动物转基因技术

动物转基因技术（精选12篇）

动物转基因技术 篇1

2008年,国务院启动了转基因生物新品种培育的重大专项。目前,我国在转基因动物的研究方面已经取得了显著性进展,获得的转基因动物的数量已初具规模,对转基因动物生物安全性的评价已迫在眉睫。本文综述了在转基因动物生产过程中,各环节需要进行评价的内容以及采取的评价技术和手段,并对安全评价技术的应用前景进行讨论。

1 外源基因自身的安全性评价

外源基因的选择是转基因动物生产的第一步,目前转入的外源基因按功能分,主要有以下3种:改良性状基因,(如品质性状改良)、辅助转化基因(如抗生素抗性筛选基因)和目的基因表达的调控序列(如启动子)。对外源基因的鉴定是转基因动物安全性评估的重要内容,主要是应用DNA测序技术结合生物信息学的预测技术,将测序结果与已经发布的相关序列进行比对,与其相似度高的序列信息可以认为与其功能相似度高,通过该信息验证对应的外源基因功能与特性,并结合相关报道开展已转入基因的安全性的评价。

2 外源基因插入位点的核定

当外源性基因导入到受体后,因其插入的方式、部位和拷贝数等都有所不同,得到的转基因后代也不完全相同。因此,在同一个转化过程中能获得多个不同的转基因动物类型。对转基因动物进行筛选评价,确定其插入位点是评价转基因动物体内安全的重要方面[1]。

2.1 基因拷贝数的检测

基因拷贝数的检测是转基因动物评价的重要项目,因为在转基因的宿主体内,外源基因拷贝数具有不确定性,这对外源蛋白表达量有显著的影响。Southern印迹杂交、实时荧光定量PCR、荧光原位杂交技术、毛细管凝胶电泳法和竞争定量PCR等是国内外检测外源基因拷贝数的方法。目前，前两种方法较为常用。Southern印迹杂交对拷贝基因数的检测所使用的标记探针有同位素和非同位素标记,前者灵敏高度,但对人员和环境会造成辐射;后者可避免辐射危害,最常用的是地高辛标记探针。荧光定量PCR技术有探针类和非探针类两种,前者主要有TaqMan探针、杂交探针和分子信标探针等[2],美国一家公司最近发明的神标荧光探针属于第四代技术,比TaqMan探针提高了60%;后者中的SYBR2Green I染料简单易用、敏感性高,因而被广泛采用。Karine等[3]用SYBR Green法进行小鼠外源基因拷贝数的分析,并确定转基因小鼠为纯合子或杂合子。

2.2 整合位点的检测

外源基因在宿主体内会随机整合,形成外源基因的高表达、低表达或沉默3种状态,干扰了转基因技术的研究。确定了外源基因的整合位点便可由此分析该插入位点对外源基因表达的影响。目前主要应用荧光原位杂交方法及克隆侧翼序列的染色体步移法进行外源基因整合位点的检测。荧光原位杂交法具有安全性高、信号强、周期短和假阴性等优点。该技术在低背景杂交探针和多位点分析上得到了进一步的改进,使其检测核酸的范围更广泛。刘薇等[4]应用FISH技术检测人APPswe基因在小鼠上的整合及定位;染色体步移技术的一个重要应用就是鉴定T-DNA或转座子的插入位点,鉴定转基因技术所导致的外源基因的插入位点。对一些未知基因组序列的物种,要想知道一个已知区域两侧的DNA序列,只能采用染色体步移技术。其中,基因于PCR扩增的反向PCR技术的缺点是易导致假阳性和假阴性结果,而另一种热不对称交错PCR技术是根据已知序列设计3个嵌套的特异性引物和简并引物组合,利用特异引物和简并引物的Tm值选择性的扩增目标片段。该技术与相关技术相比,优势强,已经成为一种普遍的实用技术,广泛应用在目的基因的整合位点检测中。pillai等[5]采用TAIL-PCR检测出鼠的3个插入位点,并提出该技术可寻找胚胎致死的外源基因的整合位点。

3 外源基因表达的检测

对外源基因转录产物进行分析，可以研究外源基因在转基因动物的表达情况。常用的方法有逆转录PCR (RT-PCR)、Northcrn印迹杂交(Northern,blot)和RNA斑点杂(RNAdot)等,以前两种技术为主。

3.1 Northern印迹杂交技术(Northernb1ot)

该技术是研究宿主中外源基因表达及调控的一种重要手段,是将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。与前面基因拷贝数的检测技术中介绍的Southern印迹杂交技术相比,更有现实意义。

3.2 逆转录PCR技术(RT-PCR)

该技术将检测对象的mRNA合成cDNA,以cDNA扩增出特异的DNA,由此可在mRNA水平上检测外源基因是否表达。由于其需要的样品量较少,易于操作,检测的灵敏度和精确度高,是目前最常用的检测方法。

4 蛋白质表达检测

mRNA与表达蛋白质的相关系数低于0.5[6]所以mRNA水平研究不能完全取代基因最终表达产物的研究,测试蛋白质水平是检测外源蛋白是否表达的最直接、最有效的方法[7]。

4.1 基因表达系列分析技术(serialanalysis of gene expression,SAGE)

该技术在对基因性质和生物系统预先并不了解的情况下,可同时检测大量的、定量的基因转录本的信息,还可以发现未知基因[8],可用于检测转基因动物体内由于外源基因的导入对上下游基因表达的影响。应用此项技术可在蛋白质水平上获得对转基因山羊体内基因表达变化的全面认识[9]。

4.2 免疫检测技术

该技术是利用免疫反应特异性的原理进行各种检测的技术。ELISA是酶联免疫吸附法的简称,依据抗原抗体杂交原理进行蛋白质的检测。该方法可以进行定性、半定量检测,具有高度特异性,可以产生肉眼可见的凝集反应,方便直观,灵敏度和稳定性都较高。施前等[10]使用双抗体夹心EUSA法,成功检测了人凝血因子Ⅸ。

4.3 Western印迹分析技术

该技术基于蛋白质凝胶电泳和固相免疫测定理论,是转基因生物蛋白质检测最权威的方法之一,由于特异性高可用于定性检测[11]。该技术利用电泳技术分离出目的蛋白,并将其原位固定在固相膜上,在高浓度的蛋白质溶液中进行温育,这过程可以把其非特异,性位点封闭起来,然后用特定抗体进行杂交结合,再通过自显影或显色技术进行观察,便可知对目的蛋白进行确定。该技术能够直接表达出目的基因导入对宿的影响,在一定程度上反应了转基因的成败[12]。

4.4 蛋白芯片检测技术

蛋白芯片检测基于免疫分析和基因芯片的理论,通过设计将已知位置及序列的蛋白、多肽和抗原等固定在特定载体上,从而组成非常密集的分子排序,当被标记的靶分子与芯片上的探针分子反应后,对荧光信号进行检测,从而进行分析并确定蛋白质相关情况。该技术为检测转基因动物中多种标志蛋白及与标志蛋白相关联的蛋白提供了有效手段。

5 转基因动物遗传稳定性检测

转基因动物能否将转入的基因通过表型等发挥出来,并能够稳定地遗传给下一代直至剔除其他常规的基因突变影响的第N代,是转基因操作成功与否的重要衡量标准。指纹图谱检测技术通过鉴别生物个体之间不同的电泳图谱而反映了个体间的内在差异,适用于生物品种的鉴定,也可以用来对转基因动物的遗传稳定性进行检测。常用的指纹图谱主要有生化指纹图谱和DNA指纹图谱两种。

6 存在的问题及展望

目前,转基因动物检测中灵敏度不高、精度不高和检测结果存在假阳性是普通存在的问题,除因仪器设备水平有限外,更重要的是缺乏技术理论上的创新和方法上的改进。随着转基因动物在新品种培育、异种器官移植、生物反应器和疾病模型等方面的研究和发展,其安全问题也越来越受到政府部门和科学家的热切关注。随着现代生物技术的不断发展,转基因动物的生物安全评价将朝着多种技术相互结合、互相补充、高效、便捷、安全、自动化的方向发展。

摘要：随着转基因动物的逐步产业化发展,转基因动物的生物安全性的评价方法和检测技术引起了人们的广泛关注。本文结合国内外检测技术的最新进展,对转基因动物生产过程涉及的生物安全评价技术进行了概述,讨论了目前检测方法中存在的问题,并对检测技术的发展前景进行了展望。

关键词：转基因动物,生物安全,评价技术

参考文献

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[2]丁嘉羽.水稻内标准基因的研究及利用TaqMan荧光定量PCR技术检测转基因水稻外源基因拷贝数[D].上海:上海大学,2004.

[3]Karine H,Jean-Marie B,Blandine L.Easy and rapid method of zygosity determination in transgenic mice by SYBR1 real-rime quantitative PCR with a simple data analysis[J].Transgenic Res,2007,16(1):127-131.

[4]刘薇,卢光诱.应用荧光原位杂交技术检测人类APPswe基因在转基因小鼠染色体上的定位及位置效应[J].遗传学报,2001,28(9):827-831.

[5]Pillai M,Venkataraman G M,Kosak S,et al.Integration site anaylsis in transgenic mice by thermal asymmetric interlaced(TAIL)-PCR:segregating multiple-integrant founder lines and determining zygosity[J].Transgenic Res,2007,12(2):31-34.

[6]Anderson L,Seilhamer J.A Comparison of selected mRNA and Protein Abundances in Human[J].Electrophoresis,1997,(18):533.

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[8]Jin Y,Lu S Y,Fresnoza A,et al.Differential placental hormone gene expression during pregnancy in a transgenic mouse containing the human growth hormone/chorionic Somatomammotropin locus[J].Placenta,2009,30:226-235.

[9]Wang L,Liu T,Peng T,et al.Efficient production of transgenic goat(Capra hircus)embryos using dual markers[J].Small Ruminant Res,2008,75:99-104.

[10]施前.凝血因子的体外检测与研究[J].复旦学报(自然科学版),1990,4:413-417.

[11]Lipton C R,Dautlick J X,Grothaus G D,et al.Guidelines for the Validation and Use of Immunoassays for Determining of Introduced Proteins in Biotechnology Enhanced Crops and Derived Food Ingredients[J].Food and Agric Immunol,2000,12(2):153-164.

[12]Huang Y J,Huang Y,Baldassarre H,et al.Recombinant human butyrylcholinesterase from milk of transgenic animals to protect against organophosphate poisoning[J].PNAS,2007,104(34):13603-13608.

动物转基因技术 篇2

抑制性消减杂交(SSH)、DNA芯片和基因表达系列分析(SAGE)技术都是高效鉴别不同细胞群之间差异表达基因的方法.作者对这3种方法在动物发育与繁殖领域中的.最新应用进展作了简要阐述.

作 者：肖朝庭 储明星 傅衍 XIAO Chao-ting CHU Ming-xing FU yan 作者单位：肖朝庭,傅衍,XIAO Chao-ting,FU yan(浙江大学动物科学学院,杭州,310029)

储明星,CHU Ming-xing(中国农业科学院畜牧研究所,北京,100094)

转基因动物迎来“冰桶挑战” 篇3

在“冰桶挑战”的风潮下，人们也许对渐冻人症渐渐熟悉。但鲜有人知的是，在人类抵抗渐冻人症的科学研究中，转基因动物正在起着重要的作用。

中国科学院广州生物医药与健康研究院再生生物学重点实验室教授赖良学常年与转基因动物“打交道”。他曾与国内科学家合作，将渐冻人症的致病基因导入猪体内，改造后的转基因猪成为了渐冻人症药物筛选的动物模型，让人类在寻找治疗渐冻人症方法的征途中又向前迈进了一步。

“转基因动物可不止这个功能。随着技术的发展，转基因动物目前已广泛地应用于生物学基础研究、医学、农业及生物工程等领域。”赖良学向笔者介绍道。

技术与世界同步

转基因植物，尤其是转基因农作物一直受到公众的安全性质疑。相对而言，转基因动物受到的关注度要小得多。但实际上，“转基因”早就“奔”向了许多动物品种，小鼠、鱼、羊、牛、兔子、猪……几乎常见的动物都可能列上了转基因技术可以涉及的名单。

转基因动物是指用实验室方法将人们需要的目的基因导入其基因组，使外源基因与动物本身的基因整合在一起，并随细胞的分裂而增殖，在动物体内得到表达，并能稳定地遗传给后代的动物。据了解，转基因动物目前主要应用在基因表达与调控的研究、人类疾病及遗传病的转基因动物模型研究、动物品种改良、利用转基因动物作为生物反应器生产目的蛋白、生产可供人体移植用的器官等领域。而且，转基因动物由于生产效率高、周期短、成本低、可以决定后代性别等受到医药研究领域的欢迎。

我国是世界上较早开展转基因动物研究与开发的国家之一，1985我国首次在国际上成功地获得了转基因鱼；1990年成功研发出了转基因猪；2000年，我国西北农业大学用体细胞克隆出山羊；2002年，中国科学院动物所自主完成了我国首批成年体细胞克隆牛群体。目前，大部分转基因家畜均已在我国成功培育并在上述几个领域进行了大量的科学研究。

国家遗传工程小鼠资源库主任、南京大学模式动物研究所教授高翔多年从事转基因小鼠的研究。他表示：“现在国内的转基因动物技术并不比国外差，有些技术甚至已经处于世界前沿。”

产业方兴未艾

相比于转基因植物的产业化进程，转基因动物的发展步伐要慢很多。

目前，转基因动物的产业化应用主要集中在医药和科研领域。已上市的转基因动物制品主要包括通过转基因山羊乳腺生物反应器生产的抗血栓素药物-ATryn与由转基因兔生产的单克隆抗体遗传性血管水肿治疗药物-Ruconest。美国约克镇公司生产的一种会发荧光、可用于环境污染指示物的斑马鱼当前还在宠物店试卖。

现在，转基因动物似乎要向人们的“餐桌”进军。比如，美国的转基因鲑鱼在等待着美国食品药品监督管理局（FDA）的审批，一些人认为转基因鲑鱼有可能成为全球第一种上市的转基因食用动物。

据赖良学介绍，转基因动物在中国的产业化应用主要集中在科研领域，转基因动物作为实验动物模型受到了企业的高度关注，已有部分企业成为转基因和基因工程模式动物的供应商，构建转基因动物模型提供给科研机构使用。

还有一批转基因动物研究成果正在等待走出实验室。例如，2011年时，中国农业大学研发的人乳铁蛋白转基因奶牛技术已获准进入转基因生物安全生产性试验，成为中国首批进入生产性试验的转基因动物。

中国农业大学农业生物技术国家重点实验室研究人员许建香等人曾在2012年发表的研究论文中介绍：实验室通过奶牛乳腺生物反应器生产的这种“人乳化”牛奶已完成了初试、中试阶段和大部分生物安全评价工作，有关部门正在对“人乳化”牛奶制品进行进入市场前的评审工作。

许建香还表示，该实验室已完成乳铁胃康胶囊、生物补血口服液、抗非小细胞肺癌口服药产品临床前研究及小规模试生产，但大规模的批量生产尚未开始。

实验室到产业化的路

笔者在采访中了解到，转基因动物要想从实验室走向市场，最终走向大规模的产业化，还有“一大桶冰水”摆在眼前。

据了解，2002年1月5日，农业部颁发了《转基因动物安全评价办法》对转基因动物的生物安全评价进行了规范和指导，规定转基因动物及其产品上市前要经过实验研究、中间试验、环境释放、生产性试验、安全证书等审批程序。

按照许建香在研究中提出的——人乳铁蛋白转基因奶牛技术正在接受安全性审批，并有望上市的期许，现实来得不尽如人意，3年过去，仍未见上市进展。赖良学认为，当前的安全评价体系依然不够完善，不能有效促进转基因动物走向产业。

在采访中还有许多专家表示，转基因动物走向产业已然不再是科学问题。

湖南师范大学生命科学院教授刘少军团队曾与中国科学院院士朱作言的科研团队合作，研究出了不育的转基因三倍体鲤鱼。这个合作团队对该转基因三倍体鲤鱼的遗传、性腺发育、生长等方面开展了较系统的研究。

刘少军表示：“在当前大家闻‘转基因而色变的环境下，转基因动物走向产业，尤其是走向食用领域，有不少困难。公众在对转基因的认知上，存在许多疑虑。需要更多的时间和更多的证据来回答和消除这些疑虑。”

转基因动物研究进展 篇4

1 转基因动物制作方法

1.1 显微注射法 (microjection)

该法是指通过显微操作仪把外源基因注入受体动物的受精卵细胞中, 外源基因整合到受体细胞染色体上, 发育成转基因动物的技术, 是目前应用最广泛, 发展最早、最有效的方法之一。该法是美国人Gordon所发明, 由于条件限制, Gordon当时应用此法并未直接获得转基因小鼠, 但他的实验工作却给予了以后研究工作者有力的启发, 开辟了一条崭新的研究途径。1982年, Palmiter将5'端调控区缺失后的大鼠生长激素基因与小鼠金属硫蛋白I基因启动子相连接, 然后将融合基因注入受精小鼠雄原核, 成功研制出了著名的“超级小鼠” (super mouse) 即生出的7只转基因阳性鼠的2号鼠, 在生后74d时, 体重达到了同类转基因小鼠平均体重的1.87倍。这项研究成果经英国科学杂志《自然》发表, 在生命科学领域中引起了一场不小的轰动, 从此掀起了试验研究转基因动物热潮, 在不很长的时间里, 应用该方法相继研究了转基因兔 (布莱姆等, 1985) 、转基因绵羊 (哈默等, 1985) 、转基因猪 (哈默等, 1985) 、转基因牛 (罗西劳等, 1989) 及转基因山羊 (艾伯特等, 1991) 。

该法外源基因转移率整合率小鼠为6%~10%, 猪和羊分别为0.98%和1%, 鱼类通常可达10%~15%。外源基因随机整合到基因组内, 常导致宿主DNA中的染色体序列丢失、重排、插入突变, 有的造成严重生理缺陷。

1.2 逆转录病毒感染法

逆转录病毒感染法 (retrovirus-mediated gene transter) 是应用分子生物学技术, 将外源基因接到逆转录病毒 (一种RNA病毒) 载体上, 因此病毒感染动物胚胎。1974年, Jaenishch等将SV40 DNA注入小鼠胚腔中, 发现获得的小鼠体内有SV40 DNA整合。1975年, Jaenish用小鼠 (Moloney) 白血病毒 (Mo MLV) 作为载体, 将外源基因导入小鼠胚腔中, 实验证明, 病毒转染的小鼠胚胎可以发育成携带病毒基因的小鼠, 并遵从孟德尔定律, Mo MLV可以在成年小鼠体内重新被激活, 再使小鼠发生白血病。不过直到1998年, 尚无人能用逆转录病毒感染法生产转基因动物, 原因是它们所感染的基因转移生产出来的动物都是嵌合体 (chimera mosdic) 。1998年, Bremel等用将逆转录病毒直接注入卵母细胞方法才生产出转基因牛。

该法操作简单, 且能很快地得到适当病毒生产株。外源基因难以植入生殖系统, 成功率低, 产生的动物为嵌合体, 需要广泛的杂交, 以建立转基因系。携带的外源基因病毒载体, 在导入受体细胞基因过程中, 有可能激活细胞DNA序列上的原癌基因或其它有害基因。

1.3 胚胎干细胞插入法

胚胎干细胞插入法 (embryonic sterm cells gene transfer) 是通过电穿孔等方法将外源基因导入胚胎干细胞 (ES) , 然后将基因的胚胎干细胞插入培养的胚胎中。

1986年, Roberoton等利用携带neo基因的逆转录病毒载体转化小鼠的ES细胞注入囊胚后, 在获得的小鼠组织中发现有neo基因表达, 共得21只小鼠, 其中20只小鼠体细胞及生殖细胞中含有外源载体序列, 部分嵌合体小鼠可将外源DNA传递给F1代, 用这种方法制作转基因小鼠的阳性率接近100%, 为首次利用胚胎干细胞介导法培育成转基因小鼠。此后, Piedrahita等于1988年从猪胚胎中获得了干细胞克隆系, Stirce和Srtethenko等1996年获得了牛的胚胎干细胞, 为转基因在动物上的定点整合开创了新的领域。不过, 目前还只有小鼠的胚胎干细胞可供商业应用。其次, 即使有了胚胎干细胞, 由于尚须经过嵌合体阶段, 对小鼠来说比较容易, 但对于繁殖周期长的其它动物则有一定困难。

1.4 精子载体法

精子载体法 (sperm mediated gene tranter) 是将活动精子放入DNA溶液中, 当精子吸附外源基因后, 用这些精子进行体外受精, 再进行胚胎移植, 使外源基因得到表达的一种方法。早在1971年, Brack等将精子暴露于纯化的SV40 DNA中后, 在精子头部监测到放射性物质, 表明异源的DNA可以进入哺乳动物的精子, 而且精子可能将外源DNA携入卵母细胞。1989年, Lavitrano等首次报导了将小鼠精子与环状或线状的PSV2CAT质粒在等渗的缓冲液中孵育15min, 然后与小鼠卵子进行体外受精, 受精卵在2细胞时移入受体鼠的输卵管。在所产生的250只小鼠中, 有30%个体为转基因阳性, 转基因可转移给后代。目前精子载体法已在12种动物中获得了基因后代 (Spadafora, 1998) , 其中包括牛 (Schellender等, 1995) 、猪 (Sperandio等, 1996) 、兔 (Rottrmann等, 1994) 、小鼠 (Lavitrano等, 1989) , 这表明精子载体法是一种有用的转基因方法。

2 转基因动物技术的发展

2.1 研究转基因动物传统方法存在的问题

外源基因的整合率低, 是当前研究转基因传统方法存在的一个共同不足问题。有资料表明, 平均每注射40枚小鼠卵可能得到1只转基因小鼠。对绵羊、山羊、牛来说, 获得1头转基因动物则分别需要110、90、1 600枚卵, 一般来说, 只有半数的转基因动物 (如猪、鱼) 能够表达外源基因。以显微注射法生产转基因动物为例, 小鼠转基因阳性率为2.6%, 大鼠为4.4%, 兔为1.5%, 猫为0.9%, 绵羊为0.9%, 牛为0.7%。此法操作过程中造成胚胎机械损伤而导致胚胎死亡是整合率低的一个极其重要原因。

其次, 整合了的外源基因在动物体内没有预期功能, 即不表达或表达水平不高。造成这种原因, 有目的基因问题, 即不同的外源基因表达水平很不相同。如在转移GH基因猪中, 仅有转移r GH和p Gh的转基因猪生长速度加快, 而转移h GH和b GH等的转基因猪作用不明显, 尽管猪血浆中GH浓度增加, 但GH浓度与促生长作用不成比例。另外, 还有一点更重要的原因是外源基因在动物基因组内整合的位置, 即所谓“位置效应”的问题。目前我们所应用的传统转基因动物技术, 还无法控制外源基因整合位置, 而只能是随机的整合。因此, 科学家正在努力研究把外源基因整合到所需要的部位的所谓“定量整合技术”。

2.2 转基因克隆动物技术

该技术首先是将目标基因转移到一种胚胎或成体来源的培养细胞中, 筛选出已整合目标基因的细胞克隆, 建立转基因细胞系。然后再用去核卵母细胞质供体, 用转基因细胞系的细胞作核供体, 通过核移植产生重植胚胎, 再通过胚胎移植产生克隆的转基因动物。Wilmut研究小组在取得克隆绵羊多利后, 于1997年6月报导用胚胎细胞为核供体, 获得了能表达治疗人血友病的凝血因子IX转基因克隆绵羊“波利” (Polly) ;1997年12月又在美国的“Science”发表了用转染胚胎成纤维细胞获得6只转基因克隆绵羊的报道。目前转基因克隆绵羊能高水平地表达人凝血因子Ⅸ, 开创了转基因克隆动物技术研究的先河。

从下表列出Comball和Brink等人的实验结果分析可说明动物克隆方法生产出转基因动物的效率, 表现出较多优点是:转基因效率已显著超过显微注射法, 按出生的幼畜计算, 牛和羊的转基因效率均为100%, 由于核移植的后代100%均为转基因动物, 可以节约90%以上的受体动物, 而显微注射实验中受体母畜所孕育的95%是非转基因动物;用基因表达水平可以预测, 不靠基因整合的机遇, 在建立细胞系过程中, 在扦测基因整合, 可同时扦测基因表达, 使用表达水平合格的细胞系进行核移植 (克隆) 。

注:COMBELL和Brink等试验资料

2.3 转基因家畜技术路线

为提高转基因家畜成功率, 鉴于经典技术路线不足, 中国和英、美科学家于1997和1998年相继研究建立3条新的转基因技术路线。

2.3.1 整合胚胎移植技术路线。

我国上海医学遗传研究所黄淑帧教授等针对当前使用的经典技术路线的缺点, 作了3方面的改进:其一, 是用体外受精技术, 从羊的卵巢里获得卵细胞, 体外孵育成熟后, 加入精子进行体外受精, 在体外培养受精卵, 观察受精卵发育的整个过程, 找到受精卵显微注射的最佳时机, 使注射后的受精卵成活率达95%以上;其二, 在胚胎移植前对外源基因在胚胎体内是否已经整合作分子鉴定, 从中挑选有目的基因整合的胚胎进行移植, 使所出生的羊羔整合率在理论上可达100%;其三, 是改进胚胎移植技术, 采用经阴道非手术胚胎移植法, 大大减少了对受精卵的损伤, 使受孕率明显提高。以上3项技术相结合在一起, 使得转基因羊的成功率提高了好几倍。这条技术路线被中国科学院和中国工程院两院院士评为1998年中国十大科技进步之一。

2.3.2 核移植 (克隆) 技术路线。

该方法是由英国罗斯林研究所应用动物克隆 (核移植) 与转基因技术相结合研制转基因的方法。研制转基因羊所用的核移植方法和克隆绵羊“多利”的方法差不多, 只是在核移植前把外源基因导入到胎羊的成纤维细胞核中, 其基本过程是:首先将编码药物蛋白的外源基因导入到胎羊的成纤维细胞核中, 获得整合有外源基因的成纤维细胞;然后取羊的成熟卵, 去掉其中的细胞核, 得到只有细胞质 (胞质体) 的“卵子”;再从整合有外源基因的胎羊成纤维细胞中吸出细胞核, 通过显微操作, 将此细胞核植入去掉细胞核的“卵子” (受精体) 中, 组装成一个类似受精卵的具有发育全能性的组装细胞。这一组装细胞 (受精卵) 经电刺激后能分裂, 并在体外培养至囊胚期, 再移植进同步发情的受体动物子宫内, 让其发育成完整的个体。据英国罗斯林研究所的研究资料表明, 应用核移植方法研制转基因羊比应用经典技术路线成功率提高2.5倍。

2.3.3 整合卵受精技术路线。

这是1998年末, 美国威斯康星大学的科学家报道的一条转基因家畜技术路线。该法是将外源基因先导入卵子, 待卵细胞整合后再和精子受精。具体做法是:先将编码乙肝表面抗原的外源基因导入一种病毒 (逆转录病毒) , 构建成带有外源基因的病毒载体, 然后将该病毒感染乳牛的卵母细胞, 待卵母细胞成熟后, 再加入精子使之受精。结果在836个注入这种抗原基因的卵母细胞中, 有174个能受精并发育成早期囊胚。将其中10个囊胚移植入5头“养母”乳牛子宫内, 有3头怀孕, 生下4头小牛 (2公2母) 。检测这些牛的皮肤和血液细胞DNA, 发现4头都携带有导入的乙肝抗原基因, 就是说:应用这种方法获得的转基因成功率达到100%。

上述3条转基因家畜新技术路线, 均在不同程度上提高了转基因效率, 为批量研制转基因家畜开辟了道路。

3 转基因动物研究的应用

3.1 促进生长、提高产量、改善品质

“超级小鼠”的研究成功为培育大型动物开辟了新思路, 掀起了向动物体内导入GH基因研究的高热潮。20世纪80年代育成的各种转基因哺乳动物中, 就是以整合表达各种不同GH (生长激素) 基因个体为主, 其中猪是主要目标, 并先后育成了转人GH、大鼠GH、牛GH基因等外源DNA的转基因猪, 这些转GH基因猪表现出瘦肉率高等优良特性, 但由于原代转基因猪具有高致畸率、高胎死亡率等缺点, 难以育成一个稳定的具备良好生产性状遗传力的种群。

美国的pursel等人 (1989年) , 曾将牛的GH转入猪中, 生产出2个猪的家系, 其生长速度比对照猪提高11%~14%, 饲料转化率提高16%~18%, 我国陈永福等用自己构建的融和基因OMT/PGH进行基因转移, 获得转基因猪生长速度提高11.8%~14.8%, 饲料利用率提高10%。

澳大利亚科学家将羊毛的一种蛋白质 (La-白蛋白) 的主要成分半胱氨基酸导入绵羊胚胎, 繁殖出的转基因羊可使羊毛增产5%, 估计全年收入增加3亿美元。另外, Pouell等将无角蛋白型中间的细丝基因导入绵羊基因组, 转基因羊毛光泽度以及羊毛中毛脂含量明显提高。

3.2 培育抗病动物

将抗病毒基因导入受精卵。由此发育成的个体会具有抗病能力, 或者应该能减轻该种病毒侵染时为机体带来的危害。1989年, 美国农业部以禽白血病病毒 (ALV) 为载体, 获得了抗ALV的新品系鸡, Carba等将小白鼠抗流感病毒基因MXI转至鸡细胞中, 使鸡获得对禽流感的抗性;Chements等将绵羊髓鞘脱落病毒 (Visna) 的衣壳蛋白基因 (EVE) 转入绵羊, 所获得转基因羊的抵抗力明显提高。

另外, 干扰素是动物机体产生的一种免疫因子, 能增加机体各种病毒感染的能力。如导入B1-干扰素基因获得的转基因鼠, 对狂犬病毒的抵抗力明显提高, 感染病毒4d后无一死亡, 数月后仍有25%的转基因鼠健在;而对照组的同窝非转基因鼠感染病毒后4d内50%死亡, 6d内全部死亡。

3.3 生产药用蛋白

通过转基因动物生产珍贵的多肽或蛋白类药物, 是当前转基因动物研究热点, 这种转基因动物被称为生物反应器 (animal bioreactor) 。乳腺是生产药用蛋白的主要靶器官, 如果将编码有生理活性物质基因与乳腺特异表达基因启动子重组, 转入乳用家畜, 便可使这些具有生理活性的物质从乳汁中不断地分泌出来, 然后用蛋白提取技术从乳汁中分离生理活性物质, 作为珍贵多肽或蛋白药物。这种方法最大优点作为生物反应器转基因动物, 可以无限扩繁, 表达产物可大量生产, 成本低, 投资周期短, 其产物为活性比较接近天然蛋白, 能充分修饰具有稳定的生物学结构。

1997年, 英国科学家Wilmat等用绵羊胚胎细胞进行核移植, 成功获得了整合人凝血因子IX的转基因绵羊, 可从其乳汁中大量表述昂贵的医用人凝血因子IX。我国扬州大学与中国科学院发育研究所合作, 已研制出具有商业应用价值的人促红细胞生成素 (EPO) 的转基因的山羊。

应用转基因动物 (家畜) —乳腺生物反应器技术来制造基因药物, 也是一种可以获得巨额经济利润的新型产业。如荷兰金发马 (genpharm) 公司用转基因牛生产乳铁蛋白, 预计每年用牛奶生产出来营养奶粉的销售额是50亿美元, 其乳汁中含有a1-抗胰蛋白酶 (a1-antitrypsin) 可治疗肺气肿病 (一种因体内缺乏该蛋白酶而导致的遗传病) 。患这种病的病人以前只能依赖于注射人的a1-抗体胰蛋白酶作替代疗法, 价格昂贵。现在用转基因羊来生产这种蛋白酶, 每升羊奶可售6 000美元。

3.4 生产移植动物器官

异种器官的移植可能是解决世界范围内目前普遍存在器官短缺的有效途径。由于猪器官的体积、形状及DNA基本上与人类相似, 因此就成为理想的肾、心、肝等器官的供应者。但是, 异种器官移植时容易产生超急性免疫排斥反应 (HAR) , 会使移植物破坏, 阻止器官移植这一进程。

超急性免疫排斥反应 (HAR) 是一种剧烈的生理反应, 其主要机制是人体内存在针对猪器官组织成分的天然抗体, 这种天然抗体通过与猪血管内皮细胞表皮的靶分子 (a-半乳糖苷) 结合, 激活补体系统, 导致细胞毒作用。为了克服超急性免疫排斥, 英国科学家将抑制人体免疫排斥反应的基因导入猪的受精卵获得转基因猪。将这种猪的心脏移植至黑猩猩体内, 能够抑制黑猩猩的免疫排斥反应, 所以术后生存了60多天, 而对照猪的心脏移植仅活了55min。

现在, 科学家设想应用基因“剔除”技术, 把猪的a-半乳糖苷基因“剔除”剔除了天然抗体作用的靶分子, 从面就避免了机体对这种猪器官的免疫排斥反应。

4 前景展望

动物转基因技术 篇5

关键词：基因工程； 疫苗； 动物疾病； 防治；

疫苗接种在防治动物和人类的传染性疾病中发挥了重要作用，其运作机制是通过向体内注射由病原微生物加工而来的自动免疫制剂，从而对这种病原菌产生免疫作用。据统计，免疫接种每年能避免200万~300万例因白喉、破伤风和麻疹导致的死亡，可见疫苗接种在对传染性疾病的防治影响之大。基因工程疫苗的出现无疑会成为一种极富潜力的新型疫苗，进一步带动疫苗技术的发展。基因工程疫苗的分类

1。1 亚单位疫苗

亚单位疫苗又被称为重组或生物合成亚单位疫苗，它是一种合成基因产物，通过基因工程方法重组微生物中的抗原肽短基因和质粒等载体，从而生成大量的保护性肽段，再加入相应量的佐剂，即研制成亚单位疫苗。但由于疫苗内所含的抗原很少，达不到对疾病的防治效果，所以还需要借助单一蛋白质抗原分子对疫苗进行免疫反应诱导。亚单位疫苗有三大类，即细菌性疫苗、病毒性疫苗和激素疫苗，其中细菌性亚单位疫苗包括大肠杆菌、炭疽和链球菌等；病毒性亚单位疫苗包括狂犬病、乙肝和口蹄疫等[1]。在亚单位疫苗的研制过程中，有两点需要注意：一是要明确免疫活性抗原DNA的编码；二是要匹配表达系统与基因产物。此类疫苗没有感染性，所以相比其他疫苗免疫效力并不强，但其很环保，不会对生态环境有危害，并且可以鉴别多种感染病毒，对动物和人类的安全来说比较实用。

1。2 活载体疫苗

活载体疫苗是通过将抗原基因携带到一些不会致病的病毒或者细菌上，从而产生相应的免疫能力，再将这种具有免疫能力的抗原基因接种到动物身上，使之达到防治疾病的效果。相比其他疫苗，该疫苗有以下几种优点：它能消灭活疫苗，弥补疫苗的免疫缺陷；研制程度相对简单，且研制成本较低；免疫效果好、持续时间长、用量少；有利于检测和鉴别流行病。它也有比较明显的缺陷：可能会出现毒力反强的现象；个别没有种痘病毒疫苗的动物会染病；在二次疫苗注射时会发生排斥现象。基因工程疫苗在运用过程中的特点

2。1 动物基因工程疫苗的优势

与传统的疫苗不同，基因工程疫苗利用生物技术在将病原体的免疫保护作用存留下来的基础上，消除了无效和致病的病原体成分，这样便加强了疫苗的安全性和有效性；基因工程疫苗可以批量生产，这大大缩短了疫苗的生产时间，并且生产成本非常低；基因工程疫苗还可以通过检测病源蛋白抗体，看出感染动物和免疫动物的差别；通过活载体可以形成多价联合疫苗，起到“一针防多病”的效果。

2。2 运用过程中存在的问题

虽然基因工程疫苗的运用带来了可观的效果，但它并不完善，会出现一些安全上、免疫力上的问题，基因工程疫苗在运用过程中主要有以下几个问题：基因工程疫苗虽然在安全问题上已有了很大的改善，其毒力反强的可能性也降到了很小，但这些问题并没有得到彻底消除和解决，在安全问题上，DNA重组技术是否会对生物有一定的安全隐患，还有待研究；在DNA重组技术上，基因的稳定性和免疫原性等问题有待更深入的临床测试，并且要考虑动物遗传背景和个体差异性；在免疫程序的制定上，需要注意动物母源抗体和免疫效力等问题。基因工程疫苗的具体应用

3。1 亚单位疫苗

亚单位疫苗的研制出现引起了许多动物疾控中心的重视，不同种类的亚单位疫苗在应用之前都进行了相应的实验，结果表明这种疫苗在动物疾病的防治上有着重要的作用，由上海生物工程中心研发的仔猪大肠埃希菌k88、k99双颊基因工程灭活疫苗，由宁夏大学研发的羔羊、犊牛大肠埃希菌基因工程灭活疫苗，这两种亚单位疫苗对于动物幼崽腹泻问题都有重要的防治效果[3]。

3。2 活载体疫苗

活载体疫苗在对动物疾控上应用十分广泛，它有着一针防多病的功效。常见的活载体病毒有痘苗病毒、禽痘病毒、火鸡疱疹病毒等。通过国家相关部门长期的疫苗研究工作，目前研制的活载体疫苗正是一针多防，以H5亚型禽流感病毒HA与NA基因的重组禽痘病毒疫苗r FPV—HA—NA为主，也含有对禽流感病毒H5N1和H7H1的抵抗因素，并且能防治痘病毒的感染。结语

基因工程疫苗有多种类型，而每种类型都有相应的优势和劣势，会产生不同的效果，因此各地的疾控中心和相关部门要认清动物疾病的特点，全面了解和掌握各类疫苗的优缺点，合理地匹配，从而达到理想的防治效果。基因工程疫苗作为一种新型防治技术目前还没有得到广阔的发展空间，但就目前的生物技术来说，它在与传统疫苗的相比，有一针治多病、研制程序简化、可大规模生产等诸多优势，可见它在动物疾控上的应用已经成为不可逆转的趋势。但它在安全、DNA重组技术、存在毒力反强等诸多方面的不完善也值得引起相关部门的重视，对其不断完全完善，从而确保其安全性和有效性。

参考文献

[1]宁志军。基因工程疫苗在动物疾病防治中的应用[J]。甘肃畜牧兽医，2016（9）：24—25。

[2]王寿富。基因工程疫苗在动物疾病防治中的应用[J]。北京农业，2014（33）：169—170。

影响动物基因表达调控的因素 篇6

【关键词】动物；基因表达调控；影响因素

1 动物营养与基因表达调控

Castor（1987）描述了营养与基因表达的关系是：营养素摄入影响DNA复制和改变染色体结构，二者共同调控基因表达，即调控基因转录、翻译，决定基因产物，从而维持细胞分化、适应与生长。目前研究较清楚的是磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）基因的表达受日粮中糖的调控[1]，微量元素锌对基因表达的调控作用，其他营养物质如脂肪、维生素等均可调控某些基因的表达，如日粮中三酰甘油酯的含量和种类可调节胰脂肪酶基因的表达。

2 动物繁殖与基因表达调控

随着分子生物学技术的不断发展，越来越多与繁殖相关的基因被克隆和鉴定，人们对繁殖与基因调控也越来越感兴趣，动物繁殖与基因表达调控的研究已经成为当今动物繁殖学研究的一个热点领域。促性腺激素释放激素（GnRH）在体内的重要功能是由促性腺激素释放激素受体（GnRH R）介导的，GnRH 及其受体相互作用的调控在繁殖性能调控中是一个关键性位点。GnRH 受体基因的表达调控受多種内源性因素的影响，研究表明，GnRH 受体的合成受四种基本因素调控，即GnRH自身、雌二醇（E2）、孕酮（P）和抑制素。精子在发生的不同阶段，睾丸组织特异性基因按严格的时间、空间特性表达，这些基因在不同的调节因子作用下从多个层次对精子发生过程进行调控，最终形成成熟的精子[2]。哺乳动物胚胎着床前，这一发育阶段基因表达与调控的研究表明：早期胚胎发育受母源型，即卵母细胞内mRNA 和蛋白质的调控，随着母型mRNA 的消耗，合子型基因取而代之进行合子型调控。其中合子型基因激活是调控过程中的关键事件。

3 动物免疫与基因表达调控

动物主要组织相容性复合体（MHC）是指染色体上的一组紧密连锁的高度多态的基因座所组成的一个遗传区域，是一个与免疫应答密切相关的多基因家族。其编码产物是免疫系统中极为复杂且具多态性的一类细胞表面转膜蛋白，称为MHC抗原，主要分布在各种细胞的表面，MHC参与了机体内外抗原的呈递，从而影响机体对疾病的抵抗力，对动物MHC基因表达调控的研究具有很重要的意义。动物MHCI类基因的表达调控因子分为顺式作用因子和反式作用因子两类，动物MHCI类基因顺式作用元件可分别与相应的反式激活蛋白分子结合，调控Ⅱ类基因的组成性和诱导性。对动物MHC分子表达调控的研究，有助于更好地了解MHC分子在免疫抑制、自身免疫性疾病和器官移植等免疫学现象中的作用，为基因治疗方法提供理论依据[3]。

4 动物抗性基因与基因表达调控

对一些种属特异性疾病，可以从抗该病的动物中克隆出目的基因，导入易感动物品种的基因组，若该目的基因能够在宿主基因中表达，那么转基因动物对该病毒具有一定的抵抗力，由此可培育出抗该病品系[4]。1989年，美国农业部以禽白血病病毒（ALV）为载体，获得了抗ALV的新品系鸡。1992年，Berm将小鼠抗流感基因转入了猪体内，使转基因猪增强了对流感病毒的抵抗能力。2000年，Ken等将溶葡萄球菌酶基因转入小鼠乳腺中，用来防治由金黄色葡萄球菌引起的乳腺炎，结果证实高表达量的小鼠乳腺具有明显的抗性，这对于防治奶牛乳腺炎具有潜在的应用前景[5]。

5 动物遗传资源的保护与基因表达调控

传统畜禽遗传资源保护是以活畜保存为主。随着分子生物学技术的发展，利用分子生物技术建立畜群、禽群的DNA 基因组文库，即利用DNA重组技术将决定畜禽重要经济性状的主基因或全部基因整合到某些特殊的基因载体上，然后用这些载体感染宿主细胞，通过宿主细胞的大量增殖构建各基因DNA 片段的无性繁殖系（克隆），当制备的克隆数把该畜禽品种的全部基因包括在内时，这一克隆的总体就是该畜禽品种的基因文库，保存该基因组文库就等于保存了该畜禽品种。

参考文献

[1]史莹华，王成章，许梓荣.分子生物学技术在动物营养学中的应用与展望[J].河南农业大学学报，2005，39（4）：83-86.

[2]郑家茂，赵国，方乐云等.促性腺激素释放激素受体及其基因表达调控[J].动物医学进展，2000，21（2）：56-59.

[3]周银松，葛红山，丁家桐.哺乳动物胚胎着床前的基因表达与调控[J].国外畜牧科技，2001，28（1）：56-59.

[4]余振东，桂耀庭，唐爱发等.精子发生基因表达的调控研究进展[J].中国实验诊断学，2006，10（1）：104-107.

动物转基因技术 篇7

1 转基因动物的研究概况

1974年Jaenisch等将猿猴的空泡病毒 (SV40) 的DNA注入小鼠的胚泡, 培养出转基因动物[1]。1982年Palmiter等将大鼠生长激素基因转入小鼠受精卵中, 获得了生长快、体型大的超级小鼠[2], 从而开始转基因动物的研究。1997年英国罗斯林研究所Wilmut等首次利用羊体细胞获得克隆羊“多莉”, 突破了有性生殖的框架, 表明高等动物也可以由无性生殖来繁殖[3]。同年, 美国PPL公司和Roslin研究所合作, 利用该法生产出具有乳腺表达人第九因子的绵羊。Schnieke等于1998年利用该法得到表达治疗人血友病的凝血因子IX的转基因克隆绵羊[4]。2001年英国PPL公司宣布世界首例转基因克隆猪诞生。Berkel等利用牛的αs12酪蛋白启动子与人乳铁蛋白基因组的6.2 kb片段构建转基因载体, 通过显微注射获得转基因牛[5]。

1984年我国开始进行转基因动物研究, 同年获得了含人β-珠蛋白基因的转基因小鼠。1985年和1986年又分别获得了含人生长激素 (MT-hGH) 基因的转基因泥鳅和小鼠。1987年获得含有大肠杆菌galk和gpt基因的转基因小鼠。以后又相继获得了含HbgAg乙型肝炎表面抗原基因的转基因兔、转基因猪、含EPO基因和人乙型肝炎表面抗原基因 (HbgAg) 的二种乳腺特异性表达的转基因山羊、含人凝血因子IX的转基因山羊 (1998) 、含人血清白蛋白基因的转基因奶牛 (1999) 等。2008年吉林大学的欧阳红升教授成功获得了带有猪瘟病毒抗性的转基因猪。这些研究标志着我国转基因技术进入了崭新的阶段。

2 转基因动物的原理

转基因动物指通过基因工程技术将目的基因导入生殖细胞、早期胚胎干细胞和早期胚胎, 并整合到受体细胞的基因组中, 它们经过各种发育途径形成所有细胞都包含目的基因的个体, 称转基因动物 (也称个体表达系统) [6]。

利用转基因技术, 人们可以在动物基因组特定的位点引入所设计的基因突变, 模拟造成人类遗传性疾病的基因结构或数量异常;可以通过对基因结构进行修饰, 在动物发生、发育的全过程研究体内基因的功能及其结构功能的关系;可以在动物基因组引入病毒基因组以模拟病毒性疾病的发病过程;可以通过引入具有重要药用价值蛋白的编码基因, 使动物成为该药物蛋白的生产场所;可以将所引入的DNA片段作为环境诱变剂作用的靶DNA, 通过对它回收后的结构分析, 研究诱变剂造成的DNA损伤和诱发基因突变的规律[7]。

从原理、技术及在生命科学研究领域中可将转基因动物研究分为以下3个部分: (1) 上游部分:克隆目的基因, 分析基因的结构并在体外或其他系统中进行功能研究; (2) 中游部分:设计遗传修饰策略 (包括载体系统的构建等) , 选择适当的靶细胞进行基因转移和鉴定, 在此基础上将遗传修饰由细胞向整体动物过渡, 实现对整体动物基因组进行人为修饰的目的; (3) 下游部分:按育种程序进行工程动物的选育和建系, 在整体动物的背景上对目的基因的功能进行详细的研究, 并进一步开发利用符合设计要求的遗传工程动物。

转基因动物的遗传修饰策略包括: (1) 导致产生新功能的基因组修饰 (gain of function, GOF) ; (2) 导致功能丢失的基因组修饰 (loss of function, LOF) , 主要有插入突变、大片段缺失突变、点突变及条件性基因缺失突变; (3) 导致基因替换的基因组修饰; (4) 染色体畸变[8]。

3 转基因的主要技术

3.1 显微原核注射法

显微原核注射法利用显微操作系统和显微注射技术将外源基因直接通过注射器注入实验动物的受精卵中, 再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受精卵移植到受体子宫内继续发育成转基因动物。试验的过程中大多数转基因动物能把整合的基因传给后代, 建立转基因动物体系。Brandl等利用该方法成功制作成了转基因兔、转基因猪和转基因绵羊[9]。目前通过显微注射法已经获得的转基因动物有兔、猪、羊、牛和鱼等, 其整合率小鼠为6%~40%, 猪和羊分别为0.98%和0.1%, 鱼类可达10%~75%[10]。

这种方法的优点是转基因效率比较稳定, 注射基因片段大小不受限制, 无需载体, 制备相对容易。缺点是操作复杂, 效率较低, 成本较高, 并且操作对胚胎损伤较大, 影响胚胎存活。

3.2 逆转录病毒感染法

逆转录病毒作为转基因载体, 感染胚胎成功获得转基因动物:将目的基因重组到逆转录病毒RNA载体上, 主要是利用逆转录病毒DNA的LTR区域具有转录启动子活性这一特点, 将外源基因连接到LTR下部进行重组后, 包装成高滴度病毒颗粒, 人为感染着床前或着床后的胚胎, 或微注入囊胚腔中, 外源基因进入宿主细胞后, 反转录为DNA, 并在整合酶和其末端特殊核酸序列的作用下整合到宿主细胞的基因组中进行表达和遗传得到转基因动物。

这种方法的优点是操作简便, 无需特别的仪器设备;整合效率高, 效果稳定, 通常外源基因是单拷贝整合到受体基因组中;而且转染不受胚胎发育阶段限制。缺点是感染宿主时, 为非同源整合, 结合不稳定, 调控区内可能会发生相互作用, 所以应选择能稳定整合表达的外源基因, 并用高感染力的反转录病毒作载体;若外源基因的长度超过8 kb, 整合后的表达率低, 并且有潜在的致病性和致癌性。

3.3 胚胎干细胞介导法

囊胚期内细胞团 (ICM) 是多潜能细胞, 可以传代增殖。当这些细胞被注入另一囊胚期胚胎的囊胚腔之后, 会很快与受体ICM聚集在一起, 共同参与正常胚泡的发育, 产生一部分细胞含有外源基因的嵌合体, 再将这种嵌合体动物与正常动物连续交配, 则可生产出转基因动物[11]。胚胎干细胞 (ES细胞) 是早期胚胎的内细胞团经体外培养建立起来的多功能细胞系, 利用反转录病毒载体、电击法等将外源基因导入ES细胞内, 外源基因通过随机插入或者同源重组的方式整合到胚胎干细胞的基因组中, 然后把转染的胚胎干细胞注射入受体囊胚腔, 参与各种嵌合体的形成。将来出生的动物的生殖系统就有可能整合有外源基因, 通过杂交繁育得到含纯合目的基因的个体, 即为转基因动物。Thompson等利用DNA同源重组, 首次在ES细胞中成功进行了基因打靶, 定点修复了E14TG2α细胞株中的hprt-突变型, 获得了hprt-得到纠正的纯合体小鼠[12]。

ES介导法的优点是可对转化的干细胞进行阳性选择, 提高了转基因效率。用外源DNA转染后胚胎干细胞可以被克隆, 继而可以筛选含有整合外源DNA的细胞用于细胞融合, 由此可以得到很多遗传上相同的转基因动物。但ES介导法的缺点是ES建株很困难, 需要预先选择和克隆基因转移型细胞, 而且许多嵌合体转基因动物生殖细胞内不含有转基因, 第一代一般是嵌合体, 很难把外源基因遗传给后代。由于家畜干细胞系没有完全建立, 它的运用前途受到很大的限制。

3.4 精子载体法

精子载体法是一种直接用精子作为外源DNA载体的转基因方法。精子能够吸附外源DNA, 大多数被吸附的外源DNA位于精子头部的赤道段和顶体后区, 精子的这种吸附DNA的能力是由精子头部的蛋白所介导的。少数DNA能够进入精子的核区, 这部分DNA只有极少数能够整合到基因组上[13]。然后将精子用于体外受精, 并进行胚胎移植, 产生的后代中就有一定比例的动物能得到外源基因的表达。现已成功制备转基因鸡、鱼、牛、羊、兔等[14]。1989年, Lavitrano等将小鼠精子与线状或环状pSV2CAT质粒一起孵育15 min后, 再与成熟卵细胞进行体外受精, 产生转基因小鼠, 且转基因效率高达30%[15]。1999年, Perry等报道利用胞质内显微注射法制作转基因小鼠[16]。预先将小鼠精子与编码绿色荧光蛋白的外源DNA共孵育1 min然后将精子的头部显微注射入减数分裂II期的小鼠卵母细胞质中, 后代中20%的小鼠表达了绿色荧光蛋白。新疆畜牧科学院绵羊中心 (农业部畜牧兽医生物技术重点实验室) 运用精子载体法得到了8只绵羊。

运用精子载体法生产转基因动物时, 许多因素影响着DNA与精子的结合。例如较长的DNA片断 (7 kb) 与较短的DNA片断 (150~750 bp) 相比, 较短的DNA片段更容易被精子所摄取。

3.5 体细胞核移植转基因法

体外培养的体细胞经外源基因转染后, 筛选获得转基因的阳性细胞群。用这些阳性细胞群作为核供体, 通过体细胞核移植技术, 生产转基因胚胎, 通过胚胎移植将转基因胚胎移植给受体母畜, 即可直接获得转基因动物。转基因动物携带的外源基因在世代交替过程中可逐代传递。1996年, Campbell等用体细胞核移植转基因技术成功获得了世界上第一只转基因羊Dolly[17]。之后, 各国科学家相继报道了类似的研究成果。目前通过细胞核移植获得的动物有牛 (Cibelli, 1998) 、猪 (Lai, 2002) 和山羊 (Keefer, 2001) 等。2008年吉林大学的欧阳红升教授成功获得了带有猪瘟病毒抗性的转基因猪。

这种方法的优点是效率高, 理论上是100%。由于移植的胚胎就是转基因胚胎, 所以可以明显降低受体的成本, 从而使生产转基因动物的成本大大降低。缺点是该技术还处于发展阶段, 很多技术环节还有待于进一步的完善和提高。

此外, 还有人工酵母染色体法、阳离子脂质体介导的DNA转染法、原生殖细胞介导法、磷酸钙共沉淀法、电穿孔法以及精原干细胞移植法等[18,19], 这些方法也先后被应用于动物的转基因当中, 并也获得了一定的成功。但总体来说, 在转基因动物的研究中以上综述的五种技术居多, 并取得了较多的成果。

4 转基因动物的检测方法

4.1 染色体和基因水平

DNA斑点杂交是通过直接将变性的待测DNA样品点在尼龙膜 (或硝酸纤维素膜) 等固体支持物上, 然后和探针杂交, 从而检测样品中是否存在目的DNA序列。PCR反应是通过反复重复变性、复性、延伸过程, 则在短时间内可将两引物间模板扩增至百万倍[20]。染色体原位杂交是确定转基因在染色体上确切位置的重要手段, 其原理是利用碱基互补的原则, 以放射性同位素或非放射性同位素标记的DNA片段作探针, 与染色体标本上的基因组DNA在“原位”进行杂交, 经放射自显影或非放射性检测体系在显微镜下直接观察出目的DNA片段在染色体上的位置[21]。

4.2 转录水平

在mRNA水平检测外源基因是否表达, 通常在做完整合检查, 并有足够子代动物数量时进行。可采用Northern印迹法、RT-PCR、real time PCR、引物延伸分析、RNase保护分析、核酸酶S1保护分析法。

4.3 翻译水平

Western印迹分析和免疫酶标法检测表达蛋白质的方法。Western具有从混杂抗原中检测出特定抗原, 或从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性, 还可以对转移到固相膜上的蛋白质进行连续分析, 具有蛋白质反应均一性、固相膜保存时间长等优点, 因此, 该技术被广泛用于蛋白质研究[22,23]。ELISA方法中所用的酶有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶等。由于HRP活性强、价廉和性质稳定, 故在ELISA中使用最广。

5 在畜牧业中的应用

5.1 动物抗病育种

通过克隆特定抗病基因组中的某些编码片段, 加以一定形式的修饰以后转入畜禽基因组, 如果转基因在宿主基因组能得以表达, 那么畜禽对该种病毒的感染应具有一定的抵抗能力, 或者应能够减轻该种病毒侵染时对机体带来的危害。其用于遗传育种, 不仅可以加速改良的进程, 使选择的效率提高, 改良的机会增多, 并且不会受到有性繁殖的限制。利用转基因技术有可能在较短时期内培育出常规方法不能或需长期培育才能育成的品种或种群, 是一项极有前途的研究领域。1986年, 中国科学家第一次把生长激素基因成功地转移到金鱼体内, 以后又成功地把人类、小鼠和其他鱼类的基因转移到多种鱼体内。美国科学家也成功地把某种生长基因转移到另一种鱼体内, 转基因鱼生长速度加快了, 体型变大了, 这就是人们称谓的“兰色革命”。

Clements将Visna病毒的衣壳蛋白基因 (Eve) 与其长末端重复导入绵羊基因组, 得到了3只成纤维细胞表达Eve基因的母羊, 人们已经获得了转入禽类白血病病毒 (ALV) 的衣壳蛋白基因env的转基因鸡, 获得的转基因鸡对禽类白血病病毒具有一定的抗性。Donovan等将编码溶葡球菌酶的基因转入奶牛基因组中获得转基因牛, 证明在其乳腺中表达的溶葡球菌酶可以有效预防由葡萄球菌引起的乳房炎, 转基因牛葡萄球菌感染率仅为14%, 而非转基因牛对照感染率达71%[24]。

5.2 改良动物生产性能“超级小鼠”的诞生为

培育大型动物开辟了新的思路。Pursel等曾把牛的生长激素基因转入猪, 生产出两个猪的家系, 其生长速度提高11%~14%, 饲料转化率提高16%~18%;美国科学家培育的转基因鲁鱼可增产20%~40%。我国的陈永福等用融合基因omT/GH进行基因转移, 转基因猪的生长速度提高11.8%~14.2%, 饲料利用率提高10%, 瘦肉率也有所增加;另外, 转基因鱼的生长速度提高20%, 节约饲料10%, 现有1 000多尾的转基因鱼。1996年damak等将小鼠超高硫角蛋白启动子与绵羊的IGF-ⅠcDNA融合基因显微注射到绵羊原核期胚胎中, 转基因羊的净毛产量比非转基因羊的净毛产量高6.2%。Brophy等报道通过转基因克隆技术提高牛自身β2酪蛋白基因、κ-酪蛋白基因的拷贝数, 使牛奶中β2酪蛋白的含量提高了8%~20%, κ-酪蛋白的含量提高了2倍, 大大改变了κ-酪蛋白与总蛋白的比例。2003年3月, 中国农业大学李宁课题组成功获得中国第1头体细胞转基因克隆牛, 同年10月, 又获得世界上第1头转人岩藻糖转移酶基因的体细胞克隆牛。郭志勤等通过精子载体法生产了15头转人胰岛素原基因的奶牛, 并在奶中检测到外源蛋白表达。Kuroiwa等将MMCT与体细胞克隆技术相结合, 把含有整个人类免疫球蛋白重链基因IgH和轻链基因Igλ的染色体片段转入牛的原代胎儿成纤维细胞, 获得了4只健康存活的转基因克隆牛, 它们的血液中能不同程度表达人类多克隆抗体。Richt等又通过基因打靶技术将牛的PRNP基因双位点灭活, 获得存活了2年以上的转基因牛[25]。这些牛在临床解剖、生理发育、组织病理以及免疫和生殖发育方面都很正常, 而且在体外试验中能够很好地抵抗疯牛病的传染, 这为生产不含朊蛋白的肉、奶制品提供了一种很好的方法。

6 展望

转基因动物的研究虽然取得了显著进展, 但整合和表达效率低、转基因的遗传率低和生产成本高都是转基因技术中存在的问题, 且外源基因的整合机制尚不清楚, 转基因在宿主基因组中的行为难以控制, 阻碍了该技术的发展。尽管如此, 基因打靶与核移植技术的结合是创建转基因动物很有前途的一种新方法, 可以在创建转基因动物之前在细胞中将目的基因插入染色体的特异位点, 避免基因随机整合带来的位置效应, 同时剔除或替换干扰目的蛋白分离和引起移植组织排斥的动物基因, 将转基因动物的筛选提高到细胞水平。采用体细胞核移植技术比传统的显微注射技术更具优点。体细胞数量远比受精卵丰富, 有利于降低生产成本;生产转基因动物的效率高, 在鉴定了适用的细胞克隆及其性别后, 可以获得速成动物群。

毛皮动物毛色调控基因的研究进展 篇8

研究发现,调控毛皮动物毛色的主要候选基因有MC1R基因、Agouti基因、TYR基因、CBD103 基因、SILV基因和KIT基因等,其中MC1R基因和Agouti基因是研究较早并已证实能调控哺乳动物毛色变异的2 个关键基因［1］。

1 MC1R基因、作用机理及其与毛皮动物毛色表型的相关性

MC1R( melanocortin receptor 1 ) 基因仅有1 个外显子,可编码黑皮质激素受体1,MC1R属于E族G蛋白耦联受体,有7 个跨膜区,约包含317 个氨基酸长度。MC1R能在皮肤中表达,在色素产生的类型方面起重要作用［1］。

细胞膜上的MC1R与促黑激素( α - MSH) 和促肾上腺皮质激素( ACTH) 结合后,使与其耦联的G蛋白转变为三磷酸鸟苷( GTP) ,从而激活膜上的腺苷酸环化酶系统,生成环腺苷酸( c AMP) ,随后进一步激活酪氨酸激酶,进而使酪氨酸( TYR) 活化,然后TYR开始参与黑色素的合成。如果黑色素细胞中活化的TYR过量,细胞会合成真黑素,反之细胞会合成褐黑素［2］。

目前,MC1R基因与毛皮动物毛色表型的相关性研究报道较少。1997 年,D. I. Vge等［3］对不同毛色狐狸MC1R基因进行了克隆分析,在携带阿拉斯加银色等位基因EA的深毛色狐狸MC1R基因中发现了一个组成型活性突变( C125R) ,证实深色狐含有显性Extension等位基因。2005 年,D. I. Vge等［4］又以北极狐为研究对象,通过PCR - RFLP和直接测序的方法发现蓝色北极狐和白色北极狐MC1R基因编码区有2 个变异位点,即蓝色北极狐编码区的第5 个位点和第280 个位点的甘氨酸和苯丙氨酸均被半胱氨酸替代,由此阻止了冬季白毛颜色的表达。J. I. Han等［5］为了确定野生型貉黄毛色的遗传机制,比较了黄色貉和正常色貉MC1R基因的序列及其mRNA和蛋白质的表达水平,结果在5'非翻译区发现了2 bp的缺失,黄色貉MC1R蛋白的表达水平显著低于野生型,提示黄色貉增加了褐黑素的合成。J. Nowacka -Woszuk等［6］检测和比较分析了家犬、赤狐、北极狐和中国貉的整个编码区和部分3'非翻译区序列。在编码区,赤狐和北极狐共计发现17 个错意突变位点,其中有6 个SNPs为赤狐独有,2 个SNPs为北极狐独有; 貉共发现9 个错意突变。在3'非翻译区,赤狐和北极狐均发现3 个SNPs,貉发现1 个SNP。柏蒙蒙等人研究发现,红褐色貉MC1R基因编码区426 bp处存在1 个SNP( A→T) 。孙静［7］在貉MC1R基因300 bp处酶切得到AB和BB两种基因型,其中红褐色貉为AB基因型,野生型貉为BB基因型,推测等位基因A可能参与控制毛色的红褐色表型,等位基因B可能参与控制野生型毛色( 青灰色或青黄色) 表型。

2 Agouti基因、作用机理及其与毛皮动物毛色表型的相关性

Agouti基因表达时,可引起褐黑素的产生,相反则引起真黑素的产生。Agouti基因编码Agouti信号蛋白( ASIP) ,该蛋白是一种旁泌信号分子［8］。ASIP于1993 年被发现,后被证实其由约130 个氨基酸组成,而且含有1 个半胱氨酸环。

ASIP是MC1R的颉颃剂。ASIP与 α - MSH竞争性地结合MC1R,ASIP与MC1R结合后可阻断 α -MSH的起始信号,然后阻碍c AMP的产生,致使c AMP含量减少,最终导致真黑素合成量增加,褐黑素合成量减少［8］。

关于Agouti基因变异与毛皮动物毛色的相关性研究报道极少,目前仅见D. I. Vge等［3］报道携有隐性等位基因( aa) 的黑色标准银狐Agouti基因存在第1 外显子的缺失。

3 TYR基因、作用机理及其与毛皮动物毛色表型的相关性

哺乳动物酪氨酸酶( TYR) 是一种Ⅰ 型膜结合糖蛋白,其TYR基因包括5 个外显子和4 个内含子,编码序列长约1. 6 kb。TYR是动物黑色素细胞中黑色素合成的限速酶,是一个含铜的氧化还原酶,催化酪氨酸氧化成多巴,再将多巴氧化成多巴醌,最后多巴醌经过一系列的生化反应合成黑色素。TYR在黑色素合成过程中至少具有酪氨酸羟化酶和多巴氧化酶活性,其活性决定着黑色素合成的种类与数量,高活性的TYR导致真黑素产生［9］。

TYR基因若发生功能性突变,可导致动物毛色出现白化现象,此现象已经在人、牛、家猫和猕猴等动物上得到了证明。在毛皮动物方面,R. Anistoroaei等［10］在半同胞貂家族中发现了与白化表型相关的2 个微卫星标记Mvi6025 和Mvi6034,随后通过分析野生型与白化型貂的TYR基因序列,在外显子1 存在1 个无义突变,即原编码半胱氨酸的TGT转变成1 个终止密码子TGA ( c. 138T > A,p. C46X;EU627590) ,突变使该基因90% 以上的产物( 包括催化结构域) 缩短了,因而导致美国水貂的白化表型。B. F. Benkel等［11］通过对美国貂罕见毛色表型———大理石花纹表型的研究发现,显示大理石花纹表型貂的TYR基因外显子4 存在1 个突变( c. 1835C > G,p. H420Q) ,因此大理石花纹表型貂也被称作喜马拉雅山貂。

4 β - defensin 103 基因、作用机理及其与毛皮动物毛色表型的相关性

β - defensin 103 基因也称CBD103 基因,其编码的防御素是一种富含精氨酸残基的分泌性多肽,通常包含28 ~ 54 个氨基酸残基,分子质量为4 ~ 6 ku。

β - defensin具有直接抵抗病原微生物和免疫调节作用,但因其结构与Agouti蛋白相似,所以还会与Agouti蛋白、α - MSH竞争性地结合MC1R,进而改变黑色素合成通路,导致黑色素合成的类型、数量发生变化,最终改变动物的毛色［12］。

β - defensin 103 基因对家犬和转基因小鼠的毛色类型转换有简单而强大的作用［12］,但目前在毛皮动物上还未发现 β - defensin 103 基因与毛色表型相关的研究报道。

5 SILV基因、作用机理及其与毛皮动物毛色表型的相关性

SILV ( silver locus protein homolog ) 基因又称为PMEL( premelanosome protein) 基因,编码前黑素体蛋白或黑色素特异性糖蛋白。SILV是一个分子质量为100 ku的 Ⅰ 型跨膜糖蛋白,主要在皮肤和眼睛的黑色素细胞中表达［13］。

在黑素体形成的初级阶段,SILV具有重要作用［14］。在黑素体形成的第2 阶段,即前黑素体Ⅱ阶段,被蛋白酶处理的SILV蛋白碎片会聚集形成纤维状条纹,这些纤维状条纹将成为黑色素存储的基质,且与真黑素的形成有关。SILV具有聚合、稳定黑色素中间体的作用和( 或) 阻止有毒的黑色素中间体对黑色素细胞的破坏［15］。目前,在毛皮动物上未见SILV基因与毛色表型相关的研究报道。

6 KIT基因、作用机理及其与毛皮动物毛色表型的相关性

KIT基因与白蛋白( albumin) 和维生素D结合蛋白( Gc) 的位点密切相关,编码肥大细胞生长因子受体,该受体属于酪氨酸激酶第Ⅲ亚族。KIT由5 个免疫球蛋白区、1 个跨膜区、1 个近膜区和1 个细胞内蛋白激酶域组成,其在黑色素生成、肥大细胞发育和功能体现、配子发生和造血等过程中具有重要作用［16］。

KIT基因正常表达肥大/ 干细胞生长因子( MGF /SGF) 时,黑素细胞前体物正常迁移,导致黑素细胞的产生,随后该细胞内充满黑色素颗粒,最终使动物毛表现出有色; 反之,如果KIT发生突变或MGF/SGF缺失,则会影响黑素细胞前体物的正常迁移并使黑素细胞减少,进而导致毛囊缺乏黑素细胞和黑色素颗粒,最终使动物毛色表现出白化现象［17］。

在毛皮动物方面,C. Y. Bai等［18］通过克隆获得了银黑狐KIT基因完整编码区序列,对比家犬和狐狸KIT基因所编码的氨基酸序列后发现,二者仅有的差异是在家犬信号肽区有2 个亮氨酸残基的插入和相邻谷氨酰胺/亮氨酸的突变。对比家犬和狐狸的KIT基因c DNA序列后发现,在760 ~ 762 bp处存在3 个碱基( CAG) 的插入/缺失及2 个转录剪接变异体存在12 bp的差异,这些结果为今后深入研究狐狸KIT基因提供了重要的基础信息。S. Q. Yan等［19］利用RT - PCR技术鉴定了显性白狐和正常蓝狐KIT基因的转录本,序列分析后发现,正常蓝狐KIT转录本包含完整编码区序列( 2 919 bp) ,而显性白狐则存在外显子12 的缺失。基因组序列分析后发现,在显性白狐和正常蓝狐的内含子12 存在1 个SNP和1 bp的缺失/插入( c. 1867 + 1G > T) ,由此导致络氨酸酶的失活。上述结果表明,KIT基因内含子12 第1 个碱基的替换会导致基因翻译时跨越外显子12,最终导致蓝狐表现为显性白色。

7 小结

动物脂肪代谢关键基因的研究进展 篇9

1 脂肪酸合成酶 (FAS)

FAS是一种基本的代谢酶类, 催化乙酰Co A和丙二酸单酰Co A合成软脂酸, FAS的多少和活性的高低对动物体脂沉积具有重要意义, 在动物体脂沉积过程中发挥重要作用, 其表达水平的升高能够显著增加三酰甘油在体内的沉积[1]。

在能量代谢过程中, 乙酰Co A是合成脂肪的起点, 它可以进入三羧酸循环, 完全氧化, 为生物细胞提供能量来源。丙二酰Co A是脂肪酸合成酶的主要底物, 它的增多意味着能量过剩, 如不控制, 将加速脂肪合成。

近年来的研究发现, 癌细胞的生长依赖于FAS的活性, 且与肥胖、癌症等疾病的关系密切, 在具有侵袭性的癌组织中持续高表达。FAS抑制剂的研制有望为相关疾病的治疗提供新的方法。经FAS抑制剂处理的小鼠, 可以减少进食量, 增加能量消耗, 有明显的减肥效果;肿瘤的发生常与FAS的不正常表达密切相关, 已发现其在多种恶性肿瘤中过度表达, 抑制FAS的表达和活性可以抑制直肠癌发生肝转移[2]。

研究发现, FAS基因在小尾寒羊尾部脂肪组织中的表达水平随着日粮中能量水平的增加而呈升高的趋势。猪脂肪组织中的FAS与胴体脂肪量、胴体脂肪率呈极显著正相关[3]。FAS在猪腹脂中的基因表达规律是随着日龄的增加而呈现升高的趋势。

饲喂高蛋白质日粮可降低脂肪组织FAS mRNA的表达量, 但不影响肝脏组织FAS mRNA的数量, 有利于体脂肪的沉积减少, 生产出高瘦肉率、低脂肪的肉类[4]。

2 乙酰辅酶A羧化酶 (ACC)

ACC是脂肪酸合成限速酶, 具有催化乙酰辅酶A形成丙二酸单酰Co A的羧化作用, 是脂肪合成和代谢过程中重要的中间代谢产物[5]。已确认的ACC有两种形式, 即ACCα和ACCβ, 它们由不同基因编码, 在不同的组织中表达, 具有不同功能。在进食后和高胰岛素水平下, ACCα处于激活状态, 协助机体以脂肪形式储存能量或减少摄食;而在空腹状态下, ACCβ是被抑制的, 有利于脂肪的水解和氧化。因此, 可通过激活ACCα或抑制ACCβ来达到治疗糖尿病的目的。

在下丘脑, ACCα可能参与了饱感的过程, 丙二酰Co A在下丘脑中有调控摄食的重要作用, 高的胰岛素和血糖水平 (餐后状态) 激活ACCα, 可以抑制动物的摄食行为[6]。哺乳动物ACCβ被证实可以作为治疗肥胖、糖尿病等代谢疾病的活性靶标[7]。肥胖小鼠血清中的三酰甘油和总胆固醇浓度高于正常小鼠。研究发现, ACC抑制剂能抑制小鼠体重的增加, 减少肥胖小鼠的肥胖程度, 降低血清中三酰甘油和胆固醇含量, 提示ACC抑制剂对肥胖小鼠有减肥作用。

ACC在多种肿瘤组织中呈高表达, 不同的ACC抑制剂能有效抑制脂肪酸合成, 具有抗肿瘤细胞增殖的作用, 并且可以引起细胞凋亡及周期阻滞, 这些结论均表明抑制ACC活性可能成为治疗恶性肿瘤的新靶点。

3 肾母细胞瘤过度表达 (NOV) 基因

NOV是CCN家族成员之一, 与大多数CCN家族成员的结构和功能相似, NOV可参与调节细胞增殖、分化、黏附及血管形成等复杂的病理和生理过程, 还可促进骨骼、神经和血管的发育。NOV基因与多种恶性肿瘤的发生、发展密切相关, 它是一种原癌基因[8]。在鸡胚胎和成体脑组织中存在一定量的NOV mRNA, 提示在这些组织中NOV基因可能有一定的促细胞生长、分化作用[9]。

研究发现, NOV可调节细胞内钙离子水平, 并对某些肿瘤有抑制生长作用, 其生物学效应也许与效应细胞种类有关。NOV基因对成纤维细胞生长也有抑制作用, 可使细胞从生长转为静止状态。

最新的研究结果表明, 背最长肌组织中NOV基因表达量与肌间脂肪含量之间具有负相关关系 (P<0.01) 。另外, NOV基因还可以在育肥牛血液中表达, 其表达丰度与育肥日龄有一定关系[10]。

4 胰岛素样生长因子-Ⅰ (IGF-Ⅰ)

IGF-Ⅰ是胰岛素样生长因子家族中的一种, 通过与IGF-Ⅰ受体结合产生生物学效应。IGF-Ⅰ是生长激素发挥促生长作用的重要调节因子。IGF-Ⅰ在哺乳动物、禽类的胚胎期和出生后的生长过程中起重要作用, 与初生重、日增重、背膘厚度等性状均有一定的相关性[11]。

IGF-Ⅰ是一种碱性多肽, 具有调节机体生长发育、生殖免疫和机体代谢的功能;此外, 还具有类似于胰岛素样的生物合成代谢功能, 能够调节机体血糖水平。研究发现, IGF-Ⅰ能够抑制多种类型细胞凋亡, 促进细胞增殖和分化。在肌细胞形成过程中, IGF-Ⅰ可促进肌细胞分化;在骨骼肌生长过程中, IGF-Ⅰ可调节骨骼肌的生长。

IGF-Ⅰ可促进骨细胞、肌肉细胞的增殖和前脂肪细胞分化, 瘦肉型猪血浆中IGF-Ⅰ含量高于脂肪型, 血浆中IGF-Ⅰ水平与体重及增重呈正相关。选择较低水平的IGF-Ⅰ会得到更多的瘦肉, 更快地生长和更有效益的猪。

研究发现, IGF-Ⅰ与断奶重及肉牛的初生重相关, 与某些猪种的背膘厚度相关。IGF-Ⅰ基因位点的多态性对日增重、瘦肉率, 以及骨、皮、脂含量等性状有显著影响[12]。育成牛血液中IGF-Ⅰ的浓度与平均日增重之间存在着正相关, 血清中的IGF-Ⅰ浓度可作为改善生长和饲料效率的选择指标而被应用于育种中[13]。

5 小结

动物的生长育肥过程受众多因子、酶体系的调控, 其生化过程极其复杂, 并非单一的对应关系, 综上所述的关键酶mRNA表达量高, 并不一定等于酶蛋白的含量高或酶的活性高, 还可能受其他因素共同影响。迄今为止的大部分研究多局限于动物营养代谢和单一的生化过程。今后的研究应定位于特定组织与基因表达特性, 研究生长与脂肪代谢相关信号通路和分子调控通路, 从分子水平揭示动物体内营养代谢及其调控机制。

摘要：动物脂肪代谢包括合成代谢和分解代谢, 两者共同调控着脂肪的沉积。在两个动态调控过程中, 脂肪酸合成酶 (FAS) 、乙酰辅酶A羧化酶 (ACC) 、肾母细胞瘤过度表达 (NOV) 和胰岛素样生长因子-Ⅰ (IGF-Ⅰ) 基因参与细胞的分化和脂肪的形成, 并且扮演着较为重要的角色。文章对FAS、ACC、NOV和IGF-Ⅰ基因的生理功能及研究进展进行了综述。

动物转基因技术 篇10

日前, 由中国农业科学院特产研究所杨福合研究员主持完成的“国家特种经济动物遗传资源库建设与创新利用”项目荣获中国农科院科技成果一等奖。该项目建成了目前世界上最大的特种经济动物基因库, 系统解决了当前我国特种经济动物遗传资源所面临的问题, 填补了国内外相关技术领域的空白, 促进了特种经济动物产业的健康发展。

该研究历时36年, 针对我国特种经济动物遗传资源保存分散、规模小, 易丢失;保存和整理不规范、缺少系统全面的评价体系;数字化管理水平较低;网络系统不健全、信息不畅通;共享机制不完善, 资源共享和创新利用率低等问题, 系统开展了我国特种经济动物遗传资源的收集保存, 整合整理, 创新利用及数据实物共享等方面大量的研究工作, 为我国资源保存利用提供基础支撑。

该项目在国内外首次对我国特种经济动物种质资源进行整理, 整合了我国农业、林业、教学科研等3大领域特种经济动物种质资源, 涵盖鹿类动物、毛皮动物、特禽及其它特种经济动物种质资源509个品种 (类型) 等, 保存在69家特种经济动物资源单位的保存场、专业实验室等;建成了目前世界上最大的特种经济动物基因库。首次建立了特种经济动物评价体系, 保证进入共享平台的特种经济动物资源的多样性和准确性。对水貂、梅花鹿、马鹿和兔资源优异基因进行了评价。制定了特种经济动物资源共性描述规范、个性描述规范、技术规程、活体异地保存技术规范和数据标准和数据控制规范等, 形成特种经济动物种质资源标准化体系;首次建立了完善的特种经济动物种质资源数据库和信息检索系统, 通过中国特种经济动物种质资源网 (www.spanimal.cn) 进行检索, 实现全方位信息共享。 (摘自农科院网站)

动物转基因技术 篇11

许多肿瘤对人类而言是致命的。然而，美国科学家的一项最新模拟研究表明，对体型较大的动物比如鲸鱼而言，肿瘤的出现可能更加普遍，但这些肿瘤往往不会致命。研究人员提出一种新的理论，即大型动物体内会逐渐进化产生更富有侵略性的肿瘤，而这些后来者会阻碍父代肿瘤的生长。

与体型较小的动物相比，大型动物通常体细胞较多，寿命也较长，这本应该使得它们更容易患上癌症，因为一方面细胞越多癌变的几率就越大，另外一方面年龄的增长会大大增加癌变风险。然而在现实世界中，动物患癌症的风险并未随着体格的增加而明显加大，这是一个困扰科学家多年的矛盾问题。

为了弄清这一问题，美国亚利桑那州立大学的生物学家John

Nagy和同事假设自然选择倾向于最具有侵略性的肿瘤细胞，它们生长迅速，能够分泌促进血管生长的化学物质，从而获得足够的营养。

研究人员认为，大型动物体内的癌细胞会逐渐进化为“超级肿瘤”(hypertumour)，它会破坏营养供给从而摧毁父代肿瘤。而大型动物的超级肿瘤只有进化得非常大的时候才可能是致命的，因此它们需要的进化时间也更长，这也就解释了为什么大型动物在众多肿瘤的影响下仍然能够长寿。

为了验证这一假设，Nagy等人用计算机模拟了单个随机定位肿瘤在美洲鼠兔、人类、蓝鲸等6种动物体内的演化过程。他们将每个物种的模拟程序都运行了1000次后发现，大多数动物进化出的超级肿瘤都阻碍了父代的生长。同时，物种的体型越大，产生的超级肿瘤也越多，而患上致命癌症的几率却相对较低。

科学家首次发现动物长寿基因知慧

美国科学家近日表示，他们在实验中首次发现一种长寿基因，该基因不仅可以控制生命的衰老过程，还能够有效促进身体健康。

科学界此前已经证明有两种延长寿命的方法，一种是减少细胞对胰岛素的敏感度，另一个是节食，如果动物把食量减少30％，它的寿命便可以延长20％至30％，如果人类这样做，则可以延长寿命15至20年。

美国加州索尔克研究院的科学家们在对蚯蚓进行实验后，首次发现了一种名为PHA-4的基因。研究表明，该基因对增加动物的寿命至关重要。在实验中，蚯蚓一旦吃了关掉PHA-4基因的细菌，即使它们节食，寿命也不比正常的长。而另一个测试发现．如果拥有PHA-4基因，蚯蚓即使维持正常饮食，寿命也会延长20％至30％。

科学家认为，上述研究解开了长寿的内在机制，从而为开发不节食也能使人长寿的新药作了药理学上的铺垫。

动物转基因技术 篇12

1基因工程疫苗的分类

就目前基因工程疫苗的分类来看,大致可分为三种类型,即基因工程亚单位疫苗、基因工程活载体疫苗和合成肽疫苗[1]。

1.1基因工程亚单位疫苗

此类疫苗在研制过程中,主要是采用基因工程方法,将微生物中所含有的抗原太短基因与质粒等载体进行重新组合,以此来生成大量的保护性肽段,然后在此基础上加入一定量佐剂,就可完成疫苗的研制工作。但需要注意的是,此阶段的亚单位疫苗内所包含的抗原并不多,不能达到疾病的防治效果。所以,还需在此基础上对其进行免疫反应诱导,此环节需要借助单一蛋白质抗原分子来完成。基因工程亚单位疫苗的优点在于对生态环境不会造成危害,同时可对多种感染进行鉴别,但由于该疫苗不具备感染性,所以免疫反应不强。

1.2基因工程活载体疫苗

活载体疫苗主要是将抗原基因携带到一些不存在致病性的病毒或细菌上,使之表达出抗原基因的免疫能力,然后接种到动物身上,达到对疾病防治的效果。与亚单位疫苗相比,活载体疫苗的研制程序要相对简单一些,且疾病防治效果好。但疫苗使用过程中却存在一些潜在隐患,比如说,毒力反强、载体在进行疫苗二次注射的时候会出现排斥现象,这些问题的存在都会在一定程度上影响到疫苗的使用效果,需要研究学者对其进一步改进。

1.3合成肽疫苗

合成肽疫苗也是基因工程疫苗的一种类型。所谓合成肽疫苗,主要是以人工合成为主要制作方法,将病原微生物的保护性多肽和对应载体有效融合在一起而形成的一种基因工程疫苗。作为一种全新的基因工程疫苗,合成肽疫苗具有可记忆、反应持续时间常等优势,但同时也存在一些有待改进的地方,比如说,抗原表位具有局限性、对纯化技术要求较高等。此外,由于合成肽疫苗具有较高的研制成本,所以在一定程度上影响了疫苗的使用范围。

2基因工程疫苗的应用

对于动物疾病防治工作而言,如果想要使基因工程疫苗的作用得以充分发挥,首要任务就是对各类疫苗的应用进行充分了解,接下来,笔者就对上述三种类型的疫苗应用进行简要介绍。

2.1亚单位疫苗应用研究

自从亚单位疫苗研制以来,受到了各地动物疾控中心的高度重视,由不同科学院研制出来的不同类型的亚单位疫苗,在应用之前都开展了必要的实验,实验结果表明,亚单位疫苗在动物疾病防治上具有重要作用,正因为如此,各类疫苗均获得了“转基因生物安全证书”。目前,常见的亚单位疫苗主要包括以下几种:上海生物工程中心研制的“仔猪大肠埃希菌K88、K99双价基因工程灭活疫苗”;宁夏大学研制的“羔羊、犊牛大肠埃希菌基因工程灭活疫苗”。上述两种疫苗实现了仔猪和幼畜腹泻问题的有效防治。可以预见,亚单位疫苗在动物疾病防治方面具有广阔的发展前景。

2.2活载体疫苗应用研究

目前,活载体病毒有多种类型,常见的有痘苗病毒、禽痘病毒和火鸡疱疹病毒几种。为了有效解决由上述病毒给动物生长带来的危害,国家相关部门开展了长期的活载体疫苗研究工作,并取得了良好的效果。就目前相关部门所研制出的活载体疫苗来看,主要以“H5亚型禽流感病毒HA与NA基因的重组禽痘病毒疫苗r FPV-HA-NA”为主,并在此基础上发现了高致病禽流感病毒H5N1和H7N1的抵抗因素,且有效预防痘病毒的感染,有着1针多防的功效。活载体疫苗在当前动物疾病防治中的应用十分广泛,但同时也存在一些有待完善的地方,需要相关部门对其给予高度重视。

2.3合成肽疫苗应用研究

关于合成肽疫苗应用研究,早期主要以口蹄疫病毒合成肽疫苗为主。但随着动物生长面临的疾病种类不断增加,对合成肽疫苗进行深入研究至关重要。当前,我国相关部门经过长时间的努力,成功研制出了“猪O型FMD合成肽疫苗”,经过实验之后,现已经投入到实际生产销售中,而且经实践证明,该疫苗仅单次免疫注射,即可维持阳性水平以上抗体,直到生猪出栏,且在注射疫苗前后也未出现应激反应,疾病防治效果显著[2]。

3结语

综上所述,基因工程疫苗分为多种类型,每一种类型的疫苗对动物疾病防治都有不同效果。动物疾病防控中心若想将各类疫苗的作用充分发挥出来,就必须根据动物疾病的特点和疫苗的具体情况,合理选择疫苗。因此,在未来的时间里,相关部门需要对各类纪基因工程疫苗进行全面了解与掌握,同时根据动物疾病的特点选用最佳疫苗,以此来将疫苗的作用最大限度发挥出来,为动物的安全成长提供充足的保障。

参考文献

[1]贺明艳.基因工程疫苗在动物疾病防治中的应用[J].中国畜牧兽医文摘,2015,(11).