转基因研究（共12篇）
转基因研究 篇1
摘要：转基因水稻是农业可持续发展的重要组成部分。从转基因水稻的研究概况、生态风险、经济效益几个方面阐述了转基因水稻面临的问题, 为转基因水稻的评价安全性提供参考。
关键词：转Bt基因水稻,生态风险,抗性,经济效益
水稻是重要的粮食作物, 全球约三分之一以上的人口以稻米为主食。水稻也是我国最大的粮食作物, 约占我国粮食总产量的40%, 因此水稻在我国的农业生产中占有举足轻重的地位。
水稻受虫害侵袭非常严重。田间危害水稻的昆虫有数百种之多, 其中鳞翅目害虫如二化螟、三化螟和稻纵卷叶螟等危害最重。通过化学杀虫剂控制水稻害虫, 不仅生产成本高, 且因农药残留可对生态平衡造成破坏, 对人、畜健康产生严重危害, 同时, 害虫也易产生抗药性。因此, 培育具有抗虫能力的水稻新品种成为控制水稻害虫的重要途径。但由于在现有的水稻种质资源中, 只有极少数野生水稻对螟虫具有一定抗性, 而且很难加以利用, 常规育种受到了很大限制。转Bt基因水稻是有效防治鳞翅目害虫危害的途径之一, 基因工程技术突破了水稻常规育种的种种限制, 为确保我国粮食安全提供了新的可依赖途径。
1 转基因抗虫水稻的研究概况
水稻本身没有足够抗虫的基因, Bt基因是水稻基因工程中可利用的主要抗虫非水稻基因库源材料之一 (Fujimoto et al., 1993;Wunn et al., 1996) 。自Schnepf和Whiteley (1981) 首次从Bt中克隆Cry1A基因以来, 揭开了利用基因工程培育抗虫植物的序幕, 至今已有130多种杀虫晶体蛋白基因被报道。目前, 水稻中主要转入的Bt基因编码为Cry1A, 包括Cry1A (a) 、Cry1A (b) 、Cry1A (c) 基因 (赵玉艳等, 2004) 。随着水稻基因工程技术的飞速发展, 转基因水稻的研究成果斐然。近20年来, 利用转基因技术已成功研发出抗虫、抗病、抗除草剂、抗逆境和优质高产的转基因新品种, 先后获得大量的目标性状强、遗传和表达稳定、农艺性状优良的转基因水稻株系资源 (舒庆尧等, 1998;杨庆文, 2003;蒋家焕等, 2003) 。1995年浙江大学与加拿大渥太华大学合作利用农杆菌介导法成功地将密码子经过优化的Bt杀虫基因Cry1Ab导入了多个水稻品种, 通过分子鉴定、抗虫性测定和多代筛选, 育成了以晚粳推广品种秀水11为遗传背景的“克螟稻”。
Ghareyazie (1987) 报道了转Cry1Ab基因香粳品系827, 对二化螟与三化螟有较高抗性, Cry1Ab基因在水稻籽粒灌浆期功能叶片中高效表达, 而在水稻籽粒 (胚和胚乳) 中不表达, 这一研究结果对解决人类食用转基因抗虫水稻稻谷的安全性问题具有开创性意义。
范云六院士领导的实验室与华中农业大学张启发院士领导的实验室经多年合作, 将能在单子叶植物中高效表达的融合型Bt杀虫基因 (Cry1Ab/Cry1Ac) 成功地转化到籼稻, 获得了高抗虫的“明恢63”恢复系T51-1及由它配制而成的“汕优63”杂交稻。
2 转基因水稻潜在生态风险
目前, 对于转基因水稻潜在的生态风险研究主要集中在以下四个方面:转基因水稻对非靶标生物和生物多样性的影响;转基因漂移及其环境风险;靶标害虫对抗虫转基因的抗性产生;水稻生态系统的间接环境安全问题。
2.1 基因漂流的风险
基因漂流是转基因植物可能引起的生态问题的主要风险之一。基因漂流主要指基因通过花粉授精杂交等途径在种群之间扩散的过程。转基因植物基因 (包括转基因) 漂流的途径大致有两个:一是通过转基因植物的种子或组织扩散到新的生境中, 并生存下来;二是通过花粉向同种或近缘种非转基因植物转移。转基因植物通过上述途径发生基因漂流, 产生的生态风险是多方面的, 归纳起来主要有: (1) 产生超级杂草。一些转抗除草剂基因的植物生存力增强, 大面积繁殖, 成为难以除去的杂草。转基因通过花粉转移到其它野生种或近缘种中, 使这些物种含有了某种基因而成为杂草; (2) 对自然基因库产生影响。由于转基因在环境中的释放, 一些基因进入野生植物基因库中, 影响基因库的遗传结构, 给育种和研究生物多样性工作造成危害; (3) 对自然环境的直接影响, 可能造成生物多样性的损失。
2.2 靶标害虫对抗虫植物的抗性及治理
迄今为止, 在田间和实验室研究中已经发现有10多种昆虫对Bt杀虫毒素产生了抗性。一般而言, 延缓害虫对转Bt基因植物产生抗性的策略有: (1) 基因策略, 即在作物中转入多个杀虫基因。可以是具有不同结合位点的Bt基因, 也可以将蛋白酶抑制剂基因与Bt基因同时转入作物中, 以提高杀虫效果、延缓抗性产生 (Dirie et al, 2000) 。或者可以尽可能的将基因在特定的时间或特定的时空来进行表达, 尽可能在害虫危害的高峰期表达将能较好的延缓抗性的发展 (Willia-ma et al., 1992;Gould1998) 。 (2) 田间高剂量/庇护所法。庇护所是用来保持群体中敏感性昆虫的非Bt作物植株, 可以由栽培了非Bt植株的田间构成, 或由Bt植株田间内的非Bt植株构成。在庇护所植株中生存的大量敏感型昆虫可以与在Bt植株中生存的少量抗性昆虫交配, 得到的后代将是非纯合的抗性基因昆虫, 它们在高剂量Bt植株中摄食时将不能生存。 (3) 高表达策略:在作物中使毒素的表达维持在一个高水平 (如超过99%的致死量) 称为高剂量法。多数研究表明害虫对Bt的抗性是以隐性方式遗传, 因此使用高剂量的制剂或高剂量表达毒素, 能杀死95%以上的敏感和抗性敏感杂合体个体, 从而延缓害虫对Bt毒素产生抗性。
2.3 对非靶标生物和生物多样性的影响
邓曙东等 (2003) 研究发现, 在转Bt基因棉田中, 除棉蓟马外, 其它主要非靶标害虫 (主要是刺吸性害虫) 的种群发生数量呈明显的上升趋势, 转Bt基因棉对于斜纹夜蛾与烟粉虱这两种近几年来对棉花危害有加重趋势的害虫, 在大田中没有表现出抗性。因此可以看出, 由于转基因作物对目标害虫具备很强的针对性, 目标害虫的种群数量下降, 导致生物群落中种与种间竞争格局发生变化, 某些非目标害虫由于其较强的适应性而转变成为主要害虫。
转基因作物的种植可对转基因作物田间生物种群组成、群落结构和生物多样性产生深刻影响。刘志诚等 (2004) 研究认为, 转Bt基因水稻对稻田节肢动物群落的影响明显弱于化学杀虫剂, 利用转Bt基因水稻防治水稻螟虫和稻纵卷叶螟等鳞翅目害虫比使用化学杀虫剂更利于保持稻田节肢动物群落的稳定性和保护稻田中的害虫天敌。
3 结束语
随着转Bt基因水稻从实验室逐渐走向环境释放, 转基因水稻可能带来的环境安全问题等引起科学家的广泛关注, 需要对不施任何杀虫剂的转Bt水稻的经济收益作一定评估, 探讨转Bt水稻的经济效益及潜在的风险, 提出应对策略。
参考文献
[1]刘雨芳, 转Bt基因抗虫水稻的研究进展与生态安全评价, 生命科学研究, 2004, 8 (4) :294-299.
[2]邓曙东、徐静、张青文、周世文、徐冠军, 转Bt基因棉对非靶标害虫及害虫天敌种群动态的影响, 2003, 46 (1) :1-5.
[3]郭建英、万方浩、韩召军, 转基因植物的生态安全性风险, 中国生态农业学报, 2008, 16 (2) :515-522.
[4]焦晓国、崔旭红、张国安, Bt水稻对田间非靶标害虫种群动态的影响, 昆虫知识, 2006, 43 (6) :774-776.
转基因研究 篇2
为建立家蚕转基因研究中切实可行的.外源基因导入方法、分别用显微注射法、精子介导法、脂质体法和压力渗透法将含有绿色荧光蛋白(gfp)基因的转座子载体和辅助质粒转入到家蚕的受精卵中.在后代中检测到发绿色荧光的蚕茧,用PCR方法检测到后代个体染色体中含有gfp基因,并比较了上述几种方法的优缺点,为进一步进行转基因家蚕的研究奠定了基础.
作 者：王宇 刘辉芬 李维 邱兴林 WANG Yu LIU Hui-fen LI Wei QIU Xing-lin 作者单位：王宇,WANG Yu(四川攀枝花医学院医学系)刘辉芬,LIU Hui-fen(四川大学生命科学学院)
美国转基因研究的风雨历程（上） 篇3
在新近形成的“反转派”和“挺转牌”两个阵营中，分别聚集了原来政治立场不同，在网上吵翻天的专家学者、公众人物甚至普通网民。而大部分普通民众则出于对于自身健康的天然关注和未知事物的天然恐惧有所保留的站在“反转派”一边。
转基因实验
30年前，这一幕在美国也同样上演过。
“莱斯利·格里克靠制造生物谋生。通过小心的混合试管里的溶液，他改变了某些普通细菌的基因，创造出可用于特殊任务的能力更强的种类，比如能制造胰岛素或者把垃圾转变为燃料。”1980年6月29日的《纽约时报》用一篇近5000字的长文追溯了过去的几年围绕着基因重组也就是转基因技术所经历的博弈，以及目前基因重组技术在美国迅速商业化的进展。在这段开场白中，作者用“制造生物”做噱头吸引人们的眼球。
1953年，英国科学家沃森和克里克发现了DNA，这是现代生物学上一个具有里程碑意义的事件，足以和达尔文的进化论相提并论。从此，生物学进入了分子生物学的时代。科学家们发现，生物的基本信息是通过DNA也就是基因传递的。基因通过复制把遗传信息传递给下一代，使后代出现与亲代相似的性状。也通过突变改变这自身的特性，储存着生命孕育、生长、凋亡过程的全部信息，通过复制、转录、表达，完成生命繁衍、细胞分裂和蛋白质合成等重要生理过程。生物体的生、长、病、老、死等一切生命现象都与基因有关。它也是决定生命健康的内在因素。
如果科学家对DNA进行改变，就可以重新控制生物体的遗传性状并制造出新的生物。到了20世纪70年代，科学家们在实验室里实现了基因的编辑重组，甚至可以让来自于不同物种的基因片段进行传递，这就是转基因技术。这项技术可以将基因从一个生物体引入另一个生物体内，从而改变生物的生命特性。
“这就是被称为重组DNA的近乎神秘的技术。有了这项技术，基因就能被剪开并以新的形式重新组装起来。基因改变可以制造新药，清除垃圾或者改变农作物的特性。”《纽约时报》的报道用最通俗的语言解释了转基因技术的原理。
当科学家们在实验室中埋头苦干，在基因重组技术方面不断推进同时，民众和公众舆论中对于转基因生物危害的担忧也开始扩散。科学家们自己也对转基因技术发展的不确定性产生了担忧。1973年，一些学者呼吁美国国家科学院调查这项新技术的危险性，随即美国国家科学院成立了一个专门委员会，召集了一组当时最为杰出的分子生物学家研讨该问题。1974年7月，委员会在著名分子生物学家伯格的带领下在《科学》杂志上发表了一封公开信，这就是历史上著名的“伯格来信”，建议全世界的分子生物学家自愿地暂停重组DNA研究，并召开国际会议讨论这项技术的安全性和控制其潜在风险的规则。
1976年6月，美国国家卫生研究院公布了重组DNA研究规则。规则将生物研究中的动物分为几个等级，等级越高，限制越大；按照不同等级要求对这类重组DNA实验的设计、流程、实验室结构和实验用生物材料进行不同等级的防护措施，以减少其扩散的可能性。由于规则过于严苛，让科学家们在事实上已经没有办法进行正常的研究，大多数实验室停止了对基因重组技术的研究。之前已经跃跃欲试的不少大公司由于对这项研究前途未卜，也停止了投入和赞助。
转基因技术存废争论
令科学家们未曾料到的是，他们对基因重组的谨慎和负责任的态度被舆论和公众曲解为这项研究具有重大的隐患，一时间反对基因重组研究的声浪一浪高过一浪。众多的文学和影视作品也把基因重组可能带来的可怕结果作为创作题材。恐慌开始蔓延，人们担心基因重组研究会创造出难以人类难以控制的怪物。与此同时，阴谋论也开始甚嚣尘上，广为流传的说法是，一些科学家被邪恶势力收买要达到不可告人的恐怖目的。政客们也从中看到了争取选票的好机会，纷纷将自己打扮成反对转基因的斗士，为转基因研究设置重重障碍。
“事实上经过两年对重组DNA研究的禁止——这期间对其危害性进行了研究，国家卫生研究院于1978年发布了关于DNA的严格准则。然而，逐渐的，随着试验工作的积累，并没有什么致命的菌株从哪家实验室意外逃脱，这导致这家机构大大放松了他们的准则。研究人员发现他们的研究并没有带来什么意外。”《纽约时报》的长篇报道没有用太多篇幅回顾过去的几年围绕基因重组技术研究存废问题上的激烈交锋。事实上，除了用事实教育大众，科学家们也都不再沉默，而是勇敢的站出来，在大众媒体发表文章，在会议上发表演讲，让大众理性的认识基因重组技术危害的可控性，以及可能对医学、农业、环境保护带来的巨大改变。
经过科学界的不懈努力，美国国家卫生研究院终于在1978年年底出台了新的管理条例，取消过于严苛研究限制，结束了转基因研究长达5年的原地踏步。一直处于漩涡中心的科学家伯格用一段充满哲理又意味深长的话总结了这段历史：“我们最终赢得了公众的信任，源于那些正在参与这项工作也最有理由为了自己的梦想而可以对风险置之不理的科学家们唤起了对这些实验潜在风险的注意；尽管面临前所未有的情形，科学家们自愿呼吁暂停了与他们自身关系紧密的实验本身并自愿承担责任，对这些风险进行了评估和处理，这些是值得赞赏的、富有道德感行为。”
最终科学战胜了恐惧。1980年联邦最高法院以5：4的结果裁定，由通用电气的一位科学家利用基因重组技术发明的一种可降解原油的微生物可以获取专利。这项决定为当时还处于探索阶段的生物转基因技术的产业化扫清了道路。在此之后，转基因技术在医学和农业上的应用突飞猛进，在20世纪90年代，通过转基因技术培育的农作物开始大规模种植。公众对于转基因技术的认识也不断提高，在2012年美国加州公众通过投票否决了对转基因食品进行标识的提案。如今，在美国虽然反对转基因技术的声音虽然一直存在，但基本上已经从主流人群和主流媒体中退出，作为一个言论自由国度观点多样性的标本而存在。从著名主持人崔永元专赴美国拍摄的长记录片的采访中，我们可以真切地感受到那些被当做专家采访的人的边缘状态。对于美国科学界来说，转基因技术的存废讨论已经是翻过去的一页。
在中国，来自宗教信仰对于民众在转基因问题上的影响基本可以忽略不计。人们的担心来自于对科学的漠不关心和对生命健康的高度关注。中国的科学界没有参与公众话题讨论的传统，科学家们不愿意因此引火烧身。但在媒体话语权普遍被缺乏科学素养的人文知识分子把持的背景下，科学界的缺席必然导致舆论的一边倒。
转基因动物研究进展 篇4
1 转基因动物制作方法
1.1 显微注射法 (microjection)
该法是指通过显微操作仪把外源基因注入受体动物的受精卵细胞中, 外源基因整合到受体细胞染色体上, 发育成转基因动物的技术, 是目前应用最广泛, 发展最早、最有效的方法之一。该法是美国人Gordon所发明, 由于条件限制, Gordon当时应用此法并未直接获得转基因小鼠, 但他的实验工作却给予了以后研究工作者有力的启发, 开辟了一条崭新的研究途径。1982年, Palmiter将5'端调控区缺失后的大鼠生长激素基因与小鼠金属硫蛋白I基因启动子相连接, 然后将融合基因注入受精小鼠雄原核, 成功研制出了著名的“超级小鼠” (super mouse) 即生出的7只转基因阳性鼠的2号鼠, 在生后74d时, 体重达到了同类转基因小鼠平均体重的1.87倍。这项研究成果经英国科学杂志《自然》发表, 在生命科学领域中引起了一场不小的轰动, 从此掀起了试验研究转基因动物热潮, 在不很长的时间里, 应用该方法相继研究了转基因兔 (布莱姆等, 1985) 、转基因绵羊 (哈默等, 1985) 、转基因猪 (哈默等, 1985) 、转基因牛 (罗西劳等, 1989) 及转基因山羊 (艾伯特等, 1991) 。
该法外源基因转移率整合率小鼠为6%~10%, 猪和羊分别为0.98%和1%, 鱼类通常可达10%~15%。外源基因随机整合到基因组内, 常导致宿主DNA中的染色体序列丢失、重排、插入突变, 有的造成严重生理缺陷。
1.2 逆转录病毒感染法
逆转录病毒感染法 (retrovirus-mediated gene transter) 是应用分子生物学技术, 将外源基因接到逆转录病毒 (一种RNA病毒) 载体上, 因此病毒感染动物胚胎。1974年, Jaenishch等将SV40 DNA注入小鼠胚腔中, 发现获得的小鼠体内有SV40 DNA整合。1975年, Jaenish用小鼠 (Moloney) 白血病毒 (Mo MLV) 作为载体, 将外源基因导入小鼠胚腔中, 实验证明, 病毒转染的小鼠胚胎可以发育成携带病毒基因的小鼠, 并遵从孟德尔定律, Mo MLV可以在成年小鼠体内重新被激活, 再使小鼠发生白血病。不过直到1998年, 尚无人能用逆转录病毒感染法生产转基因动物, 原因是它们所感染的基因转移生产出来的动物都是嵌合体 (chimera mosdic) 。1998年, Bremel等用将逆转录病毒直接注入卵母细胞方法才生产出转基因牛。
该法操作简单, 且能很快地得到适当病毒生产株。外源基因难以植入生殖系统, 成功率低, 产生的动物为嵌合体, 需要广泛的杂交, 以建立转基因系。携带的外源基因病毒载体, 在导入受体细胞基因过程中, 有可能激活细胞DNA序列上的原癌基因或其它有害基因。
1.3 胚胎干细胞插入法
胚胎干细胞插入法 (embryonic sterm cells gene transfer) 是通过电穿孔等方法将外源基因导入胚胎干细胞 (ES) , 然后将基因的胚胎干细胞插入培养的胚胎中。
1986年, Roberoton等利用携带neo基因的逆转录病毒载体转化小鼠的ES细胞注入囊胚后, 在获得的小鼠组织中发现有neo基因表达, 共得21只小鼠, 其中20只小鼠体细胞及生殖细胞中含有外源载体序列, 部分嵌合体小鼠可将外源DNA传递给F1代, 用这种方法制作转基因小鼠的阳性率接近100%, 为首次利用胚胎干细胞介导法培育成转基因小鼠。此后, Piedrahita等于1988年从猪胚胎中获得了干细胞克隆系, Stirce和Srtethenko等1996年获得了牛的胚胎干细胞, 为转基因在动物上的定点整合开创了新的领域。不过, 目前还只有小鼠的胚胎干细胞可供商业应用。其次, 即使有了胚胎干细胞, 由于尚须经过嵌合体阶段, 对小鼠来说比较容易, 但对于繁殖周期长的其它动物则有一定困难。
1.4 精子载体法
精子载体法 (sperm mediated gene tranter) 是将活动精子放入DNA溶液中, 当精子吸附外源基因后, 用这些精子进行体外受精, 再进行胚胎移植, 使外源基因得到表达的一种方法。早在1971年, Brack等将精子暴露于纯化的SV40 DNA中后, 在精子头部监测到放射性物质, 表明异源的DNA可以进入哺乳动物的精子, 而且精子可能将外源DNA携入卵母细胞。1989年, Lavitrano等首次报导了将小鼠精子与环状或线状的PSV2CAT质粒在等渗的缓冲液中孵育15min, 然后与小鼠卵子进行体外受精, 受精卵在2细胞时移入受体鼠的输卵管。在所产生的250只小鼠中, 有30%个体为转基因阳性, 转基因可转移给后代。目前精子载体法已在12种动物中获得了基因后代 (Spadafora, 1998) , 其中包括牛 (Schellender等, 1995) 、猪 (Sperandio等, 1996) 、兔 (Rottrmann等, 1994) 、小鼠 (Lavitrano等, 1989) , 这表明精子载体法是一种有用的转基因方法。
2 转基因动物技术的发展
2.1 研究转基因动物传统方法存在的问题
外源基因的整合率低, 是当前研究转基因传统方法存在的一个共同不足问题。有资料表明, 平均每注射40枚小鼠卵可能得到1只转基因小鼠。对绵羊、山羊、牛来说, 获得1头转基因动物则分别需要110、90、1 600枚卵, 一般来说, 只有半数的转基因动物 (如猪、鱼) 能够表达外源基因。以显微注射法生产转基因动物为例, 小鼠转基因阳性率为2.6%, 大鼠为4.4%, 兔为1.5%, 猫为0.9%, 绵羊为0.9%, 牛为0.7%。此法操作过程中造成胚胎机械损伤而导致胚胎死亡是整合率低的一个极其重要原因。
其次, 整合了的外源基因在动物体内没有预期功能, 即不表达或表达水平不高。造成这种原因, 有目的基因问题, 即不同的外源基因表达水平很不相同。如在转移GH基因猪中, 仅有转移r GH和p Gh的转基因猪生长速度加快, 而转移h GH和b GH等的转基因猪作用不明显, 尽管猪血浆中GH浓度增加, 但GH浓度与促生长作用不成比例。另外, 还有一点更重要的原因是外源基因在动物基因组内整合的位置, 即所谓“位置效应”的问题。目前我们所应用的传统转基因动物技术, 还无法控制外源基因整合位置, 而只能是随机的整合。因此, 科学家正在努力研究把外源基因整合到所需要的部位的所谓“定量整合技术”。
2.2 转基因克隆动物技术
该技术首先是将目标基因转移到一种胚胎或成体来源的培养细胞中, 筛选出已整合目标基因的细胞克隆, 建立转基因细胞系。然后再用去核卵母细胞质供体, 用转基因细胞系的细胞作核供体, 通过核移植产生重植胚胎, 再通过胚胎移植产生克隆的转基因动物。Wilmut研究小组在取得克隆绵羊多利后, 于1997年6月报导用胚胎细胞为核供体, 获得了能表达治疗人血友病的凝血因子IX转基因克隆绵羊“波利” (Polly) ;1997年12月又在美国的“Science”发表了用转染胚胎成纤维细胞获得6只转基因克隆绵羊的报道。目前转基因克隆绵羊能高水平地表达人凝血因子Ⅸ, 开创了转基因克隆动物技术研究的先河。
从下表列出Comball和Brink等人的实验结果分析可说明动物克隆方法生产出转基因动物的效率, 表现出较多优点是:转基因效率已显著超过显微注射法, 按出生的幼畜计算, 牛和羊的转基因效率均为100%, 由于核移植的后代100%均为转基因动物, 可以节约90%以上的受体动物, 而显微注射实验中受体母畜所孕育的95%是非转基因动物;用基因表达水平可以预测, 不靠基因整合的机遇, 在建立细胞系过程中, 在扦测基因整合, 可同时扦测基因表达, 使用表达水平合格的细胞系进行核移植 (克隆) 。
注:COMBELL和Brink等试验资料
2.3 转基因家畜技术路线
为提高转基因家畜成功率, 鉴于经典技术路线不足, 中国和英、美科学家于1997和1998年相继研究建立3条新的转基因技术路线。
2.3.1 整合胚胎移植技术路线。
我国上海医学遗传研究所黄淑帧教授等针对当前使用的经典技术路线的缺点, 作了3方面的改进:其一, 是用体外受精技术, 从羊的卵巢里获得卵细胞, 体外孵育成熟后, 加入精子进行体外受精, 在体外培养受精卵, 观察受精卵发育的整个过程, 找到受精卵显微注射的最佳时机, 使注射后的受精卵成活率达95%以上;其二, 在胚胎移植前对外源基因在胚胎体内是否已经整合作分子鉴定, 从中挑选有目的基因整合的胚胎进行移植, 使所出生的羊羔整合率在理论上可达100%;其三, 是改进胚胎移植技术, 采用经阴道非手术胚胎移植法, 大大减少了对受精卵的损伤, 使受孕率明显提高。以上3项技术相结合在一起, 使得转基因羊的成功率提高了好几倍。这条技术路线被中国科学院和中国工程院两院院士评为1998年中国十大科技进步之一。
2.3.2 核移植 (克隆) 技术路线。
该方法是由英国罗斯林研究所应用动物克隆 (核移植) 与转基因技术相结合研制转基因的方法。研制转基因羊所用的核移植方法和克隆绵羊“多利”的方法差不多, 只是在核移植前把外源基因导入到胎羊的成纤维细胞核中, 其基本过程是:首先将编码药物蛋白的外源基因导入到胎羊的成纤维细胞核中, 获得整合有外源基因的成纤维细胞;然后取羊的成熟卵, 去掉其中的细胞核, 得到只有细胞质 (胞质体) 的“卵子”;再从整合有外源基因的胎羊成纤维细胞中吸出细胞核, 通过显微操作, 将此细胞核植入去掉细胞核的“卵子” (受精体) 中, 组装成一个类似受精卵的具有发育全能性的组装细胞。这一组装细胞 (受精卵) 经电刺激后能分裂, 并在体外培养至囊胚期, 再移植进同步发情的受体动物子宫内, 让其发育成完整的个体。据英国罗斯林研究所的研究资料表明, 应用核移植方法研制转基因羊比应用经典技术路线成功率提高2.5倍。
2.3.3 整合卵受精技术路线。
这是1998年末, 美国威斯康星大学的科学家报道的一条转基因家畜技术路线。该法是将外源基因先导入卵子, 待卵细胞整合后再和精子受精。具体做法是:先将编码乙肝表面抗原的外源基因导入一种病毒 (逆转录病毒) , 构建成带有外源基因的病毒载体, 然后将该病毒感染乳牛的卵母细胞, 待卵母细胞成熟后, 再加入精子使之受精。结果在836个注入这种抗原基因的卵母细胞中, 有174个能受精并发育成早期囊胚。将其中10个囊胚移植入5头“养母”乳牛子宫内, 有3头怀孕, 生下4头小牛 (2公2母) 。检测这些牛的皮肤和血液细胞DNA, 发现4头都携带有导入的乙肝抗原基因, 就是说:应用这种方法获得的转基因成功率达到100%。
上述3条转基因家畜新技术路线, 均在不同程度上提高了转基因效率, 为批量研制转基因家畜开辟了道路。
3 转基因动物研究的应用
3.1 促进生长、提高产量、改善品质
“超级小鼠”的研究成功为培育大型动物开辟了新思路, 掀起了向动物体内导入GH基因研究的高热潮。20世纪80年代育成的各种转基因哺乳动物中, 就是以整合表达各种不同GH (生长激素) 基因个体为主, 其中猪是主要目标, 并先后育成了转人GH、大鼠GH、牛GH基因等外源DNA的转基因猪, 这些转GH基因猪表现出瘦肉率高等优良特性, 但由于原代转基因猪具有高致畸率、高胎死亡率等缺点, 难以育成一个稳定的具备良好生产性状遗传力的种群。
美国的pursel等人 (1989年) , 曾将牛的GH转入猪中, 生产出2个猪的家系, 其生长速度比对照猪提高11%~14%, 饲料转化率提高16%~18%, 我国陈永福等用自己构建的融和基因OMT/PGH进行基因转移, 获得转基因猪生长速度提高11.8%~14.8%, 饲料利用率提高10%。
澳大利亚科学家将羊毛的一种蛋白质 (La-白蛋白) 的主要成分半胱氨基酸导入绵羊胚胎, 繁殖出的转基因羊可使羊毛增产5%, 估计全年收入增加3亿美元。另外, Pouell等将无角蛋白型中间的细丝基因导入绵羊基因组, 转基因羊毛光泽度以及羊毛中毛脂含量明显提高。
3.2 培育抗病动物
将抗病毒基因导入受精卵。由此发育成的个体会具有抗病能力, 或者应该能减轻该种病毒侵染时为机体带来的危害。1989年, 美国农业部以禽白血病病毒 (ALV) 为载体, 获得了抗ALV的新品系鸡, Carba等将小白鼠抗流感病毒基因MXI转至鸡细胞中, 使鸡获得对禽流感的抗性;Chements等将绵羊髓鞘脱落病毒 (Visna) 的衣壳蛋白基因 (EVE) 转入绵羊, 所获得转基因羊的抵抗力明显提高。
另外, 干扰素是动物机体产生的一种免疫因子, 能增加机体各种病毒感染的能力。如导入B1-干扰素基因获得的转基因鼠, 对狂犬病毒的抵抗力明显提高, 感染病毒4d后无一死亡, 数月后仍有25%的转基因鼠健在;而对照组的同窝非转基因鼠感染病毒后4d内50%死亡, 6d内全部死亡。
3.3 生产药用蛋白
通过转基因动物生产珍贵的多肽或蛋白类药物, 是当前转基因动物研究热点, 这种转基因动物被称为生物反应器 (animal bioreactor) 。乳腺是生产药用蛋白的主要靶器官, 如果将编码有生理活性物质基因与乳腺特异表达基因启动子重组, 转入乳用家畜, 便可使这些具有生理活性的物质从乳汁中不断地分泌出来, 然后用蛋白提取技术从乳汁中分离生理活性物质, 作为珍贵多肽或蛋白药物。这种方法最大优点作为生物反应器转基因动物, 可以无限扩繁, 表达产物可大量生产, 成本低, 投资周期短, 其产物为活性比较接近天然蛋白, 能充分修饰具有稳定的生物学结构。
1997年, 英国科学家Wilmat等用绵羊胚胎细胞进行核移植, 成功获得了整合人凝血因子IX的转基因绵羊, 可从其乳汁中大量表述昂贵的医用人凝血因子IX。我国扬州大学与中国科学院发育研究所合作, 已研制出具有商业应用价值的人促红细胞生成素 (EPO) 的转基因的山羊。
应用转基因动物 (家畜) —乳腺生物反应器技术来制造基因药物, 也是一种可以获得巨额经济利润的新型产业。如荷兰金发马 (genpharm) 公司用转基因牛生产乳铁蛋白, 预计每年用牛奶生产出来营养奶粉的销售额是50亿美元, 其乳汁中含有a1-抗胰蛋白酶 (a1-antitrypsin) 可治疗肺气肿病 (一种因体内缺乏该蛋白酶而导致的遗传病) 。患这种病的病人以前只能依赖于注射人的a1-抗体胰蛋白酶作替代疗法, 价格昂贵。现在用转基因羊来生产这种蛋白酶, 每升羊奶可售6 000美元。
3.4 生产移植动物器官
异种器官的移植可能是解决世界范围内目前普遍存在器官短缺的有效途径。由于猪器官的体积、形状及DNA基本上与人类相似, 因此就成为理想的肾、心、肝等器官的供应者。但是, 异种器官移植时容易产生超急性免疫排斥反应 (HAR) , 会使移植物破坏, 阻止器官移植这一进程。
超急性免疫排斥反应 (HAR) 是一种剧烈的生理反应, 其主要机制是人体内存在针对猪器官组织成分的天然抗体, 这种天然抗体通过与猪血管内皮细胞表皮的靶分子 (a-半乳糖苷) 结合, 激活补体系统, 导致细胞毒作用。为了克服超急性免疫排斥, 英国科学家将抑制人体免疫排斥反应的基因导入猪的受精卵获得转基因猪。将这种猪的心脏移植至黑猩猩体内, 能够抑制黑猩猩的免疫排斥反应, 所以术后生存了60多天, 而对照猪的心脏移植仅活了55min。
现在, 科学家设想应用基因“剔除”技术, 把猪的a-半乳糖苷基因“剔除”剔除了天然抗体作用的靶分子, 从面就避免了机体对这种猪器官的免疫排斥反应。
4 前景展望
转基因食品评价公众参与机制研究 篇5
转基因食品评价公众参与机制研究
文章对公众参与转基因食品评价的现实动因和理论依据进行了分析,前者包括公众对转基因食品存有疑虑、专家决策的有限理性和机会主义行为倾向以及公众科技民主意识的觉醒和参与能力的.提升,后者包括公众理解科学理论的发展、科技决策价值理性的彰显和科学高度社会化、体制化,并对我国公众参与转基因食品评价机制构建提出了若干建议,以使公众更好地参与转基因食品的评价,实现转基因食品发展决策的科学化与民主化.
作 者：彭建华 张鸿 喻春莲 郑林用 作者单位：四川省农业科学院科技管理处,成都,610066 刊 名：农业科技管理 英文刊名：MANAGEMENT OF AGRICULTURE SCIENCE AND TECHNOLOGY 年，卷(期)： 29(3) 分类号：X836 Q788 关键词：转基因食品 评价 公众参与 机制新疆海岛棉转基因育种的研究进展 篇6
关键词 新疆；海岛棉；转基因；育种
中图分类号：S562 文献标志码：B 文章编号：1673-890X（2015）24--02
如今，转基因技术已经成为了现代生物技术改良的重要手段之一。世界上第一例转基因植物诞生于1983年，正是这第一例转基因植物的应用拉开了转基因改良作物的序幕，进而转基因技术迅速在各个生物领域所使用。在棉花领域，自1987年美国Agracetus公司通过基因工程手段首次获得了转Bt基因的抗虫棉株以来，国内外纷纷的培育出了多种抗虫、抗除草剂等新型性状的转基因棉花，这些准基因棉花不仅培育出了适应性较强的新品种，同时也为世界的棉花生产起到了一定的推动作用[1]。
海岛棉纤维具有长、粗、强等特点，是我国国内棉花的主要培育品种之一，主要种植区域为新疆。2003年以来，随着陆地棉花转基因技术的不断发展和完善过程，国内外迅速的将转基因技术尝试运用到海岛棉的育种方面，因此，主要对转基因技术在海岛棉应用的方法和途径进行梳理，并对实际的应用和研究进展进行了综述，为进一步的改良和培育新型的海岛棉品种给予相应的指导和建议。
1 海岛棉转基因育种常用技术
1.1 农杆菌介导转化法
农杆菌介导转化法是一种天然的植物遗传转化技术，是目前转基因工程领域最为常见的一种方法，在所有成功转化的实例中，有75%是通过此种方式实现。因此，这种转化方式与其他的转基因方法相比较，具有十分高的转化效率。目前，其转化机理十分的清楚，且有研究表明通过农杆菌介导转化法能够缩短转化周期，使遗传较为稳定。
1994年，我国新疆农业科学院核生物技术研究所和塔里木农垦大学分别对海岛棉进行了性状变异的研究，摸清了海岛棉胚性愈伤诱导的条件。同时，获得了6个海岛棉品种胚性愈伤组织和转导DNA后的转基因后代，并且在棉花茎尖多芽发生方面取得了一定进展，建立了一种多芽发生再生体系，筛选出了诱导芽生根的培养基，解决了海岛棉组织培养诱导过程中出现的外植体褐化问题，这种优化极大的提高了海岛棉的转化率效率，并进一步通过体细胞胚胎发生途径获得了海岛棉再生植株，之后研究者以新海30号和新海16号的胚性愈伤组织作为转化受体，通过1代PCR及2代RT-PCR检测证实Bt基因已经整合到了海岛棉基因组中，获得了转基因的海岛棉植株。
1.2 回交转育法
回交转育法实指通过轮回的亲本自交，能够保持亲本的优良性状，进而添加非轮回亲本的目标性状，是目前改良培育新品种的一种常规方法。人们利用配合力好、表达量高的转基因抗虫棉与海岛棉进行杂交，然后再利用海岛棉品种之间进行回交，然后对其后代进行鉴定和强化筛选，最终获得稳定且表达量高的抗虫、抗除草剂的海岛棉植株。
1.3 花粉通道法
花粉通道法是通过植物自身的种质细胞或者受精卵转化对象的一种常用技术，这种方式能够直接的获得转基因的棉花种子，并且转基因过程相对简单，既省工又省时，不需要复杂的棉花组织培养或者是诱导再生棉株的过程，并且这种方式能够对所有的棉花受体材料进行转化，转化速度也较快，然而这项技术受天气环境的影响十分的大，其子一代的转化率不高，在海岛棉第一代的转化率仅为0.3%左右。
1.4 基因枪法
基因枪法又称微弹轰击法，这种方法是借助高速的金属微粒将外部的基因导入到活体细胞之中，原理是将要导入的DNA包裹于微小的金属颗粒表面，然后通过高压的作用，使微小颗粒快速的进入到受体的组织以及细胞之中，最终整合到受体的染色体之中，进而实现遗传特性的表达，实现基因转化的过程。由于这种技术不会受到导入基因种类的限制和受体器官的限制，所以，现阶段应用其进行转基因过程是比较普遍的，但是这种技术也有其本身的弊端，如成本较高，整合效率低，是所有外援基因导入技术中性价比相对较低的方法。
2 海岛棉转基因育种存在的问题
2.1 转基因技术与常规育种结合不紧密
生物技术与常规育种技术的结合是今后海岛棉育种
（下转第页）
（上接第页）
的一大发展方向，采用常规的育种技术能够弥补转基因海岛棉的某些性状的缺陷。因此，在确保转基因目标性状的同时，应进一步的改善农艺手段，确保棉花的产量和质量，前两方面不能紧密结合，造成产量、抗性、品质等性状很难兼顾，转基因棉花品种与生产需求仍有较大的距离。
2.2 缺少明显的功能基因
现阶段，新疆各个大学以及相关的研究机构已经逐步的开展了基因组学、蛋白质学等基础性的研究，取得了一定的研究成绩，但是由于对功能性基因研发相对较少，导致基因的研究方法手段明显的缺乏创新性，由此进展十分的缓慢[2]。
2.3 棉花遗传转化难以突破
棉花的基因型对离体培养起决定性作用，不同基因型的植株再生能力有很大差别。由于品种基因型的限制，高效遗传转化体系始终是棉花基因工程的瓶颈，同样在新疆海岛棉转基因培育过程中，也受到该难题的困扰。现阶段，新疆海岛棉的转基因育种主要是通过花粉管通道法来实现的，有些科研单位也通过农杆菌转化法以及基因枪法进行遗传转化，然而，这些方法虽然能够解决不收外援基因种类的限制，操作也十分简单，但是其后期对性状的筛选以及鉴定过程需要较大的工作量，因此也成了制约转化体系的一大难题。
3 结论与建议
总体来看，我国对于新疆海岛棉转基因育种的研究还主要集中于初期的培育技术上，没能有效外源基因进行进一步的开发和利用，还未建立起高效成熟的海岛棉遗传转化体系。新疆是我国重要的棉花生产基地，在我国的棉业中占据着重要的地位。因此，快速和发展新疆海岛棉转基因棉花育种具有十分重要的意义。要想实现这种转基因育种的快速发展，首先，应当加快其特殊生物资源基因的开发和利用过程；其次，要建立实现外源基因遗传转化体系，实现其对新品种的培育能力，促进新疆棉业的进一步发展。
参考文献
[1]黄乐平，马盾，李建平，等.新疆转基因棉花育种方法初探[J].新疆农业科学，2003（3）.
[2倪万潮，郭三堆，贾士荣.花粉管通道法介导的棉花遗传转化[J].中国农业科技导报，2000（2）.
小麦转基因技术研究及应用 篇7
1 小麦转基因技术研究现状
我国小麦转基因首次研究于1992年, 当时研究者为小麦导入多种基因, 产生了转基因植株, 进而确定了2种不同的转基因技术, 即裸露DNA的直接转化与农杆菌介导的转化。农杆菌介导转化是从农杆菌Ti质粒转走DNA, 通过编码才能得到转移的蛋白毒性基因, 一旦植物被农杆菌侵染, 可在植物中有效表达携带的基因。农杆菌转化粳稻技术日益成熟, 但小麦农杆菌转化技术成果依然不显著, 不仅受到宿主范围的限制, 也和基因型限制有关, 尤其是组织培养技术依赖性不足, 很难充分发挥小麦基因转化中农杆菌的主导作用[2]。就裸露DNA的转化而言, 主要有花粉管道法、基因枪法、显微注射法等方法。花粉管通道法的转化, 我国研究者最先对抗白粉病二棱大麦总DNA进行花粉管通道法转化, 可得到极少数稳定抗白粉病株系。基因枪法作为小麦转化最常见的一种方法, DNA分子释放后做好小麦原生质的培养, 广泛的受体来源于未成熟的胚胎和花粉, 也包括一些胚性愈伤组织, 这种组织培养技术要求并不严格。虽然现如今的显微注射法也有广泛的应用, 并取得一定的成就, 但在1988年小麦原生质体培养才成功, 原生质获取途径困难。
影响小麦转基因技术研究落后的原因多是因为不过关的小麦组织培养技术, 花粉管通道法的研究需要组织培养, 但在基因型影响下很难实现小麦愈伤组织的分化, 育种时多引入外源目的基因。这些传统的育种方法逐渐被淘汰, 因为不仅耗费大量的人力, 而且浪费了更多的物力。就农杆菌转化法而言, 可实现大片段外源DNA的转化, 并从组织培养立场增强了农杆菌的技术依赖性。当前小麦组织培养中组织培养技术不过关, 尤其是缺乏花粉管通道法和基因枪法的系统性研究, 小麦基因转化效率不显著, 优良目的植株很难得到。
2 小麦转基因技术的应用
近些年来, 小麦转基因技术的广泛应用, 使得物种间的界限逐步被打破, 而且增加了导入小麦外源基因的范围。小麦基因遗传重组仅靠传统常规育种方法很难实现, 极其不利于小麦育种的大规模化发展。当前小麦种耐除草剂基因的引入, 是最早的转基因研究, 用于减少人工除杂草的时间。与此同时, 耐除草剂外源基因转化以后, 可将基因逐步转育到恢复系用于杂交, 小麦田不仅杀死了杂草, 假杂种也完全消灭, 提高了杂交小麦的纯度。此外, 当前小麦生产面临着产量降低与品质下降等问题, 原因主要在于小麦病虫害, 因此可选用耐/抗病虫害能力高的小麦品种, 比如将大麦BYDV-GPV株系导入小麦中, 可有效提高小麦抗病毒能力;小麦基因组中导入哺乳动物的免防御素基因, 可有效开展抗病基因工程;将雪花莲凝集素基因导入小麦, 可有效防治麦蚜害虫等。另外, 现如今人们对小麦面粉的品质有越来越高的要求, 从小麦品种选育与品质状况改良角度出发, 应做好植物基因工程技术的改良工作。当前小麦转基因技术的研究方向是雄性不育的研究, 以基因工程方法更好地搭建小麦雄性恢复基因, 才能充分发挥小麦杂种优势, 提高小麦的品质与产量。
摘要：小麦作为人们食用的重要粮食作物, 其基因工程改良始终是人们关注的焦点。越来越多的研究者为提高小麦作物产量, 改善小麦的品质, 在小麦育种中广泛应用小麦转基因技术, 并取得了可喜进展。基于此, 本文分析小麦转基因技术研究现状, 从存在的问题出发, 探讨小麦转基因技术的应用。
关键词：小麦,转基因技术,应用
参考文献
[1]苏玲, 杨蕾.小麦转基因技术及其应用研究[J].中国科技纵横, 2016 (23) :226.
油菜转基因技术研究进展 篇8
1 油菜转基因的目的
近年来, 基因转化的目的主要有研究植物基因调控机理以及功能基因, 选育抗病、抗虫、高产、优质等符合育种目标的品种, 对受体植物进行遗传及品质改良, 拓展植物分子遗传学基础理论[7]。在油菜转基因应用上, 目前可查的就有40多种基因, 这些基因主要用来改良油菜品质, 提高油菜含油量, 改善菜籽油品种以及其他抗虫、抗除草剂等抗性改良[8,9]。
1.1 改良品质
油菜品质改良是油菜育种的一个重要方向, 通过转基因技术改良油菜品质的研究已见报端。石东乔等[10]为获得低含量亚油酸、亚麻酸, 高含量油酸的油菜种子, 通过利用农杆菌介导法在油菜中导入反义的油酸脱饱和酶基因而获得转基因油菜植株。陈锦清等[11]为获得高含油量的转基因油菜, 将反义PEP基因导入油菜。Vesna Katavic[12]将拟南芥的FAE1 基因和酵母的SLC1-1 基因导入甘蓝型油菜中, 提高了芥酸含量。有诸多研究报道通过特定基因的导入可明显提高油菜含油量[13,14]。
1.2 抗虫害
基因工程的另一个重要应用领域是培养抗虫植物, 以改良作物。抗虫的Cp TI、Bt基因已成功地在油菜中进行了转化。官春云等[15]将Bt毒蛋白基因成功地转化到甘蓝型双低油菜品种湘油13 号, 获得稳定的转Bt基因油菜品系。俄罗斯科学院植物生理研究所已筛选出抗卡那霉素的油菜苗[1,2,3,4,5,16]。侯丙凯等[1,2,3,4,5,17]利用基因枪法将抗虫基因cry1Aa10 定点整合到油菜叶绿体基因组并获得抗虫转基因植株。周小梅等[18]用农杆菌转化芥菜型油菜, 获得具有抗病虫性的油菜转化体。有学者为获得抗虫的转基因植株[19], 通过用农杆菌共培养法将苏云金杆菌杀虫蛋白基因导入甘蓝型油菜而实现。
1.3 抗除草剂
为更好地选择除草剂, 提高除草剂的安全性, 将除草剂抗性引入农作物是一条途径, 目前已培育出部分抗除草剂的油菜品种。将抗除草剂溴苯腈基因bxn转入油菜也获得抗溴苯腈转基因植株[20]。有研究将抗草甘膦的EPSP合成酶基因从大肠杆菌突变株中克隆出, 并将该基因导入到油菜中, 成效很好, 加拿大已有2 个抗草甘磷的, 且产量与当前品种相当, 品质和抗性得到提高的转基因油菜品系[1,2,3,4,5,21]。
1.4 抗病害
抗病毒的转基因材料, 可通过克隆植物抗病基因, 将植物病毒的外壳蛋白基因转移到植物中获得。王新发等[22]获得了油菜转基因恢复系和保持系植株。黄永菊等[23]以抗 (耐) 、感病品种 (系) 为材料研究油菜菌核病的遗传力发现, 油菜菌核病抗性主要受核基因控制, 并存在一定的母性效应。张海燕等[24]为获得抗病毒转基因油菜, 通过用激光微束穿刺法将商陆病毒蛋白导入油菜中而实现。此外, 通过转基因技术已获得了抗菌核病的油菜植株[17,25,26]。有研究用微注射法将烟草花叶病毒基因转入白菜型油菜。
1.5 杂种优势利用
传统油菜杂种优势利用途径育种时间长、育性不稳定后代有分离、杂种纯度不高等缺陷, 限制了杂种优势的发挥, 利用转基因技术可很好地解决这一矛盾, 具有很高的研究价值。目前, 此类研究还处于基础阶段, 鲜有转育成的不育和恢复系报道。Mariani等[27]利用核糖核酸酶和TA29 启动子, 获得油菜的不育和恢复植株。陈社员等[28]将不育基因barnase导入到湘油15 号, 通过多代回交选育, 获得遗传稳定的转基因雄性不育系15A。
2 油菜转基因方法
新的植物遗传转化方法不断被探索、发展, 目的是将外源基因方便有效地导入植物体内。在转基因研究中, 植物遗传转化是关键步骤之一。转基因技术的不断发展为油菜遗传转化提供了多样化的选择, 可分为农杆菌 (发根农杆菌) 介导遗传转化 (也称生物介质介导的遗传转化) 或直接通过电击、基因枪、激光微束穿刺、显微注射、花粉管、PEG介导等方法进行转化。
2.1 种质系统介导转化法
借助生物体自身的种质细胞为媒体, 尤其是植物的花粉、子房、幼胚、卵细胞等生殖系统的细胞以及细胞结构来实现转化之目的, 简便易行, 不需建立离体培养体系。本方法主要是将外源DNA注射入种胚、子房、幼穗中, 进而获得转基因植株。种质系统介导基因转化的DNA可以是重组在质粒上的, 也可以是裸露的[1,2,3,4,5]。
2.2 生物介质介导的遗传转化
根癌农杆菌和发根农杆菌是目前应用的主要生物介质, 它们转化的原理分别是通过活化Ti和Ri质粒的Vir区基因转移T-DNA[1,2,3,4,5]。Moloney等认为子叶柄切面的薄壁细胞的再生能力强, 且很易受农杆菌感染[29]。Boulter等认为较之发根农杆菌, 根癌农杆菌转化频率高, 并能直接从农杆菌转移基因到植物细胞核基因组[30,31]。
2.3 PEG介导法
Krens等[1,32]首先建立聚乙二醇 (PEG) 介导法, 该法操作简单、处理量大、融合频率高, 且不影响再生, 基本上已克服了再生植株嵌合体的发生, 其主要原理是借助细胞融合剂诱导原生质体摄取外源DNA[1,2,3]。该法不需要昂贵的仪器设备, 但培养和处理原生质体的时间长, 且处理效果无法把握, 多元原生质体融合体常常形成。Nugent等[33]报道用PEG介导油菜原生质体和细胞核的转化, 并比较对其的转化。Parihar等[34]研究认为在甘蓝型油菜中, DNA摄入和外源基因表达的提高可通过低剂量的紫外线实现。
2.4 基因枪法
基因枪法最早是由Sanford等于1987 年提出的, 目前应用于十几种植物 (诸如油菜、水稻、玉米、小麦等) 中。为达到稳定遗传和表达, 基因枪法通过高压将包被外源DNA的微小金粒或钨粒高速射入受体细胞或组织[1,2,3,4,5], 使外源DNA进入植物细胞并整合到植物染色体组中。Cheng Lin等[35]利用基因枪法转化油菜子叶柄叶绿体基因组的研究表明油菜可能是一种适合叶绿体遗传转化的作物。侯丙凯等[14]在国际上首次实现了抗虫基因对油菜叶绿体基因组的定点整合, 其通过基因枪法将苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因 (Bt) 转入油菜而实现。
2.5 激光微束穿刺法
激光微束穿刺法操作简单、重复性好、受体材料广泛、对细胞损伤小、靶向性极强, 其原理是利用聚焦到的激光微束 (微米级) 穿刺组织, 导致细胞膜的可逆性穿孔, 进而导入外源DNA。但该法设备复杂、转化效率不高、费用较高。王兰岚等[36]在世界上率先得到有分子证据的稳定转化植株, 其通过一套用激光微束向植物细胞导入外源DNA的体系获得。Weber等[37]证实了激光微束可定向地穿透细胞壁和质膜, 将外源基因导入细胞和细胞器中。
2.6 显微注射法和电激法
显微注射法是利用显微注射仪将外源基因直接注入到生物的生殖细胞中, 从而获得转基因再生植株。该方法的过程非常复杂、技术难度大, 必须以精细的显微操作技术和细胞低密度培养为基础, 必须建立固定植物细胞或原生质体的技术, 因此使用率不高。电激法是利用高压电脉冲作用, 形成可逆的瞬间通道, 从而促进外源DNA的摄入。电激法操作简单、转化效率高, 但仪器昂贵, 较易损伤原生质体, 原生质体的分离和再生较困难[1,38]。
3 油菜转基因存在的问题
随着转基因植物环境释放种类增多、规模增大, 人们关注的热点是转基因植物释放后可能引起的种种问题。转基因植物释放后, 可以通过种子或花粉将导入的基因从基因修饰植物向非且标植物或杂草扩散[1,2,3,4,5]。因此, 在推广应用转基因油菜前必须严格审定程序, 并评估其环境安全性。
油菜转基因体系日臻成熟, 油菜转基因技术及其应用已取得了长足的进展, 但目前仍有许多问题有待解决。
目前, 油菜基因转化主要存在转化效率低、遗传稳定性差、无法预测基因的插入位点、定点整合等问题[3,4,5]。油菜转化体系的稳定性及转化率不高。研究表明, 湿度、光照、基因型、苗龄、受体材料等环境因子及抗生素、植物激素、Ag+离子等是影响油菜遗传转化体系建立的主要因素。应用于基因改良的油菜栽培品种越来越多, 特别是优化油菜转化体系[1,2,3,4,5], 可趋向稳定油菜遗传转化体系, 特别是农杆菌介导的花絮浸泡方法, 不受限于品种。
油菜外源基因的表达调控及其遗传稳定性不高, 随机导入的外源基因整合到油菜基因组中, 会产生不确定性, 表现为其表达部位、表达水平、表达时间等的不确定。另外, 随机插入外源基因, 其在油菜基因组中的拷贝数是不确定的[1,2,3,4,5], 常常会出现嵌合体现象或出现外源基因沉默。而采用使用其本身特定的启动子、优化转化方法等策略, 可以避免这些问题。
转基因作物的安全性一直以来是个重要问题, 既要考虑到转基因油菜环境释放后是否会危害或影响其他生物[1,2,3,4,5], 又要考虑到转基因油菜环境释放后, 遗传物质的横向传递对一些野生物种尤其是亲源关系很近的植物可能会造成污染。Gressel[39]报道了转基因油菜种子特性表达基因的漂流问题。转基因油菜在食用方面的安全性问题亟需进一步的科学验证。
植物基因工程的研究与应用已取得了重大的进展, 是大势所趋, 且不可逆转。转基因油菜的研究与生产备受各界瞩目, 油菜在保障我国油品安全方面的地位举足轻重, 运用分子生物技术是大势所趋[40,41,42,43,44]。
摘要：随着转基因技术的深入发展, 用于转化的目的基因越来越多。目前转基因技术已运用到油菜研究的各个领域。本文概述了油菜转基因研究的几个方向以及基因转化方式, 并探讨了油菜转基因研究中的一些问题。
转基因植物疫苗的研究进展 篇9
转基因植物疫苗是指把植物基因工程技术与机体免疫机理相结合,生产出的能使机体获得特异抗病能力的疫苗。由于口服疫苗到肠内黏膜诱导部位之前要经过胃内的不利环境,因此有效的口服疫苗经过这些不利环境时必须要受到保护,否则会失去免疫性。而植物细胞壁作为天然的生物胶囊,可使细胞内的疫苗抵抗消化道的酸性环境和各种酶类降解,使表达的疫苗在小肠内释放,引起消化道的黏膜免疫反应,刺激黏膜下B、T淋巴细胞产生的抗菌素到消化道、血液、呼吸道中,发挥对机体的全面保护作用,疫苗通过胃进入与淋巴组织相关连的肠道,从而刺激免疫球蛋白A1的产生,以达到防治疾病的目的。动物实验已经证实,转基因植物表达的抗原蛋白经纯化后仍保留了免疫学活性,注入动物体后能产生特异性抗体;用转基因植物组织饲喂动物,转基因植物表达的抗原呈递到动物的肠道淋巴相关组织(GALT),被其表面特异受体特别是M细胞所识别,产生黏膜和体液免疫反应。
2 转基因植物疫苗的生产方法
在目前的转基因植物疫苗生产领域里,存在着两种不同的疫苗表达系统。
2.1 稳定整合的表达系统
这一方法是将抗原基因构建在植物表达载体上,利用脓杆菌或基因枪介导的方法,将抗原基因转化到植物细胞中并与植物基因组整合,获得稳定表达的转基因植株。本方法具有以下优点:一是通过有性或无性繁殖的方法,可以很容易地获得大量的转基因植株;二是通过有性杂交的方法,可以获得生产多价复合疫苗的转基因植物;三是通过特异性表达启动子使抗原基因在器官或组织中特异性表达。
2.2 瞬时表达系统
本方法是应用植物病毒作为载体,将目的基因插入病毒基因组中,然后将重组病毒接种到植物叶片上,任其蔓延,外源基因随病毒的复制而高效表达。这一方法又分为两种方式:一种是将抗原基因置于病毒基因组启动子控制之下,另一种是将抗原基因与病毒外壳蛋白基因融合在一起。值得指出的是,抗原基因融合于病毒外壳蛋白的表达方式更具有免疫原性。目前用作载体的植物病毒主要是烟草花叶病毒(TMV)和豇豆花叶病毒(CMPV)。
本方法表达量高,而且一般认为植物病毒不会传染动物,无交叉感染,但缺点是不能稳定遗传。此外,尚有几个问题需要解决:一是抗原的纯化;二是弱毒株系的选择,即病毒对植物的浸染不会使植物生长异常,还要保证抗原基因的整合不会使病毒失去浸染和复制的能力;三是现有植物病毒载体浸染的植物宿主范围有限。
2.3 生产转基因植物疫苗的一般程序
(1)克隆特异中和抗原的编码基因;(2)构建植物表达载体,把基因整合到植物表达载体上,或利用重组病毒作为载体;(3)利用各种转基因方法将抗原基因转入植物体,使植物带有编码抗原的基因;(4)进行愈伤组织的诱导和分化及转基因植物的再生,使抗原蛋白基因在植物中表达;(5)进行表达水平的检测和免疫原性的测定;(6)进行安全性评价、检测。
3 转基因植物疫苗的发展历程
近年来的研究集中在转基因植物疫苗在人类及动物中的应用。到目前为止,已报道的转基因植物疫苗大致可分为4类:即细菌疫苗、病毒疫苗、寄生虫疫苗及避孕疫苗。
3.1 细菌疫苗
用转基因植物生产的细菌疫苗主要有大肠杆菌不耐热毒素B亚单位疫苗(LT-B)和霍乱肠毒素B亚单位疫苗(CT-B)。
3.1.1 LT-B疫苗
Mason等把编码LT-B的基因转化到马铃薯中,使得LT-B在马铃薯的叶片和块茎中得到表达。经分析表明,马铃薯来源的重组LT-B具有五聚体结构,能结合神经节苷脂。
动物实验表明,转基因马铃薯产生的LT-B能刺激小鼠产生体液和黏膜免疫反应,它诱导产生的抗体能中和LT的活性。之后,他们对此进行了深入研究,结果表明LT-B主要积累在叶片和块茎中。用含有重组LT-B的马铃薯块茎直接饲喂小鼠,每周1次,每次5 g(约含LT-B 20μg),共免疫3次,免疫后的小鼠产生了黏膜和血清抗体;同时,用5μg细菌来源的重组LT-B来免疫小鼠(采用管饲法),在第3次免疫结束后隔一周采血检测抗体水平,结果显示用马铃薯来源的重组LT-B免疫小鼠所产生的抗LT-B血清抗体和黏膜抗体水平比用细菌来源的重组LT-B免疫小鼠所产生的抗体水平高;然后用25μg的LT喂小鼠进行攻击感染,结果显示用高剂量转基因马铃薯LT-B疫苗比用源于细菌的重组LT-B疫苗更具保护作用。
3.1.2 CT-B疫苗
霍乱毒素B亚单位(CT-B)与肠道黏膜细胞表面的特异性神经节苷脂结合会引起腹泻。Arakawa等将该基因导入马铃薯中,用其块茎直接饲喂小鼠,而后在其血清和肠道内检测到了特异性抗体,当黏膜抗体水平下降后,用其块茎强化免疫,抗体水平又迅速提高。毒性中和实验表明,马铃薯口服疫苗诱导小鼠产生的特异性抗体可以中和CT的毒性。用CT接种经转基因马铃薯口服免疫后的小鼠,其肠道腹泻分泌液量与对照组小鼠相比减少了60%。以上结果说明,口服转基因植物疫苗有可能成为一种预防细菌内毒素疾病的有效手段。
3.2 病毒疫苗
3.2.1 乙型肝炎(HB)疫苗
Mason等首次报道了转基因植物HB疫苗的研究结果。乙型肝炎表面抗原(HBs Ag)可刺激机体产生针对HBV的保护性抗体,此抗体是现有商业疫苗的主要成分。他们将编码HBs Ag的结构基因导入烟草并获得了表达,在叶片提取液中检测到了HBs Ag及其特异性m RNA,并在电镜下观察到重组HBs Ag形成了直径为22 nm的球形颗粒,与其天然状态相似。用相当于商用疫苗3%有效剂量的转基因植物蛋白粗提液肌肉注射小鼠,发现能诱导较强抗体。来源于经植物疫苗免疫过的小鼠T细胞,在体外能被植物来源的重组HBs Ag、酵母来源的HBs Ag及合成的多肽激活,表明植物疫苗免疫的小鼠产生了T细胞免疫。这些结果说明,转基因植物中表达的HBs Ag具有正确的B细胞及T细胞识别表位。
刘玉乐等将人乙型肝炎病毒(adw亚型)表面抗原(HBs Ag)基因插入植物双元载体p ROKⅡ-HBs Ag的Ca MV35S启动子下游,构建重组质粒p ROKⅡ-HBs Ag,将此质粒导入脓杆菌LBA4404中,利用脓杆菌感染叶盘的方法转化烟草,经酶联免疫分析,发现转化植株及其后代均能产生具有免疫活性的HBs Ag;免疫吸附电镜观察表明,转化植株产生的HBs Ag呈典型的直径为22 nm的颗粒,显示了用植物生产HBs Ag的可行性。刘德虎等人利用所获得的转基因马铃薯饲喂小鼠后,在小鼠血液中检测到了乙肝病毒保护性抗体,其抗体滴度足以对人产生保护力。
3.2.2 兔出血症病毒(RHDV)疫苗
Vp60是RHDV的主要结构蛋白。Castanon等用编码RHDV Vp60蛋白的基因转化马铃薯,该转基因马铃薯植株产生了特异的m RNA和正确的Vp60蛋白,用此植株的叶片提取物免疫兔子,在兔子体内产生了高滴度的抗Vp60特异性抗体。攻毒试验表明,所免疫兔子完全避免了兔出血症的发生。
3.2.3 口蹄疫病毒(FMDV)疫苗
Wigdorovitz等用转基因苜蓿表达了FMDV结构蛋白vp1,用此转基因苜蓿的新鲜叶片饲喂小鼠后,小鼠体内产生了特异性抗体。攻毒试验表明,经免疫的小鼠能抵抗毒性FMDV的感染。
3.3 寄生虫疫苗
疟疾是世界性的严重寄生虫病。Turpen等将编码疟原虫抗原决定簇的基因片段插入到烟草花叶病毒(TMV)外壳蛋白的编码区中,构建了植物病毒载体,然后用它感染烟草,所产生的高水平重组融合蛋白经试验证明具有抗原活性。
3.4 避孕疫苗
哺乳动物受精过程中精卵细胞的结合具有种属特异性,这种特异性的结合是由精子表面的特异性蛋白与卵细胞透明带糖蛋白通过受体配体模式进行的,透明带是卵细胞膜外的一层非细胞结构,是精子与卵细胞识别和结合的部位,透明带具有多种糖蛋白,其中ZP3充当精子受体在受精过程中起着重要作用,而从避孕的角度来说它是免疫避孕的一个靶位。Fitchen等将小鼠ZP3蛋白的一个含有13个氨基酸残基的抗原决定簇转化到烟草花叶病毒的衣壳蛋白中,利用其作载体感染植物获得了转基因植物,用此转基因植物免疫小鼠,其体内产生了抗ZP3的特异性血清,还发现透明带聚集了抗ZP3抗体,证明利用转基因植物生产避孕疫苗具有可行性。
4 转基因植物疫苗的优点
4.1 利于大规模工业化生产
利用哺乳动物细胞表达系统的优点是可与人的内环境进行相似的复制、翻译、表达,但是哺乳动物细胞培养需要牛血清,成本花费大,而植物是能够大规模也是最经济的生产蛋白质的生产系统。在转基因植物中,只要将外源基因成功转入一个植株中,就可以通过种子遗传给下一代,从而大面积种植,成本很低。其次,动物细胞培养不利于大型工业化生产,它受很多因素制约,如温度、p H值、溶解氧浓度等,这些因素会影响细胞产出蛋白的量。当然,植物中蛋白质的密码子和哺乳动物的仍有差别,但是和微生物相比,这种差异较小。
4.2 使用安全
对免疫接种动物来说,表达系统中的非目的成分对动物无害,不存在其他动物病原体污染的可能;免疫接种时,不需要注射器和针头之类的设备,不存在通过注射接种而使动物感染病原微生物的可能,同时大大减少了免疫接种时动物的应激反应。关于转基因食品安全性的争论,美国食物安全和应用营养中心已经证明了卡那霉素抗性基因植物作为食物添加剂的安全性。对环境来说,转基因植物疫苗也是绿色环保产品,无论其生产过程还是生产成品都不存在污染环境的问题。转基因植物只表达亚单位疫苗,不含致病微生物或潜在的致病微生物,对人畜安全。
4.3 免疫效果好
植物细胞中的疫苗抗原通过胃内的酸性环境时可受到细胞壁的保护,直接到达肠内黏膜诱导部位,刺激黏膜和全身免疫反应。不仅如此,转基因植物口服疫苗还可诱导消化道相关淋巴样组织(GAL T)产生分泌性Ig A(s Ig A),并在病原体和宿主之间相互作用的起始部位直接诱发免疫反应,从而大大提高其免疫有效性。
4.4 植物细胞具有全能性
能够再生植株且易于成活,生长周期短,易于快速筛选出转基因阳性植株。不仅比构建动物生物反应器节省时间,而且构建植物生物反应器的技术更成熟,成功率更高。
4.5 能进行有效的翻译后加工
植物与动物一样,属真核生物,具有与之相似的翻译后加工过程,适合于动物病毒抗原的表达,病毒产物具有与之相似的免疫原性。
5 展望
转基因植物作为生物反应器生产转基因植物疫苗或其他转基因产品,为人和动物提供了一个最经济有效的生产系统,具有许多潜在优势,但这只能算是起步阶段,离实际应用还有很大一段距离,还面临着许多未知的和有待解决的难题,仍需做进一步的效力试验、稳定性试验以及免疫途径、免疫剂量等多方面的研究,关键问题是提高抗原表达水平。随着转基因技术和相应检测手段的逐步建立和优化,转基因植物疫苗在产业化生产中必将具有广阔的应用前景。
参考文献
[1]Stephen J,Streatfield,John A,et al.Plant-based vaccines[J].International Journal for Parasitology,2003,33:479-493.
[2]王景会.可食用植物疫苗的探讨[J].农产品加工,2005,(11):26-36.
[3]王宝琴,张永光,王小龙.转基因植物疫苗与转基因植物抗体的研究进展[J].中国兽医科技,2003,33(9):29-33.
[4]陈书明.转基因植物在免疫学研究中的应用进展[J].国外医学免疫学分册,1996,(5):269-271.
[5]Curtiss R,Cardineau G.Oral immunization by transgenic plants[P].W ashingtonUniversity,St,Louis,USA:Patent Cooperation Treaty,1989.
[6]Tacket C O,Mason H S,Losonsky G,et al.Immunogenieity in humans of a recombinant bac-terial antigen delivered in a transgenic potato[J].Nat.Med.,1998,4:607-609.
[7]Mason H S,Lan D M,Amtzen C J,et al.Exprsesion of hepatitis surface antigen in transgenic plant[J].Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1992,89:11745-11749.
[8]Glynis Giddings.Transgenic plants as protein factories[J].Current Opinion in Biotechnology,2001,12:450-454.
[9]陈章权.转基因疫苗的研究进展[J].国外医学免疫学分册,2002,(1):9-13.
转基因研究 篇10
植物转基因操作中,通常用标记基因将转化细胞筛选出来。在选择压力下,非转化细胞不具备抗性而死亡,因此在转基因研究中,抗性标记基因对于从大量非转化细胞中选择转化细胞至关重要。目前,转基因研究中普遍应用的抗性标记基因是抗生素和除草剂抗性基因。这些抗性标记基因在植物转化过程中是很有利的选择工具。然而,一旦转化完成,这些抗性基因便失去了作用,其存在还可能带来生物安全性问题[1]。另外,由于选择标记基因数量有限,这些基因的存在也给转基因植物的再次转化带来了不便[2]。
对转基因植物中标记基因的安全性评价主要集中在环境和食品安全性2个方面,其中对环境危害评价已发展到从分子、个体、种群、群落到生态系统的水平。标记基因的环境安全性主要包括:转基因植物的残枝落叶转移到其他土壤微生物中从而导致外源抗性基因的逃逸,可能造成生态失衡;很多情况下标记基因的沉默可能引起邻近目的基因的沉默。转基因产品中的抗生素抗性基因,有可能通过食物链,最终给人类的安全带来潜在的威胁[3]。在解决转基因植物可能存在的安全性问题中,研究者研究了共转化法、转座子法、位点特异性重组系统、同源重组[4]、无选择标记基因的转化系统[5]及安全标记基因的转化系统等方法。现对提高转基因植物标记基因安全性的方法作一综述。
1 共转化法
共转化的原理是将目的基因和标记基因单独组装到2个质粒上,或1个质粒的2个不同T-DNA区段上,然后同时转化。由于T-DNA的插入是随机的,二者可同时插入同一细胞的不同染色体上,经过后代的遗传重组,使目的基因与标记基因分离,从而获得仅带有目的基因的转基因植株[6](图1)。
Komari et al[7]构建了包含2个T-DNA的超二元质粒载体,将gus(β-glucuronidase)和hpt(hygromycin phosphotran sferase)通过共转化方法转入烟草和水稻,经过后代分离,50%以上的株系为无标记基因的gus转基因植株。Miller e al[8]通过多个菌株共转化玉米,共转化率为11.7%;而通过包含双T-DNA超二元质粒载体进行转化,共转化率高达93.4%。陈松彪等[9]采用体外重组技术构建一个双T-DNA载体系统,41.7%的后代为无选择标记的转基因烟草植株。为了提高共转化效率,研究者们对共转化方法进行了改进。叶兴国等[10]通过几个中间质粒构建了含有3段T-DNA的双元表达载体p NB35SVIP1,高频率获得无选择标记转基因大豆植株。
共转化系统去除转基因植物中选择标记为最早研究的技术,因其方法简单,多数无选择标记转基因作物均通过共转化系统所获得。目前,国内外已成功地运用共转化法获得了烟草、水稻、玉米和大豆等[7,8,9,10]作物的无选择标记转基因植株。但是共转化需要有性杂交过程将标记基因和目标基因分离,限制了此种方法在无性繁殖植物中的应用。此外,共转化耗时长,工作量大且转化效率较低,极大地限制了共转化系统的应用。
2 转座子法
转座子是存在于染色体DNA上的一段可自我复制和移动的DNA序列。把标记基因或目的基因和转座子相连,在转座子移动的过程中,标记基因与目的基因分离,子代植株通过遗传分离,获得仅带目的基因的转基因植株。因此,转座子系统可用于培育无选择标记的转基因植株。目前,已经报道的用于转基因植物标记基因删除的转座系统来源于玉米的Ac/Ds系统。
Goldsbrough et al[11]以nptⅡ(neomycin phosphotransferaseⅡ)为选择标记基因,以gus为报告基因转化番茄,在转基因植株后代中发现nptⅡ和Ds-gus-Ds结构的重组分离现象,获得了只含gus基因而无选择标记基因nptⅡ的转基因植株。Ebinuma et al[12]将ipt(isopentenyltransferase)基因插入Ac基因中,然后与nptⅡ和gus基因串联构建成MAT(MultiAuto-Transformation)表达载体,用其转化烟草和白杨,在转基因植株后代中发现无标记基因的转基因植株。
转座子具有跳跃性和可删除性,不需要再次转化或杂交引入重组酶。但是该途径也存在一些问题,如效率较低、需要有性繁殖分离途径、周期较长等,仅适用于有性繁殖以及生活周期短的植物,限制了其在标记基因剔除中的应用。
3 位点特异重组系统
位点特异性重组系统包括2个基本元件,即重组酶基因和特异性识别位点。把标记基因放在2个识别位点之间,在重组酶的作用下,标记基因可以被切除[13](图2)。
目前,在植物中已发现的有效的位点特异性重组系统有来源于噬菌体Pl的Cre/lox P(Cre:causes recombination;Lox P:locus of crossing X-over in P1)系统、接合酵母SR质粒的R/RS(R:recombinatinase;RS:recombination site)系统、啤酒酵母的2μm质粒FLP/FRT(FLP:flipping DNA;FRT:FLP recombination target)系统和噬菌体Mu的Gin/Gix(Gin:invertion of the G loop;Gix:Gin invertion complex sites)系统,其中以Cre/lox P系统的应用最为广泛。
3.1 Cre/lox P系统
Cre/lox P系统去除筛选标记的原理是将标记基因构建于lox系统的2个34 bp特异识别序列之间,将目的基因构建于lox位点之外,筛选到转化子后再诱导Cre酶表达,从而切除选择标记基因。
Dale et al[14]首次利用此方法转化烟草,将一个嵌合的荧光素酶(Luc)基因作为报告基因插入到含有选择标记基因hpt的载体中,Cre重组酶的表达催化2个同向lox位点间的重组反应,使hpt基因被切除,切除效率达到90.9%。一些研究者采用诱导型启动子诱导Cre重组酶的表达,在适当的时候对转基因植株进行化学诱导或热激处理来删除标记基因。此系统通过一次转化即可获得无选择标记的转基因植株。Zuo et al[15]构建了一个化学诱导型的载体转化拟南芥,以受雌二醇诱导的融合转录激活因子XVE控制Cre基因的表达,从而剔除lox序列之间的选择标记基因,获得了高频率的无选择标记的转基因拟南芥。Luo et al[16]利用同向融合lox P与FRT 2个特异识别位点构建识别位点lox P-FRT,获得一个全新的基因删除系统,大大提高了外源基因的删除效率。宋洪元等[17]利用Cre/lox定位重组系统在烟草中成功实现了与gfp(green fluorescent protein)基因连锁的bar(bialaphos resistance)基因的高效删除,并通过自交分离的办法获得了含gfp的无选择标记转基因烟草,表明利用Cre/lox系统获得烟草无选择标记的转基因植物是稳定可行的。Zhang et al[18]在位点特异重组系统Cre/lox中引入雌二醇诱导表达系统,成功获得了无选择标记基因的抗逆番茄。Khattri et al[19]利用Cre/lox系统转化水稻,由大豆热激启动子控制Cre重组酶基因的表达,获得了无选择标记基因的转基因水稻。由于化学诱导和热激诱导都需要对转基因植株进行处理,这可能对转基因植株的生长产生不利的影响。利用组织特异性启动子调控表达Cre基因来删除标记基因,不需要任何诱导剂即可完成标记基因的组织特异性删除。Kopertekh et al[20]将2个载体p LH-nap-vst-lx-35S-bar-lx和p LH-gusnap-cre共转化烟草。Cre重组酶基因由种子特异性启动子napin控制,在种子中特异表达并删除bar基因。结果表明T1代种子中bar基因已被高效删除。通过反相高效液相色谱证明了此系统不会对靶基因的表达产生影响。
3.2 FLP/FRT系统
FLP/FRT系统中FLP重组酶可催化位于同一DNA分子上2个同向位点FRT间DNA片段的切除,可用于选择标记基因的删除。目前,已成功获得无选择标记基因的烟草、玉米、水稻等[21,22,23,24,25]作物。
Woo et al[24]采用氧化胁迫诱导的过氧化物酶(POD)启动子控制重组酶FLP基因的表达,将转基因烟草用过氧化氢处理,13%~41%的再生植株的标记基因被删除。Li et al[25]将表达FLP重组酶基因的转基因玉米与包含靶基因At NHX1(提高植物耐盐性)和位于FRT 2个识别位点之间的选择标记基因als(acetolactate synthase)的转基因玉米进行杂交,在F1代植株中,40.7%的als基因被删除。进一步盐胁迫试验表明,在高盐环境下,无选择标记的At NHX1转基因玉米的产量高于野生型。
3.3 Gin/gix系统
Maeser et al[26]发现Gin/gix系统,重组酶Gin表达时可催化同一DNA分子上2个特异位点gix间DNA片段的切除,但因Gin基因影响植物的再生,该系统在植物中成功应用尚未见报道。
3.4 R/RS系统
R/RS系统中重组酶R能够专一地识别其特有的识别序列RS,并将2个紧邻的RS之间的DNA片段切除。
Onouchi et al[27]将含有RS-gus-RS的转基因拟南芥与由35S启动子控制的R基因的转基因拟南芥进行有性杂交,借助杂合状态下R基因的表达,删除了转RS-gus-RS基因拟南芥中的gus基因。Sugita et al[28]利用R/RS系统建立了GST-MAT载体,将重组酶R与化学诱导表达的启动子GST-Ⅱ-27(glutathione-S-transferase,谷胱甘肽转移酶)融合,这样在转化当代就获得了无选择标记的转基因烟草。Saelim et al[29]利用该系统对木薯进行转化,表型正常的转化植株中有88%~96%为无选择标记转基因木薯。Khan et al[30]利用该系统获得了无ipt选择标记基因的转基因番茄。位点特异性重组是目前无选择标记转基因植物研究中广泛应用的方法。尤其是后来发展起来的化学诱导系统,通过化学诱导表达的启动子驱动重组酶基因表达,从而严格控制标记基因删除。此外,此技术在标记基因删除过程中不需要二次转化,适合于无性繁殖的植物。同时它也存在弊端,利用位点特异重组酶切除标记基因时,往往在重组位点留下一个识别序列,从而影响同一位点特异性重组系统在受体植物中的再次应用。另外,经过几次去除标记基因后,基因组中分布着多拷贝的识别序列,可能会导致目的基因沉默。
4 同源重组
同源重组发生在DNA的同源序列之间,重组以后会导致位于同源序列之间的基因序列的切除。把标记基因放在2个DNA同源序列之间,发生同源重组后,标记基因可以被切除,即可获得无标记基因的转基因植株。
Fischer et al[31]利用同源重组的原理,在标记基因aad A(aminoglycoside-3′-adenyltransferase)两端加上正向重复序列,转入烟草叶绿体基因组,在有选择压力条件下得到转化植株,当去掉选择压力后发现aad A基因由于同源重组而被去除。噬菌体的352 bp的附属P区域att P(attachment site phage)是3个特异蛋白的结合位点,在烟草中,att P区不需要特异蛋白辅助就能切除位于2段att P重复序列之间的DNA序列。Zubko et al[32]利用attp同源序列介导的染色体内同源重组剔除了选择标记基因,得到了无标记基因的转基因烟草。
同源重组对序列特异性没有要求,严格地配对即可,其机理与位点特异性重组相同,但无需辅助蛋白参与,因而也不会对植物基因组造成可能的伤害。但是由于重组频率低,限制了其广泛应用。目前,此技术已成功应用于微生物和动物,但在植物中的应用尚处于探索阶段。
5 无选择标记基因的转化系统
在植物遗传转化过程中,可以不使用选择标记基因就能获得含目的基因的转基因植株,如马铃薯[33]、烟草[34]等。L et al[35]通过根癌农杆菌介导转化烟草,在不使用选择压力的情况下获得了无选择标记的转基因烟草,转化率为4%。Madhurima et al[36]报道了一个不使用任何选择标记基因的方法转化花生。他们利用根癌农杆菌介导转化花生的子叶外植体,转化率高达75%。无选择标记基因的转化系统简单、高效,为培育无选择标记转基因植株提供了新的方法。但是此方法也存在弊端,由于无法对转化植株的生长进行选择性地控制,研究者们必须从大量的再生植株中检测出转基因植株,这样不仅花费高而且还很耗时[37]。
6 安全标记基因的转化系统
安全标记基因是对生态环境和人体健康相对安全的标记基因。使用这类基因作选择标记的转化选择系统不是将非转化细胞杀死,而是使转化细胞处于某个有利的代谢或发育条件下,从而筛选出转化植株[38]。
近年来发现的生物安全标记基因主要有木糖异构酶基因(xylose isomerase,xyl A)、6-磷酸甘露糖异构酶基因(6-phosphomannose isomerase,pmi)、异戊烯基转移酶基因(isopentenyl transferase,ipt)、吲哚-3-乙酰胺水解酶基因(indole-3-acetamide hydrolyse,iaa H)、甜菜碱醛脱氢酶基因(betainealdehydedehydrogenase,BADH)、β-葡萄糖醛酸苷酶基因(β-glucuronidase,gus)、绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein,gfp)等。目前,生物安全标记基因已成功用于水稻、玉米、小麦、大麦等[39,40,41,42]的遗传转化。
安全标记基因本身及表达产物一般没有毒性,选择剂也无毒副作用,转化效率高,因此安全标记基因的筛选系统在提高转基因植物安全性研究中发挥了重大作用。然而,标记基因的存在不利于多重转化,无法将多个优良性状累积在同一转化植株内;而标记基因删除技术为此提供了一个很好的解决方案,能够彻底地删除转基因植物中的标记基因,从根本上解决转基因植物安全性问题。
7 展望
转基因研究 篇11
关键词：转基因甜瓜Kan早期筛选PCR
蔬菜作物转基因研究已在国内外广泛开展。研究过程中为了便于选择转化植株，通常在构建基因表达载体时插入遗传标记基因，如Gus、cat、NPT－II、gfp、pat、荧光素酶基因、冠瘿碱合成酶基因及二氢叶酸还原酶基因等，其中NPT－II基因应用最为广泛。使用NPT－II基因转化植物。可以使植物细胞产生对卡那霉素(Kanamycin，以下简称Kan)等抗生素的较大抗性，植株能够正常生长。
利用花粉管通道法能够收获大量“转化”种子。单纯依靠实验室的分子检测耗资大、时间长。因此，迫切需要建立一种与花粉管转化相适应的早期筛选技术。目前。Kan已经应用于转基因棉花、小麦早期筛选及田间检测，大量分子证据验证了Kan检测的可靠性。由于植物自身对Kan敏感性不同，且同一植物的不同发育时期对Kan抗性也存在差异。因此，研究甜瓜对Kan处理的反应，选择有效I临界浓度，可为大量“转化”种子早期快速筛选提供依据，加快花粉管通道技术在甜瓜基因转化中的应用。
1、材料与方法
1.1试验材料
受体甜瓜：乌克兰(厚皮)、雪里华(网纹)、鲁薄1号(薄皮)3个高代低糖自交系及相应的花粉管通道法转化种子，由山东省农业科学院蔬菜研究所甜瓜课题组提供。供体质粒：携带Npt－II、Anti－MAI基因。由山东大学生命科学院赵双宜、于喜艳教授提供。Kan：硫酸阿米卡星注射液由齐鲁制药厂有限公司生产，产品批号0508171，20万单位/支。NPT－II引物由上海生工生物工程公司合成。
P1：5’－GGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGC－3’，P2：5’－TGCCGACCATCTGTTGTYTGCCC－3’。TaKaRaTaqTM、λEcoTl4 I购自TaKaRa公司。Southern分析DIG High Primer DNA Labeling and Dectection StarterKit II(Cat No.11585614910)购自Roche DiagnosticsGmbh。Germany。HybondTM－N+尼龙膜购自AmershanPhamacia公司。其他为常规分析纯试剂。
1.2试验设计
1.2.1试验浓度种子：Kan质量浓度0～1500 mg/L，每100mg/L设置1个浓度梯度，0mg/L为对照(CK)。叶片：Kan质量浓度0～8000mg/L，每500mg/L设置1个浓度梯度，0mg/L为对照(CK)。
1.2.2处理方法涂抹法：毛笔在Kan液中浸透，均匀涂抹1片子叶、半片真叶正面：连续重复处理3次。浸润法：脱脂棉团成小球，在Kan液中浸透。摆在叶片正面，为防止棉球滑落，用透明胶固定，3d后拿掉。喷雾法：幼苗2叶1心时用小型喷雾器均匀向苗床喷雾，保证雾流细、匀。连续重复处理3次。
1.2.3调查方法挑选整齐饱满的普通甜瓜种子，每个材料每个浓度均为100粒。在Kan溶液中浸种，30℃恒温黑暗条件下催芽。3～4d后统计种子萌发及根系生长情况。田间播种，调查出苗率、绿苗率。
普通种子常规浸种催芽。播种于单孔穴盘，幼苗子叶完全展平及真叶如贰分硬币大小时，挑选生长一致的幼苗进行Kan处理。连续重复处理3次，每个处理每个重复50株，7 d后调查子叶反应。调查标准参阅祝建波等人的方法。
0级：叶片正常。
1级：叶片处理部位叶色与周边正常叶色略有差异，但不明显，叶色仍为绿色。
2级：叶片处理部位叶色与周边正常叶色对比加深，差异较明显，叶色变浅。
3级：叶片处理部位叶色与周边正常叶色差异明显。叶色由绿转黄。
4级：叶片处理部位叶色与周边正常叶色差异极明显，叶色由黄逐步转白。
5级：叶片处理部位叶色与周边正常叶色差异极明显，叶色由白逐步转褐，并稍有破损。
6级：叶片处理部位叶色与周边正常叶色差异极明显，叶色基本变褐。破损极为严重。
1.3转化种子的筛选
每个品种、每个处理随机取500粒花粉管通道法转化的甜瓜种子，使用Kan临界浓度处理种子、幼苗，提取Kan+绿苗的基因组DNA，进行PCR及Southern杂交检测。
2、结果与分析
2.1Kan处理方法比较
涂抹法、浸润法、喷雾法处理甜瓜幼苗，各品种表现黄斑趋势一样。涂抹叶片黄斑面积较大，但颜色深浅有差异，特别是处理真叶，叶尖、主叶脉部位黄斑重；浸润法黄斑明显。斑迹与脱脂球形状相同，同样浓度黄斑颜色深、明显：喷雾法黄斑呈随机点状，表现不均匀、不明显，增加了调查误差。3种方法相比较，以涂抹法较好，操作简单，处理结果清晰，易调查。
2.2Kan处理种子临界浓度筛选
甜瓜种子在不同浓度Kan溶液中均能萌发，但下胚轴、胚根发育差异明显。超过一定浓度时，处理种子的下胚轴粗短，主根无任何侧根、根毛，随浓度加大差异更明显，且根尖变褐、腐烂。播种到田间后，Kan处理过的种子出土晚。随浓度增加出苗率、绿苗率降低，生长速度减慢，出土时间延长甚至不出土。由此可见。Kan不影响种子萌发，但却明显抑制芽、根系生长，这可作为一项易于鉴定转化后代的指示性状。表1表明，本试验选用的3个甜瓜自交系Kan压力有差异，Kan浓度为1100、800、600mg/L时，乌克兰、雪里华、鲁薄1号的绿苗率为0，Kan已将普通种子杀死，可确定为种子有效临界致死浓度。
2.3Kan处理幼苗临界浓度筛选
Kan对叶片伤害依次表现为黄化、白化、干枯、破损。1、2级反应可能是植株自身对Kan存在一定抗性，进行转化植株检测会增加假阳性，影响选择效果；6级反应筛选压力过强，造成转化植株呈Kan阴性而逃逸。3～5级反应基本消除了植株本身对Kan处理的负面效应，可作为临界筛选的标准。5级黄化指数为83.3％，因此以指数接近80％的Kan浓度作为临界。表2结果表明，乌克兰宜选用4000mg/L、雪里华选用5000mg/L、鲁薄1号选用2500mg/L作为子叶临界选择压；真叶对Kan反应比子叶敏感，
3个试材的真叶临界浓度分别为3500、5000～5500、2000mg/L。
另外，Kan处理甜瓜后的调查数据表明，3个材料的种子、幼苗对Kan反应呈一定正相关性，即种子接受Kan压力高。幼苗临界选择压相应较高，幼苗承受Kan压力比种子高3～4倍。田间试验发现，Kan处理过的甜瓜种子，虽然能较早筛选到绿苗。但后期部分植株无生长点，停留在1片或2片真叶甚至只有2片子叶状态，无法进行后续研究。而处理真叶后Kan药液易集留并沿叶柄流到生长点，也影响植株后期生长。因此。在实际应用研究中。处理子叶较为理想。
2.4花粉管转化甜瓜种子的田间筛选与分子检测
使用Kan临界选择压处理3个甜瓜转化种子、幼苗，结果见表3。乌克兰、雪里华2个厚皮甜瓜真叶筛选后的绿苗率均高于种子、子叶处理，而鲁薄1号筛选种子、子叶的绿苗率高于真叶。Kan+绿苗的PCR检测结果表明，3个自交系的Kan检测准确率以种子处理最高，子叶次之，真叶处理最低。因此，3个甜瓜真叶、子叶的Kan临界质量浓度可适当提高。
Kan+绿苗的PCR及Southern杂交检测结果见图1、2。PCR阳性谱带杂交信号有差异，1、3、4、5、7、12、13、14阳性谱带无信号，与其对应的植株为假阳性，而其他较强的杂交信号说明外源基因已经整合到植株基因组DNA。
3、讨论与结论
Kan对转基因植物进行筛选实质上是通过Kan抗性基因NPT－II起作用的。Kan与植物细胞器中的核糖体30S亚基结合，阻止翻译过程，干扰蛋白质合成。导致植物细胞死亡。NPT－II利用ATP的KP使Kan的某个特定羟基发生磷酸化，抑制Kan与核糖体相结合。植物叶片叶绿体等器官正常生长，无NPT-H基因的叶片失绿黄化。NPT-H作为标记基因一般与目的基因连锁在一起。Kan处理植株后。若保持绿色，则认为目的基因已被转入。本试验根据此原理，利用适宜Kan临界浓度筛选转化携带NPT－II的Anti－MAI基因的甜瓜种子、幼苗。可以直观地在早期筛选出转化株，大大减少后期工作量。
很多研究证实利用Kan对转基因后代进行筛选是切实可行的，可应用于筛选转化后代外源基因遗传分离规律、转基因种子纯度、田间转基因成株的筛选等。此方法简单快速、经济高效，检测结果可靠，适用于生产试验上的大面积应用。由于不同植物对Kan敏感性差异较大。使用时期、方法、浓度、环境条件等因素均影响转化植株的筛选效率。因此，Kan临界浓度的选择是一个动态的过程，确定最佳选择浓度是提高Kan筛选效率的关键问题。
转基因研究 篇12
随着社会经济的不断发展和人口的持续增加,我国的粮食安全问题越来越突出,人们开始寻求生物技术提高粮食产量,转基因水稻品种应运而生。转基因水稻品种的出现为提高农业生产力和农民经济收益(Scott Rozelle,2008),保护生物多样性,减轻贫困和饥饿,减少农业对环境的影响(黄季焜,2007)提供了可能性。对于转基因品种,农户是否愿意种植?哪些因素会决定和影响农户对转基因水稻品种的采用?尽管中国的转基因水稻并未商业化,但已有相当的文献就此问题进行了不同角度的研究。陆倩和孙剑(2014)以湖北地区547户农户的调查数据为依据,在分析农户禀赋特征和其对转基因作物的认知这两者关系的基础上,发现农户关于转基因作物的认知对农户的种植意愿有显著正向影响。薛艳、郭淑静和徐志刚(2014)基于黑龙江、吉林、山东、河南和福建五省723个农户的实地调查数据,研究发现农户种植转基因作物的积极性很高,如果政府批准转基因作物品种的商业化生产,总体上八成左右农户会选择种植转基因作物,并且农户对种植转基因水稻意愿较高,平均达到90%以上,而种植转基因玉米的意愿相对较低。对农户技术采用的研究中,早期主要用计量方法来定量考察影响因素的作用。但即使是个别农户的决策,其结果是受到其他农户行为的影响的,因此适合采用博弈的框架加以分析。丁雄、贾仁安和王翠霞等(2013)采用演化博弈理论分析面对差异化的市场需求时,农户有机种植方式决策行为的演化与稳定过程,发现农户种植方式选择的演化趋势主要依赖于其所选种植方式获得的利润,规模种植户在政府扶持与监督下承担环境责任机制减少了农户有机种植成本,政府的绿色补贴直接提高农户有机种植的利润,两种方式增加了农户的有机种植偏好,促使农户种植方式选择演化稳定于农产品的有机种植。因此本文从农户利润最大化的角度出发,通过比较生产传统水稻和转基因水稻的单位成本,采用农户博弈的框架,分析农户之间的决策相互影响因素。
二、模型
本文中农户的生产决策不会对价格产生影响,市场上转基因水稻和传统水稻的价格(PG和PN)是给定的,转基因水稻的单位生产成本为CG,传统水稻的单位生产成本为CN,类型一和类型二的生产者生产转基因水稻的单位产量为yG1和yG2,生产传统水稻的单位产量为yN1和yN2。
1、产量增加型转基因品种
产量增加型转基因品种的条件为成本相同,产量增加,即cN=cG=c,y1N<y1G,y2N<y2G。
(1)同质农户。同质农户即生产N和G的单产相同,则有y1N=y2N=λy1G=λy2G,0<λ<1。
首先,类型一的农户选择N和G的条件:
类型一的农户选择N的条件为:,化简得的单位产量之比大于G和N的价格减去成本之比时,类型一的农户更愿意选择生产N。
类型一的农户选择G的条件为:,化简得,即当生产N和G的单位产量之比小于G和N的价格减去成本之比时,类型一的农户更愿意选择生产G。
其次,类型二的农户选择N和G的条件:
类型二的农户选N的条件为:,化简得λ>λ,即当生产N和G的单位产量之比大于G和N的价格减去成本之比时,类型二的农户更愿意选择生产N。
类型二的农户选择G的条件为:,化简得,即当生产N和G的单位产量之比小于G和N的价格减去成本之比时,类型二的农户更愿意选择生产G。产量增加型的同质农户选择如图1.a所示。
(2)异质农户。假定类型一的农户在生产N上有相对优势,类型二的农户在生产G上有相对优势,则:y1N=λy1G,yN2=(λ-m)yG2,0<λ<1,0<m<λ。
首先,类型一的农户选择N和G的条件:
根据类型一的农户选择N的条件可得:即当生产N和G的单位产量之比大于G和N的价格减去成本之比时,类型一的农户更愿意选择生产N。反之,即当生产N和G的单位产量之比小于G和N的价格减去成本之比时,类型一的农户更愿意选择生产G。
其次,类型二的农户选择N和G的条件:
根据类型二的农户选择N的条件可得:,即当类型二生产G和N的单产之比大于G和N的价格减去成本之比时,类型二的农户更愿意选择生产N。否则,即当类型二生产G和N的单产之比小于G和N的价格减去成本之比时,类型二的农户更愿意选择生产G。产量增加型的异质农户选择如图1.c所示。
2、成本节约型转基因品种
成本节约型转基因品种的条件为产量相同,成本节约,即y1N=y1G,y2N=y2G,cG=δcN,0<δ<1,t=0,s=0。
(1)同质农户。同质农户即生产N和G的单产相同,yN1=yN2=yG1=yG2。
首先,类型一的农户选择N和G的条件:
根据类型一选N的条件可得:,即当生产G和N的成本之比大于临界值δ*时,类型一的农户更愿意选择生产N。反之,即当生产G和N的成本之比小于临界值δ*时,类型一的农户更愿意选择生产G。
其次,类型二的农户选择N和G的条件:
根据类型二的农户选N的条件可得:,即当生产G和N的成本之比大于临界值δ*时,类型二的农户更愿意选择生产N。反之,即当生产G和N的成本之比小于临界值δ*时,类型二的农户更愿意选择生产G。成本节约型的同质农户选择如图1.b所示。
(2)异质农户。假定类型一的农户在生产N上有相对优势,类型二的农户在生产G上有相对优势,c1G=δc1N,c2G=(δ-n)c2N,令c1N=(δ-n)c2N=cN,0<δ<1,0<n<δ。
首先,类型一的农户选择N和G的条件:
根据类型一的农户选择N的条件可得:,即当类型一生产G和N的成本之比大于临界值δ*时,类型一的农户更愿意选择生产N。反之,即当类型一生产G和N的成本之比小于临界值时,类型一的农户更愿意选择生产G。
其次,类型二的农户选择N和G的条件:
根据类型二的农户选择N的条件可得:,即当类型二生产N和G的单位成本之比大于临界值(δ-n)*时,类型二的农户更愿意选择生产N。否则,即当类型二生产N和G的单位成本之比小于临界值(δ-n)*时,类型二的农户更愿意选择生产G。成本节约型的异质农户选择如图1.d所示。
三、结论
当转基因水稻是产量增加型且农户为同质时,当生产N和G的单位产量之比大于G和N的价格减去成本之比时,类型一和类型二的的农户都更愿意选择生产传统水稻(N,N)。反之当生产N和G的单位产量之比小于G和N的价格减去成本之比时,类型一和类型二的农户都更愿意选择生产转基因水稻(G,G),如图1.a所示。
当转基因水稻是产量增加型且农户为异质时,当生产N和G的单位产量之比小于G和N的价格减去成本之比时,类型一和类型二的农户都会生产转基因水稻(G,G),如图1.c中竖线阴影部分。当生产N和G的单位产量之比大于G和N的价格减去成本之比且类型二生产G与N的单产之比大于G和N的价格减去成本之比时,类型一选择种植传统水稻,类型二选择种植转基因水稻(N,G),如图1.c中横线阴影部分。当生产N和G的单位产量之比大于G和N的价格减去成本之比且类型二生产G与N的单产之比小于G和N的价格减去成本之比时,类型一和类型二都选择种植传统水稻(N,N),如图1.c中点状阴影。
当转基因水稻是成本节约型且农户为同质时,当类型一生产G和N的成本之比小于1减去N和G的价格差与其生产N的成本之比时,两类型的农户都选择种植转基因水稻(G,G),反之两类型的农户都选择种植传统水稻(N,N),如图1.b所示。
当转基因水稻是成本节约型且农户为异质时,当类型一生产G和N的成本之比小于临界值δ*时,两类型的农户都会生产转基因水稻(G,G),如图1.d中的竖线阴影部分。当类型一生产G和N的成本之比大于临界值δ*且类型二生产N和G的单位成本之比小于临界值(δ-n)*时,类型一的农户选择种植传统水稻,而类型二的农户选择种植转基因水稻(N,G),如图1.d中横线阴影部分。当类型一生产G和N的成本之比大于临界值δ*且类型二生产N和G的单位成本之比大于临界值(δ-n)*时,两类型的生产者都选择生产传统水稻(N,N),如图1.d中点状阴影部分。
摘要：本文用博弈论的方法分析了农户选择种植传统水稻还是转基因水稻的生产决策影响因素,并将转基因水稻分为产量增加型和成本节约型,将农户分为同质农户和异质农户。研究结果发现,同质农户会同时选择种植传统水稻或种植转基因水稻,而异质农户视其相对优势的差异进行选择。
关键词：博弈,转基因水稻,农户
参考文献
[1]丁雄:农户有机种植方式决策过程的演化博弈分析[J].数学的实践与认识,2013(18).
[2]黄季焜:转基因水稻生产对稻农的影响研究[J].中国农业科技导报,2007,9(3).
[3]陆倩:农户关于转基因作物的认知对种植意愿的影响研究[J].中国农业大学学报,2014,19(3).
[4]薛艳:经济效益风险态度与农户转基因作物种植意愿——对中国五省723户农户的实地调查[J].南京农业大学学报(社会科学版),2014,14(4).
[5]Ping He.:Strategic choice of flexible production technology using game theory approach[J].Robotics and ComputerIntegrated Manufacturing,2012(28).