疫苗是最理想的选择, 可以在动物的饲料中加入含有疫苗的植物, 让动物很轻松的使用下去, 从而接种疫苗。

但是目前仍然有诸多的因素影响着植物疫苗的应用和发展, 首先, 植物受体的选择, 虽然许多的植物可以当成疫苗的受体, 但是大部分的植物不能表达植物口服疫苗, 有些谷类植物的转化率较低, 这样极大限制了植物疫苗的发展。其次, 因为植物疫苗的转化率较低, 这就无形中增加了疫苗的生产成本, 疫苗是面向大众的一种药品, 价格太昂贵肯定不会被认可和接受, 这也制约着植物疫苗的发展。再次, 转基因技术一直是被受争议的一项技术, 在很多的国家不太接受转基因技术, 尤其是欧洲一些国家, 对于转基因是抵触的, 这就给转基因植物疫苗的发展设置了很大的障碍。因此, 要想推进转基因植物疫苗的发展, 必须在技术方面进行创新, 加大转基因植物的开发研究, 也要注重全社会普及转基因植物的知识, 消除人们对于转基因植物的错误认识, 让转基因疫苗更好的为我们服务。

参考文献

[1]王军政, 彭爱红, 姚利晓, 范达, 陈善春.转基因植物疫苗的研究进展[J].湖北农业科学, 2011 (17) .

[2]曲静, 王丕武, 范玉广.植物生物反应器生产转基因植物可食疫苗的研究进展[J].中国生物制品学杂志, 2010 (01) .

[3]朱宏, 赵凯, 段可, 潘爱虎, 贾军伟, 孙建萍, 李鹏, 何婷, 唐雪明.转基因植物疫苗研究进展[J].上海农业学报, 2009 (01) .

转基因植物疫苗研究 篇4

根据基因工程疫苗研制的技术路线和疫苗组成的不同, 目前可分为如下几类:核酸疫苗、亚单位疫苗、活载体疫苗、基因缺失疫苗、合成肽疫苗和转基因植物可食疫苗。

1 目前已商品化的禽用基因工程疫苗

目前, 用于禽类的新型基因工程疫苗的研究进展很快, 有的已经投入使用。

1.1 H5禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗

H5禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗是我国哈尔滨兽医研究所的Qiao CL等将GS/GD/96的HA和NA基因重组到鸡痘病毒疫苗株的基因组中构建而成, 用此重组病毒免疫接种后, 能够对强毒攻击提供100%的保护力。该疫苗成本低, 免疫保护持续时间长, 有利于鉴别免疫和野毒感染, 不需添加佐剂, 但是重组鸡痘苗对家禽的实际免疫效果受母源抗体的影响较大, 免疫后抗体效价不高。离散度较大, 不利于临床应用时免疫效果的评价。

1.2 H5N1重组禽流感病毒灭活疫苗

H5N1重组禽流感病毒灭活疫苗是由我国国家禽流感参考实验室采用当前国际先进的流感病毒反向遗传基因操作技术研制出来的。与全病毒相比, 该疫苗病毒在鸡胚中的生长滴度高, 且对禽类和哺乳动物高度安全, 抗原针对性强, 使用方便。在实验室条件下该疫苗对鸡的有效免疫保护长达10个月以上。两次免疫后, 可诱导鸭产生长达10个月的有效免疫保护, 诱导鹅产生长达3个月以上的有效免疫保护。是我国目前禽流感防控的首选疫苗。

1.3 鸡传染性喉气管炎和鸡痘基因工程活载体疫苗

鸡传染性喉气管炎和鸡痘基因工程活载体疫苗是中国农科院哈尔滨兽医研究所研制的以鸡痘病毒为载体, 表达鸡传染性喉气管炎病毒g B的基因工程疫苗, 系用表达鸡传染性喉气管炎病毒g B重组鸡痘病毒的鸡胚成纤维细胞培养物, 经反复冻融后加冻干保护剂冷冻干燥制成。该苗具有使用方便、未见不良反应、紧急注射可以有效地控制病情等优点。

1.4 重组新城疫病毒活载体双价疫苗

重组新城疫病毒活载体双价疫苗是我国科研人员自行培育、免疫效果良好的以新城疫病毒弱毒为载体, 表达H5亚型高致病性禽流感病毒抗原基因的双价疫苗。它不但可以保护强毒的攻击, 而且还具有疫苗用量低、成本低、免疫保护持续时间长、不需添加佐剂、不影响禽流感病毒检测和流行病学调查等优点。但重组新城疫病毒活载体双价疫苗在实际应用中还存在免疫剂量大、受母源抗体和新城疫抗体干扰以及免疫程序等现实问题的困扰。

2 处于实验室研究阶段的禽用基因工程疫苗

2.1 病毒活载体疫苗

病毒活载体疫苗除了H5禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗已经投入使用外, 有很多正处于实验室研究阶段。目前插入鸡痘病毒基因组并获得成功表达的外源基因有:传染性喉气管炎病毒g B基因, 新城疫病毒F和HN基因, 传染性法氏囊病毒VP2基因, 马立克氏病病毒g B基因等。以火鸡疱疹病毒为载体的外源基因有马立克氏病病毒g B基因, 新城疫病毒F和HN基因等。据报道, 以传染性喉气管炎病毒为载体表达禽流感病毒H5亚型的HA基因的重组病毒免疫鸡也能成功地抵抗两种强毒的攻击。

2.2 基因工程亚单位疫苗

基因工程亚单位疫苗利用杆状病毒为外源基因载体, 以酵母或昆虫细胞为受体的表达系统, 将主要保护性抗原基因在体外大量表达, 具有产量高、产物可进行翻译后加工的特点。目前已有实验证明, 在昆虫细胞中表达的鸡传染性贫血病毒VP1/VP2、马立克氏病毒g B基因、新城疫D26株的HN和F基因都具有一定的免疫保护作用。利用酵母表达的传染性法氏囊病毒VP2蛋白也具有良好的免疫保护效果。

2.3 核酸疫苗

DNA疫苗最近几年的研究进展也非常快, 国外已有用核酸疫苗基因临床试验的报道, 我国也开展了大量的研究, 实验证明, 禽流感病毒的HA基因, 新城疫病毒的F和HN基因, 鸡传染性喉气管炎病毒和马立克氏病病毒的g B基因, 鸡传染性支气管炎病毒S1基因直接免疫鸡均能产生较好的保护性免疫应答反应, 但却达不到常规疫苗的保护水平。

2.4 转基因植物疫苗

转基因植物疫苗是利用分子生物学技术把重组的疫苗基因导入植物, 并使植物能大量表达重组蛋白的一类生物技术。目前此项技术在禽类疫苗方面的研究仅限于鸡传染性支气管炎病毒和新城疫病毒。ZhouJY等用土壤杆菌属系统构建含有IBVS1基因的载体转化马铃薯, 在马铃薯中表达了IBVS1糖蛋白并免疫鸡, 通过3次免疫后, 免疫鸡受到完全保护。此外, 墨西哥科学家培育出了一种转基因玉米, 他们把来自新城疫病毒的一个基因插入到了玉米的DNA中。食用了这种转基因玉米的鸡会产生新城疫抗体, 其保护程度与商业疫苗类似。这类疫苗的效果好, 成本低.疫苗的植物载体易于保存, 使用方便, 市场潜力巨大, 发展前景十分广阔。

3 小结及展望

以上, 对我国禽用基因工程疫苗的研究和应用进展进行了简要综述。尽管已有商品化基因工程疫苗的推广应用, 但由于基因工程疫苗存在的免疫原性较弱和成本较高等因素, 仍将影响基因工程疫苗的研发和推广应用。进一步开展相关研究, 打破基因工程疫苗的研发瓶颈, 十分必要。

当然, 考虑到养禽业自身具有的高密度、养殖数量大、仔鸡个体小和需免疫疫病种类多和免疫程序复杂等特点, 基因工程疫苗的可改造和容易实现多价免疫原共存的优势, 将有助于降低生产成本、简化免疫程序, 并且可克服不同病毒弱毒苗间产生的干扰现象, 因此, 这将推进禽用基因工程疫苗的研发和商品化应用。可以预见, 随着生物技术的不断完善, 禽用基因工程疫苗在禽用生物制品类型中将占有越来越大的比例, 在禽病防控中将发挥重要作用。

参考文献

[1]吴石金, 等.畜禽基因工程疫苗研究现状及其应用前景[J].畜禽业, 1999, (9) :13-14.

[2]钱凤芹.新城疫基因工程疫苗最新研究进展.121.

[3]唐艳林, 等.畜禽基因工程疫苗的研究进展及应用前景[J].吉林畜牧兽医.2005, (12) .

[4]陈少渠, 等.浅谈基因工程疫苗的类型和应用[J].河南畜牧兽医.2005, 26 (3) :9-10.

[5]孙秋艳, 等.禽用基因工程疫苗的特点及其存在的问题[J].山东家禽.2003, (10) :48-51

[6]童光志.禽用基因工程疫苗的研究进展及应用前景[J].中国家禽.2002, 24 (19) :3-9.

[7]郭文龙, 等.基因工程亚单位疫苗的研究现状及发展动态[J].国外畜牧学.2008, 28 (4) :72-75.

[8]刘文波, 等.鸡传染性喉气管炎因工程疫苗研究进展[J].禽病防治.2008, 10:27-19.

[9]李前, 等..鸡传染性支气管炎病毒基因工程疫苗研究进展[J].畜牧兽医科技信息.2010, 5:16-17.

[10]李桂喜.鸡传染性喉气管炎和鸡痘基因工程活载体疫苗的临床应用[J].养禽与禽病防治.2006 (4) :35-36.

转基因植物疫苗研究 篇5

鸡传染性支气管炎 (Infectious Bronchitis IB) 是由传染性支气管炎病毒 (Infectious bronchitis virus, IBV) 引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病, 主要侵害鸡的呼吸系统、泌尿生殖系统和消化系统, 并且在世界许多国家和地区都有发生, 是养禽业中较严重要的疾病。

S1蛋白是鸡传染性支气管炎病毒的主要保护性抗原, 能诱导机体产生中和抗体和血凝抑制抗体, 继而使机体得到保护, 引起了许多学者的极大关注。随着现代生物技术的发展, 有关鸡传染性支气管炎S1蛋白基因工程疫苗的研究不断地深入, 并已取得了一定的进展。

1 亚单位疫苗

亚单位疫苗是指用DNA重组技术, 将编码病原微生物保护性抗原的基因导入原核细胞或真核细胞, 使其高效表达分泌保护性抗原肽链。提取保护性抗原, 加入佐剂即制成亚单位疫苗。黄亚东 (2003) , 廖明 (1997) 分别在毕赤酵母和昆虫细胞中表达了IBV的S1基因, 所表达蛋白的分子量小于天然蛋白。尽管这些表达系统存在一定的缺陷, 且IBVS1基因中和位点的高度构象依赖性一定程度上妨碍了S1亚单位蛋白疫苗启动免疫的有效性, 但有资料表明单独使用传染性支气管炎基因工程亚单位疫苗免疫仍可产生一定的保护免疫效应。Song CS等重组杆状病毒表达了IBV嗜肾KM91毒株S1基因, 单独用重组的S1糖蛋白免疫对肾的保护率为50%, 而用异源弱毒疫苗株H120初免再用重组杆状病毒S1糖蛋白进行加强免疫, 对肾的保护率达到83%, 这些实验数据表明, 单独使用重组杆状病毒S1糖蛋白免疫可产生一定的免疫保护效应。

2 核酸疫苗

核酸疫苗是由编码能引起保护性免疫反应的病原体抗原的基因片段和载体构建而成。进入机体的核酸疫苗不与宿主染色体整合, 目的基因可在动物体内表达, 进而刺激机体产生体液免疫应答和细胞免疫应答, 但目前的基因免疫技术不是太成熟, 导致基因免疫效果并不理想。

刘思国等 (2001) 、陈洪岩等 (1999) 分别将鸡传染性支气管炎病毒S1基因和N基因构建成真核表达质粒接种SPF鸡, 结果显示40%的鸡可耐过IBV强毒的攻击, 血清IgG抗体在攻毒前后呈现规律性变化, 说明S1基因在鸡体内得到了表达, 并使鸡获得了一定免疫力, 但保护作用不及传染性支气管炎病毒油苗, 分析认为, 肌注质粒吸收不佳, 致使主要免疫原蛋白表达量不高而使免疫保护率不高。

3 活载体疫苗

活载体疫苗是用基因工程技术将保护性抗原基因转移到载体中使之表达的活疫苗。目前, 作为载体的病毒有痘苗病毒、禽痘病毒、疱疹病毒、腺病毒和反转录病毒等。

3.1 禽痘病毒载体

利用禽痘病毒作载体其特征为, 病毒不能整合进入基因组, 可携带多个基因, 宿主细胞谱广, 瞬间表达转基因。但缺点是难以大量产生。WangX等 (2002) 用重组鸡痘病毒表达了马萨诸塞州41株的S1基因, 免疫鸡受到部分保护, 并且试验结果显示, 翅下免疫接种效果更好。

3.2 腺病毒载体

重组腺病毒作为基因载体已在基因转移, 载体疫苗和基因治疗等各个方面得到广泛应用。JohnsonMA等用禽腺病毒主要晚期启动子调控下的血清8型禽腺病毒表达Vic S株IBVS1基因, 对0或6日龄雏鸡口腔免疫且在35日龄攻毒, 试验结果显示, 接种后的第6d, 对于IBV同源和异源毒株在支气管的保护率达到90%~100%。对于规模化养禽业来说, 一次性免疫, 廉价而有效的疫苗很重要, 而且用腺病毒作载体表达IBV的保护性抗原作为活病毒载体疫苗代替弱毒苗, 可减少新变异株的出现。

3.3 传染性支气管炎病毒载体-反向遗传操作技术

随着反向遗传操作技术的不断发展, 对IBV的基因组结构及其复制, 转录调控机制有了更深入的了解, 构建IBV感染性分子克隆并用它作为活病毒RNA载体表达异源基因, 报告基因及γ-干扰素, 表明所构建的IBV RNA载体是可行的。很快IBV将作为活病毒RNA载体表达外源基因, 为更有效的预防传染性支气管炎做出贡献。

4 转基因植物疫苗

转基因植物疫苗是Mason于1992年提出的, 该技术是利用分子生物学技术把重组的疫苗基因导入植物, 并使植物能大量表达重组蛋白的一类生物技术。王红宁等 (2003) 通过RT-PCR获得IBV S1基因片段, 并将其导入玉米表达载体进行了表达。此外, ZhouJY等 (2003) 用土壤杆菌属系统构建含有IBV S1基因的载体转化马铃薯, 在马铃薯中表达了IBV S1糖蛋白并免疫鼠和鸡, 通过3次免疫后, 免疫鸡受到完全保护, 此结果表明转基因马铃薯表达的IBV S1糖蛋白也可作为防治IBV的疫苗资源。

5 展望

转基因植物疫苗研究 篇6

1 植物生产口服疫苗的不同表达系统

利用植物生物反应器生产口服疫苗的过程包括目的基因的克隆、高效表达载体的构建、植物细胞的遗传转化、受体细胞的组织培养与植株再生、转化植株的栽培、目标产品分离纯化与纯度鉴定等。其载体表达系统为:稳定表达系统与瞬时表达系统。

1.1 稳定表达系统

稳定转化是将目的基因整合到转基因植物的核基因组或叶绿体基因组中, 能够稳定表达目的蛋白的转基因植株称为稳定表达系统。

1.1.1 核表达系统。

通过根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) 介导。农杆菌Ti质粒中含一段T-DNA, 能与植物核基因组DNA发生同源重组, 在T-DNA两侧插入外源基因, 外源基因就能与T-DNA一起随机整合到植物核基因组中。Mason等将乙型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg) 基因转入马铃薯中并获得表达, 并用薯块饲养小鼠, 在小鼠体内检测到保护性抗原包括黏膜抗体, 以抵御细菌的侵染。另外, 在一些农业经济作物中, 如大豆、水稻等不易进行农杆菌转化, 在这类植物中, 基因枪法被广泛应用, 外源基因可能整合到植物核基因组中。与农杆菌法相比, 基因枪法具有更高的整合率。

1.1.2 叶绿体表达系统。

用基因枪法把外源基因打入叶绿体中, 外源基因可能在叶绿体中整合。叶绿体转化体系只应用于几种植物, 但是叶绿体的基因拷贝数很多, 利于增强目的蛋白的表达量, 具有很大的潜力;叶绿体基因是严格的母系遗传, 可避免植物传粉过程中的基因污染, 而且不会出现基因沉默问题。

1.2 瞬时表达系统

通过整合外源基因的重组病毒感染植物, 外源基因随病毒的复制而得到高水平的表达, 这样的植物就成了生产疫苗的“绿色工厂”。最常用的2种宿主:病毒表达系统是烟草和烟草花叶病毒 (TMV) 及豇豆和豇豆花叶病毒 (CPMV) 。瞬时表达系统病毒复制拷贝数多可提高表达量。然而, 病毒表达系统不稳定, 外源基因容易丢失。此外, 每株植物都要接种病毒, 大大增加了工作量。

2 植物生产口服疫苗的研究现状

2.1 植物生物反应器生产口服疫苗的优势

除了转基因植物, 能够生产重组疫苗的系统有细菌、酵母、动物病毒、植物病毒和转基因动物等。植物表达系统与上述疫苗生产系统相比, 具有较大的优势。植物生物反应器具有如下优点:一是植物生产系统具有廉价性。植物表达系统最吸引人之处是它能廉价地生产高价值、供不应求的蛋白。在获得转基因阳性植株后, 生产转基因口服疫苗工艺简单, 不需要昂贵的培养基和复杂的纯化过程, 也不需要严格的无菌生产和冷藏保存, 只需增加耕种面积就能扩大其产量并易于栽培管理。二是植物细胞的全能性。植物的组织培养、细胞或者原生质体在适当培养条件下均能再生出完整的植物个体。药用基因转化到植物细胞后可培育出药用植物品种, 并可稳定遗传。三是安全性。动物细胞生产转基因疫苗, 常用动物病毒作为载体导入抗原基因, 生产过程可能被动物病毒污染, 这些病毒对人类健康具有潜在的危害性。而在植物中, 外源蛋白的生产或通过重组植物病毒载体的侵染, 或通过外源基因稳定地整合进植物基因组中来实现, 避免了转基因动物带来的伦理问题。植物病毒不能感染人类, 表达产物无毒性和副作用, 安全可靠, 无残存DNA和潜在的致病性、致癌性。四是植物具有完整的真核细胞表达系统。表达产物可糖基化、酰胺化、磷酸化, 可完成对亚基的正确装配等翻译后加工过程, 使表达产物具有与高等动物细胞一致的免疫原性和生物活性。

2.2 利用转基因植物生产的重组疫苗

从20世纪90年代初提出口服疫苗的概念, 利用转基因植物生产人口服疫苗就成为研究热点。表1为2000~2007年利用植物生物反应器生产的重组疫苗和药用蛋白。

3 转基因植物疫苗存在的问题和解决方法

利用转基因植物生产口服疫苗是近10年的事情, 尽管利用转基因植物生产疫苗有很多优点, 但就目前的技术而言, 仍然存在一些急需解决的问题, 主要表现为以下几点。

3.1 重组蛋白的表达问题

重组蛋白的表达量低, 表达效率不稳定, 在已报道的研究中, 外源基因所表达的重组抗原蛋白, 大约只占植物可溶蛋白的0.01%~0.37%。为使外源抗原基因更好地在植物中高水平表达, 可对目的基因进行修饰, 如优化密码子、优化抗原表位、添加增强子, 或前导序列、添加修饰基因或吸附基因使抗原直接靶向免疫系统等;为消除目的基因转化后的沉默现象, 在构建表达载体时, 尽量降低目的基因与植物基因组的同源性, 对多基因结构采取不同的启动子和polyA序列, 或在转基因的侧翼接上核基质结合序列以避免位置效应;选组织用强启动子如来源于花椰菜花叶病毒 (CaMV) 的35S启动子, 可增强目的蛋白在叶片中的表达水平;选用组织特异性启动子, 如番茄果实特异性启动子、马铃薯块茎启动子等, 可使目的蛋白在植物的特定部位集中表达。

3.2 用于口服时易被消化及作用机理问题

转基因植物疫苗是在植物体内表达的亚单位疫苗, 生物安全性高, 不需要注射, 在人们享用美食的同时就得到了免疫, 并排除了繁琐的疫苗纯化过程。但这种亚单位疫苗没有减毒活疫苗免疫性强, 需要加强免疫来提高免疫应答的水平;另外, 消化系统会降解抗原, 因此, 要求转基因植物疫苗具有肠稳定性和形成荚膜包被的抗原。细胞壁是阻止抗原被降解的第1道屏障, 植物细胞膜可进一步保护抗原避免胃液、肠液的降解作用, 植物细胞的次生壁可以使内含物释放更慢, 直到达到小肠内植物细胞壁才开始破裂逐步释放抗原, 从而实现免疫功能, 但仍需要对其中的细节问题进行研究。另外, 也可采取在抗原基因上附加修饰基因或吸附基因序列, 保护口服疫苗不易被迅速消化, 使之长时间地停留在消化系统内。

3.3 口服抗原疫苗免疫耐受方面的问题

动物实验表明, 口服疫苗涉及到口服耐性问题。口服疫苗也有可能导致人和动物产生口服耐性, 从而不再对疫苗抗原产生免疫反应, 致使疫苗失去作用。必须研究口服疫苗的安全性、有效剂量和服用时间表, 必须确定口服疫苗是起刺激作用还是抑制作用。

3.4 植物疫苗的生物安全性问题

转基因植物的生物安全性问题一直是近年来争论的焦点。外源基因是否会漂到环境中而破坏环境;抗生素抗性基因是筛选转基因植物常用的标记基因;长期使用这类转基因是否会对人体或动物造成抗生素医疗无效;转基因植物中新基因会不会传递给人畜肠道的正常微生物, 引起菌群和数量的变化或插入并表达, 从而危害人畜健康。这些问题目前都无法解答, 仍需要大量学者研究证实。

4 利用植物生产口服疫苗前景展望

用转基因植物生物反应器生产有医疗价值的抗体、疫苗及一些重要药用蛋白, 具有一定的优势和良好的前景。转基因植物口服疫苗优势突出, 具有极大的潜力, 20多年来, 植物疫苗的研究取得了很大的进展。目前, 美国DowAgroscience公司开发用于预防禽类的NEWCASTLE Concent成为第1个获得美国农业部兽用生物制品中心批准的兽用植物疫苗, 极大地促进了人用植物疫苗的研究与开发。随着人类基因组计划的逐渐深入, 相信不久的将来, 人们将会发现更多的有医疗作用的蛋白, 植物疫苗将广泛地用于人类疾病的预防。

参考文献

[1]井鑫, 张兴国.植物生物反应器进展[J].西北农业大学学报, 2004, 2 (4) :109-102.

[2]汪正, 刘坚.转基因植物研究进展[J].生物学教学, 2002, 27 (9) :1-3.

[3]王明忠, 朱进.A组轮状病毒基因在马铃薯细胞中的初步表达[J].免疫学杂志, 2004, 20 (3) :204-207

[4]周彦兵.转基因植物的安全性评价[J].生物学通报, 2001 (12) :11-12.

[5]李晓东, 曹宛虹.抗癌基因P53导入番茄的初步研究[J].园艺学报, 2001, 28 (4) :356-358.

[6]康杰芳, 王喆之.转基因植物生产药用蛋白的研究进展[J].现代生物医学进展, 2006, 6 (9) :73-76.

[7]姜鹏, 秦松, 曾呈奎.乙肝表面抗原基因在海带中的表达[J].科学通报, 2002, 47 (14) :1095-1097.