分子标记技术在蝇类研究中的应用

分子标记技术在蝇类研究中的应用（共7篇）

分子标记技术在蝇类研究中的应用 篇1

分子标记技术在蝇类研究中的应用

DNA分子标记作为新发展起来的一种遗传标记形式,凭借其可靠有效等优点,在动植物研究中的应用已越来越广泛.本文主要综述了DNA分子标记技术的`发展及其在蝇类研究应用的进展,并对有关问题进行了初步讨论和展望.

作 者：王亚超 白林 侯蓉 WANG Ya-chao Bai Lin HOU Rong 作者单位：王亚超,白林,WANG Ya-chao,Bai Lin(四川农业大学动物科技学院,四川雅安,625014)

侯蓉,HOU Rong(成都大熊猫繁育研究基地)

刊 名：四川动物 ISTIC PKU英文刊名：SICHUAN JOURNAL OF ZOOLOGY年，卷(期)：200625(3)分类号：Q78 Q969.44关键词：分子标记 蝇 RAPD RFLP

分子标记技术在蝇类研究中的应用 篇2

国内外的大量研究表明印楝的研究正在向两个方向发展,一是深入到印楝素分子毒理水平,进行结构与活性关系的研究,另一方面是研究其在害虫防治中的应用[5,10],主要集中在与应用密切相关的印楝提取物的药理药效和印楝的组织培养方面,其他方面的研究涉及较少。类似印楝的种质资源保护、印楝素含量主要是受遗传因素影响还是受环境因素影响等问题还有待深入研究。其他方面的基础研究和应用基础研究的缺乏也影响了印楝的种植栽培及其向产业化的发展。随着人们的广泛关注,逐渐开始注重印楝的种质资源保护、管理和利用研究及遗传多样性等方面的研究,而DNA分子标记(DNA molecular Markers)是目前普遍采用的可靠性高的技术之一。

DNA分子标记是指能反映生物个体或种群间基因级中某种差异特征的DNA片段,他能够直接反映基因组DNA间的差异是以基本遗传物质脱氧核糖核酸(DNA)的分子差异为基础的一种标记技术[11],该技术是通过直接分析遗传物质的多态性来诊断生物内在基因排布规律及其外在性状表现规律。由于DNA分子标记具有快速、微量、特异性强、准确可靠等优点,且不受生育阶段、供试部位、环境条件、贮藏等因素影响,近年来对其研究及运用十分活跃。其方法主要包括限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、简单序列重复(SSR)、重复序列之间长度多态性(ISSR)、扩展片段长度多态性(AFLP)等,被广泛应用于各种植物的遗传多样性研究、品种鉴别、良种选育、系统与进化、基因定位及资源分类等方面[11,12,13]。本文主要探讨DNA分子标记技术在印楝的种质资源鉴定、遗传多样性评价、体细胞无性系变异鉴定、异交率和基因流的测定等方面的应用概况。

1 在遗传多样性和进化研究上的应用

遗传变异是植物改良的基础,准确评价种质资源的遗传变异程度对于种质资源的保存、利用和品种改良有重要意义。DNA分子标记可以克服传统的农艺性状易受环境条件影响的缺点,能够反映种质资源的遗传本质[14]。随着印楝的关注加大,联合国粮食及农业组织(FAO)于1994年专门建立了国际印楝网络(International Neem Network INN),由来自亚、非、欧、拉丁美洲23个国家的国际机构组织参与网络活动,主要工作是对印度印楝的遗传多样化进行探查和评价[15]。

Farooqui等[16] 1998年首次应用DNA分子标记——RADP标记技术分析了印度17个不同区域的34个印楝种群的遗传多样性,从200条引物中筛选出49条总共扩增了819条条带,结果显示不同产地印楝种源的遗传相似性超过了预料的程度,表明印楝的遗传基础很窄。与Kundu[17]和Changtragoon等[18]用传统的种子形态标记和同工酶生化标记的结果相反,造成这样的原因可能是形态和生化标记容易受环境因素的影响。Singh等[19]用AFLP分子标记评估了37个印度不同生态地理区域的印楝种源和4个泰国的印楝种源的遗传多样性,得出表现型树状聚类图,表明印度的种源之间的基因相似系数为0.74~0.93,具有较宽的遗传基础,而泰国的4个种源之间的基因相似系数为0.88~0.92,具有较窄的遗传基础,印度种源和泰国种源基因相似系数很低,仅为0.47,可见他们亲缘关系较远。Singh等[20]用AFLP和SAMPLE两种分子标记方法研究了印度坎普尔地区的印楝种源和两个外地种源的遗传多样性,综合二者的数据,显示出坎普尔的种源同泰国的种源在遗传上有明显的差异,他们的平均遗传相似系数仅为0.41;通过遗传一致性分析揭示了坎普尔种源具有高的遗传多样性,同时表明种源内具有高的遗传变异。

Ranade 等[21]2002年应用SPAR(Single Primer Amplification Reaction)方法结合SSR标记技术发现,在印楝居群水平上的简单重复序列列间(ISSR)和小卫星(Minisatellite)区域上变异很小。Singh等[22]再次应用RAPD标记技术对29个印楝居群进行了遗传多样性和亲缘关系分析,结果再次印证了前面的结果,种内遗传多样性高,而种群间相似性高。Chanpen Boontong等[23]利用微卫星标记(Microsatellite markers)即简单重复序列(SSR)从印楝DNA中分离提取并设计了8对引物分别对印楝和泰楝(Azadirachta siamensis)进行了扩增,扩增结果显示印楝和泰楝每个基因座包含等位基因数范围分别是3-9和3-9,能观察的和预期的杂合性分别是0.63~0.70和0.61~0.70,并且有两个基因座基因分布明显偏离Hardy-Weinberg平衡。国内有关这方面研究到目前也只有刘新龙[24]利用AFLP分析4个从缅甸引种的印楝遗传多样性和范刚等[25]利用ISSR分析了13个分别从缅甸和澳大利亚引种的印楝遗传多样性,结果也都符合前面的研究结果。由此可见,DNA分子标记技术在遗传多样性探索等一系列问题上是很有效的方法,可能为种群遗传学的保护和管理策略提供有力的工具。

由此可见,应用DNA分子标记对印楝进行遗传多样性研究,明确居群内及居群间的遗传变异水平,从而开展种质资源的鉴定、亲缘关系的划分是很有必要的,并且对以后开展印楝的研究具有重要的参考意义。

2 异交率和基因流的测定

分子标记技术出现以后,交配系统的研究方法发展为亲本分析[26]。目前异交率和基因流测定主要是通过分析每一个后代的亲本来实现,在已知母本的情况下,亲本分析主要是进行父本分析。最近几年植物繁育系统研究受到重视,DNA分子标记也得到更多应用[27]。印楝相关方面研究很少,仅Kundu[28] 1999年用等位酶方法首次估计了孟加拉天然印楝种群交配系统的异交率;吴疆羽中等[29]首次应用RAPD标记技术对引种于云南省元谋县和红河县的印楝种群进行父本分析,平均异交率为96.27%,有52. 9%的传粉集中在以母本为圆心,半径30~50 m的范围内。通过DNA分子标记技术来进行异交率和基因流的测定为将来优良无性系和种子园经营管理提供了可靠依据。

3 体细胞无性系变异鉴定

植物体细胞无性系变异是植物组织培养中的普遍现象,体细胞无性系变异(somaclonal variation)泛指在植物细胞、组织和器官培养过程中,培养细胞和再生植株中产生的遗传变异或表观遗传学变异[30]。2002年Singh等[31]首次利用AFLP标记技术对母树和从通过组培培育的子代中随机挑选9棵进行体细胞无性系变异检测,结果子代与母树条带高度一致,检测结果可以为以后印楝大量体细胞无性繁殖商业化提供依据。由此可见,AFLP是检测体细胞无性系变异的理想工具。

4 展望

应用各种DNA分子标记技术并且采集不同区域的印楝种群进行实验分析,发现印楝的种群内遗传多样性高于种群间。弄清印楝居群内及居群间的遗传变异水平,从而开展种质资源的鉴定、亲缘关系的划分有利于印楝的种质资源保护和管理工作。而在辅助标记育种和品种改良上、基因组作图、cDNA文库的建立等还需要加强研究。

DNA分子标记技术有利于从本质上,即从生物遗传物质DNA分子上揭示物种遗传变异及其变异的规律等优点,因此被广泛地应用于各种植物多层次多范围的研究,如植物亲缘关系,开展植物种质资源鉴定、近缘物种鉴别、生态和遗传多样性等,还可以科学快速的鉴别市场上的植物种苗、种子及植物辅助选择育种[32]。

分子标记技术在蝇类研究中的应用 篇3

关键词：分子标记；大白菜；育种

中图分类号：S634.1 文献标识码：A 文章编号：1671-864X（2016）06-0159-01

大白菜起源于我國，是一种具有悠久栽培历史的蔬菜，为我国的标志性蔬菜种类之一。生物技术的发展，尤其是DNA分子标记技术在大白菜育种研究上的应用，为突破物种间的界限，进一步研究白菜类作物提供了新的途径，给大白菜的遗传育种研究带来了巨大的变化，使大白菜的遗传图谱构建、农艺性状定位、遗传多态性及亲缘关系、品种鉴定等研究领域深入到分子水平，为大白菜今后的育种研究奠定了基础。以下就大白菜在分子标记研究领域中取得的主要进展做一简要概述。

一、分子标记

分子标记作为一种基本的遗传分析手段，是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种新的较为理想的遗传标记形式。现在最常用的DNA分子标记技术主要有限制性片段长度多态性技术（RFLP）、随机扩增多态性DNA技术（RAPD）、微卫星DNA技术（SSR）、扩增片段长度多态性技术（AFLP）等。

（一）农艺性状定位。

分子标记可以利用系列引物对整个基因组进行DNA多态性分析，快速寻找两组DNA样品间多态性差异，得到与此差异区域相连锁的DNA标记，从而可定位某一特定DNA区域内的目标基因。基因标记包括对数量性状和质量性状基因的标记，利用分子标记进行大白菜农艺性状基因定位已得到广泛应用。2002年郑晓鹰等[1]用RIL为材料，用同功酶及RAPD和AFLP标记技术鉴定了与大白菜耐热性数量性状相关的遗传标记，得到了9个与耐热性紧密连锁的分子标记，包括5个AFLP标记，3个RAPD标记和1个PGM同工酶标记.

（二）亲缘关系与遗传多样性分析。

分子标记所检测的是植物基因组DN水平的差异，具有稳定、客观的特点。

它的研究可为物种、变种、品种和亲缘类群间的系统发育提供大量的DNA水平的证据，因而可用于品种资源的鉴定与保存、探索作物的起源与进化等。曲士松等[2]用2个RAPD随机引物对20份不同结球方式的大白菜品种在幼苗期进行了分子标记分析，结果表明11个品种具有明显的与不同白菜品种的来源地及定向培育有关的多态性差异。李丽等[3]利用EST-SSR标记对大白菜种质资源基因库中 686 份样品所代表的1900份大白菜种质资源进行分析研究，构建了大白菜种质资源的核心种质并且形成核心种质的EST-SSR 指纹图谱库。

（三）遗传图谱的构建。

传统的遗传图谱是由形态和生化标记构建的，存在标记数量有限、图谱密度较低等问题，不能很好地反映基因组的全部情况，应用受到一定限制。由分子标记构建的高密度遗传图谱克服了传统遗传图谱的缺点，已广泛应用于作物遗传育种研究中。张明科等[4]以紫菜薹和大白菜杂交的F2为作图群体，构建了一张 RASP的遗传图谱，全长 821.3 cm，平均图距 5.04 cm，含有117个RSAP、38个SRAP、5个SSR及3个RAPD标记。

（四）特定性状的连锁标记。

分子标记技术在白菜抗病育种中也得到了应用。刘秀村等[5]运用RAPD标记在大白菜的小孢子培养DH系群体中采用BSA法进行了分子标记研究，找到了一个与桔红心球色基因连锁的分子标记，其遗传距离为3.8cM。郑晓鹰等用同工酶及RAPD和AFLP分子标记技术鉴定了与大白菜耐热性状相关的遗传标记，分析结果表明，有9个与耐热性QTL紧密连锁的分子标记，分布在5个连锁群上。

（五）鉴定品种纯度。

利用分子标记技术进行品种鉴定，不受环境、取材部位、时间等因素影响，种子或幼苗阶段就可鉴定，而且信息量大，可以区分出形态标记难以鉴别的细微差异，准确、快速。分子标记在这方面的应用对防止伪劣种子销售及保护育种者的权益具有重要意义，也可克服种质资源中所存在的同物异名、同名异物的现象。宋顺华等[6]用50个随机引物检测了2个杂交种及其亲本，找到某些引物在特定杂交种中产生了有别于双亲的特殊标记，并将它们应用于这2个杂交种的纯度检测。这显示了RAPD标记在大白菜杂交种商品种子纯度检测上的实际用途。

（六）数量性状QTL分析。

于拴仓等[7]采用复合区间作图的方法，对大白菜叶球相关的7个农艺性状进行QTL定位及遗传效应研究。结果表明，在14个连锁群上检测到3个QTL，其中控制生育期的QTL有3个，控制外叶数的QTL有3个，控制球高的QTL有7个，控制球径的QTL有5个，控制球叶数的QTL有4个，控制球重的QTL有4个。

二、展望

由上所述可见，目前用于白菜遗传与育种研究中的DNA分子标记主要是AFLP、RFLP和RAPD标记，与其它植物相比，所涉及的分子标记类型还不够广泛。白菜的分子育种研究取得了显著的成绩，但与水稻、小麦、玉米等大田作物相比，无论在研究的广度还是深度上，仍然有较大的差距。而且与大白菜重要农艺性状紧密连锁（如抗逆性） 的分子标记数量有限，在一定程度上限制了分子标记辅助育种；其次，不同研究者采用不同的大白菜群体和遗传标记，导致遗传图谱无法相互整合，图谱密度低、通用较差。培育抗逆特性显著、品质性状优良、对一些关键病害具有较强抗性的新品种，是我国育种工作者当前最迫切的任务。

参考文献：

[1]郑晓鹰，刘岩.用过氧化物酶及酯酶同功酶鉴定大白菜杂交种纯度[J].园艺学报，1994，21（1）：59-64.

[2]曲士松，黄宝勇，石琰，等.RAPD法分析鉴定大白菜的亲缘关系[J].莱阳农学院学报，2002，19（2）108-111.

[3]李丽，郑晓鹰.用于白菜和大白菜品种鉴定的EST-SSR复合标记的建立[J].园艺学报.2009，36（11）：1627-1634.

[4]张明科，张鲁刚，巩振辉，等.白菜紫色性状RAPD连锁标记的筛选与染色体定位研究[J].西北植物学报，2008，28（5）：901-906.

[5]刘秀村，张凤兰，张德双，等.与大白菜桔红心基因连锁的RAPD标记[J].华北农学报，2003，18（4）：51-54.

[6]宋顺华，郑晓鹰.利用RAPD技术鉴定大白菜主栽品种及品种间遗传多样性分析[J].华北农学报，2000，15（3）：1-5.

[7]于拴仓，王永健，郑晓鹰.大白菜耐热性QTL定位与分析[J].园艺学报，2003，30（4）：417-420.

分子标记技术在蝇类研究中的应用 篇4

目前用于种质资源鉴定和遗传育种研究的分子水平标记技术主要包括:以Southern杂交为基础的限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)标记等;以PCR为基础的随机扩增多态性DNA(Randomly amplified polymorphic DNA,RAPD)标记、扩增片段长度多态性(Amplified fragment length polymorphism,AFLP)标记、序列特征化扩增区域(Sequence characterized amplified regions,SCAR)标记和随机引物PCR(Random primer PCR,RP-PCR)标记等;以重复序列为基础的简单重复序列(Simple sequence repeat,SSR)标记和简单重复序列多态性(Inter-simple sequence repeat,ISSR)标记等;以mRNA为基础的表达序列标签(Expressed sequence tag,EST)、基因表达序列分析(Serial analysis of gene expression,SAGE)和序列标签位点(Sequence tagged site,STS)等;以单核苷酸多态性为基础的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)标记等。

该文对ISSR分子标记技术的原理和特点做了简要介绍,对其在植物,特别是蓖麻遗传育种研究中的应用进行综述,旨在指出目前研究中存在的问题,并对ISSR标记技术在蓖麻研究中的应用前景进行展望。

1 ISSR标记的原理和特点

ISSR(简单重复序列多态性)又称作锚定简单序列重复(Anchored simple sequence repeat,ASSR)或微卫星引物PCR(microsatellite-primed PCR,MP-PCR),该技术是1994年Zietkiewicz等[1]提出的一种微卫星类分子标记技术。其来源于植物基因组中丰富的简单重复序列,在微卫星序列的3’或5’端锚定2~4个随机核苷酸,组成单引物进行重复序列间DNA的PCR扩增。在PCR反应中,锚定引物可以引起特定位点退火,导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。所扩增的inter SSR区域的多个条带通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或者琼脂糖凝胶电泳得以分辨。

ISSR标记技术操作简单、快速、高效,不需要繁琐地构建基因文库、杂交和同位素显示的步骤;遗传多态性高,可同时提供多位点信息和揭示不同微卫星座位个体间变异的信息;采用的引物较长(17~24 bp),退火温度较高,因此引物具有更高的专一性,降低了条带的干扰,随之提高试验结果的可重复性;ISSR标记为显性标记,符合孟德尔遗传规律;ISSR标记技术结合了RAPD和SSR的优点,耗资少,模板DNA用量少。

2 ISSR技术在植物研究中的应用

2.1 构建遗传连锁图谱与基因定位

遗传图谱研究目的是寻找足够的多态分子标记,从而将所有基因定位到特定染色体的特定区域。ISSR技术因具有较高的准确性、重复性和高度多态性,并遍布在整个染色体上,可将特定PCR标记锚定在染色体的已知位置,而被广泛应用于绘制遗传连锁图谱和基因定位。Lu Jiangjie等[2]用细茎石斛和铁皮石斛的杂交F1,通过拟测交理论,包括74个ISSR引物在内的共422个引物构建基因图谱,细茎石斛图谱总长1127.9 cM,共17个连锁群,165条标记位点;铁皮石斛图谱总长1 210.9 cM,19个遗传连锁群,169条标记位点。Zhang Fei等[3]利用ISSR技术与其它分子标记技术相结合,绘制了菊科植物‘雨花落英’和‘奥运含笑’的连锁图谱。Chen Danwei等[4]利用ISSR和AFLP标记腊梅花F2,共标记了84个父本特异性条带51母本特异性条带绘制亲本基因链锁图谱,母本遗传图总长2 417.8 cM,平均相邻间距25.61 cM,最大相邻遗传间距48.2 cM;父本连锁遗传距离1 184.2 cM,平均相邻连锁间距25.7 cM,最大相邻间距49.0 cM。曹娴等[5]用ISSR标记技术鉴定出草莓的一个与抗灰霉病基因连锁的标记UFFa01H05,该标记与抗性基因间的遗传距离为15.9 cM。

2.2 种质资源鉴定

种质资源是选育新品种的基础材料,包括各种植物的栽培种、野生种的繁殖材料以及利用这些繁殖材料人工创造的各种植物的遗传材料。种质资源鉴定评价的传统方法主要是通过植株观察和试验,这种方法会因外界环境因子的影响而出现偏差。而分子标记鉴定能较好地克服外界的影响。近年来,ISSR标记技术已经广泛应用在小麦、玉米、甘蓝、马铃薯和柑橘等植物的种质资源鉴定,并取得了较好的结果。例如,徐菲等[6]应用ISSR标记将33个秋海棠属植物品种划分为3大聚类。He F等[7]应用ISSR技术和RAPD技术相结合,对560种拟南芥进行种群间多样性和遗传距离分析。LIU Benying等[8]以8个种群134份云南茶树资源为材料,应用ISSR标记方法,应用Nei-Li相似系数法估算了134个材料间的相似系数为0.445~0.819,平均为0.512,说明茶树资源间的遗传基础较宽。Prevost等[9]用4个ISSR引物,就区分开30多个马铃薯品种。

2.3 遗传多样性和系统进化关系

遗传多样性是生命系统的基本特性,包括种内两个隔离地理种群间及单个种群内个体间的遗传变异,是物种适应自然和发生进化的遗传基础。ISSR标记可以有效地揭示种群间及种群内的遗传多样性,分析其系统分化规律,并研究群体多样性程度及遗传结构,了解基因频率发生的变化,为种源划分提供DNA分子水平上的依据。LIU Benying等[8]对云南茶树资源分析检测,共获得475条稳定的谱带,其中多态性谱带470条(占98.9%),有效地说明了遗传多样性丰富。大厂茶等8个种群间的遗传相似系数介于0.850~0.987,平均相似距离0.92,表明不同种群间的遗传差异较小。Li Zuo等[10]分析了莲属的87个品种,包括70个中国观赏莲种,7个泰国野生莲种、2种美洲黄莲、8个中国莲和美洲黄莲的杂交品种,遗传多态性达91.2%。Cai Yu[11]等利用ISSR技术研究224个麻疯树属品种,在219个中国品种中,扩增多态性条带占75.15%,Nei基因多态性指数为0.19,平均香农信息指数为0.292。Li Huiying等[12]利用29个ISSR引物研究了95个中国野生狗牙根品种的遗传多态性,特异性条带(242条)占97.6%,遗传相似系数0.51~0.97。Ali Shahi-Gharahlar等[13]对39种樱桃属植物用12条引物共扩增出151条特异多样性条带,扩增多态率达81.8%~100.0%,并发现欧洲甜樱桃和小果樱桃的相似率最低(0.04)。孙小琴[14]等采用ISSR标记分析寒兰的遗传多样性,结果表明不同开花季节寒兰的遗传多样性存在明显差异。

3 ISSR技术在蓖麻遗传育种中的应用

ISSR分子标记是蓖麻品种鉴定和遗传多样性研究的有效手段,对蓖麻种质资源、遗传多样性与亲缘关系鉴定,以及在遗传育种等方面的研究都能起到重要的指导作用,进一步为蓖麻分子育种积累一定的理论基础及实践依据。

通过ISSR标记技术,王亚[15]对单雌蓖麻材料做了分子水平的分析,以单雌蓖麻和两性蓖麻以及杂交后的F2群体为材料,初步得到了与蓖麻雌性控制位点紧密连锁的分子标记UBC844750。郑鹭[16]通过对81份蓖麻品种的ISSR分析,共筛选出20条多态性较好的ISSR引物,扩增多态条带252条,多态条带比率(PPB)为53.17%,遗传相似系数范围为0.45~0.94。吕二锁[17]对33个蓖麻材料,利用4条ISSR适宜引物进行PCR扩增,得到多态性条带25条,多态性条带百分率为75.7%,表明33个供试材料具有丰富的多态性。并在此基础上研究了蓖麻不同亲本及F1间的遗传相似度和遗传距离。黄文霞[18]等应用ISSR标记,对国内外17份蓖麻材料的亲缘关系进行分析,筛选出11条能扩增出清晰条带并具有多态性的引物,且这些引物共计扩增出90条DNA条带,平均每条引物扩增的DNA条带数为8.18条,其中,多态性DNA条带57条,占63.33%。17份蓖麻材料的遗传相似系数在0.52~0.97,且明显分为2个大类群,遗传相似性相对较高。Bhavesh[19]用5条ISSR引物在22个蓖麻品种中共扩增出47条带,其中32条多态性条带,平均每条引物扩增6.4条,扩增条带数从8~13不等,扩增条带长度从240~2 700 bp不等。多态性水平从33.3~100不等,平均多态性水平为68.1%,展现出丰富的遗传多样性。

4 存在问题及应用前景展望

综上所述,ISSR分子标记作为多位点标记,已在蓖麻遗传多样性研究、亲缘关系及系谱分析、蓖麻品种和种质鉴定及遗传图谱构建和标记辅助育种等方面已取得较大进展。但同样也存在着一些技术缺陷。如ISSR标记大多数为显性标记,多数情况下不能提供检测位点的纯合与杂合状态。ISSR的多态性低,绘制的遗传图谱饱和度低和标记间距离大等。

ISSR技术对研究蓖麻资源所能提供的DNA水平上的信息是有限的,因此应针对蓖麻生产中的突出问题,加强交流与合作,将分子标记与传统育种有机结合起来,开展RFLP、AFLP、EST和SNP等多种分子标记,将多种标记技术统一综合研究,筛选出多态性更高、稳定性更好的引物和探针,降低试验成本,解决分子标记研究与育种实践联系不密切等问题,从而加速蓖麻遗传改良的进程。

分子标记技术在蝇类研究中的应用 篇5

关键词：白僵菌,DNA,分子标记

白僵菌作为最常见的昆虫病原真菌之一, 在分类学上属半知菌亚门 (Deteromycotina) 、丝孢纲 (Hyphomycetes) 、丝孢目 (Hyphomycetales) 、丛梗孢科 (Moniliaceac) 、白僵菌属 (Beauveria) 。作为一种虫生真菌, 寄主范围极广, 已记载的包括15目、149科的700余种昆虫及蜱螨目的6科、10余种螨和蜱[1]。根据NCBI的最新分类报道[2], 显示白僵菌隶属于真菌界的子囊菌门 (Ascomycota) 粪壳菌纲 (Sordariomycetes) , 肉座菌目 (Hypocreales) , 虫草科 (Cordycipitaceae) , 虫草属 (Cordyceps) 。具有寄主范围广、致病力强, 对人、畜无毒害, 不伤害天敌, 不污染环境等优点, 既是家蚕常见的病害, 也被广泛应用于害虫的生物防治[3]。

综观各国学者对白僵菌的分类历史, 基本上都是依据传统的生物分类法即根据微生物物种的形态特征和生理学特性对其进行分类的。白僵菌菌株的形态、生化指标等受培养基质、温度等环境条件影响, 表现出较大差异性, 这给真菌的分类和谱系分析带来了许多困难和不确定性。因此仅仅依靠传统的方法是远远不够的。

近几十年来, 随着生物技术的发展, 利用分子生物学手段进行鉴定已成为该属分类鉴定的一个十分重要的手段。利用DNA分子标记技术来研究白僵菌能够建立更为准确、更加合理的分类系统。在白僵菌研究中, 常用的分子标记为RFLP, RAPD, AFLP, SSR和ISSR, 它们是继形态标记 (Morpholog ical markers) 、细胞标记 (Cytological markers) 和生化标记 (Biochemical markers) 之后发展起来的一种以DNA多态性为基础的新一代遗传标记。与形态标记和生化标记相比, 分子标记具有明显的优越性:大多数分子标记是共显性的, 基因组变异极其丰富, 分子标记的数量几乎是无限的。分子标记不受环境影响, 其变异只源于等位基因DNA序列的差异, 与不良性状无必然的连锁, 不需专门创造特殊的遗传材料[4]。基于上述这些优点, 分子标记技术对白僵菌的分类研究在世界范围广泛地开展起来, 使分类鉴定工作由一般的表型特征鉴定深化到分子水平和遗传型特征的鉴定。运用分子标记技术从分子水平揭示白僵菌的遗传背景差异, 鉴定白僵菌菌种, 并为研究白僵菌分离株的遗传多样性、亲缘关系、菌种保护和利用提供参考。本文综述了RFLP、RA PD、AFLP以及微卫星DNA分子标记技术的方法和原理, 及近年来在白僵菌研究中进展。

1 RFLP技术

1.1 RFLP的原理

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism, 限制性片段长度多态性) 是Grodzicker于1974年发明, 1980年由David等再次提出的发展最早的DNA标记技术[5]。RFLP的原理是生物不同种或品种的基因组DNA被限制性内切酶消化时, 会产生大量的、分子量不等的DNA片段, 利用凝胶电泳技术分离被酶解的DNA片段, 采用同位素或生物素标记的DNA片段作探针进行分子杂交, 来显示与探针同源的酶切片段在长度上的多态性, 从而将不同的种或品种区分开[6]。这些差异同样可以作为白僵菌分类的依据来鉴别不同菌株之间的遗传关系。

1.2 RFLP在白僵菌中的应用

Maurer等利用RFLP和RAPD对从不同地域鳞翅类和甲虫类分离出38株虫生白僵菌, RFLP方法得到了65条特征性条带, 聚类分析把所分析的白僵菌分为三个类群。RAPD同样得到了65个条带, 分析结果和RFLP结果十分相似。两种方法都表明白僵菌的群体结构和特定宿主有明显的相关性[7]。由于真菌线粒体基因组很小 (17～176 kb) , 拷贝数多, RFLP很容易检测, 因而成为广泛应用的分子标记。真菌细胞核DNA经过消化、电泳和染色后, 菌株之间DNA图谱存在某些差异, 但仍然需要用标记的DNA探针来检测[8]。Uribe等用RFLP对18株白僵菌的线粒体基因组进行分析。证明在白僵菌中存在九种不同的线粒体DNA基因型。作者使用了两个探针标记, 都可以把白僵菌和粉拟青霉与金龟子绿僵菌区分开[9]。

RFLP具有分析方法简便, 影响因素少, 快捷、稳定性高, 准确率高, 重复性好的优点。缺点是需要首先构建基因组文库, 实验周期很长。并且RFLP分型一般呈二态特征, 等位基因数少, 个人识别能力有限。

2 RAPD技术

2.1 RAPD的原理

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA, DNA随机扩增多态性) 是由Williams和Welsh两个研究小组于1990年分别研究提出的一种分子标记[10,11]。其原理是通过合成长度约10bp的随机单引物, 以较低的温度退火结合到同源序列上, 使得引物之间的区域得到扩增, PCR产物的多态性可以作为物种鉴定的依据。

2.2 RAPD在白僵菌中的应用

用RAPD-PCR技术可以识别DNA序列的多态性, 并且可提供特殊基因型的特异性遗传“指纹”。目前这项技术已广泛应用于白僵菌[12]。同时RAPD可以对生物的整个基因组进行差异性分析, 较容易找出菌株之间有差异的DNA片段, 从而对菌株群进行分类。

李增智等利用RAPD-PCR技术检测3种卵孢白僵菌及球孢白僵菌RAPD扩增片段的多态性, 比较了彼此间的相似率。试验采用5个引物对15个菌株多态性进行了分析, 获得的基因组DNA指纹图谱清楚显示出种间的差异。通过分析发现球孢白僵菌与另一种布氏白僵菌之间的相似率在64.9%～80.9%之间, 与牯孢白僵菌之间的相似率在50.0%～61.9%之间[13]。方志刚等采用27个RAPD引物分析了l6个球孢白僵菌菌株的遗传分化情况, 结果从l6个白僵菌菌株中共获301个RAPD标记, 其中多态性标记288个, 占95.7%, 表明菌株间具有较丰富的遗传多态性[14]。杨毅等筛选出扩增效果较好的30个RAPD引物对21个不同来源的寄生松墨天牛的球孢白僵菌进行了扩增, 共扩增出315个位点 (分子量在300 bp～3000 bp之间) , 平均每个引物产生10.5个, 其中多态性位点251个, 占总位点数的79.7%, 表明同样寄生松墨天牛的白僵菌各菌株间具有丰富的多态性。通过对DNA图谱的系统聚类, 分析得出其多态性与采集地有一定的相关性, 而白僵菌菌株DNA的多态性与对松墨天牛幼虫的毒力不表现相关性[15]。安徽农业大学王滨等人对DNA沸水抽提方法进行了改进, 通过PCR扩增仪对DNA提取液进行加热, 迅速完成DNA的提取过程。该研究为大批量快速提取真菌基因组DNA提供了较为理想的方法。通过大批量快速提取真菌基因组DNA方法提取的DNA质量可满足RAPD扩增分析的需要[16]。

RAPD技术是一项很有价值的分子标记技术, 在检测多态性时是一种相当快速的方法。因此, 继RFLP之后, RAPD在国内白僵菌研究中应用最广泛的分子标记技术。RAPD较为简单, 但是重复性不好, 受条件影响很大。同时, RAPD随机扩增引物的选择和数量是十分关键的环节, 不同的引物或引物选择数量的多少将直接影响分析的结果。因此对设备、条件及超作的要求都很严格, 若达不到要求, 稳定性和重复性就很难保证, 解决的办法是严格控制实验条件, 使用相同的PCR仪和引物。

3 AFLP技术

3.1 AFLP的原理

AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms, 扩增片段长度多态性) 是1992年由荷兰Keygene公司科学家Zabeau和Vos发明创造的一种DNA分子标记新技术[17,18]。它的原理是对基因组酶切片段的选择性扩增, 将获得的扩增片段通过琼脂糖凝胶或变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测, 根据带型中一些特征条带的出现或消失, 检测出不同扩增片段长度的多态性[17]。

3.2 AFLP在白僵菌鉴定中的应用

近年来, 国外文献中有大量关于应用AFLP分子标记进行白僵菌菌株遗传多样性和亲缘关系分析的报道。Fernandes等对收集的49株自巴西的白僵菌和4株自美国的白僵菌进行了AFLP检测, 使用了3对引物产生了82个多态性位点, 试验重复性高, 结果表明从巴西分离得到的白僵菌菌种间存在着显著遗传多样性, 同时还发现巴西南部和东南部的白僵菌有高度的相关性, 为至少存在一个种群克隆结构提供了证据;而巴西大部分白僵菌与美国白僵菌遗传水平上有明显差异, 用曼特尔检验 (Mantel test) 证明遗传多样性与地理分布距离有明显相关性[19]。Muro等用AFLP标记分析了来自肯尼亚等16个国家的47株白僵菌, 结果表明AFLP具有高度的灵敏性和丰富的条带 (每对引物有50个～100个条带) 。利用电泳条带分析和算术平均数的非加权配对算术平均法, 通过相似相关性将其聚类。而用核糖体转录间隔区限制性片段多态性 (ITS-RFLP) 则都显示出相同的带形, 因而不能鉴别不同的白僵菌株[20]。Muro等利用3对AFLP引物分析了来自中东和亚洲西部七个国家的麦扁盾蝽及其他越冬昆虫来源的白僵菌, 得到的条带在40个-75个之间, 平均每对引物有66个条带, 说明了分离株地理位置的相关性和种内分类的相关遗传多样性[21]。

AFLP结合了RFLP和RAPD各自的优点, 它快速方便, 不需要知道DNA的顺序信息, 且实验结果稳定可靠, 可快速获得大量的信息。同时由于AFLP产物呈典型的孟德尔方式遗传, 所以AFLP具有最有力的分子标记。它可以应用于一般分子标记的所有应用范围, 如遗传多样性和种质鉴定、基因追踪、基因定位, 连锁图的构建等[22]。理论上讲, 不管所研究的基因组DNA有多么复杂, 用AFLP都可以检测出任何DNA之间的多态性。缺点是AFLP的费用昂贵, 实验涉及面广, 技术要求全面, 对操作人员素质要求高。

4 微卫星DNA分子标记

4.1 SSR和ISSR的原理

微卫星分子标记是一种新兴的技术, 对于遗传多样性的检测, 这些微卫星已经成为分子标记的可选序列。SSR、ISSR可成为RAPD、RFLP、AFLP等标记的补充。

SSR (Simple Sequence Repeats, 简单重复序列) 分子标记由Litt等在1989年创建的[23]。SSR两端有一段相对保守而专一的DNA序列, 通过这段序列可以设计一段互补的寡聚核苷酸引物, 对SSR进行PCR扩增, 由于SSR多态性仅由简单序列的重复次数的差异引起, 通常表现为共显性[24,25]。根据其两端的保守序列设计一对特异性引物, PCR扩增, 再经聚丙烯酰胺凝胶电泳即可显示不同基因型个体在这个SSR位点的多态性[26]。

ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat, 简单重复序列间扩增) 是由Zietkiewicz等在1994年创建的一种简单序列重复区间扩增多态性分子标记[27]。ISSR技术的基本原理就是在SSR的3’端或5’端加锚1个～4个嘌呤或嘧啶碱基, 然后以此为引物, 对两侧具有反向排列SSR的一段DNA序列进行扩增, 然后进行电泳、染色, 根据谱带的有无及相对位置, 来分析不同样品间ISSR标记的多态性[28]。

4.2 SSR和ISSR在白僵菌中的应用

Schwarzenbach等使用6对SSR引物, 监测土壤中的白僵菌菌株, 其中15株菌株有特异性PCR扩增。结果证明SSR方法是一种快速而灵敏的方法, 并且具有普遍的应用价值[29]。Ormond等用IS-SR研究了针叶林上白僵菌的遗传差异, 利用了4对ISSR引物对不同微环境和季节分离得到的白僵菌进行分析, 得到了157个多态性ISSR条带。分析发现白僵菌在遗传上具有多样性, 且发现地上和地下的白僵菌分离株具有差异, 表明白僵菌在这些系统中占有不同的生态位[30]。Estrada等用IS-SR172个标记分析了来自不同地域的十一株白僵菌, 结果发现这些标记有高度的多态性 (近80%) 。七个不同的分离株有特征性条带, 其中873个ISSR标记可以区别所有分离株。根据这些标记建立的系统进化树与这些分离株的地域分布相吻合。所有来自加勒比地区的分离株被分成了一组, 而其他的分离株则被划分到其他分支上。说明在DNA指纹作图中, ISSR是一种迅速, 可靠和信息量大的体系, 可以用于鉴定不同的白僵菌菌株[31]。

SSR是共显性标记, 许多等位基因表现出高度的杂合性, 并且遵循孟德尔式遗传法则, 利用微卫星标记来研究昆虫种群间和种群内的遗传特性, 可以得到丰富的遗传多样性信息, 操作简便, 重复性高。但是由于白僵菌基因组并没有完成测序, 开发新的SSR标记具有一定难度。与此同时, 在运用过程中也受到一些因素的制约:首先是微卫星的筛选过程繁杂;其次是对微卫星DNA的检测需要高分辨率的检测方法, 理论上最高分辨率应能够分辨出一个碱基的差别[32]。

ISSR技术可以比RFLP、SSR、RAPD等技术更多地揭示基因组中的多态性, 是一种很好的DNA指纹标记。因此该技术在种质资源鉴定方面显示出比其他方法更高的优越性。

5 展望

随着分子生物学和相关技术的发展, 分子标记技术以其快速、准确、灵敏的优点逐渐成为微生物分类鉴定的主要手段。迄今各种分子标记的手段已经广泛应用到真菌 (包括白僵菌) 的研究当中。但每种方法都有各自的优缺点, 且任何一种分子标记都不能解决所有的问题。根据有关文献的报道, 近些年来在分子多态性标记的研究中, 多采用至少两种以上标记技术进行比较研究, 综合得出结论以提高实验结果的可靠性。同时在实际应用中要根据不同的研究目的选择使用不同的分子标记方法。人们正在探索结合现代生理生化法、分子生物学技术和计算机技术等多项技术在内的鉴定方法, 以便更加有效、准确地进行白僵菌的分类和鉴定。

分子标记在芒果上的应用研究 篇6

1 RAPD标记特点及在芒果上的应用

1.1 RAPD技术的特点

RAPD技术是建立在PCR (Polymerase Chain Reaction) 基础之上的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术。其优点主要体现在以下几个方面: (1) 技术简单, 不涉及分子杂交和放射性自显影等技术, 成本较低; (2) 对模板DNA的纯度要求不高, 需DNA样品量极少; (3) 不依赖于种属特异性和基因组结构, 一套引物可用于不同生物基因组分析, 并可借助于计算机系统进行分析; (4) 灵敏度高, 可提供丰富的多态性。不足之处在于:不能鉴别杂合子和纯合子;存在共迁移问题, 凝胶电泳只能分开不同长度DNA片段, 而不能分开那些分子量相同但碱基序列不同的DNA片段;影响因素很多, 所以试验的稳定性和重复性差。

1.2 RAPD技术在芒果上的应用

Valdomiro[1]等利用RAPD技术分析了巴西芒果亲缘关系。Lopez[2]等利用RAPD技术鉴定了15个芒果品种地理差异和胚型。Schnell[3]等利用RAPD技术分析了25个芒果种之间的遗传关系, 得到了这9个种的遗传树系图。Bally[4]等用RAPD研究了澳大利亚Kensington Pride芒果的遗传多样性。徐碧玉[5]等对海南岛主栽的10个芒果品种进行RAPD技术研究。邓九生[6]等对美国红芒、桂香芒和迟熟红苹芒株系的基因组DNA进行RAPD分析。Karihaloo[7]等对印度29个芒果品种进行RAPD分析, 北方与东方区聚类在一起, 西方与南方区聚类在一起。Jayasankar[8]等利用RAPD技术分析了Hin di和Carabao 2个芒果种类的抗病性。谢江辉[9]等对不同生态型、不同胚型、不同果形与果色的38份芒果品种和1个近缘种———扁桃进行了RAPD分析。胡新文[10]等对海南、广东、四川、广西等14个芒果主要栽培地采集的70个芒果炭疽菌分离菌株利用RAPD技术进行了遗传多样性分析。Cordeiro[11]等利用RAPD技术对Rosinha部分多胚性芒果品种的遗传起源进行了分析。Rajwanna[12]等利用RAPD对25个芒果品种进行了遗传多样性分析。Souza[13]等利用RAPD技术将巴西42个芒果找到了起源地。

2 AFLP标记特点及在芒果上的应用

2.1 AFLP技术的特点

AFLP即扩增片段长度多态性, 是由Zabeau和Vos (1993) 发明的一种利用PCR技术检测DNA多态性的方法。其优点主要体现在以下几个方面: (1) 分析所需DNA量少; (2) 试验重复性好, 多态性强、基因型分析效率非常高; (3) 能获得更高的信息量; (4) 不需要Southern杂交, 无放射性危害, 不需要基因组DNA的序列信息; (5) 可应用于任何生物; (6) 稳定的遗传性。不足之处在于对DNA质量要求严格, 操作复杂, 对实验人员的技术水平要求较高;技术所需仪器和药品价格昂贵, 实验成本较高。

2.2 AFLP技术在芒果上的应用

Eiadthong[14]等应用AFLP分析了芒果属14个种间 (包含3个重要经济价值的种) 的遗传关系。房经贵[15]等利用14对引物组合对AFLP标记在2个芒果亲本 (Keitt-Tommy) 间杂交F1代群体的多态性水平与分离方式进行了研究;利用AFLP分子标记技术对16个芒果品种以及7个芒果砧木材料进行了初步研究[16];用15对AFLP引物组合扩增了芒果品种间杂交组合 (Keitt-Tommy Atkins) 的60个F1单株[17]。Hautea[18]等分别采用RAPD和AFLP技术对来自泰国不同种植区的Carabao品种遗传多样性与发展目标进行了鉴定。Khalil-K ashkush[19]等采用AFLP技术对以色列的16个芒果品种遗传关系和7个砧木品种间的遗传连锁图进行了研究。雷新涛等[20]利用AFLP标记对国内外31个芒果主要品种进行分类与亲缘关系研究。王园[21]等采取AFLP标记技术将31个芒果品种区分开来。石胜友[22]等利用AFLP标记对中国热带农业科学院南亚热带作物研究所芒果种质资源圃的56份国内外芒果种质进行遗传多样性分析。应东山[23]采用AFLP、ISSR分子标记技术检测我国不同省份部分芒果种质间的DNA多态性, 通过对供试材料对78份芒果种质进行AFLP、ISSR综合聚类分析, 分析亲缘关系远近。Chunwongse[24]等利用AFLP和RFLP绘制了泰国的2个芒果品种遗传连锁图谱。

3 ISSR标记特点及在芒果上的应用

3.1 ISSR技术的特点

ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat) 是由ZIETKIEWICZ等于1994年创建的一种简单序列重复区间扩增多态性分子标记。其主要优点体现在: (1) 简单、快速、高效, 不需构建基因文库; (2) 扩增基因组DNA适用于任何富含SSR重复单元和SSR广泛分布的物种, 能够提供过多的信息; (3) 遗传多态性高, 重复性好, 稳定性较高; (4) 显性标记, 符合孟德尔遗传规律; (5) 不需要杂交和同位素显示灯步骤, 无需知道任何靶序列的SSR背景信息; (6) 结合了RAPD技术标记和SSR技术标记的优点, 耗资少, 模版DNA用量少。不足之处在于需要一定时间摸索最适反应条件;呈显性遗传标记, 不能区分显性纯合和杂合基因型;ISSR引物可能在特定基因组的DNA中没有配对区域, 而有可能导致无扩增产物出现。

3.2 ISSR技术在芒果上的应用

Wiadthong[25]等利用ISSR技术研究了包括13个台湾种、4个美国种、3个印度种、1个印尼种和1个菲律宾种在内的22个芒果品种的亲缘关系。Gonzalez[26]等用ISSR技术研究了澳大利亚芒果品种的遗传多样性。何新华[27]对23个分别来自广西本地品种或广西选育的芒果品种进行了ISSR分析;用ISSR技术鉴定7个吕宋芒品种 (系) 和柳州吕宋芒的亲缘关系[28];通过叶绿体简单重复序列标记 (cp ISSR) 还对36个芒果品种进行了亲缘关系与遗传多样性分析[29]。Sagar[30]等用ISSR技术对70个芒果品种与远外类群进行了遗传多样性分析。王家保[31]等利用ISSR技术分析了38个芒果品种的亲缘关系。郭永泽[32]利用ISSR标记对38个芒果栽培种、扁桃、冬芒进行了亲缘关系分析;对33个芒果品种和2个近缘扁桃、冬芒进行基因组DNA和叶绿体DNA ISSR分析;利用ISSR鉴别20个芒果品种的生理病害;还利用ISSR技术对20个芒果品种的炭疽病抗病性分析。黄国弟[33]等对“桂热芒120号”等22个品种 (系) 的亲缘关系进行了ISSR分析。张宇[34]利用ISSR技术将对8个芒果品种进行了亲缘关系聚类分析。房志超[35]利用ISSR技术对66份芒果种质进行聚类, 分析了芒果种质的性状及其遗传关系。

4 SSR标记在芒果上的应用

4.1 SSR技术的特点

微卫星DNA是一种广泛分布于真核生物基因组中的串状简单重复序列。其主要优点体现在: (1) 微卫星DNA数量多且均匀分布在基因组中; (2) 微卫星DNA具有丰富的多态性, 并且微卫星位点检测可以显示纯合子和杂合子; (3) 检测容易、重复性较好、省时, 适合于进行自动化分析。不足之处在于SSR标记首先要对微卫星侧翼序列进行克隆、测序、人工合成设计引物以及标记的定位、作图等基础性研究, 因而其开发有一定的困难, 费用也很高。

4.2 SSR在芒果上的应用

Wichab Eiadthong[36]等还利用SSR技术研究了22个芒果品种的亲缘关系, 认为SSR是品种鉴别的有效手段, 14个品种并没有按来源地分类, 而是被分在不同的群组, 分组与胚性也没有关系Virel[37]等利用微卫星技术检测了28个芒果品种的指纹图谱, 胚类型及起源。姚全胜[38]等从16对SSR引物中筛选l4对多态性引物构建l1个品种的指纹图谱。王静毅[39]等应用SSR技术, 检测了48个芒果品种 (系) 的遗传关系。Duval[40]等利用微卫星标记鉴定了来自印度, 东南亚, 佛罗里达州, 非洲和加勒比地区的307份芒果种质的遗传多样性。黄丽芳[41]利用SSR技术对116份芒果砧木种子资源进行了聚类分析。

5 其他分子标记特点及在芒果上的应用

数目可变串联重复序列 (Variable Number of Tandem Repeats, VNTR) 数目可变串联重复序列又称小卫星DNA (minisatellite DNA) , 是一种重复DNA小序列, 为10到几百核苷酸, 拷贝数10~1000不等。VNTR基本原理与RFLP大致相同, 只是对限制性内切酶和DNA探针有特殊要求, Lavi等利用VNTR分析了20个芒果品种的亲缘关系。Adato等用小卫星探针对20份芒果基因型进行DNA指纹鉴定和遗传分析。RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism, 限制性片段长度多态性) 是通过限制性核酸内切酶切片段长度多态性来揭示DNA碱基序列组成的异同, Wichan Eiadthong等用cp DNA-RFLP (叶绿体DNA-RFLP) 技术分析了泰国芒果属的13个种[42]。

另外还有, SRAP (Sequence-related amplified polymorphism, 相关序列扩增多态性) ;在RAPD技术基础上发展起来的SCAR标记 (Sequence-characterized Amplified Region, 序列特异性扩增区) 等等分子标记技术在芒果上的应用尚未见到报道。

摘要：文章综述了RAPD、AFLP、ISSR、SSR等分子标记优缺点及其在芒果遗传多样性分析、构建核心种质、种质资源分类鉴定、亲缘关系分析、杂种鉴定、抗病性鉴定、遗传图谱构建等方面的现有应用现状。

分子标记技术在蝇类研究中的应用 篇7

1 用于牡丹遗传多样性分析与品种鉴定的分子标记类型

1.1 分类

根据分子标记的实用性, 即标记与目标性状等位基因之间的连锁关系及遗传距离, 分子标记技术可分为随机DNA分子标记、目的基因分子标记和功能性分子标记三大类[1]。目前应用于牡丹遗传多样性分析与品种鉴定研究的方法主要有随机DNA分子标记和目的基因分子标记。前者主要包括RAPD、AFLP、ISSR、SSR等方法, 后者主要有SRAP、TRAP、EST-SSR、SCo T和CDDP等[2]。

1.2 机理及其特点

随机DNA分子标记一般是扩增非编码区域或随机在基因组中扩增, 所得位点一般与目标性状基因相距较远, 与目标性状连锁不紧密, 应用限制较大。而目的基因分子标记是对目的基因内部的序列进行扩增, 所得标记可能是目的基因的一部分或与其紧密连锁, 具有产生功能标记的潜力, 是对随机DNA分子标记强有力的补充, 在植物资源遗传多样性分析等方面具有重要作用[3]。另外, 这两类技术一般具有可在不同物种间通用且不需要或需要很少基因组序列信息等的共同点。

2 牡丹遗传多样性分析与品种鉴定的分子标记研究进展

2.1 随机DNA分子标记的应用

2.1.1 RAPD标记的应用

牡丹种质资源遗传多样性的研究中RAPD是应用最早的标记方法[4]。虽然聚类结果与传统形态学研究没有取得完全一致的结论[5], 但有研究表明, 牡丹资源中存在着丰富的RAPD遗传变异, 谱带信息中多态性条带比例达22.5%~80.1%[6,7]。

在品种水平上, Hosoki T等[8]分析了19个牡丹品种的RAPD相似性系数为0.722~0.928。陈向明等[9]构建了7种花色35个牡丹品种的RAPD指纹图谱, 并首次提出产地来源较花色对牡丹品种亲缘关系的影响更为突出, 其中有18个品种产生了特异性标记。苏雪等[10]在16个紫斑牡丹品种中获得了4个特异位点, 而且大部分楼子类品种的遗传相似性较高。李涛等[11]对6个牡丹品种进行RAPD分析鉴定共找到17个特异位点。因此, RAPD技术对牡丹资源遗传多样性的分析及品种鉴定具有一定的适用性。

2.1.2 AFLP标记的应用

AFLP技术也广泛应用于牡丹种质资源的研究, 对牡丹的品种鉴定效率也较高。侯小改等[12]运用该技术证明矮牡丹和卵叶牡丹的亲缘关系较近, 并指出株高有可能成为判断品种间亲缘关系远近的因素。8对AFLP引物对30个牡丹品种产生了数目不等的品种特异带型, 并能完全区分开30个供试品种[12]。刘萍等[13]用AFLP技术构建了30个牡丹品种的指纹图谱, 用3对引物组合在2个受试品种中产生了特异位点。对不同花色牡丹品种的AFLP扩增结果表明, 夜光杯、紫球银波、葛巾紫、白鹤卧雪等4个品种分别了产生1~3条特异位点[14]。聚类结果与陈向明等[9]采用RAPD分析的结果相一致, 即来源相同的同色牡丹品种间的亲缘关系相对较近, 但产地来源比花色对牡丹品种间亲缘关系的影响更大。

2.1.3 ISSR标记的应用

目前, 牡丹ISSR分子标记的实验技术体系已经十分成熟。杨淑达等[15]应用ISSR标记得出了滇牡丹遗传多样性水平较高、居群间遗传分化较大并不濒危的结论。该标记还应用到了品种杂交后代的验证方面为牡丹育种工作开辟了有效的检验途径[16,17]。

Suo ZL等[18]指出ISSR分子标记可用来区分牡丹品种, 并提出了“ISSR引物结合位点”与“DNA ISSR片段长度差异”相组合的区分策略[19]。石颜通等[20]分析了89个内国外牡丹品种的ISSR遗传多样性, 结果表明, 多态性条带占94.15%, 能将不同来源的品种区分开, 品种相似系数为0.3294~0.7744, 平均为0.5722。因此, ISSR技术对牡丹种质资源具有较高的区别效率, 且该技术开发费用较低, 具有较大的应用潜力。

2.1.4 SSR标记的应用

因需要设计特定引物, SSR标记技术在牡丹资源研究中的应用受到了限制, 到目前仅获得了共52对适合于牡丹种质资源研究的SSR引物, 然而试验表明这些标记可适用牡丹资源的起源研究和遗传多样性分析[21,22,23]。如Yuan J H等[24]用SSR标记证明了杨山牡丹的母本是稷山牡丹而父本是紫斑牡丹。Zhang J M等[25]的试验结果表明7对核微卫星标记 (n S-SR) 和6对叶绿体微卫星 (cp SSR) 标记对滇牡丹具有中等水平的遗传多样性, 而且SSR标记也适用于大花黄牡丹。SSR标记还证明了秦岭山区是紫斑牡丹地域分布的重要分水岭[26]。今后, 还需在牡丹品种鉴定相关研究中尝试应用SSR标记, 探讨其鉴别效率。

2.2 目的基因分子标记的应用

2.2.1 SRAP和TRAP的应用

虽然SRAP对芍药组的多态性要高于牡丹组[27], 试验表明牡丹种质资源仍然具有丰富的SRAP遗传多样性, 其多态位点百分率达71.4%~90.15%[28,29,30]。牡丹资源的SRAP遗传多样性分析表明:滇牡丹与大花黄牡丹亲缘关系较近, 与品种较远, 而杨山牡丹与全部供试品种的亲缘关系都比较近[28]。另外, 王燕青等[31]构建了33个牡丹品种的SRAP指纹图谱, 并认为遗传差异与品种的重瓣性高低和花型有很大关系。Han XY等[32]对我国芽变群和日本芽变群的SRAP分析表明该技术可有效应用于鉴别芽变品种的亲本。因此, SRAP也可用于鉴定牡丹品种。

TRAP技术非常适合于牡丹品种指纹图谱的构建, 仅用1对引物组合即可成功区分42份材料 (7个野生种和35个栽培品种) [33]。然而, 由于开发成本较高, TRAP技术在牡丹上的应用还极少, 还有待于进一步改进。

2.2.2 EST-SSR的应用

牡丹EST序列数量的速增为EST-SSR标记在牡丹上应用提供了条件。目前, 研究者主要利用现有的大约2204条牡丹EST序列进行分析并获得EST-SSR引物[34,35], 如张艳丽等[34]等确定了10对EST-SSR引物可用于牡丹研究。之后, 有试验表明7对EST-SSR引物组合对56份牡丹产生了较好的多态性[36], 虽然不能将56个供试品种完全区分开, 但有研究表明EST-SSR是进行牡丹品种异名同物鉴定的有效方法[33], 可为今后牡丹品种真伪的鉴定提供便利条件。

2.2.3 SCo T和CDDP的应用

SCo T和CDDP均为新型分子标记方法[37,38], 目前, 这两种技术在牡丹资源中的应用尚处于探索阶段[39]。侯小改等[40]最先以洛阳红基因组DNA为模板筛选出可用于牡丹研究的24个SCo T引物, 每个引物对牡丹资源的多态性也较好, 预期SCo T技术可以应用于牡丹的标记辅助选择育种及分子遗传学分析等方面。

李莹莹等[41,42]筛选出了18条适合于牡丹种质资源分析的CDDP引物, 并对菏泽牡丹品种资源进行了遗传多样性分析, 结果表明, 用18条CDDP引物对299份样品共扩增得到385条扩增带, 其中多态性条带和特异条带分别达95.58%和5.97%, 而且该技术操作简单、费用较低、且多态性明显高于传统分子标记方法, 对牡丹品种具有较高的区分效率。

3 问题和措施

3.1 牡丹种质资源丰富, 分子标记研究还需系统化

牡丹种质资源非常丰富, 品种群较多且地域分布范围极广[43]。各品种群对其主要分布区的生态气候具有适应性, 引种存在一定困难, 因此, 要系统地完成全部牡丹种质资源的遗传多样性分析, 取样范围广、难度大, 所需经费多、周期长, 因此, 前人多以某一品种群为主体开展研究。在品种水平上, 现有牡丹品种数千个, 而且分子标记技术的应用成本相对较高, 因此, 基于分子标记的牡丹品种鉴定工作还比较薄弱。随着社会交通条件的改善和经济水平的提高, 以及分子标记技术的不断改进和完善, 牡丹种质资源的系统化研究将会逐步实现。

3.2 加强随机DNA标记与目的基因分子标记的对比研究

目前, 基于传统随机DNA标记的牡丹种质资源遗传多样性和品种鉴定的研究较多, 而基于目的基因分子标记技术的研究相对较少, 特别是同时应用两类不同分子标记方法对牡丹资源进行横向对比的报道几乎为空白。然而, 两类分子标记方法的联合应用不仅能发现新型分子标记的优缺点, 也有利于全面考察牡丹资源的遗传多样性和提高品种鉴定的效率[44], 因此, 有必要加强上述两类标记技术在牡丹资源研究中的联合应用。

3.3 发挥目的基因分子标记技术的优势, 深化研究内容

在内容上, 牡丹种质资源的研究还多侧重于分析牡丹组内野生种间的亲缘关系、野生种遗传多样性分析以及栽培品种的起源及分类等方面;关于品种水平上的遗传多样性、进化关系以及品种鉴定的研究相对较少[43]。今后, 还需充分开发利用新型的目的基因分子标记技术对牡丹种质资源开展更深层次新内容的研究。

4 展望

今后, 我们可以将实用性更强的新型目的基因分子标记技术用于分析研究牡丹品种水平的遗传多样性, 为建立高效、可靠的品种鉴定技术提供科学依据。另外, 随着牡丹相关基因的分离和测序[45]以及研究者们对目的基因分子标记特点与优势的充分重视, 我们有望开展与牡丹花色、花型、叶形等性状相关的QTL定位研究[37], 这将为牡丹种质资源的研究开辟新途径。相信, 随着新型分子标记技术的发展, 牡丹种质资源的研究会取得许多新突破。

摘要：分子标记技术的实用性越来越受到人们的重视, 在牡丹种质资源遗传多样性分析和品种鉴定等研究方面, TRAP、SRAP、SCoT、EST-SSR和CDDP等新型目的基因分子标记方法的应用为以RAPD、AFLP、ISSR、SSR等传统随机DNA分子标记的研究成果提供了强有力的补充。此文分别对随机DNA分子标记和目的基因分子标记技术在牡丹遗传多样性及品种鉴定中的应用现状作了综述, 指出了目前相关研究中存在的主要问题及其解决措施与方法, 以期为牡丹种质资源的整理、亲缘关系的分析和品种鉴定工作提供研究基础和科学依据。