转基因鸡（精选9篇）
转基因鸡 篇1
摘要：ADFP基因对脂肪的形成有很重要的作用,表达量变化与脂肪性状有相互关系。本文从生物学功能、调控机制和对脂肪沉积的影响三个方面阐述ADFP基因的研究进展。
关键词：鸡,ADFP,脂肪沉积
脂肪含量不仅可以提高优质鸡鸡肉味道和柔软性,也是评价优质肉鸡肉质品质的关键因素之一。脂肪分化相关蛋白(adipose differentiation- related protein,ADFP)是覆盖在脂滴表面的一种脂肪酸结合蛋白,能够促进对长链脂肪酸的摄取,刺激细胞内脂滴的形成,维持甘油三脂储存量,参与脂质的合成、转移和代谢,从而影响动物机体内脂肪的沉积。Jiang等从小鼠脂肪细胞的c DNA中首次分离出ADFP m RNA序列。Magnusson等对ADFP基因定量研究发现,鼠肝细胞中ADFP基因的表达量对甘油三酯的沉积有很重要的影响。也有研究发现该基因表达量变化与人类多种疾病显著相关,如2- 型糖尿病(2-DM)、动脉粥样硬化等。鸡ADFP基因位于Z染色体上,现有序列为7775 bp,包含8个外显子和7个内含子,共编码438个氨基酸。目前,关于ADFP的研究多集中在人和哺乳动物上。鉴于此,本文对ADFP基因生物学功能、 调控机制和对脂肪沉积的影响及近年来国内外的研究动态阐述如下。
1 ADFP的生物学功能
1.1刺激脂质的聚集和脂滴的形成
ADFP是形成细胞内脂滴的主要成分,也是脂肪细胞内脂质沉积的重要标志之一。脂肪细胞未分化时ADFP基因表达量很低,开始分化后其表达量迅速增加。有研究表明,绿色荧光蛋白-ADFP过度表达时主要以环状蛋白形式存在于脂滴表面,如果将其导入小鼠的纤维原细胞后,可以检测到甘油三酯含量在这些细胞中显著增加,并观察到细胞内脂滴数目增多,伴随细胞体积增大。
1.2参与脂质转移和代谢
Schultz研究表明,ADFP m RNA及其表达产物随鼠生长发育能够促进甘油三酯在鼠肺组织中大量沉积。ADFP基因在分离后的脂成纤维细胞中的表达量高于EPII细胞中,而当把这两种细胞共同培养时,发现EPII细胞中ADFP基因的表达显著增高,说明该细胞能够从脂成纤维细胞获取脂质,从而引起ADFP基因表达量增加,提示ADFP参与了细胞之间脂质的转移。
Larigauderie等研究表明,巨噬细胞中的低密度脂蛋白在修饰后能够刺激Adipophilin表达,进一步促进甘油三酯和胆固醇沉积,减少它们的流失。巨噬细胞中的ADFP在脂质代谢的过程中可能通过蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)途径发挥重要的调节作用。
1.3促进长链脂肪酸的摄取和维持甘油三脂的储量
ADFP是一种广泛表达的脂肪分化相关蛋白,能够提高对长链脂肪酸的吸收效率。同时,脂肪酸也能够在转录水平刺激ADFP基因表达。其中,饱和或不饱和的长链脂肪酸均能刺激ADFP基因的表达,而短链脂肪酸如己酸盐不能刺激ADFP基因的表达。因此,脂肪酸饱和程度不会影响ADFP基因的表达。研究发现,依据注射长链脂肪酸的剂量及其作用时间来刺激ADFP m RNA与其产物在前脂肪细胞中表达,而放射菌素D又能完全抑制这种作用。由于脂肪酸能够提高ADFP基因表达产物的稳定性,因此其在脂肪酸的刺激下比ADFP m RNA表达更明显,所需时间更长。同时也有研究证实细胞内的ADFP和甘油三酯能够相互调控。
Chang等研究发现剔除鼠ADFP基因以后,脂肪组织分化和脂解没有发生改变,肝甘油三酯的储量减少了60%,并对食物诱导的脂肪肝产生抗性。
2 ADFP的调控机制
过氧化物酶体增殖激活物受体(peroxisome proliferator activated receptors PPARs) 家族可调控ADRP基因的表达, 配体与PPARs结合并使之激活后,入核可与基因上的PPAR的反应元件(PPAR response element PPRE)结合从而调控基因的转录水平。Edvardsson等研究发现,PPAR激动剂在体外或体内均可调节ADFP m RNA的表达水平,使用PPARa激动剂的小鼠,发现ADFP基因表达量明显上升,对PPARa基因敲除小鼠的ADFP基因表达量无影响,说明PPARa可以调节ADFP基因的表达。Kotokorpi等研究发现,在肝脏中肝X受体(Liver X receptor,LXR)显著提高ADFP基因表达量,说明LXR能够调控ADFP基因表达水平。因此,ADFP基因在转录水平的调控方式较为复杂。此外,环氧化酶抑制物、 长链脂肪酸和药物的诱导均可调节ADFP m RNA的表达水平。
在脂肪细胞分化的前期,ADRP基因的表达量很高,分化后3~5d,尽管其m RNA表达仍在持续上升,但其蛋白水平急速降低,提示ADRP蛋白表达受转录后水平的调节。Xu等研究发现,用油酸培育的仓鼠卵巢纤维细胞内ADFP蛋白积累明显增多,并同时伴有脂滴的聚集。而去除油酸后继续培养,蛋白积累显著减少。Dalen等发现小鼠肝脏中PPARa激动剂可显著上调ADRP基因的m RNA水平,对ADRP的蛋白水平影响不大,推测只有细胞内脂滴增加时ADRP的蛋白才会随之增加。说明ADRP的存在具有脂稳定性,转录后调节对其表达起到关键作用。Tomaru等研究发现蛋白酶体的活性会随着年龄的增加而下降,一些与衰老相关的代谢疾病很有可能与蛋白酶体活性逐渐下降有密切关系。因此,研究ADFP基因的表达调控机制对深入理解机体内脂肪积累的调节方式以及许多脂代谢相关疾病的产生和发病机理具有重要的理论意义。
3 ADFP对脂肪沉积的影响
ADFP基因最初是从鼠脂肪细胞中分离出。Brasaemle等在鼠肺、肝、睾丸、脾、脑、心、骨骼肌和肾等组织中检侧到ADFP m RNA的表达。腹脂、皮脂组织主要是由脂肪细胞组成,肌内脂肪随肌纤维组织的成熟而逐渐沉积于肌束间,因此,ADFP基因在胸肌和脂肪等组织中的表达量变化,能够体现该基因在脂肪细胞中的表达量变化。Prats等研究发现, 脂肪分化相关蛋白与骨骼肌肌内甘油三酯的水解紧密相关,对脂质代谢具有重要作用。赵小玲等对优质肉鸡的研究发现,ADFP基因第3内含子和第7外显子内的单核苷酸变异对腹脂重、腹脂率和肌内脂肪含量有显著影响,可以利用c.A4079T和c.A7070G 2个SNP位对鸡腹脂重、腹脂率和肌内脂肪含量进行标记辅助选择。ADFP基因可能是影响鸡的脂肪性状的主效基因或与主效基因连锁。赵小玲等研究发现,四川山地乌骨鸡ADFP基因表达量在28d时腹脂和肝脏中的表达量显著高于胸肌(P<0.05);在42d时胸肌中的表达量显著高于皮脂(P<0.05);在84d时胸肌中的表达量显著高于肝脏中的(P<0.05)。腹脂中ADFP基因的相对表达量的变化与活重和冠重性状的变化显著相关(P<0. 05),胸肌中ADFP基因的相对表达量发育性的变化与肌内脂肪含量的变化显著相关(P<0.05),说明ADFP基因表达量与鸡脂肪组织,尤其是肌内脂肪含量的发育紧密相关。 ADFP基因可能在鸡脂肪性状形成的过程中发挥重要的调控作用。
4小结
肌内脂肪是评价肉质的一个重要影响因素,脂肪沉积的速度对肌内脂肪的形成有很大的影响,脂肪沉积速度慢会导致肌内脂肪含量减少,而脂肪沉积速度过快又会引起脂肪的过度沉积,即影响口感,又产生浪费。因此,发掘那些有价值的分子遗传标记用于育种愈来愈迫切。ADFP是脂肪细胞分化和脂质蓄积的标志物, 对促进细胞内脂质形成发挥着重要的作用。因此,研究鸡体脂肪形成与调控的遗传机理,对控制脂肪沉积,开展优质鸡的育种和生产有重要意义。目前在ADFP基因的研究中,碱基突变和m RNA表达量变化都对脂肪沉积有显著影响。但在不同品种中的研究报道很少,下一步要开展更大范围的研究,找到不同品种中ADFP基因对脂肪沉积的影响,在生产实践中提供切实可行的理论依据,创造更大的经济效益。
转基因鸡 篇2
鸡新城疫病毒HeB02分离株F基因的克隆及其DNA疫苗的研究
根据GenBank报道的鸡新城疫病毒F基因序列设计了一对引物,以鸡新城疫病毒HeB02分离株基因组为模板,通过RT-PCR扩增出了1.66kb左右的F基因片段,序列分析表明HeB02株F基因与国内标准强毒株F48 E9及弱毒疫苗La Sota和Clone30的F基因核苷酸序列的同源性分别为88.1%、84.9%和83.8%.将HeB02株F基因插入真核表达载体pVAX1中,构建了真核表达质粒pSV-F,通过脂质体转染COS-7细胞,SDS-PAGE分析可见表达的特异蛋白条带;Western blot、ELISA和中和试验检测结果表明:真核表达的.蛋白与抗新城疫病毒的抗体发生特异性反应,说明F蛋白具有很好的免疫原性.采用活体电击法以真核表达质粒pSV-F免疫3周龄SPF鸡,剂量为50μg/只,3周后加强免疫1次,5周后以100倍鸡胚感染剂量(EID)的F基因同源病毒对所有鸡进行攻毒,攻毒前后每周分别以喉拭子进行病毒分离和HI效价测定.结果显示对照组在攻毒前一直没有检测到抗体效价,攻毒后检测效价为3.0 log2±1.40,并且于攻毒后第9天全部死亡;活疫苗组和实验组免疫后第2周检测到抗体效价,第5周最高,HI效价分别为8.3 1og2±1.30和7.2log2±1.23,攻毒1周后HI效价分别达9.8log2±1.55和8.9log2±1.77,极显著高于对照组(P<0.01).免疫组未分离到新城疫病毒,对照组全部分离到新城疫病毒.表明所构建的F基因真核表达质粒可作为候选基因疫苗诱导鸡产生免疫保护反应.
作 者：李楠 孙一敏 赵宝华 LI Nan SUN Yi-Min ZHAO Bao-Hua 作者单位：河北师范大学生命科学学院,石家庄,050016刊 名：生物工程学报 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY年，卷(期)：200622(3)分类号：Q785关键词：新城疫病毒 F基因 克隆和表达 DNA疫苗
转基因鸡 篇3
关键词：DNA池；GH基因；胫骨长度；SNPs；高脚鸡；矮脚鸡；百宜黑鸡
中图分类号：S831.2文献标志码：A文章编号：1002-1302（2015）11-0038-04
收稿日期：2014-11-03
基金项目：贵州省科技计划（编号：黔合科NZ字[2012]3007号）；贵州省农业动植物育种专项（编号：黔农育专字[2012]10号）；浙江大学基本科研业务费专项资金（编号：2012XZZX003-1）。
作者简介：杨红（1990—），女，硕士研究生，研究方向为动物遗传育种与种质资源创新。Email：15085933126@139.com。
通信作者：王芳芳，女，高级畜牧师，主要从事家禽遗传育种及饲养管理工作。E-mail：1587676665@qq.com。贵州省地形复杂、地貌特殊，具有丰富的地方鸡种资源，其中包括竹乡鸡、威宁鸡、黔东南小香鸡、高脚鸡、矮脚鸡、百宜黑鸡等。高脚鸡、矮脚鸡、百宜黑鸡均为贵州省特有的地方鸡种，在体型外貌尤其是胫骨长度上存在较大差异。高脚鸡是贵州省特有的地方品种，1982年录入《贵州省畜禽品种志》，2006年录入《中国畜禽资源名录》，其胫骨比其他品种鸡长3～4 cm，公鸡平均胫长13.62 cm、母鸡平均胫长 10.92 cm[1]。矮脚鸡分布于贵州省黔西南州兴义市，其胫长较普通鸡短，公鸡平均胫长6.5 cm、母鸡平均胫长5.9 cm[2]，1993年录入《贵州省畜禽品种志》。百宜黑鸡为贵州优质地方鸡种，主产地为贵阳市乌当区百宜乡[3]，其胫骨长度介于高脚鸡和矮脚之间。
鸡生长激素（chiken growth hormone，cGH）是由垂体前叶合成和分泌的一种多肽类激素，由191个氨基酸组成。研究报道称该激素在鸡生长发育、骨骼生长、脂肪沉积、饲料转化及产蛋等方面具有调节作用[4]。该基因位于1号染色体，全长近4 kb，由5个外显子和4个内含子组成，且内含子远大于外显子[5-6]。国内外学者相继发现GH基因的多态位点对鸡各类生长性状有特定影响[7-10]。对于贵州省境内部分鸡种的GH基因已有相关研究，如朱丽莉等对兴义矮脚鸡GH基因的多态性研究中发现该鸡种在第一内含子区域存在较多变异[11]。黄波等在对贵州小香鸡GH基因研究中，对GH基因2～3外显子区域SNP位点进行了检测并开展了相关性分析[12]。本试验选择胫骨长度差异较大的高脚鸡、矮脚鸡、百宜黑鸡作为对象，研究GH基因的多态性，并进行生物信息学分析，旨在检测GH基因在不同胫长性状鸡种中的差异，以期探究GH基因多态性与胫骨生长发育的关系，为进一步研究影响胫骨发育机制的功能基因奠定工作基础。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1试验动物高脚鸡92个血样采自贵州省安顺市普定县，矮脚鸡99个血样采自贵州省黔西南州兴义市兴牧畜禽水产科技服务中心矮脚鸡养殖场，百宜黑鸡69个血样采自其中心产区贵州省贵阳市百宜乡。每羽鸡翅下静脉采血2～3 mL于真空采血管中，肝素钠抗凝，-20 ℃保存。
1.1.2主要试剂血液基因组DNA提取试剂盒、2×Taq Master Mix、核酸染料、DL2000 DNA Marker 等试剂均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。实验室自备试剂为去离子水、无水乙醇、TAE缓冲液等。
1.2试验方法
1.2.1DNA提取、检测及构建DNA池运用上海生工生物工程技术服务有限公司血液基因组DNA提取试剂盒提取DNA，用含核酸染料的1%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度，凝胶成像系统照相保存，并用紫外分光光度计测量DNA样品浓度，每个样品测量3次，取平均值。用ddH2O将所有DNA样品调至100 ng/μL，各取10 μL构建品种DNA池[13]，-20 ℃保存备用。
1.2.2引物设计与PCR扩增参照GenBank（登录号为 NC_006114.3）提供的鸡GH基因序列，运用 Primer Premier 6.0 和 Oligo 6.0 设计引物，委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列及扩增条件如表1。
2结果与分析
2.1DNA提取结果
将提取的DNA用含核酸染料的1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果见图1。由图1可见，DNA条带集中，整齐明亮无拖尾，可用于下一步试验。
2.2PCR产物检测结果
PCR产物用含核酸染料的1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2：所检测片段与预期片段大小相符，条带清晰、整齐无拖尾，PCR产物特异性较好，可用于进一步测序分析。
2.3序列分析
在所扩增的序列中共发现6个SNPs 位点：第2内含子A1133G、G1166A，第4外显子C2027G、C2030T，第4内含子G2152A，第5外显子G3347A，3′非编码区T3416C、 C3436T（图3）。
nlc202309021028
2.4等位基因频率估算
从表2可见，3个鸡种在A1133G、G1166A、C2027G、G2152A、C3436T这5个SNPs位点上基因频率存在较大差异。
2.5GH基因所有外显子RNA二级结构预测结果
采用在线软件 RNAfold web server分别对在GH基因外显子中的3个 SNPs 位点 mRNA进行预测，结果见图4。
3讨论
鸡胫骨为全身长骨之一，其生长过程受到多种激素及细胞因子调控，且存在不同的信号通路。GH基因是调控禽类整个机体的重要激素，具有加快肌肉和骨骼生长、促进生长发育及提高饲料报酬的作用[15-17]，也有研究报道称GH基因可促进鸡长骨和软骨的发育[18]。朱丽莉等对贵州个体较小的矮脚鸡、小香鸡的GH基因进行了多态性分析，发现较多变异位点，通过关联性分析得到该基因对体斜长、胫长、胫围等生长性状有一定的影响[11-12]。
本研究对胫长差异较大的高脚鸡、矮脚鸡和百宜黑鸡的GH基因所有外显子和部分内含子进行了单核苷酸多态性检测，发现了8个可能与胫长性状相关的SNPs位点，分别为A1133G、G1166A、C2027G、C2030T、G2152A、G3347A、T3416C、C3436T。其中C2027G、C2030T等2个SNPs位点位于第4外显子区，G3347A位于第5外显子区，3个位于外显子区域的SNP位点均为同义突变。
各SNPs位点分析发现，在第2内含子区A1133G处，只有高脚鸡发生了突变，矮脚鸡与百宜黑鸡均未发生突变；第4内含子G2152A处，高脚鸡的优势碱基为G，矮脚鸡与百宜黑鸡的优势碱基则为A；3′非编码区C3436T处，高脚鸡未发现SNPs位点，而矮脚鸡、百宜黑鸡却存在突变。这表明高脚鸡在A1133G、G2152A、C3436T这3个SNPs位点上与其他2个鸡种存在较大差异，推测这2个SNPs位点可能对高脚鸡胫骨长度有较大影响。在G1166A、C2027G位点处，矮脚鸡发生突变的基因频率与高脚鸡和百宜黑鸡差异较大，推测这2个SNPs位点可能与矮脚鸡胫骨较短存在相关性。同时，在C2027G位点处，这3个贵州地方鸡种的优势碱基均为G，而GenBank（登录号为NC_006114.3）中所报道的则为C，这可能是贵州地方鸡种的一个共同特征，同时也是贵州地方鸡种与其他鸡种之间所存在的普遍差异。
真核生物的基因一般由若干个外显子和内含子组成，为断裂基因，外显子的功能是构成编码区编码功能蛋白，编码区内核苷酸的变异可能导致基因mRNA二级结构改变，进而导致蛋白质结构改变而影响其生物功能[15]。本研究中所检测出的3个SNPs位点均未引起所编码氨基酸改变，为同义突变。运用生物信息学软件进行进一步分析发现，所检测到的3个SNPs位点均导致了GH基因mRNA二级结构改变，使其最小自由能发生变化，从而影响mRNA二级结构稳定性。当C2027G发生C→G突变后，GH基因mRNA二级结构最小自由能增加了167.894 kJ/mol，其稳定性减弱；当C2030T发生C→T突变后，GH基因mRNA二级结构最小自由能减少了2.51 kJ/mol，其结构稳定性增加；当G3347A发生G→T突变后，GH基因mRNA二级结构最小自由能增加了7.093 kJ/mol，其结构稳定性减弱。GH基因突变与鸡胫骨长度的关系及其引起的mRNA二级结构变化所发生的生物学意义将在后续试验中进一步加以研究。
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鸡贫血病毒全长基因串联体的构建 篇4
我国关于CAV生物学特性及基因工程疫苗方面的研究很少, 本研究采用分子克隆技术成功获得CAV全长基因串联体, 为后续感染性分子克隆的构建奠定了基础, 也为进一步研究CAV生物学特性和研制CAV基因工程疫苗提供了依据。
1 材料与方法
1.1 材料
CAV Cux-1鸡胚组织毒株, 由德国罗曼公司提供。
PrimeSTARTMHS DNA Polymerase、dNTP Mixture、5×PS Buffer、Kpn Ⅰ、Nco Ⅰ, 购自宝生物工程 (大连) 有限公司; DNA Marker, 购自天根生化科技 (北京) 有限公司;Biospin 组织基因组DNA提取试剂盒、核酸凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒, 购自博日科技有限公司; pBluescript Ⅱ SK (+) 载体, 购自北京普京康生物科技有限公司;大肠杆菌DH5α感受态细胞, 由天津市动物疫病预防控制中心实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 引物的设计与合成
根据GenBank上已发表的CAV Cux-1株序列设计1对引物, 序列为上游引物P1 5′-GCTGGTACCGCTCGGCACGGAGAC-3 ′, 下游引物P2 5 ′-AGGGGTACCAGCGTGTGCCATCTC-3 ′, 引物中下划线部分为 KpnⅠ酶切位点。引物由金思特科技 (南京) 有限公司合成。
1.2.2 DNA的提取
参照Biospin 组织基因组DNA提取试剂盒说明书进行。
1.2.3 PCR扩增
PCR扩增体系 (25 μL) :5×PS Buffer 5 μL, dNTP Mixture (2.5 mmol/L) 2 μL, PrimeSTARTMHS DNA Polymerase (2.5 U/μL) 0.25 μL, 模板DNA 2 μL, 上、下游引物各1 μL, MgCl2 (25 mmol/L) 0.8 μL, 再用灭菌去离子水补至 25 μL。PCR反应条件:94 ℃ 5 min;98 ℃ 10 s, 70 ℃ 210 s, 共30个循环;72 ℃ 10 min。反应结束后用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
1.2.4 PCR产物的回收
参照核酸凝胶回收试剂盒说明书回收PCR 产物。
1.2.5 CAV全长基因组DNA分子克隆的构建
用Kpn Ⅰ酶切PCR回收产物和pBluescript Ⅱ SK (+) 载体;37 ℃消化4 h, 经1.0%琼脂糖凝胶电泳后用DNA片段快速胶回收试剂盒回收酶切产物;然后将酶切、回收后的pBluescript Ⅱ SK (+) 载体用碱性磷酸酶处理, 去磷酸化;用处理后的PCR产物与处理后的pBluescript Ⅱ SK (+) 载体建立10 μL的连接体系连接过夜;转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞, 菌液涂布于Amp/LB/X-Gal/IPTG平板上, 37 ℃培养过夜, 用蓝白斑筛选重组转化体;用质粒提取试剂盒提取转化的质粒, -20 ℃保存, 备用;分析用Kpn Ⅰ酶切、提取的质粒, 检查是否插入目的片段;取酶切鉴定正确的阳性重组质粒 (命名为重组质粒PskCAV) 进行测序鉴定。
1.2.6 CAV全长基因组DNA分子克隆的鉴定
(1) PCR鉴定。
用1.2.1中设计的引物对重组质粒PskCAV进行鉴定, PCR 扩增体系及反应条件同1.2.3。
(2) 酶切鉴定。
用Kpn Ⅰ酶对重组质粒PskCAV进行酶切。
(3) 序列鉴定。
对经PCR及酶切鉴定正确的阳性重组质粒PskCAV进行测序鉴定, 序列测定由天根生化科技 (北京) 有限公司完成。
1.2.7 CAV全长基因串联体的构建与鉴定
提取鉴定为阳性的重组质粒PskCAV, 通过改变KpnⅠ酶的作用浓度及反应时间来摸索最佳的不完全酶切条件;对阳性重组质粒PskCAV进行不完全酶切, 回收、纯化不完全酶切产物;去磷酸化处理后与 1.2.4中处理的基因组进行连接, 转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞;挑取单个菌落培养, 提取质粒 (命名为Psk2CAV) 进行Nco Ⅰ酶切鉴定, 同时进行测序, 进一步证实2个基因组是否顺向连入载体。
2 结果与分析
2.1 CAV全长基因组PCR扩增
通过PCR可在鸡胚组织中扩增到长约2 300 bp的片段, 与预期片段大小相符, 见图1。
2.2 DNA分子克隆的鉴定
重组质粒PskCAV经PCR扩增后可获得长为2 300 bp左右的片段, 与预期片段大小相符, 见图2。对重组质粒PskCAV进行酶切后也获得和预期大小一致的长为2 300 bp左右的片段, 见图3。序列测定也证明已成功构建出CAV全长基因组的分子克隆。
1.CAV Cux-1 基因组; 2.阴性对照; 3.DL- 23 000 Marker。
1.重组质粒PskCAV; 2.DL –23 000 Marker。
1.DL –23 000 Marker; 2.重组质粒PskCAV/Kpn Ⅰ。
2.3 CAV全长基因串联体的构建与鉴定
通过调整KpnⅠ酶的浓度及作用时间摸索到了KpnⅠ酶的最佳不完全酶切条件;然后进行酶切、回收, 获得大小为5 200 bp的片段, 回收后进行去磷酸化处理, 与长为2 300 bp的基因组进行连接、转化;然后对提取质粒进行NcoⅠ酶切鉴定, 结果证实2个基因组已顺向连入载体中 (见图4) , 表明质粒构建成功。为进一步证实2个基因组是否为顺向连入载体, 对重组质粒Psk2CAV进行测序鉴定, 测序结果也证实2条目的基因顺向连入载体。
1.DL-15 000 Marker; 2.重组质粒Psk2CAV/Nco Ⅰ。
3 讨论
Fenaux M等[3]首次报道了将猪圆环病毒Ⅱ型 (PCV2) 的双拷贝基因组顺向连入载体pBluescript中, 在体外证实其有感染性以后将其直接接种猪体, 可以产生与PCV2感染相似的病理变化。考虑到CAV与PCV基因组结构存在一定的相似性, 基因组都较小, 以2个基因组串联的方式构建感染性克隆易于操作, 受其他因素影响小, 因此本研究也采取将2个基因组顺向连入一个载体的策略来构建CAV串联体。为了证实2个基因是否顺向连入载体, 研究利用CAV基因组内存在单一的位点, 对重组质粒Psk2CAV进行NcoⅠ酶切鉴定, 由于NcoⅠ酶切位点位于基因组2 129 bp处, 而引入的分子标签KpnⅠ位于1 899 bp处。因此, 若经NcoⅠ酶切后得到2条大小分别为3 400, 4 200 bp的片段, 则证实2个基因组反向连入载体中;若经NcoⅠ酶切后得到2条大小约为2 300, 5 200 bp的片段, 则证实2个基因组顺向连入载体中。在本研究中, NcoⅠ酶切鉴定结果证实2个基因组顺向连入载体, 基因串联体构建成功。
自1979年首次发现CAV以来, 便因其对鸡群引起的重大损失而受到研究者的关注。CAV的主要致病机理是通过CAV编码产生的细胞凋亡因子造成造血细胞和淋巴细胞的程序性死亡 [4], 进而引起感染鸡贫血、出血及免疫抑制。CAV野毒感染几乎不引起典型的临床症状, 但由于其免疫抑制作用感染鸡群易并发或继发其他疾病, 严重影响着养禽业的经济效益[5], 至今仍没有理想的预防CAV感染的方法。国外学者将CAV基因组双拷贝串连在一起克隆进载体质粒, 用所得到的重组质粒转染MDCC-MSB1细胞后可产生传染性的CAV[6]。这就有可能用基因工程的方法构建出能在体内复制的无致病性CAV毒株。为了尝试构建这样的毒株并用作疫苗株, 研究用PCR技术扩增CAV全基因组DNA, 并克隆到pBluescript Ⅱ SK (+) 载体上, 获得全长基因组DNA分子克隆, 再将2个全长基因连接, 成功获得CAV全长基因串联体, 为后续感染性分子克隆的构建奠定了基础, 也为研制基因工程疫苗提供了依据。
参考文献
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转基因鸡 篇5
关键词：肌苷酸,肉质风味,基因,含量,鸡,综述
我国拥有丰富的地方鸡品种资源,与国外培育的一些专门化鸡种相比,我国地方鸡具有广泛的遗传多样性,具有高度适应性,抗逆性强,肉质好等特点。在过去,对肉鸡的选育主要集中在生长性能的提高上,由于具有较高的遗传力,因此肌肉和腹部脂肪产量得到很大的提高,但口感却呈下降趋势。随着生活水平的提高,对肉鸡风味和鲜香味的要求也越来越高,为此研究者对肌肉的风味物质进行大量研究,结果表明,肌苷酸(Inosine monophosphate acide,IMP)是影响鲜味与香味肉质风味的重要物质,其含量因鸡的品种、性别、部位及日龄不同而存在差异,肌肉IMP的含量与遗传因素相关。因此,本文综合近年国内外的研究报道,对影响地方鸡肌肉的IMP含量的候选基因概况加以综述。
1 腺苷琥珀酸裂解酶基因
腺苷琥珀酸裂解酶(Adenylosuccinate lyase,ADSL)于1984年被首次发现[1],是IMP合成酶系中催化嘌呤核苷酸起始合成与提供嘌呤核苷酸循环中间产物的双功能酶[2,3]。刘长青等[4]对山东的4个地方鸡种(寿光鸡、济宁百日鸡、莱芜黑鸡和琅琊鸡)为研究对象,发现在ADSL基因c DNA全序列共出现17处碱基有差异,其中8处为错义突变,为后续ADSL可能作为鸡肉质风味性状候选基因奠定了基础。张学余等[5]对4个地方品种(丝羽乌骨鸡、萧山鸡、白耳鸡、藏鸡)和一个国外品种(隐性白羽鸡)IMP含量分析表明,藏鸡、丝羽乌骨鸡肌肉中IMP含量最高,白耳鸡稍低,萧山鸡、隐性白羽鸡最低。对ADSL基因外显子9进行多态性分析发现处C9839A的错义突变,AA、AC和CC,3种基因型频率分布与品种有关,但对基因型和IMP含量进行关联分析发现,该位点的多态性与胸肌的IMP含量之间并未存在显著的相关性。韩威等[6]采用PCR-SSCP方法分析白耳鸡ADSL外显子2区域存在C3484T突变位点,TT为有利基因型,TT基因型个体的IMP含量显著高于CC型和CT型个体。
龚琳琳在3个地方鸡品种(如皋鸡、安卡鸡、文昌鸡和)和隐性白羽肉鸡ADSL基因2号外显子上检测到g.3713G>A和g.3797C>T的同义突变[7],在9号外显子上检测到g.10191C>T的同义突变,其中9号外显子的多态位点上检测出显著的基因型效应,BB型个体胸肌IMP含量分别较AA型与AB型低1.149mg/g和1.181mg/g,且差异极显著;AB型个体IMP含量稍高于AA型,但二者之间差异不显著。
Zhang等[8]以伊莎B系蛋鸡和广西黄鸡为研究对象发现,广西黄鸡的IMP含量高于伊莎B系蛋鸡,检测ADSL基因发现第2外显子有C3484T的突变,且2个鸡种均表现为CC型的IMP最高,TT型的IMP最低。
石浩[9]对米易鸡ADSL基因发现在外显子2(A3713G、C3797T)和外显子9(C10191T)处共出现3个SNP位点,其中第9外显子的SNP位点与IMP含量存在显著相关性,CT型个体的胸肌IMP含量高于CC型个体。
2 腺苷-磷酸脱氨酶基因
腺苷-磷酸脱氨酶(Adenosine monophosphate deaminase,AMPD)家族包括3个成员:AMPD1、AMPD2和AMPD3,其核苷酸序列和氨基酸序列都有一定的保守性,AMPD1酶的功能是催化AMP脱氧生成IMP,从而影响肉质风味。AMP-DA1是该家族中研究最多的肉质候选基因。柴丽娟[10]采用PCR-RF-SSCP技术对5个地方鸡种(泰和乌骨鸡、北京油鸡、崇仁麻鸡、鹿苑鸡和霞烟鸡)AMPD1基因研究发现,AMPD1有3个等位基因,共产生6种基因型,除泰和乌骨鸡外,B等位基因为几个地方鸡种的优势基因,AMPD1基因不同基因型与IMP含量的关系因品种而异。罗桂芬等[11]采用PCR-SSCP技术,以两个地方品种(北京油鸡、三黄胡须鸡)和两个国外品种(隐性白羽肉鸡、白来航蛋鸡)鸡为试验对象,对AMPD1基因进行SNPs检测和基因类型判别,结果表明:除三黄胡须鸡和隐性白羽肉鸡、北京油鸡和白来航鸡间差异不显著(P>0.05)外,其他各品种间差异极显著(P<0.01)。IMP含量在3种基因型间差异显著(P<0.05),初步推断AMPD1可能为影响鸡肉中IMP生成的主效基因或与主效基因相连锁。
于平[12]以快大青麻鸡和灵山土鸡为研究对象,对AM-PD1基因的5’侧翼远端调控序列和15个外显子序列进行SNPs全面筛选,发现有10个SNPs在两个鸡种中都存在,其中外显子8中的T6751C为错义突变,分别分析3个多态性位点的不同基因型与IMP含量的关系,虽然某些基因型的IMP含量高于另外的基因型IMP含量,但是均未表现出显著差异。对于AMPD1的研究,应结合更大的群体规模和更全面的品种,来寻求与IMP含量紧密连锁的遗传标记,以便应用于标记辅助选择中。
3 GARS-AIRS-GART基因
鸡GARS-AIRS-GART基因编码IMP合成过程中的3种酶,即甘氨酰胺核苷酸合成酶(Glycinamide ribonucleotide synthetase,GARS)、5-氨基咪唑核苷酸合成酶(Aminoimidazole ribonucleotide synthetase,AIRS)和甘氨酰胺核苷酸转甲基酶(Glycinamide ribonucleotide formyltransferase,GART)全长30kb,包括21个外显子,位于1号染色体上。韩威等[6]采用PCR-SSCP方法分析白耳鸡GARS-AIRS-GART基因5'侧翼区存在C-179T突变位点,TT基因型个体的IMP含量显著高于CC型个体。
龚琳琳[7]3个地方鸡品种(如皋鸡、安卡鸡、文昌鸡和)和隐性白羽肉鸡GARS-AIRS-GART基因3、4和21号外显子经10%聚丙稀酰胺凝胶电泳检测3号和4号外显子没有检测到多态,21号外显子检测到4个多态:g.29943G>A、g.29968C>T、g.30011T>C、g.30017C>T,其中3处为错义突变,共得到11种基因型,AE型个体胸肌IMP含量比其他基因型的IMP含量都低,均达到了极显著水平(P<0.01),其他基因型之间IMP含量差异均不显著。
张增荣[13]以大恒优质肉鸡品系为研究对象,发现GARS-AIRS-GART基因外显子4有1个SNP位点位于6545处(A→C突变)的错义突变,该位点对鲜味氨基酸含量和IMP含量有显著影响,NN型表现为高IMP含量,HN型个体表现为高鲜味氨基酸含量。
4 PURH基因
氨基咪唑氨甲酰核苷酸转甲酰基酶/次黄嘌呤核苷酸环水解酶基因(PURH)为影响肌肉IMP含量的候选基因,其具有氨基咪唑氨甲酰核苷酸转甲酰基酶(EC2.1.2.3)和次黄嘌呤核苷酸环水解酶(EC3.5.4.10)催化活力的双功能酶,对IMP的合成具有十分关键的调控作用[14]。
而已有的研究表明,这两种蛋白油PURH基因编码。束婧婷等研究发现,PURH可能是影响IMP含量的主效基因或其连锁基因,以单倍型用作鸡肉质性状分子标记具有一定优势,而且做鸡不同生长阶段和组织都能检测到PURH的表达,其影响了IMP在肌肉中的沉积[15]。
郭俣等利用SMART技术构建北京油鸡肝脏全长c DNA文库[16]。通过pur H基因保守引物对该文库进行筛选,将克隆的pur H基因(Gen Bank登录号:EU334506)导入鸡体外培养的细胞中,转染后发现pur H基因表达分布于细胞质和细胞核中。
5 GPAT基因
谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶(Glutamine phosphoribosyl pyrophosphate amidotransferase,GPAT)是一种限速酶。张学余等以白耳鸡为试验材料,采用PCR-SSCP和测序相结合的方法,GPAT基因均对白耳鸡胸肌IMP含量的差异产生影响,均与鸡肌肉IMP含量存在显著关联(P<0.05),这3个位点可作为影响鸡的肉质风味性状进行标记辅助选择的分子标记。余春林等采用实时荧光定量PCR技术对肉鸡不同品系和生长阶段的GPAT基因表达水平进行检测[17],并对GPAT基因的表达量与IMP沉积量的相关性进行研究,发现其与IMP含量呈极显著正相关(P<0.01)。
6 小结
转基因鸡 篇6
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
鸡胚成纤维细胞传代细胞系DF-1购自中国科学院细胞库;DH5α感受态细胞由笔者实验室保存。
1.1.2 试剂
Trizol Reagent、克隆载体p CR2.1、T4 DNA连接酶购自Invitrogen公司;质粒小量提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自Axy Gen公司;c DNA第一链合成试剂盒、DNA高保真聚合酶、限制性内切酶EcoRⅠ、DNA marker购自Thermo Fisher公司;DMEM高糖培养基、胎牛血清购自Gibco公司;其它试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 鸡importinβ1基因的克隆
根据Gen Bank中登录的鸡importinβ1基因序列(XM_015299473),利用Primer Premier 5.0软件设计合成扩增鸡importinβ1基因CDS区的特异性引物,上游引物imβ-F:5'–AGGGATCCATGAAC-CAATGGCCTGAGC-3',下游引物imβ-R:5'–CCCGATCTCGAGAGATCAAGCTTGATTCTTCAG-3',预期扩增片段大小为2 268 bp。引物由上海Invitrogen公司合成。
按照Trizol试剂说明书从DF-1细胞中提取总RNA,用c DNA第一链合成试剂盒进行反转录。以合成的c DNA为模板,用特异性引物进行PCR扩增。PCR体系为:3μL c DNA模板,1μL d NTP Mixture(2.5 mmol/L),1.5μL Mg SO4,2.5μL 10×PCR Buffer,1μL上游引物(10μmol/L),1μL下游引物(10μmol/L),0.5μL pfu Taq酶(5 U/μL),加灭菌dd H2O至25μL。反应程序:94℃预变性5 min;94℃变性40 s,60℃退火50 s,72℃延伸1 min,25个循环;最后,72℃延伸10 min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。
将得到的PCR产物回收纯化后与p CR2.1克隆载体连接,转化大肠杆菌DH5α。挑取单菌落培养过夜,提取质粒,用EcoRⅠ对重组质粒进行酶切鉴定。挑取3~5个阳性克隆质粒送至上海Invitrogen公司进行测序,鉴定正确的阳性克隆质粒命名为p CR2.1-importinβ1。
1.2.2 鸡importinβ1蛋白生物信息学分析
利用生物信息学软件对鸡importinβ1基因编码的蛋白质进行理化性质(Prot Param:http://us.expasy.org/tools/protparam.html)、蛋白质二级结构(SOPMA:https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)分析。从Gen Bank下载已知各物种的importinβ1基因,用Meg Align软件进行核苷酸同源性分析,经序列比对后用MEGA6.0软件对importinβ1基因构建分子系统进化树。
2 结果与分析
2.1 鸡importinβ1基因的克隆
用特异性引物从鸡胚成纤维细胞总RNA反转录的c DNA中通过PCR扩增得到约2 268 bp的特异性扩增条带(图1-A),与预期片段大小一致。对获得的重组质粒经过EcoRⅠ酶切电泳,获得约3 900bp的载体条带和2 268 bp的目的基因条带(图1-B),说明成功构建重组克隆质粒p CR2.1-importinβ1。将获得的阳性重组质粒送公司测序,与GenBank中登录的鸡importinβ1基因进行比对,未发生基因突变。
2.2 鸡importinβ1蛋白生物信息学分析
2.2.1 鸡importinβ1蛋白理化性质分析
鸡importinβ1基因编码区长度为2 268 bp,共编码755个氨基酸,其中含量较高的氨基酸有亮氨酸(11.5%)、丙氨酸(9.3%)和谷氨酸(7.9%),含量较少的是色氨酸(1.1%)、苯丙氨酸(2.6%)和半胱氨酸(2.8%);带正电荷氨基酸残基(精氨酸+赖氨酸)61个,带负电荷氨基酸残基(天冬氨酸+谷氨酸)110个。鸡importinβ1蛋白分子式可表示为C3712H5901N979O1152S46,分子量为84.15 k Da,属于亲水性蛋白,理论等电点为4.61,其在哺乳动物体外网织红细胞中的半衰期为30 h,在酵母体内大于20 h,在大肠杆菌体内大于10 h(图2)。
A:Electrophoresis detection of PCR product of chicken importinβ1 gene;B:Enzyme-digested products of the recombinant plasmids p CR2.1-importinβ1.
2.2.2 鸡importinβ1蛋白二级结构分析
鸡importinβ1蛋白含有丰富的二级结构,其中α-螺旋占64.90%,无规卷曲占21.46%,延伸链占7.02%,β-转角占6.62%(图3)。
2.2.3 鸡importinβ1基因同源性分析
将鸡与鹌鹑、绿头鸭、丹顶鹤等禽类进行importinβ1核苷酸序列同源性分析,结果表明禽类importinβ1基因核苷酸相似性在93.6%~97.7%,其中鸡与鹌鹑的相似性最高(为97.7%),与白尾海雕的相似性最低(为93.6%)。将鸡与人、家犬、斑马鱼等11种非禽类importinβ1基因核苷酸序列进行同源性分析,结果表明鸡与家犬的相似性最高(为84.6%),而与斑马鱼的相似性最低(为78.0%)(图4)。进一步将鸡与人类、大鼠和猪importinβ1基因编码的氨基酸序列进行比对分析,结果发现鸡importinβ1蛋白氨基酸变异位点主要位于316(M/L)、325(I/V)、353(T/S)、409(A/S)、526(D/E)、611(D/E)、651(I/V)、678(Y/F)、691(V/G)、696(S/A)和736(T/A)(图5)。
2.2.4 鸡importinβ1遗传进化分析
利用Gen Bank中登录的人和动物importinβ1基因绘制遗传进化树,发现鸡与鹌鹑importinβ1基因位于同一分支,其遗传距离最近;而与水生动物斑马鱼importinβ1基因在不同的分支,其遗传距离最远(图6)。遗传进化分析结果与importinβ1基因同源性分析结果相一致。
3 讨论
importinβ1蛋白属于核质转运受体蛋白importinβ家族重要成员,越来越多的研究证实其在蛋白质入核转运过程中发挥了重要作用。本研究克隆了鸡的importinβ1基因,序列比对分析发现鸡与与鹌鹑importinβ1基因的相似性最高(为97.7%),而与与斑马鱼的相似性最低(为78.0%),这与importinβ1基因的系统进化树结果相一致,说明鸡与鹌鹑的亲缘关系最近。目前对人importinβ1蛋白研究较为深入,它包含1个保守的IBN_N结构域和19个HEAT结构域,其中IBN_N结构域位于第21~101位氨基酸区域,可与Ran蛋白发生相互作用;HEAT结构域位于第128~873位氨基酸区域,可与接头蛋白、Ran-GTP、核孔蛋白等多种靶蛋白结合[6,7]。将鸡与人importinβ1蛋白进行氨基酸序列比较,发现HEAT结构域差异较大,变异位点316(M/L)、325(I/V)位于HEAT 7,353(T/S)位于HEAT 8,409(A/S)、526(D/E)位于HEAT 12,611(D/E)位于HEAT 13,651(I/V)位于HEAT 14,678(Y/F)、691(V/G)、696(S/A)位于HEAT 15,736(T/A)位于HEAT 16;氨基酸序列分析表明,鸡与人importinβ1蛋白氨基酸相似性在98.0%,这些变异位点是否影响importinβ1蛋白的功能有待进一步研究。
早期的研究证实蛋白质入核转运需要importinα和importinβ蛋白的共同参与,但是近年来,importinβ1蛋白单独介导靶蛋白入核过程受到人们更多的关注。如Mingsheng Cai等[8]研究发现importinβ1蛋白可直接识别水痘-带状疱疹病毒ORF9蛋白携带的经典NLS(RRKTTPSYSGQYRTARR),介导ORF9蛋白进入细胞核。Reena Ghildyal等[9]证实人呼吸道合胞病毒M蛋白与importinβ1蛋白具有相互作用,通过importinβ1蛋白识别M蛋白携带的经典NLS(KKVIIPTYIRSISVRNK)介导其入核。此外,许多研究同样证实importinβ1蛋白可直接识别细胞蛋白携带的经典和非经典型NLS。目前,国内外在家禽病毒蛋白细胞核定位的分子机制研究方面,仅发现禽流感病毒M1、NP和NS1蛋白入核过程需要importinα/β1蛋白的共同参与[10]。作为副黏病毒重要成员之一的新城疫病毒,其M蛋白携带一个经典的NLS(KKGKKVIFDKIEEKIRR),具有明显的核定位特征[11,12],它的入核是否与importinβ1蛋白有关尚未见报道。本研究成功克隆鸡importinβ1蛋白基因,并进行了生物信息学分析,这为后续开展importinβ1蛋白参与新城疫病毒M蛋白的细胞核定位研究奠定了工作基础。
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转基因鸡 篇7
鸡传染性支气管炎 (Infectious Bronchitis IB) 是由传染性支气管炎病毒 (Infectious bronchitis virus, IBV) 引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病, 主要侵害鸡的呼吸系统、泌尿生殖系统和消化系统, 并且在世界许多国家和地区都有发生, 是养禽业中较严重要的疾病。
S1蛋白是鸡传染性支气管炎病毒的主要保护性抗原, 能诱导机体产生中和抗体和血凝抑制抗体, 继而使机体得到保护, 引起了许多学者的极大关注。随着现代生物技术的发展, 有关鸡传染性支气管炎S1蛋白基因工程疫苗的研究不断地深入, 并已取得了一定的进展。
1 亚单位疫苗
亚单位疫苗是指用DNA重组技术, 将编码病原微生物保护性抗原的基因导入原核细胞或真核细胞, 使其高效表达分泌保护性抗原肽链。提取保护性抗原, 加入佐剂即制成亚单位疫苗。黄亚东 (2003) , 廖明 (1997) 分别在毕赤酵母和昆虫细胞中表达了IBV的S1基因, 所表达蛋白的分子量小于天然蛋白。尽管这些表达系统存在一定的缺陷, 且IBVS1基因中和位点的高度构象依赖性一定程度上妨碍了S1亚单位蛋白疫苗启动免疫的有效性, 但有资料表明单独使用传染性支气管炎基因工程亚单位疫苗免疫仍可产生一定的保护免疫效应。Song CS等重组杆状病毒表达了IBV嗜肾KM91毒株S1基因, 单独用重组的S1糖蛋白免疫对肾的保护率为50%, 而用异源弱毒疫苗株H120初免再用重组杆状病毒S1糖蛋白进行加强免疫, 对肾的保护率达到83%, 这些实验数据表明, 单独使用重组杆状病毒S1糖蛋白免疫可产生一定的免疫保护效应。
2 核酸疫苗
核酸疫苗是由编码能引起保护性免疫反应的病原体抗原的基因片段和载体构建而成。进入机体的核酸疫苗不与宿主染色体整合, 目的基因可在动物体内表达, 进而刺激机体产生体液免疫应答和细胞免疫应答, 但目前的基因免疫技术不是太成熟, 导致基因免疫效果并不理想。
刘思国等 (2001) 、陈洪岩等 (1999) 分别将鸡传染性支气管炎病毒S1基因和N基因构建成真核表达质粒接种SPF鸡, 结果显示40%的鸡可耐过IBV强毒的攻击, 血清IgG抗体在攻毒前后呈现规律性变化, 说明S1基因在鸡体内得到了表达, 并使鸡获得了一定免疫力, 但保护作用不及传染性支气管炎病毒油苗, 分析认为, 肌注质粒吸收不佳, 致使主要免疫原蛋白表达量不高而使免疫保护率不高。
3 活载体疫苗
活载体疫苗是用基因工程技术将保护性抗原基因转移到载体中使之表达的活疫苗。目前, 作为载体的病毒有痘苗病毒、禽痘病毒、疱疹病毒、腺病毒和反转录病毒等。
3.1 禽痘病毒载体
利用禽痘病毒作载体其特征为, 病毒不能整合进入基因组, 可携带多个基因, 宿主细胞谱广, 瞬间表达转基因。但缺点是难以大量产生。WangX等 (2002) 用重组鸡痘病毒表达了马萨诸塞州41株的S1基因, 免疫鸡受到部分保护, 并且试验结果显示, 翅下免疫接种效果更好。
3.2 腺病毒载体
重组腺病毒作为基因载体已在基因转移, 载体疫苗和基因治疗等各个方面得到广泛应用。JohnsonMA等用禽腺病毒主要晚期启动子调控下的血清8型禽腺病毒表达Vic S株IBVS1基因, 对0或6日龄雏鸡口腔免疫且在35日龄攻毒, 试验结果显示, 接种后的第6d, 对于IBV同源和异源毒株在支气管的保护率达到90%~100%。对于规模化养禽业来说, 一次性免疫, 廉价而有效的疫苗很重要, 而且用腺病毒作载体表达IBV的保护性抗原作为活病毒载体疫苗代替弱毒苗, 可减少新变异株的出现。
3.3 传染性支气管炎病毒载体-反向遗传操作技术
随着反向遗传操作技术的不断发展, 对IBV的基因组结构及其复制, 转录调控机制有了更深入的了解, 构建IBV感染性分子克隆并用它作为活病毒RNA载体表达异源基因, 报告基因及γ-干扰素, 表明所构建的IBV RNA载体是可行的。很快IBV将作为活病毒RNA载体表达外源基因, 为更有效的预防传染性支气管炎做出贡献。
4 转基因植物疫苗
转基因植物疫苗是Mason于1992年提出的, 该技术是利用分子生物学技术把重组的疫苗基因导入植物, 并使植物能大量表达重组蛋白的一类生物技术。王红宁等 (2003) 通过RT-PCR获得IBV S1基因片段, 并将其导入玉米表达载体进行了表达。此外, ZhouJY等 (2003) 用土壤杆菌属系统构建含有IBV S1基因的载体转化马铃薯, 在马铃薯中表达了IBV S1糖蛋白并免疫鼠和鸡, 通过3次免疫后, 免疫鸡受到完全保护, 此结果表明转基因马铃薯表达的IBV S1糖蛋白也可作为防治IBV的疫苗资源。
5 展望
转基因鸡 篇8
在蛋鸡生产中, 由于饲料来源广泛, 可能含有TMA或其前体物质, 带有这种基因缺陷的蛋鸡体内的三甲胺不能正常代谢, 从而导致了三甲胺在鸡蛋中沉积而产生了鱼腥味鸡蛋[2]。研究报道, 三甲胺主要存在于蛋黄中, 携带鱼腥味鸡蛋蛋黄中TMA的含量为正常鸡蛋蛋黄中含量的10倍[3], 鱼腥味严重降低了鸡蛋的品质和口感。张龙超[4]、Chu等[5]、邱家维等[6]分别对我国不同地方鸡种FMO3基因T329S位点基因型分析表明部分地方鸡品种有携带鱼腥味的个体。对于饲养量众多的河北太行鸡未见其研究报道。本研究旨在检测FMO3基因T329S突变位点在太行鸡群体中的分布, 对于剔除携带鱼腥味敏感基因的个体, 为太行鸡的改良和选育提供基础资料。
1 材料与方法
1.1 样品采集
本试验所选取的河北太行鸡均为纯种。血样采集在翅下静脉, 约0.5 m L, 采用ACD抗凝剂对血液进行抗凝, 共计422个样品。肝脏组织样品采集约0.5 g, 放入1.5 m L Eppendorf管中, 收集肝脏样品95个。置于-20℃冻存备用。
1.2 引物设计
据Gen Bank中鸡FMO3的基因序列 (登录号AJ431390) , 获得含T329S突变位点的序列信息。应用Primer Premier 5引物设计软件, 针对T329S位点设计引物, 引物由北京华大科技公司合成。所用引物序列为:
F-primer:5’-CAGGGTGGTATCAAGCCTGT-3’
R-primer:5’-GATCCAAAGGACTGGACCAA-3’
1.3 PCR反应
本试验均采用10μL PCR反应体系:dd H20 7.1μL, 10×PCR Buffer 1.0μL, (2.5 m M) d NTPs 0.8μL, (10μM) 上下游引物各0.2μL, Taq DNA聚合酶 (5 U/μL) 0.2μL, (100 ng/μL) DNA模板0.5μL。PCR反应程序为:95℃预变性5 min;95℃变性30 s, 退火温度67℃退火30 s, 72℃延伸45 s, 30个循环;最后72℃延伸10 min。取2μL PCR扩增产物与1μL6×溴酚蓝上样缓冲液混匀, 点样于1.5%琼脂糖凝胶 (含0.05%GV) , 电泳检测, 并在凝胶成像系统下观察PCR扩增情况。
1.4 酶切反应体系
采用PCR-RFLP方法检测太行鸡个体FMO3基因的基因型, 限制性内切酶为Bsr I, 该内切酶所切序列为:5’-ACTGGN↓-3’, 3’-TGAC↑CN-5’, 其中箭头所指位置为酶切位点。PCR-Bsr I酶切总体系为10μL, 酶切体系为:灭菌dd H2O4μL, 10×Buffer 0.5μL, PCR产物5μL, Brs I限制性内切酶 (10 U/μL) 0.5μL。酶切温度为67℃, 时间为2 h。PCR产物酶切完成后, 经2.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。并在凝胶成像系统下观察、拍照。
1.5 统计分析
根据PCR-RFLP检测结果, 采用POPGENE软件计算河北太行鸡群体该基因位点基因型频率、等位基因频率、观测杂合度 (HO) 、期望杂合度 (He) 、有效等位基因数 (Ne) 及多态信息含量 (PIC) ;采用SPSS 19.0中的卡方检验进行哈代-温伯格 (Hardy-Weinberg) 平衡性检测。
2结果与分析
2.1基因组DNA提取样品基因组DNA提取均参照血液基因组提取试剂盒说明书进行。基因组DNA经琼脂糖凝胶电泳检测条带单一、整齐、清晰, 亮度较好, 无降解现象, 即基因组DNA的完整性好, 见图1。采用Nano Drop 2000超微量分光光度计对提取的基因组DNA进行浓度和纯度检测, 其比值 (OD260/OD280) 在1.8~2.0之间, 可直接用于后续PCR、酶切等下游试验。
2.2PCR扩增取2μL PCR扩增产物, 点样于1.5%琼脂糖凝胶 (含0.05%GV) , 电泳检测, 并在凝胶成像系统下观察PCR扩增情况, 如图2所示, PCR扩增产物大小与预期片段 (369 bp) 大小一致, 为目的片段, 且没有特异性扩增条带, 可直接用于PCR-RFLP分析。
2.3 PCR-RFLP分析PCR产物酶切完成后, 经2.0%的琼脂糖凝胶电泳检测, FMO3基因PCR产物酶切后的琼脂糖凝胶检测结果如图3所示, 参考电泳图谱, 可以根据带型对太行鸡个体进行基因型分型, 若为226 bp、143 bp两条带, 即判定为AA型;若为369 bp、226 bp、143 bp三条带, 即判定为AT型;若为369 bp一条带, 即判定为TT型。
2.4基因型频率及等位基因频率对采集的517只太行鸡血液和肝脏样品DNA进行FMO3基因T329S突变位点基因型频率与基因频率分析, 结果如表1所示。
从表1可知, 在河北太行鸡群体中, AA基因型和AT基因型频率显著高于TT基因型, A等位基因频率显著高于T等位基因频率。经卡方检验, 卡方值为2.052 (P>0.05) , 说明所检测河北太行鸡群体在此位点处于Hardy-Weinberg平衡状态, 见表2。
2.5遗传变异参数杂合度、多态信息含量是度量群体遗传变异的参数。该群体的观测杂合度 (HO) 为0.1644, 期望杂合度 (He) 为0.1763、有效等位基因数 (Ne) 为1.2140, 多态信息含量 (PIC) 为0.1607, 由此可知, 该群体在该基因位点上均处于低度多态 (PIC<0.25) , 因而将携带鱼腥味综合征易感基因纯合型 (TT) 和杂合型 (AT) 个体从群体中剔除相对较容易。
3讨论
我国地方禽类品种资源丰富, 地方品种在肉蛋品质及风味上优于高产商业品种。本研究中太行鸡主产于河北境内, 经人工选择形成的河北省优良地方品种, 其蛋肉品质优良, 营养成分含量丰富, 深受消费者欢迎。但新鲜鸡蛋中有时会出现一种类似臭鱼的难闻味道, 即所谓的“鱼腥味综合征”, 严重影响消费者的感官感受。研究证实, FMO3是体内三甲胺 (TMA) 代谢的唯一有效酶[7], FMO3基因T329S突变位点引起FMO3活性降低是导致产生腥味蛋的遗传因素。
关于FMO3基因T329S突变位点在不同品种鸡群体中已有不少研究报道, 因遗传背景及选育程度不同, T329S突变位点在各个鸡品种中的分布也不尽相同。张龙超[4]采用PCR-RFLP方法分析了我国地方鸡种包括白莱航蛋鸡、东乡绿壳蛋鸡和H褐壳蛋鸡鸡种FMO3基因T329S突变位点的分布, 该结果表明部分地方鸡种有携带鱼腥味的个体;刘伟等[8]研究的安徽地方鸡种中鱼腥味敏感基因型频率均在0.05以下;邱家维等[6]、陈强等[9]、Chu等[10]报道的林甸鸡、绿壳蛋鸡、北京油鸡群体中均存在鱼腥味综合征易感基因型个体, 不利等位基因T的基因频率分别为0.005~0.25, 王晓亮等[11]对10个地方鸡种的研究发现均存在鱼腥味综合征易感个体, 但易感基因型频率都不高, 可以采用PCR-RFLP方法剔除。本试验中, 所研究的太行鸡群体中TT基因型频率为0.0155, T等位基因的频率为0.0976, 由此可见, 河北太行鸡群体中鱼腥味综合征易感基因型频率较小。因此, 对河北省优质太行鸡种FMO3基因T329S突变位点进行筛查, 对携带该基因的杂合子及纯合子予以剔除, 从而从遗传上保证太行鸡群体中不再出现产鱼腥味鸡蛋的个体, 最终建立无鱼腥味基因的地方品种具有重要的意义。
摘要：本试验旨在研究含黄素单氧化酶3 (Flavin-Containing Monooxygenase 3, FMO3) 基因T329S突变在河北太行鸡群体中的分布。本研究根据Gen Bank中公布的鸡FMO3基因序列设计引物, 采用PCR-RFLP方法对517只河北太行鸡FMO3基因频率及基因型频率进行检测。结果显示, 该位点在河北太行鸡群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态 (P>0.05) ;等位基因A、T频率分别为0.9023、0.0976;AA、AT、TT基因型频率分别为0.8201、0.1644、0.0155。结果表明, 河北太行鸡群体中鱼腥味综合症易感基因型频率不高, 可以通过PCR-RFLP的方法予以剔除。
关键词：河北太行鸡,含黄素单氧化酶3基因,基因型频率,PCR-RFLP
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转基因鸡 篇9
到目前为止, 大多数实验室都采用大肠杆菌系统对鸡Mx蛋白进行表达[5,6]。该表达系统虽然具有遗传背景清楚、所需成本相对低等优点, 但存在表达产物缺乏翻译后加工, 得到的蛋白质可能缺乏某些天然蛋白所具有的活性等缺点。而巴斯德毕赤酵母是一种使用广泛的外源表达系统, 它具有高效表达、高稳定、高分泌等特点, 而且可以对表达产物进行类似真核细胞的翻译后修饰和加工等。试验利用酵母表达系统表达鸡抗病毒Mx蛋白, 实现了该蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达, 进而为鸡抗病毒Mx蛋白基因的进一步研究和应用奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 质粒与菌株
鸡抗病毒Mx蛋白基因真核表达质粒pcDNA-MMx, 由动物遗传繁育与分子设计江苏省重点实验室构建;大肠杆菌DH5α感受态细胞、酵母表达载体pPIC9K、宿主菌GS115, 由动物遗传繁育与分子设计江苏省重点实验室保存。
1.1.2 主要试剂
各种限制性内切酶、DNA聚合酶、TaKaRa LA TaqTM、pMD19-T Simple载体试剂盒、低分子质量蛋白标准, 均为宝生物工程 (大连) 有限公司产品;DNA回收试剂盒、T4 DNA连接酶, 购于MBI公司;胰蛋白胨、酵母浸出粉, OXID公司产品;特异性引物, 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成;其他试剂均为进口或国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 目的基因片段的扩增
引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。上游引物P1 5′-GC-TACGTAATGAACAATCCATGGTCC-3′ (下划线部分为SnaBⅠ酶切位点) , 下游引物P2 5′-TTGCGGCCGCTTACAGAGACTTAAAGTC-3′ (下划线部分为NotⅠ酶切位点, 斜体为酵母偏爱终止密码子) 。
以pcDNA-MMx为模板扩增出鸡抗病毒Mx蛋白编码序列。PCR反应体系: 10×LA PCR Buffer (Mg2+ Plus) 5 μL, dNTPs Mixture (各2.5 mmoL/L) 4 μL, 引物P1、P2 (10 μmoL/ L) 各1.5 μL, pcDNA-MMx质粒模板1 μL、TaKaRa LA TaqTM (5 U/μL) 0.5 μL, 加灭菌纯化水至50 μL。反应条件:94 ℃预变性10 min ;94 ℃变性40 s, 52 ℃退火40 s , 72 ℃延伸150 s, 共30个循环;72 ℃延伸10 min。扩增产物经0.8 %琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收目的片段, 将回收后的目的片段与pMD19-T Simple载体连接, 用连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞, 挑取阳性克隆进行PCR、酶切及测序鉴定, 将鉴定正确的质粒命名为pMD-Mx。
1.2.2 重组穿梭质粒pPIC9K-Mx的构建和鉴定
分别用SnaBⅠ和NotⅠ双酶切pMD-Mx质粒并回收目的片段 (Mx基因) , 将其与同样酶切回收的pPIC9K载体16 ℃连接过夜, 转化大肠杆菌DH5α感受态细胞, 筛选阳性重组质粒, 经PCR、酶切及测序鉴定后将阳性重组质粒命名为pPIC9K-Mx。
1.2.3 重组表达质粒pPIC9K-Mx的线性化及其电转化
制备酵母菌GS115感受态, 将其与10 μg经SalⅠ酶切线性化的重组表达质粒混合, 转入0.2 cm电击杯中冰浴5 min;用Eppendorf Multiporator®*1于1 500 V、5 ms条件下电转化, 立即向电击杯内加入1 mol/L冰浴山梨醇, 30 ℃静置培养2 h;取200 μL菌液涂于MD平板上, 30 ℃倒置培养2～3 d, 观察其生长情况。
1.2.4 多拷贝整合转化子的筛选
将在MD平板上生长的菌斑用双蒸水重悬, 涂于G418浓度逐步增高 (0.5, 1, 2, 3, 4 mg/mL) 的YPD平板上, 30 ℃培养2～3 d, 筛选出具有高抗性且生长良好的单菌株。
1.2.5 MM (minimal methanol medium) 与MD (minimal dextrose medium) 对比生长试验
将在4 mg/mL G418-YPD平板上生长的单菌落分别点在MM、MD平板上, 30 ℃倒置培养2～3 d, 筛选出His+、Mut+型菌株。
1.2.6 转化子的鉴定
挑取高拷贝单菌落接种至5 mL YPD液体培养基中, 30 ℃培养16～18 h;取1.5 mL菌液离心收集菌体, 弃上清液, 用双蒸水洗涤、离心;取沉淀悬浮于100 μL TE中, 沸水煮5～8 min, 冰浴10 min;离心收集上清液, 以2 μL上清液为模板, PCR鉴定阳性克隆。
1.2.7 表达菌株的诱导表达
将筛选出的高拷贝菌株菌落接种于50 mL BMGY培养液中, 30 ℃振荡培养至OD600值为4～6;离心收集菌体, 弃上清液, 将菌体重悬于原培养液1/5的BMMY中诱导表达, 期间每隔24 h加甲醇1次, 使其终浓度分别保持在0.5%、1%;分别在24, 48, 72, 96, 120 小时取出1 mL培养物, 12 000 r/min离心2 min, 取上清液进行SDS-PAGE检测。
2 结果
2.1 鸡抗病毒Mx蛋白基因的克隆
以P1 (含SnaBⅠ酶切位点) 和P2 (含NotⅠ酶切位点) 为引物, 以真核表达载体pcDNA-MMx为模板扩增鸡抗病毒Mx蛋白基因的编码区 (见图1) 。
M.1 kb DNA Marker;1.Mx 基因PCR产物。
2.2 重组质粒pMD-Mx的构建与鉴定
回收目的片段后与pMD19-T Simple载体连接, 连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞, 挑取阳性克隆参照试剂盒提取质粒, 经SnaBⅠ和NotⅠ双酶切鉴定, 酶切结果见图2。该结果与预期结果一致, 将鉴定正确的质粒命名为pMD-Mx。
1.重组质粒酶切结果;M.1 kb DNA Marker。
2.3 重组穿梭质粒pPIC9K-Mx的构建与鉴定
重组穿梭质粒pPIC9K-Mx的构建结果见图3, pPIC9K双酶切结果见图4, 重组质粒阳性克隆双酶切鉴定结果见图5。构建及测序结果显示, Mx的序列及插入位置正确。
1.pPIC9K酶切;M.1 kb DNA Marker。
1.重组质粒pPIC9K-Mx酶切结果;M.1 kb DNA Marker。
2.4 重组酵母菌株的筛选
将pPIC9K-Mx重组质粒及pPIC9K空载体分别用SalⅠ酶切线性化后, 回收目的产物转化GS115, 经MD、G418梯度筛选及MD与MM平板对比生长试验, 挑选出生长快并且菌落饱满的菌株, 制备其PCR鉴定模板, 进行PCR鉴定, 筛选含有目的片段的重组子, 结果见图6。
1～4.重组质粒检测结果;5.阴性对照;M.1 kb DNA Marker。
2.5 诱导表达产物的SDS-PAGE检测
从高抗G418平板挑取菌株, 经PCR鉴定后进行甲醇诱导, 用1%的甲醇连续诱导5 d, 取诱导后上清液进行SDS-PAGE检测, 目的产物鸡抗病毒Mx蛋白的表达情况见图7。与阴性对照比较, 诱导表达上清液在4～8 h、约75 ku处有明显特异性条带出现, 与预期的鸡Mx蛋白相对分子质量基本一致, 并且在96小时达到高峰。扫描结果显示, 目的蛋白约占上清液总蛋白的39.2%。
1～5.1%甲醇诱导24, 48, 72, 96, 120 h;M.低分子质量蛋白标准;6.阴性对照。
3 讨论
在人、小鼠、大鼠、猪、牛等哺乳动物体内都发现了类似的Mx蛋白, 并且都具有能够抑制RNA病毒复制的活性。鸡Mx蛋白属于诱导表达型蛋白, 其天然来源十分有限, 远不能满足对其抗病毒机理及作用机制研究的需要, 因此采用基因工程技术制备鸡抗病毒Mx蛋白十分重要。
到目前为止, 外源基因的表达及其蛋白的获取大多都采用大肠杆菌表达系统而酵母表达系统作为一种有效的表达系统, 已逐渐成为基因工程领域外源基因蛋白获取的重要途经[7]。毕赤酵母表达系统兼具有原核和真核表达系统以及高效发酵并对表达产物进行类似真核细胞的翻译后修饰和加工 (如糖基化、二硫键的形成以及肽链的正确折叠) 等显著优点[8,9]。毕赤酵母利用甲醇作为唯一的碳源, 它有2个醇氧化酶基因AOX1和AOX2, 该基因具有很强的启动活性。毕赤酵母表达载体正是利用该启动子来启动外源蛋白表达的, 并将其分泌到培养基中, 分离、纯化简便, 是一种理想的外源基因表达系统[10]。试验将鸡Mx基因编码序列和α-分泌信号肽融合表达, 使重组蛋白在α-分泌信号肽的引导下穿过细胞膜并分泌到培养基中, 易于分离和纯化, 可获得高活性重组蛋白。由于酵母分泌的内源性蛋白比较少并且酵母培养基的成分相对简单, 这有利于表达的目的蛋白分离和纯化。
影响外源蛋白在毕赤酵母中表达的因素很多, 它不仅受整合位点、mRNA非翻译区、cDNA的AT含量等影响, 也受宿主菌、糖基化、培养基、重组质粒拷贝数的影响。一般来说, 高拷贝质粒表达外源蛋白的能力相对较强, 但不是绝对的。在试验中, 采用5个G418浓度 (0.5, 1, 2, 3, 4 mg/mL) 梯度对转化子进行筛选。结果显示, 高拷贝重组质粒表达效果明显高于低拷贝数转化子, 单拷贝及低拷贝转化子的表达效果不明显甚至不表达。经SDS-PAGE检测无特异性条带出现, 提示重组转化子拷贝数对鸡抗病毒Mx蛋白在毕赤酵母中表达的影响很大。
试验首次利用毕赤酵母表达系统表达了鸡抗病毒Mx蛋白, 这对该蛋白体外获取及其活性检测研究提供了很好的思路。
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