转基因棉花（通用7篇）
转基因棉花 篇1
在6月18日举行的第五届中国生物产业大会上, 来自深圳创世纪转基因技术公司的两株硕果累累的棉花, 因为具有强大的抗棉铃虫能力而备受瞩目。据介绍, 棉铃虫大爆发的时候, 可能导致减产50%左右。这两株棉花导入抗棉铃虫的基因, 抗棉铃虫能力大幅提高, 在种植过程中, 基本不使用农药, 每亩抗虫成本可减少150元左右。
目前, 世界上只有美国和中国有大规模商业化的转基因产品。以前都是美国在做转基因抗虫棉, 中国培育出转基因抗虫棉后, 已经出口到印度、巴基斯坦等国家。
转基因棉花 篇2
棉花GhADF7基因结构与进化分析
ADF蛋白是一种在真核生物中广泛存在的低分子量的肌动蛋白结合蛋白,在细胞分裂、细胞运动、花粉管伸长等重要的生命活动中发挥着重要的作用.我们以陆地棉(Gossypium hirsutum)叶片DNA为模板,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增分离获得棉花GhADF7基因.该基因长度为902 bp,包含420 bp阅读框;编码区含有3个外显子和2个内含子;其编码的ADF蛋白含有139个氨基酸残基.GhADF7与其它生物的ADF蛋白具有较高的`同源性.其中GhADF7与NtADF1,tADF2的亲缘关系较近,与 LlADF、ZmADF的亲缘关系次之,它们的氨基酸序列同源性在75%～79%之间.上述系统发育进化分析表明,植物ADF基因具有高度保守性.
作 者：张成伟 黄耿青 许文亮 王秀兰 李学宝 ZHANG Chengwei HUANG Gengqing XU Wenliang WANG Xiulan LI Xuebao 作者单位：华中师范大学,生命科学学院,武汉,430079刊 名：华中师范大学学报(自然科学版) ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF CENTRAL CHINA NORMAL UNIVERSITY(NATURAL SCIENCES)年，卷(期)：40(4)分类号：Q943关键词：棉花ADF基因 肌动蛋白解聚合因子 序列分析 分子进化
转基因棉花 篇3
关键词：转基因；杂交棉品种；选育；栽培技术
中图分类号： S562.03 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）07-0104-02
收稿日期：2013-10-30
基金项目：江苏省农业科技自主创新资金[编号：CX（13）2029]；江苏省科技支撑计划（编号：BE2013380）；国家转基因生物新品种培育重大专项（编号：2012ZX08013009-003）。
作者简介：蔡立旺（1965—），男，江苏盐城人，硕士，副研究员，主要从事棉花与特经作物研究。Tel：（0515）68668953；E-mail：jsclw86@163.com。苏棉29（代号：盐G0801）是江苏沿海地区农业科学研究所最新育成的高产、优质、抗病虫、中熟棉花新品种。该品种以盐2008与盐1136杂交，于2008年育成，属转基因抗虫棉杂交一代种。苏棉29的母本盐2008为中棉所12/泗棉2号//徐州576选择的后代，父本盐1136为苏棉15号//GK19杂交选择的后代，GK19是国产Bt基因导入泗棉3号材料中选育出的抗棉铃虫、抗枯萎病、耐黄萎病、丰产稳产、品质优良的转基因抗虫棉新品种[1]。2013年经江苏省农作物品种审定委员会第五十三次会议审定通过，江苏省农业委员会2013年第6号公告公布（审定编号：苏审棉201302）。
1选育经过
2006年以盐2008为母本，盐1136为父本进行杂交；2007年、2008年继续做杂交，参加所级品种比较试验，同时进行抗性鉴定与品质测试；2009年参加江苏省棉花品种预备试验；2010—2011年参加江苏省杂交棉花品种区域试验；2012年参加江苏省棉花品种生产试验并于2013年2月获得农业转基因生物安全证书[农基安证字（2012）第099号]，2013年通过江苏省审定定名。
2特征特性
苏棉29出苗较好，前中期长势较强，后期长势稳健，生育期内整齐度好。株型较紧凑，通风透光性好，茎秆较粗壮，茸毛较少，耐肥抗倒；叶片中等大小，叶色较淡；果枝长，果节短，层次清晰，正常果枝6～7节，全株果节较多，果枝上举，果枝与主茎的夹角从下向上逐步减小，通风透光条件较好，有利于上、中、下部三桃齐结，单株成铃率40%以上；单铃重较高，铃卵圆形；吐絮畅，花色白，易采摘。2010—2011年江苏省区试平均结果：生育期139天。株高120.4 cm，单株果枝18.4台，果枝始节位7.2节，单株结铃35.1个，单铃重6.1 g，衣分41.5%，子指11.0 g，霜前花率87.3%。农业部棉花品质监督检验测试中心测试：HVICC纤维上半部平均长度30.9 mm，整齐度指数86.3%，断裂比强度29.0 cN/tex，马克隆值4.8，纺纱均匀性指数150。江苏省农科院植保所病圃接种及抗棉铃虫生物学鉴定：枯萎病指18.0，黄萎病指34.7，耐枯萎病，耐黄萎病，高抗棉铃虫。
3产量表现
苏棉29于2007年、2008年参加江苏沿海地区农科所所级品种比较试验。2年试验结果，苏棉29籽棉产量 3 898 kg/hm2，较对照泗杂3号增产12.32%；皮棉产量 1 573 kg/hm2，较对照增产12.08%，居10个参试品种首位。2009年参加江苏省棉花品种预备试验（G组），产量水平居23个杂交棉参试品种首位，籽棉产量为3 603 kg/hm2，皮棉产量为1 629 kg/hm2。皮棉产量是对照泗杂3号的111.2%。
苏棉29于2010—2011年参加江苏省棉花品种区试，2010年参加A组试验，2011年参加B组试验。2年12点次中，6点次皮棉产量居参试品种首位，3点次居第2位，仅1点次较对照减产1.4%，其余11点次均较对照增产。2年区试结果，苏棉29的籽棉产量4 185 kg/hm2，皮棉产量 1 737 kg/hm2，分别为对照品种泗杂3号的110.6%和1085%，2年皮棉产量均极显著高于对照品种，皮棉产量也是自2006年泗杂3号作为江苏省杂交棉花品种区试对照品种以来，增产幅度最大的棉花品种[2]。
苏棉29于2012年参加江苏省棉花品种生产试验，在6个试点中，苏棉29的籽棉产量和皮棉产量均较对照品种增产，其中籽棉产量4 176 kg/hm2，为对照的106.3%，皮棉产量1 745 kg/hm2，为对照的108.1%。
4稳产性
以苏棉29（盐G0801）参加的2010年（11个品种，7个试点）和2011年（11个品种，5个试点）江苏省杂交棉花品种区域试驗产量数据为基础，采用GGE双标图法[3-4]，作出各品种产量和稳定性分布图（图1、图2）。图中原点与品种边线到平均环境轴（ATC，右下为正向）的投影距离表示品种丰产性，正向距离越长表示丰产性越好；品种到平均环境轴的距离表示稳产性。可以看出，苏棉29是丰产性与稳产性结合较好的品种。
5纤维品质
农业部棉花品质监督检验测试中心HVI900系统对2010—2011年江苏省区试品种纤维品质测试结果，苏棉29与泗杂3号的纤维品质在年度间有一定的差异。2年平均：苏棉29的上半部纤维长度30.9 mm、比强度29.0 cN/tex、马克隆值4.8；泗杂3号的上半部纤维长度31.0 mm、比强度29.0 cN/tex、马克隆值4.4。苏棉29与泗杂3号品质相当，3项综合指标均达到农业行业标准《农作物品种审定规范 棉花》（NY/T 1297—2007）Ⅲ型标准[5]。
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6抗病虫性及适应范围
2010—2011年江苏省农业科学院植物保护研究所以泗棉3号为枯、黄萎病感病对照品种，对所有参试品种进行了抗枯萎病和黄萎病鉴定，苏棉29的棉花枯萎病病指18.0，黄萎病病指34.7，表现为耐枯萎病、耐黄萎病；同时对参试品种进行了抗棉铃虫生物学鉴定，苏棉29的抗级达3.50以上，综合抗级为高抗。
2009—2012年江苏省预备试验、区域试验及生产试验多年多点的结果表明，苏棉28适宜在江苏省枯、黄萎病轻病区种植，且能达到较高的产量水平。
7栽培技术
7.1适时播栽
该品种出苗快而整齐。育苗移栽宜在3月底4月初播种，1钵1～2粒。采用脱绒包衣棉种应干籽下种，保证棉种吸足水分，利于出苗。有条件的可采用双膜育苗，其间注意苗床温湿度调节，从而促进早出苗。一熟棉或麦套棉种植，于5月上中旬移栽。麥后移栽棉可适当推迟播种，但不应迟于4月10日；地膜直播棉以4月中下旬播种为宜。
7.2合理密植
宜采用等行种植，行距90～110 cm，保证植株的通风透光；如用宽窄行种植，小行距保持在60 cm为宜。一熟棉、油菜茬、上等肥力田及肥水平较高的田块，移栽密度为 24 000株/hm2；麦后棉、麦套棉及中等肥力田，营养钵育苗移栽密度3 0000～37 500株/hm2；地膜直播棉密度为30 000～45 000株/hm2。
7.3科学施肥
施肥时注意氮、磷、钾肥的配合使用，适量补充多元微肥，保证植株营养均衡，促进棉花生长发育。育苗移栽棉全生育期内一般施肥4次：基肥采用N、P、K含量为15-15-15的复合肥300kg/hm2；棉苗活棵后，施1次提苗肥，用尿素
150 kg/hm2 左右，促进棉苗平衡生长；7月上旬和下旬分2次施花铃肥，用尿素225 kg/hm2和150 kg/hm2 。在施好基肥的基础上，花铃肥应采取早施、重施的原则，既保证结铃高峰期的养分供应，又防止后期脱力早衰。第1次花铃肥一般在单株成铃2个左右施用。对前茬为水稻或地力比较肥沃，棉花生长强劲有力的地块，可酌情少施或不施肥料；对于后劲不足的田块，可酌情补施盖顶肥，用尿素75～150 kg/hm2 。施肥方式以穴施或沟施为主，采用撒施的需适当增加用量。结合施肥及时中耕，做好培土壅根，防倒伏。花铃期是棉花需水敏感期，如干旱严重，可适当进行灌水保墒，以减少脱落，防止早衰，提高成铃强度和铃重。
7.4及时打顶
打顶时间根据棉花生长情况决定。气候正常年份，棉花生长良好的地块，打顶时间一般在8月上旬，对长势较好的田块，可适当推迟打顶，一方面增加果枝生长量，另一方面利用顶端优势抑制后期赘芽的生长。
7.5适度化控
全生育期化控3～4次，甲哌纯品用量：蕾期 15.0 g/hm2，初花期15.0～30.0 g/hm2，盛花结铃期 45.0 g/ hm2 左右，打顶后5～7 d 60.0 g/hm2左右。具体应根据棉花长势、天气状况酌情增减用量和次数，应掌握少、轻、勤的原则。对长势均衡的田块，可结合治虫等农艺措施采取少量多次的办法，中期每次用7.5～15.0 g/hm2，打顶后用60.0 g/hm2封顶，以改进通风透光条件，塑造理想株型。
7.6病虫草害防治
棉苗移栽时，可穴施或沟施呋喃丹颗粒剂来防治地下害虫，同时可兼治棉蚜、棉叶螨、蓟马等。注意防治盲椿象、蚜虫、红蜘蛛、烟粉虱和斜纹夜蛾等害虫。苏棉29高抗棉铃虫，一般2代不治，注意棉铃虫的后期防治工作。及时中耕除草，可以根据杂草种类使用合适的除草剂。
参考文献：
[1]施爱民，涂松林，胡国祥，等. 转基因抗虫棉GK19生产试种示范与研究[J]. 湖北农业科学，2000，39（1）：18-21.
[2]江苏省棉花新品种试验总结汇编：2006—2012[Z].
[3]金石桥，许乃银. GGE双标图在中国农作物品种试验中应用的必要性探讨[J]. 种子，2012，31（12）：89-92.
[4]许乃银，张国伟，李健，等. 基于HA-GGE双标图的长江流域棉花区域试验环境评价[J]. 作物学报，2012，38（12）：2229-2236.
[5]NY/T 1297—2007农作物品种审定规范：棉花[S].
转基因棉花的研究现状及发展探讨 篇4
1 我国转基因棉花的研究现状
棉花, 是我国主要的农作物之一, 且棉花在基因工程方面的研究进展迅速。1992年我国农科院生物技术研究所在我国内首次合成Bt基因, 该基因的主要作用是具有杀虫性, 然后在后续科研工作中, 又将Bt杀虫基因与豇豆胰蛋白酶抑制剂基因进行基因重组后, 将重组基因导入棉花中, 进而培育出转基因抗虫棉, 并获得巨大成功。但是随着我国转基因抗虫棉种植面积的增多, 棉田次生害虫也呈现逐年增加的趋势, 不仅严重危害我国棉业的可持续发展, 而且影响我国国民经济的增长, 棉田的次生害虫成为危害我国棉业的一大难题。
在转基因棉花技术研究的过程中, 需重视对生态效应的研究。我国新疆地区虽然自然条件优越, 但是也存在较多的不利于棉花产业发展的因素, 其中较为典型的就是病虫危害, 棉田次生害虫逐年增加。针对以上情况, 为加强新疆育种单位的育种条件, 开设了“十五”和“十一五”新疆优质棉基地建设等利于新疆棉业发展的项目, 同时引进专业研究转基因育种技术的综合型人才, 与此同时引入一批分子标记和转基因育种的鉴定、检测仪器设备, 为转基因棉花的研究做好充分的准备工作。
2 我国转基因棉花存在的问题
虽然我国转基因技术在很大程度上有较大的发展, 但是不可避免的是关于转基因棉花也存在许多问题, 这些问题大致可以分为以下3点:常规育种和转基因技术两者间的结合不紧密, 两者之间不能紧密结合, 造成转基因棉花不能同时满足品质、产量、抗性等性状, 这就造成转基因棉花仍相距较远于生产需求, 同时也可以看出, 常规育种和转基因技术紧密结合是我国今后棉业发展的趋势和方向;转基因棉花缺乏效果显著的功能基因, 虽然我国部分院校均开展关于转基因棉花的基础性研究课程, 但是在成功的案例中, 效果显著的功能基因所占比例非常小, 功能基因研究手段和方法缺少创新, 使得我国转基因棉花育种工作处于迟缓发展的状态;难以突破棉花遗传转换, 棉花的基因型影响棉花植株的再生能力, 也就是说, 棉花基因型限制棉花基因工程的发展。目前在我国新疆地区, 花粉管通道法是转基因棉花主要的遗传转化方法, 少数的研究机构采取的遗传转化方法是基因枪法或农杆菌介导法, 但是对于转基因棉花外源基因遗传技术来说, 仍存在体系急需完善, 创新不足的缺点。
3 我国对转基因棉花的发展对策
针对影响我国棉花产业发展的长期性的诸多因素, 培育耐除草剂、抗病虫害和复合型转基因棉花在较大程度上推动我国棉花产业的发展, 关于培育耐除草剂、抗病虫害和复合型转基因棉花可以从以下几点考虑:
研发新型转基因棉花, 可以从抗虫性状、抗病性状、耐除草剂性状、纤维品质改良性状来进行对新型转基因棉花的研究, 关于对转基因棉花抗病性状的研究, 目前尚未取得对其研究成果的进展, 需要最大可能的发掘抗病功能基因。达到不仅可以使转基因棉花具有抗虫性、抗病性、耐除草剂性等较多优点, 还可以加快我国棉花纤维品质质量的改良的目的。
安全性评估和管理策略, 靶标病虫草的抗性是转基因棉花的主要环境安全性问题, 转基因棉花的环境安全问题还包括, 管理模式的变化对危害植株的生物地位的演化过程中的影响, 以及转基因棉花生态系统中生物多样性等, 针对以上问题可以采取加强环境安全性评估和采取相应的管理策略。例如, 对转基因抗病虫棉花的环境安全性评估指的是其对农业生态系统生物多样性和群落结构、对棉田靶标生物地位演化以及靶标生物对其的风险评估和抗性检测。
4 结语
转基因棉花 篇5
关键词：转基因棉花；hpa1Xoo基因；抗黄萎病；农艺性状
中图分类号： S435.621文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0170-05
收稿日期：2015-02-06
基金项目：教育部博士点基金（编号：20104601110004、20124601110004）；国家自然科学基金（编号：31160359、31360029）；国家科技部项目（编号：2004BA901A36）。
作者简介：刘悦（1990），女，黑龙江人，硕士研究生，从事植物病理学研究。E-mail：heizi2327@126.com。
通信作者：缪卫国，博士，教授，从事分子植物病理学研究。E-mail：weiguomiao1105@126.com。在世界范围内棉花是非常重要的纤维作物，也是食用油料来源之一。是仅次于粮食的第二大农作物[1]。黄萎病是棉花成株期危害最大的病害之一。棉花黄萎病的病原菌为大丽轮枝菌（Verticillium dahlia Klebahn），对棉花质量、皮棉产量、纤维品质影响非常严重[2-3]。1993年，棉花黄萎病在我国大暴发，发病面积达266.67万 hm2，损失皮棉约1亿 kg，2002—2003年黄萎病再度暴发，棉花黄萎病已成为棉花减产的主要原因之一[4-5]。选育高产抗病品种对有效控制该类病害尤为重要。多年来，我国对筛选与培育新品种的方法不断更替革新，由开始常规棉育种至现在利用转基因、分子标记与生化辅助育种等技术，定向、高效培育出高产、抗病虫、优质的复合抗性品种[6]。如转基因Bt抗虫棉，不仅在抗棉铃虫方面有显著成效，还能够增强农业生态系统害虫自然控制的能力，世界范围内实现了大范围的推广种植[7-8]。但至今对于抗病转基因棉的研究成效甚微，未见抗黄萎病转基因棉花大面积种植的报道，生产上大面积种植的棉花品种对棉花黄萎病的抗性仍处于抗病或耐病水平，缺乏高抗黄萎病棉花品种的报道。
Wei等首次从梨火疫病菌（Erwinia amylovora）中分离和鉴定了一种能够激发非寄主植物发生过敏性反应（hypersensitive resistence，HR）的蛋白激发子，命名为harpinEa[9]。目前，人们已经在Erwinia、Psedomonas、Xanthomonas等属的多种植物病原细菌中克隆到编码harpin蛋白的hrp（hypersensitive response and pathogenicity，hrp）基因[10-17]。人们已经将编码harpin蛋白的基因成功转入到烟草、马铃薯、苹果、梨、甜菜、小麦、棉花[18-26]及水稻[15，17，27-29]等植物中，获得的转基因植物都对其主要病原菌产生了较好的复合抗性。
hpa1Xoo是来自水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）编码harpinXoo蛋白的hrp基因[17]，笔者项目组用含农杆菌T-DNA区域的重组质粒，通过花粉管通道法将hpa1Xoo基因导入多个陆地棉，结合常规育种获得具有多种有益表型如抗棉花黄萎病、枯萎病、棉铃虫等的后代株系[30]。在此基础上，2008—2014年项目组选用抗病较差但农艺性状较好的陆地棉材料854，将hpa1Xoo基因导入854，通过系统选育获得了稳定表达的后代株系854-3、854-5，在2013—2014年对854-3、854-5的黄萎病抗性、农艺性状等方面与泗棉3号、中植棉2号进行了比较，以期为棉花抗病品种选育及病害有效防控提供优良种质。
1材料与方法
1.1材料
陆地棉材料854-3、854-5是以854（江苏科腾种业有限公司提供）为转化受体的转hpa1Xoo基因棉花的遗传稳定后代株系，抗性标记基因为nptⅡ[28]。对照为中植棉2号（抗病）、泗棉3号（感病）。
1.2试剂
卡那霉素（5 000 mg/L）、胶回收试剂盒、DNA试剂盒与RNA试剂盒均购自BIOMIGA公司；反转录试剂盒购自TianGen公司；GoldView DNA染料购自北京赛百盛基因技术有限公司；引物由华大基因引物合成。DNA测序由华大基因完成。
1.3方法
1.3.1卡那霉素抗性筛选参照缪卫国的方法[31]，当棉苗长出2～3张真叶时，用5 000 mg/L浓度的卡那霉素对叶片均匀涂抹，无黄色斑痕的为卡那霉素抗性植株，以此作为阳性植株进行下一步分子筛选。
1.3.2转基因棉抗病性考察试验选择在江苏大丰大中镇红花村发病均匀的棉花黄萎病重病田进行，田间管理同大田常规方法。病情考察分2个时期进行，黄萎病第1发病峰在棉花蕾花期（7月中下旬），黄萎病第2发病峰在棉花铃期（9月下旬），调查发病率，计算病情指数，参照顾本康等的方法[32]划分抗病等级。
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1.3.3农艺性状调查棉花采用育苗移栽的方式种植，4月中旬播种，5月中旬移栽。试验田采用随机区组排列，重复3次，小区长8 m、宽4 m，行距1 m，株距30 cm，每个区组设1个感病对照（泗棉3号）、1个抗病对照（中植棉2号）。调查项目包括吐絮期株高、单株果枝数、单株铃数和吐絮个数，并考察皮棉、籽棉产量、单铃质量、衣分等指标。采集植株中部铃50个，称量其纤维20～30 g送检（中国农业科学院棉花研究所农业部棉花纤维检测中心检测）。
1.3.4统计分析参照顾本康等的抗病性鉴定方法[32]，抗病性指标计算公式如下：
发病率=（∑病株数/调查总株数）×100%；
病情指数=[∑（各级病株数×相应病级）/（调查总株数×4）]×100%；
相对抗性指数（IR）=校正系数K×鉴定材料病指；
校正系数K=50/本次鉴定感病对照病指（50为感病对照标准病指）。
比较854-3、854-5这2个株系（材料）与对照品种在2013—2014年的抗病性与农艺性状，对均值进行t测验，依据测验值的显著水平确定供试材料的品质优劣。
1.3.5PCR与RT-PCR检测采用DNA提取试剂盒（E.Z.N.A. HP Plant DNA Kit）提取棉花4～5张真叶期时的叶片总DNA，参照缪卫国等方法[31]，用引物hpa1Xoo（Forward：5′-TTCGGATCCATGAACTCTTTGAACACACAATT-3′；Reverse：5′-GGTGAGCTCTTACTGCATCGATGCGCT-3′） PCR扩增目的基因hpa1Xoo全长。其程序为：95 ℃变性5 min，然后95 ℃变性45 s，56 ℃复性45 s，72 ℃延伸1 min，此循环进行35次；最后72 ℃延伸10 min。
利用RNA提取试剂盒（E.Z.N.A. Plant RNA Kit RNA）提取花铃期棉叶的RNA，使用反转录试剂盒（Quant Reverse Transcriptase）进行RNA反转录。使用hpa1Xoo引物（同上），以反转录后的cDNA为模板进行PCR，程序同上。
2结果与分析
2.1转基因棉花的黄萎病抗性
2008年，我们采用花粉管通道法结合农杆菌介导的方法，将来自水稻白叶枯病菌编码harpin蛋白的hpa1Xoo基因导入受体陆地棉材料854[30]，通过卡那抗性和抗病性田间筛选，结合分子验证，经单株选育，获得了854-3、854-5，2个农艺表型稳定的材料。2013—2014年，继续观察854-3、854-5农艺性状和对黄萎病的抗病性。结果表明，在江苏大丰大中镇红花村棉花黄萎病重病田，抗病对照中植棉2号相对病情指数为12.41～16.68，平均为14.54，感病对照泗棉3号病情指数为42.76～50.00，平均为46.38，每年3个区组的感病对照泗棉3号黄萎病病情指数均在50左右，重复间、年度间差异不显著，表明供试黄萎病病田发病均匀，适宜做病圃开展棉花品种（材料）抗病性鉴定（表1）。854-3、854-5在2013—2014年平均病情指数分别为4.23、2.80，最高为6.01，最低为2.02，分别较抗病对照中植棉2号相对病情指数低70.9%、80.7%，较感病对照泗棉3号相对病情指数低 90.9%、94.0%，参照棉花品种抗性划分标准[32]，二者均属于高抗。
2.2转基因棉花的主要农艺性状及经济性状
2.3转基因棉花纤维品质性状
2014年，对854-3、854-5纤维样品进行品质检测，纤维品质性状良好，纤维长度分别为28.78、28.83 mm，比强度分别为27.9、28.4 cN/tex，马克隆值分别为5.67、5.83，伸长率分别为6.3%、6.2%，整齐度分别为85.4%、84.7%（表3）。
2.4PCR、RT-PCR、PCR-Southern blot检测结果
从整齐排列生长一致的株行中，分别随机选择854-3、854-5材料各2株。以叶片基因组DNA为模版，用hpa1Xoo引物进行PCR扩增（图1-A）。将上述PCR产物电泳后，以地高辛标记的hpa1Xoo全长序列为探针，进行PCR Southern blot。以水稻白叶枯菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae）PXO99菌株的DNA为模板进行PCR的产物为阳性对照。PCR Southern blot结果，854-3、854-5阳性对照均在400～500 bp间出现了明显的阳性信号（图1-B）。RT-PCR检测是以随机选择854-3、854-5 2材料各4株的叶片基因组RNA为模版，反转录后，同样以hpa1Xoo引物进行PCR扩增（图2）。分子检测所得到的目的条带单一，测序结果为hpa1Xoo，表明引物特异性很高，并且经多代选育后转入的外源基因hpa1Xoo仍然能够在棉花内转录表达，在世代间稳定遗传。
3讨论
Harpin蛋白在病原菌与植物互作过程中不仅能赋予转基因植物抗病虫性，而且能够激发一些防卫基因的表达[31，33]。如能够诱导植物系统获得抗性[34]，能在多种植物上诱导过敏性细胞死亡[35]，并能够启动水杨酸[36]、茉莉酸/乙烯[37]、脱落酸[38]等信号传导途径。不仅编码Harpin蛋白的基因可以作为外源基因导入，还起到抗病虫、提高品质的作用，而且在植物上的直接施用也能够赋予植物较好的抗病性[19，39]。多年来，人们已经从多种植物病原细菌中克隆得到编码harpin蛋白的hrp基因，并成功将其转入到不同的作物中，使转基因植物获得了抗性，不同程度上提高了农作物的品质，例如将编码harpin蛋白的基因成功转入到烟草[18-21]、马铃薯[22]、苹果[25]、梨[24]、甜菜[18]、小麦[25]、棉花[26]及水稻[15，17，27-29]等植物中，获得的转基因植物都对其主要的病原菌产生了较好的复合抗性。将编码水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）编码harpin蛋白的hpa1Xoo基因转入水稻中，使得转基因水稻获得良好的复合抗性[15，17，27-29]。缪卫国将hpa1Xoo基因导入到棉花Z35中，hpa1Xoo基因的表达可以促进防卫反应，有效降低了棉花黄萎病的发生，培育筛选过程中还发现转hpa1Xoo基因棉花不仅对黄萎病有抗性，而且对枯萎病、立枯病也有很好的抗病性，对棉铃虫、棉蓟马、棉大卷叶螟也有较好的抗虫性[31]，也就是说harpin能够赋予植物多种复合抗性。本试验中笔者选取了江苏科腾种业有限公司提供的棉花材料854，该材料适于长江中下游种植，将hpa1Xoo基因转入854中，经过2008—2014年获得了适于长江中下游种植的棉花材料854-3、854-5，二者兼具高抗黄萎病及良好的农艺性状。
nlc202309021028
近年来，研究选育的棉花品种（材料）多为耐黄萎病品种，少部分为抗黄萎病品种，如冀杂1号黄萎病指数163[40]，冀棉169黄萎病指数12.5[41]，辽棉20号、辽棉25号、中棉91、辽K133黄萎病指数分别为16.3、13.0～18.85、248、20.83[42]等，现今仍缺乏高抗黄萎病的品种（材料）。利用转基因技术培育棉花抗病品种成为目前最经济有效的方法之一。不论采用常规育种还是分子育种技术培育高抗黄萎病的棉花品种，均存在一定的瓶颈，主要体现在一是缺乏高抗黄萎病的抗源，二是棉花对黄萎病菌的抗性遗传特性还存在一些理论和技术性的问题。针对黄萎病的抗性品种育种，时常会发现某一个材料或者品系在独特年份表现出较好的抗病性，但这种抗性不像对枯萎病抗性会具有较好的持久性，在后续种植过程中会发现目标品种对黄萎病的抗性又减弱或者丢失，这是困扰抗黄萎病品种选育的一个较突出的问题。目前，我们获得的854-3、854-5 2个棉花材料的黄萎病指数分别为4.23、2.80，在连续种植的2年中都保持着高抗黄萎病，农艺性状和经济性状优良，有望作为抗黄萎病品种培育过程中的种质或材料。
尽管转基因作物产业化发展速度快前景好，能为社会带来巨大的经济利益，但不可忽视的是转基因作物确实存在一系列潜在的安全问题。转基因作物安全性包括两方面：食品安全性问题和环境安全性问题。为能够安全持久种植利用转基因作物，在转基因作物商品化前要对其可能带来的环境生物安全问题进行严格、充分的科学研究和评价，并进行有效的生物安全监测和管理[43-48]。我们获得的转hpa1Xoo基因棉花均规范种植，设立了隔离带，按照相关规定对转基因品种产业化采取严格谨慎的管理和审批，在尽量消除和降低安全隐患的基础上科学利用转基因技术，以促进整个社会经济的发展。
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转基因棉花 篇6
新疆是我国唯一的海岛棉生产基地,海岛棉(Gossypium barbadense)因其纤维品质优良,是纺织高档和特种棉纺织品的重要原料[1]。棉花枯萎病已成为一种危害严重的世界性病害,严重威胁和阻碍着棉花生产的发展。自20世纪70年代初开展全国性的棉花枯黄萎病综合防治科技攻关以来,特别是抗病品种的选育和应用,我国主要棉区陆地棉的枯萎病危害已基本得到控制。但长绒棉由于长年连作及缺乏抗枯萎病品种,枯萎病的发病面积逐年扩大,危害日益加重。枯萎病已成为影响长绒棉生产可持续发展的一个主要问题[2]。
随着分子生物学的迅速发展,利用基因工程技术培育抗病品种成为解决海岛棉枯萎病的新的途径和方法。cDNA-AFLP技术是一种差异表达基因的鉴定与分离技术,由于重复性好,假阳性低,能够准确反映基因间表达量的差别,可检测低丰度表达的mRNA,可用来分析不同组织在不同条件下基因表达差异,是一种灵敏简单和高通量的方法[3]。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
陆地棉抗枯萎病品种为中棉12号,由石河子大学农学院育种教研室提供。枯萎病菌(Fusarium oxysporum)为7号生理小种的强致病菌,由石河子大学农学院植物保护系提供。
1.1.2 试剂
DEPC(焦磷酸二乙酯)购自Sigma公司;cDNA双链合成试剂盒购自宝生物Takara公司(大连);cDNA-AFLP试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司;其他试剂购自国产分析纯。
1.1.3 仪器
电子分析天平;高速冷冻离心机;数显三用恒温水浴箱;微波炉;超低温冰箱;PCR仪;恒温箱;凝胶成像系统。
1.2 方法
1.2.1 接菌处理
将种子浸泡在3%的双氧水,消毒15min,进行沙培。待幼苗第一片真叶完全展平时转入霍格兰营养液培养[4],幼苗长至三叶期时用浓度为107个孢子/L枯萎病菌处理[5],以未接菌的作对照,分别取棉花新鲜叶片,液氮冷冻后贮于-80℃冰箱,用于RNA的提取。
1.2.2 RNA提取和cDNA合成
RNA的提取采用CTAB法[6],分别用琼脂糖凝胶检测RNA的质量,用分光光度计检测RNA的浓度。cDNA的合成采用宝生物公司Takara双链合成试剂盒的说明方法进行。
1.2.3 cDNA检测
以管家基因UBI为内参,设计引物,用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测合成cDNA的质量(图1)。
1.2.4 cDNA-AFLP分析
采用EcoRⅠ和MseⅠ限制性内切酶对cDNA样品进行双酶切,之后加预扩增接头,制备预扩增模板。为了得到更为理想的结果,对酶切体系及接头连接体系试剂进行浓度梯度优化。将预扩增产物稀释20倍,进行选择性扩增,选择性扩增各选用8个EcoRⅠ和MseⅠ引物,组合成64对选择性扩增引物。将选择性扩增产物用 6%聚丙烯酰胺凝胶电泳,之后银染法显示其差异片段。
1.2.5 差异片段二次扩增及回收
用乙醇灭菌后的刀片,切取差异条带,将条带放入已灭菌1.5ml的离心管,加50μl灭菌蒸馏水,100℃沸煮20min,吸取上清液-20℃保存。取上清液8μl进行PCR扩增,扩增条件同前面相应的选择性扩增条件。扩增产物在1.0%琼脂糖凝胶上电泳,采用DNA纯化回收试剂盒(天根)进行纯化回收。
1.2.6 差异cDNA片段克隆,测序及序列分析
回收的差异cDNA片段与pGEM-T 载体连接后转化大肠杆菌,酶切鉴定筛选阳性克隆。送交北京六合华大基因科技股份有限公司测序。序列分析应用GenBank的BLAST工具分析,通过比较与已知基因的同源程度,推测cDNA片段所代表的基因功能。对于不能检索到的同源基因的片段,可能是本研究新发现的与抗病有关的cDNA片段。
2 结果与分析
2.1 RNA提取及双链cDNA合成
用CTAB法,提取了接菌和未接菌处理的棉花叶片总RNA。经琼脂糖凝胶电泳检测显示,所提取的总RNA完整性很好,28S rRNA的亮度约为18S rRNA的2倍(图2),说明mRNA没降解,经分光光度计测定OD260/OD280=1.80～2.00,OD260/OD280=2.00～2.35,说明RNA无降解,纯度较高。采用TaKaRa公司的cDNA双链合成试剂盒进行合成双链cDNA。
2.2 预扩增和选择性扩增
合成的双链cDNA经EcoRⅠ和MseⅠ限制性内切酶酶切,并连接接头,用预扩增引物对其进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳显示:扩增产物呈弥散带(图3),弥散带分布在400～1 000bp之间,说明酶切充分,预扩增合理,适合选增性扩增。
将预扩增产物稀释15倍后,用64对引物对预扩增产物进行选择性扩增,选择性扩增产物经琼脂糖凝胶电泳(图4),选取条带清晰的产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(图5)。
2.3 差异条带的回收和克隆测序
用64对引物组合扩增,共得到94个差异条带,挑选差异明显的52个进行回收,回收产物进行PCR的二次扩增,获得48个片段。
从48个差异片段中选取选取25个片段进行克隆,并进行酶切鉴定(图6),将阳性克隆送交北京六合华大基因科技股份有限公司测序。
2.4 测序结果进行生物信息比对
在GenBank中进行同源性序列比对,25个差异片段中有24个片段在GenBank数据库中发现同源序列。Blast 结果显示24个ESTs在NCBI中找到较高同源性的序列,其中19个是蛋白功能已知序列,4个ESTs在NCBI中有同源序列但功能未知,1个EST在NCBI中没有同源序列,这个EST可能是新的未知功能基因,有待进一步研究。
3 讨论
棉花枯萎病是棉花生产上危害严重、药剂难于防止的土传病害。实践证明,选育抗病品种是防治棉花枯萎病既经济又有效的途径,而克隆抗病相关基因培育抗源种质又是选育抗病品种的基础[7]。本研究采用cDNA-AFLP差异显示技术分离抗枯萎病相关基因,该技术与其它技术相比较具有所需DNA量少,扩增效率高,多态性强,易于分辨等特点受到广泛的应用,如棉花雄性不育系差异基因的筛选,小麦抗黄矮病基因的验证,水稻白叶枯病感病相关基因的识别等[9,10,11]。
cDNA-AFLP技术需要低频和高频限制性内切酶对cDNA进行酶切,本试验采用EcoRⅠ和MseⅠ分析基因片段的多态性,长度多态性主要来源于cDNA链上酶切位点的增加,消失及被诱导产生新的基因片段。因此,酶切频率的高低是获得基因差异片段的关键,酶切频率过低,会把一些基因差异片段丢失;酶切频率过高,会造成基因片段长度过短,信息量过大,试验步骤繁重,假阳性太多。另外引物的选择很重要,尤其是选择性扩增时所选的引物,不同引物组合扩增的条带不同,并且随机选择的引物碱基决定将来的差异片段[12,13]。
转基因棉花 篇7
关键词：干旱,棉花,转基因,Bt+CPTi基因,脯氨酸,叶绿素
水分是影响作物生长发育最重要的因素之一, 而土壤水分过多过少都会影响作物的产量和品质。目前, 抗旱节水不仅是干旱和半干旱地区的重要问题, 也是湿润地区的重要问题。如何把有限的水资源充分利用已成为节水农业共同关注的问题。为了充分发挥棉花的增产作用和抗旱、节水、抗虫效果, 获得较高的经济效益, 更应注意加强对棉花苗期的管理。而转基因棉花品种在我国已大面积应用于生产并获取巨大成功。这种利用基因工程技术转入棉花的外来基因, 可以在棉花各组织器官中高效表达, 对棉花生理指标产生重要影响[1]。然而, 当前有关干旱对转Bt+CPTi基因棉的研究较少。通过研究干旱对Bt+CPTi转棉花的叶绿素和脯氨酸影响的测定分析, 旨在为转基因棉的大力推广和合理节约用水提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
高光子棉花新品种新研9648及在新研9648导入Bt+CPTi基因的棉花品种SGK36。
1.2 试验设计
2008年4月28日将新研9648、SGK36种植在塑料桶中, 每个塑料桶装沙土40kg, 并分别施入尿素50g、磷酸钙50g、氯化钾20g。土壤相对含水量控制在75%左右, 棉花3叶1心 (出苗后21d) 时进行干旱处理。干旱标准采用土壤相对含水量40%~50%, 对照土壤相对含水量为70%~80%[2], 每个处理种植20桶, 重复3次。
1.3 取样与测定方法
处理开始后, 每14d取样1次, 每株取倒3叶, 放入冰壶中带回实验室待测。取样3次后复水。第4次结果为复水7d后测定。叶绿素含量测定采用分光光度法[3];脯氨酸含量测定用茚三酮显色法[4]。
2 结果与分析
2.1 干旱对叶绿素a的影响
由图1可以看出, 出苗后21d时, SGK36的叶绿素a含量比新研9648略高, 随着生育进程的延续, 新研9648的叶绿素a迅速提高到一个较高的水平。在干旱出现后, SGK36的叶绿素a含量快速下降, 但是随着干旱的持续, 叶绿素a的含量有所恢复。新研9648的叶绿素a的含量因前期基础较低, 而在干旱出现的初期有所提高, 但是随着干旱的持续, 叶绿素a的含量增速迅速下降。2个品种在复水以后, 叶绿素a的含量也恢复到相似的水平。
2.2 干旱对叶绿素b的影响
从图1和图2比较可以看出, 2个品种叶片中叶绿素b的含量均低于叶绿素a的含量。由图2可知, SGK36叶片中的叶绿素b含量同样高于新研9648叶片中的叶绿素含量, 随着生育进程的延续, SGK36叶片中的叶绿素b含量迅速增加。而干旱出现的初期, SGK36和新研9648叶片中的叶绿素b的含量相对稳定, 但是随着干旱时间的延长, 2个品种的叶绿素b的含量均出现明显的降低。
2.3 干旱对叶片脯氨酸的影响
从图3可以看出, 在出苗后21d时SGK36和新研9648叶片中的脯氨酸含量基本一致。在干旱出现以后, 脯氨酸含量逐渐上升, 随着干旱时间的延长, 脯氨酸含量上升到一个较高的水平, 同时SGK36脯氨酸含量略高于新研9648。而在复水以后, 脯氨酸含量迅速降低到一个较低的水平。说明脯氨酸含量随着干旱时间的延长而增大, 且SGK36的抗旱能力与新研9648相似。
3 结论与讨论
良好的环境条件是棉花正常生长发育的保证。阶段性积水与干旱是我国北方棉区经常发生的自然灾害。试验结果表明:在干旱的初期, 2个品种的叶绿素含量均有所降低, 随着干旱时间的延长, 2个品种的叶绿素含量都有所恢复。而脯氨酸含量逐渐上升, 当复水以后迅速降低。说明脯氨酸含量随着干旱时间的延长而增大, 转Bt+CPTi基因的SGK36的抗旱能力与新研9648没有明显的差异。说明棉花转入Bt+CPTi基因后, 对棉花新研9648的抗旱性没有显著的影响。
参考文献
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