功能分离（共9篇）
功能分离 篇1
初乳是近年来功能性乳品开发的热点,被誉为“21世纪的保健食品”。作为一种相当有前景的生长促进剂和提高免疫力的功能性食品,初乳被国外科学家描述为“大自然赐给人类的真正的白金食品”,已遍及全球市场。近年来,随着我国奶牛养殖业的迅速发展,牛初乳市场不断扩大,初乳功能性产品的开发越来越受到人们的重视。本文就初乳功能性组分的分离提取和功能性食品开发进行了一定评述。
1 初乳的化学组成及功能性组分
初乳是所有雌性哺乳动物分娩后7天,特别是3天内分泌的乳汁。新鲜初乳色泽黄而浓稠,甚至混有血红色,有苦味和乳腥味。初乳干物质含量比常乳高1.5～2倍,尤其是蛋白质、脂肪、无机盐的含量均显著高于常乳。初乳中维生素A效价特别高,而乳糖含量较之常乳低。其热稳定性差,加热至60 ℃即开始形成凝块[1]。几种动物初乳特点见表1。
注:人、马初乳样品为分娩后24小时内乳汁,牛、骆驼初乳样品为分娩后最初6次挤奶所获乳汁。
初乳中除了含有丰富的优质蛋白质、维生素和矿物质等营养成分外,还含有大量具有生理活性的功能性物质,包括免疫因子和生长因子两大类,其中包括免疫球蛋白(Igs)、乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)、乳过氧化物酶(Lactoperoxidase,LP)、溶菌酶(Lysozyme)、胰岛素样生长因子(IGF-Ⅰ 和IGF-Ⅱ)、转化生长因子(TGF-α、和TGF-β)、表皮生长因子(EGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)等及生物活性肽类。初乳是自然界免疫因子最为富集的食品资源之一,是一种能增强人体免疫力、促进组织生长的健康功能性食品[3]。
2 牛初乳的保健功能
2.1 牛初乳的免疫功能
牛初乳天然富含多种免疫因子,但主要是含量很高且具有抗原结合特性的IgG、LF、LP、PRP及其降解产物,酪蛋白和其他乳清蛋白降解产物等也具有免疫功能。一些较难消化的乳清蛋白组分在肠道形成片段,吸附在肠黏膜上或者吸收进入人体内也会诱发机体免疫反应。
2.2 改善胃肠道、促进生长发育的功能
牛初乳含包括IgG在内的诸多免疫因子,对机体代谢、内分泌具有系统性影响。天然或免疫牛初乳进人胃肠道后,调节肠道菌群,强化营养物质的吸收和利用,对生长发育起到促进作用[4]。
3 初乳功能性组分的分离提取
由于初乳中具有生理功能的免疫因子和生长因子几乎都为蛋白性组分,存在于乳清中,故分离提取出乳蛋白组分非常关键,是乳功能性食品制造的前提。
3.1 超滤(Ultra filtration, UF)法
超滤是集蛋白质浓缩和分离为一身的纯化方法。此法简便快速、条件温和、无相变、处理量大、蛋白质变性及失活少,可用于分离精制及浓缩[5]。李长彪等通过对牛初乳免疫球蛋白IgG乳清液进行超滤浓缩试验,证明超滤浓缩中梯度洗脱法是进一步提高牛初乳中IgG分离纯度的有效手段[6]。贾建波等研究了从牛初乳中用中空纤维超滤膜分离纯化牛初乳IGF-Ⅰ与IGF-Ⅱ,发现在碱性条件下超滤有利于提高类胰岛素生长因子的回收量[7]。卢蓉蓉等采用超滤法可从初乳中初步分离出质量分数为26%,纯度为29.8%的乳铁蛋白粗品[8]。1989 年,日本学者岛崎敬一已经成功将超滤法应用于分离乳铁蛋白,超滤法适合大规模工业生产[9]。
3.2 溶剂提取法
大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液,少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中,因此,可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。Polson等用聚乙二醇(PEG)对IgA进行粗提[10]。也有人使用果菜胶粗提。Beetham等对硫酸铵粗提法、PEG粗提法、果菜胶提纯法进行了比较,γ-果菜胶纯化的IgA活性最低,但果菜胶和PEG法较硫酸铵法省时;硫酸铵法操作较复杂,但纯化的IgA活性高,如能进行改进应该是最为理想的粗提方法[11]。
3.3 凝胶过滤法
也称分子筛层析,是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶(Sephadex gel)和琼脂糖凝胶(Agarose gel)。最初纯化IgA 是牛初乳除脂肪和酪蛋白后,连续经过三次凝胶过滤,即葡聚糖G-200、DEAE-52和葡聚糖G-200,获得较纯的IgA[12]。目前,一般采用盐析后过层析柱方法。云振宇采用SephedexG-75凝胶过滤层析从牛初乳中分离IGF-Ⅰ。结果表明,层析过程IGF-Ⅰ的平均收率为58.84%,分离物中IGF-Ⅰ的浓度平均达到2.137 0 mg/g,较初乳提高约440倍[13]。
3.4 离子交换法
离子交换剂有阳离子交换剂(羧甲基纤维素,CM-纤维素)和阴离子交换剂(二乙氨基乙基纤维素)。傅维琦等选择弱酸性阳离子交换剂CM-SEPHAROSE FAST FLOW装柱,脱脂牛初乳在4 ℃下进行动态吸附上柱后进行阶跃洗脱,乳铁蛋白洗脱液经过超滤和冷冻干燥,得到冻干粉纯度可达98.98%,得率为29.0%[14]。卢蓉蓉采用超滤-离子交换色谱分步洗脱法,对牛初乳中的乳过氧化物酶进行了分离和纯化[15]。肖岚等对牛乳经离心脱脂、酶凝乳除酪蛋白后,通过强阳离子交换色谱分离纯化得到乳过氧化物酶,结果,每毫升牛乳能提取乳过氧化物酶0.027 mg,纯度为97%[16]。
3.5 色谱法
亲和层析法(Affinity chromatography)是分离蛋白质的一种极为有效的方法,常只需经过一步处理即可分离出纯度很高的待提纯的蛋白质。1990 年,T. William Hutehens 利用嗜硫色谱法同步制备初乳乳清中的IgA、IgG、IgM,取得良好的分离效果[17]。徐榕榕等采用金属螯合色谱可较好地分离提取免疫球蛋白,纯度可达89%,同时还可分离得到含量为33%的乳铁蛋白[18]。
3.6 盐析法
蛋白质盐析常用的中性盐主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。凌雪萍等通过盐析法和层析法从牛初乳中分离出乳铁蛋白,并应用酶联免疫法(ELISA)检测不同分离纯化方法所获得的乳铁蛋白的含量,获得纯度约为92%的乳铁蛋白[19]。曲练达等采用3次盐析法和1次凝胶层析法从牛初乳中分离纯化LF,并利用电泳和分光光度法法检测得纯度约为92%的乳铁蛋白[20]。
3.7 乳组分分离的其他技术
除以上所述外,还有以下一些对乳组分进行分离、分级的技术。
3.7.1 微滤(Microfiltration,MF)
MF在乳品工业中的应用包括:分离乳料液中的细菌,即所谓的“冷杀菌”工艺;分离常乳或初乳中的体细胞;酪蛋白分级或标准化;微滤脱脂仍有待进一步研究。
3.7.2 纳米过滤(Nanofiltration,NF)
目前在乳品工业上可采用NF代替反渗透处理乳品,如分离其中的多肽和氨基酸等[21]。
3.7.3 超临界流体萃取
该技术一般用于对乳脂组分进行分级、分离。郭亚东等建立了超临界流体色谱法(SFC)测定牛奶中乳清素的方法,样品前处理简单,可用于牛奶中乳清酸的快速测定[22]。
3.7.4 反胶团萃取
张伟等设计出滚筒式填料筛板萃取器,并用该萃取器反胶团法萃取蛋白质。萃取溶菌酶的实验结果表明,该萃取器萃取效果良好,分相迅速,可有效解决反胶团萃取法萃取蛋白质过程中分相困难的问题[23]。
3.7.5 酶解法
因为胃蛋白酶对IgG能起到酶解作用,而且对IgA 的活性没有影响,是一种非常简便易行的分离IgA的方法。
4 初乳制品生产现状
目前市场上的牛初乳制品都是在牛初乳粉的基础上研制的。市面上牛初乳产品可分为四类:纯牛初乳粉类、初乳奶粉类、牛初乳片剂类、液态产品类。
4.1 纯牛初乳粉类
纯牛初乳粉是将牛初乳经冷冻干燥或低温喷雾干燥成粉后直接包装的牛初乳产品。这类产品由于使用牛初乳粉原料直接包装,未针对特定人群的特点进行配方,IgG和蛋白质含量高、脂肪含量较低,适合添加食用。
4.2 初乳奶粉类
牛初乳奶粉分为两大类:一类是在婴幼儿配方奶粉中强化微量的牛初乳制成的配方奶粉。另一类是针对婴幼儿、儿童、孕产妇、中老年等不同人群的生理需要添加了10%以上的牛初乳粉,并强化各种维生素、微量元素和其他营养素的配方奶粉。为保证其发挥应有的生理功能,冲调温度都在55 ℃以下,防止免疫球蛋白的活性受到破坏。
4.3 牛初乳片剂类
根据牛初乳粉含量的不同和强化营养素的不同可将其分为牛初乳片和牛初乳钙片两类。牛初乳片产品的牛初乳含量较高,其中免疫球蛋白IgG含量为1.5%～4%。牛初乳钙片产品是利用牛初乳能够促进胃肠蠕动和消化吸收,提高矿物质的生物利用率的特点而研制的。牛初乳钙片产品中的牛初乳含量一般较少,其免疫球蛋白IgG含量在1%～1.5%。
4.4 液态类产品
液态牛初乳功能食品中活性IgG数量也依赖于制造工艺的热处理强度。若采用普通工艺,大多数IgG经高强度热处理后均发生变性,例如UHT奶、长效奶等。所以液态牛初乳功能食品的种类较少,主要是牛初乳酸乳饮料和含牛初乳的巴氏杀菌牛奶两种,而且产品的保质期也相对较短,并需要在冷链的条件下储存和销售。
5 初乳功能性食品开发存在的问题、对策与前景
牛初乳潜在的消费市场和巨大的利润空间吸引了许多市场和销售商加入到牛初乳行业中,但由于缺乏统一的牛初乳原料收购标准、产品标准和加工技术,在牛初乳的开发、生产、销售和消费中都暴露出许多问题,包括质量良莠不齐、产品价格偏高、产品宣传夸大、消费者对牛初乳的认识相对滞后、科技研发不力等[24]。
5.1 制订标准、加强监督、规范市场
牛初乳粉等产品问世不久,已发现假冒产品,而且产品价格偏高。因此制定进口牛初乳统一的产品标准、完善检测技术、加强标准安全监管体系是引导牛初乳产业健康发展的当务之急。
5.2 改进现有工艺 ,研究新工艺
牛初乳热稳定性差,可以采用膜分离、微胶囊、 冷冻干燥等高新技术对其进行加工处理,防止酸碱变性,增加稳定性,保持牛初乳产品营养成分与功能性组分[25]。
5.3 针对不同人群,采用不同的产品开发策略
针对儿童、孕妇、运动员等特殊人群的不同生理需求,开发出安全且满足营养要求的产品。利用牛初乳的抗衰老功能还可开发保健食品,美容食品等。
总之,牛初乳是一种营养全面的纯天然食品,具有多种保健功能。目前国内市场上成熟的初乳制品还不多,为了更好地利用牛初乳这一宝贵的资源,满足市场需求,研究开发初乳功能性食品必将成为热点,前景广阔。
6 展 望
我国目前约有成乳牛687.3万头,1头乳牛分娩4天内的泌乳量平均为39～52 kg,牛犊出生后初乳实际喂养量在6.8～11.7 kg,这意味着每年存在约27万t潜在的初乳资源[26]。我们应该利用现代生物技术、分离纯化技术等分离初乳的功能成分,研究牛初乳中功能成分的最佳加工方法,生产如调配牛初乳粉、牛初乳片、初乳口服液、初乳布丁和软糖等种类丰富的功能性食品。随着我国奶牛养殖业的迅速发展、对牛初乳研究的深入和现代科技的进步,初乳作为纯天然的功能性食品将具有更加广阔的开发应用前景和可观的社会经济效益,我国初乳功能性食品的开发正进入方兴未艾的阶段。
摘要：初乳中含有许多免疫因子和生长因子,具有很好的保健功能。文章就初乳的保健功能,功能性组分及其分离提取,初乳制品生产现状,初乳功能性食品开发存在的问题、对策与前景等方面进行了综述,并提出了开发初乳功能性食品的发展方向。
关键词：初乳,功能性组分,保健功能,分离提取
功能分离 篇2
以水产病害的病原菌为目标菌,从中国对虾(Penaeus chinesis)体液中分离筛选抗菌肽,通过Sephadex G-50、RP-HPLC等分离纯化技术,得到一种抑制水产病原菌的抗菌肽PC-V-2.经初步鉴定,该抗菌肽具有广谱抗性,不仅抗鲁克氏耶尔森氏菌(Yersinia ruckeri),而且对金黄色葡萄球菌(Staphyloccus aureus)、枯草杆菌(Bacillus subttilis)等革兰氏阳性菌,大肠杆菌(Escherichia coli)等革兰氏阴性菌和白色念珠菌(Candida albicans)等真菌也有较强的抗性.另外,该抗菌肽还有一定的.抑制凝血的活性,但没有检测到溶血和丝氨酸蛋白酶抑制活性.经MALDI-TOF质谱分析,其分子量为1 848 D,但其序列及其他生物特性还有待进一步研究.
作 者：安贤惠 梁建国 李卫国 徐春花 吕毅 王旭 董靖 张崇星 张克云 AN Xian-hui LIANG Jian-guo LI Wei-guo XU Chun-hua LU Yi WANG Xu DONG Jin ZHANG Chong-xing ZHANG Ke-yun 作者单位：安贤惠,AN Xian-hui(南京农业大学,生命科学院,江苏,南京,210095;淮海工学院,江苏省海洋生物技术重点实验室,江苏,连云港,222005)
梁建国,徐春花,吕毅,王旭,董靖,张崇星,张克云,LIANG Jian-guo,XU Chun-hua,LU Yi,WANG Xu,DONG Jin,ZHANG Chong-xing,ZHANG Ke-yun(南京农业大学,生命科学院,江苏,南京,210095)
李卫国,LI Wei-guo(淮海工学院,江苏省海洋生物技术重点实验室,江苏,连云港,222005)
功能分离 篇3
产品特点：
1.筛粪、出皮、分大小、选蛹、选死虫可同步进行。
2.密封收集虫皮、虫粪，灰尘少。
3.幼虫选净率近100%。
4.功效是人工的8～10倍。
5.费用低，每小时用电在1.5千瓦左右。
操作步骤：
1.该机能自由转动，但工作时要垫平四轮。
2.将随机配送的铁架、木盒放在指定的位置。
3.系好装粪、装皮的布袋。
4.接通電源（220伏），倒入待选的黄粉虫，启动电机，然后调节流量至适宜大小，再锁紧调节杆。
5.注意适时添加黄粉虫和更换接虫盒。
（湖北省随州市富广养殖机械有限公司 陈光付 雷光义 邮编：441300）
功能分离 篇4
石油的主要成份包括烷烃、苯、甲苯和二甲苯等多种有机物组分,其中的复杂芳香烃类化合物有致癌、致突变作用。而且石油在加工和运输等环节均可由于油气挥发、油罐及输油管线渗漏而造成大气环境、土壤以及地下水源的污染[1]。因此,石油污染问题亟待解决。目前,生物降解是解决石油污染问题的关键途径之一。
国内外对石油生物降解方面的研究历时已久。1964年,Zobell CE等对海洋细菌降解石油烃的速率进行了研究[2]。此后,国外学者研究多集中于烃类代谢机制、生物修复、报告基因在生物降解中的应用[3]和降解性质粒等方面[4]。另外,Atlas RM[5]报道,当有污染物胁迫时环境中石油降解微生物的比例会增加。Mishra S等[6]研究表明石油污染物的降解是微生物群落共同作用的结果。
而国内的研究多主要集中在微生物对石油的降解能力[7]、影响生物降解的因素[8]和降解机制等领域[9]。李玉瑛等[10]从石油污染的土壤中及无污染而经芳香烃驯化后的土壤中分离出可以利用石油烃物质的细菌,并对其降解石油烃的能力作了进一步探讨,而且从齐鲁石化炼油区的土壤中分离到6株石油降解细菌。黄永红等[11]通过构建16S rDNA克隆文库,对油藏系统的微生物群落结构和种群的遗传多样性进行分析。结果表明,油藏系统中微生物存在部分未知菌种,大部分微生物为外源微生物。刘永军等[12]通过对石油集输系统中微生物群落结构进行研究,得出以下结论:①油田产水中微生物群落远比原油中的菌群丰富,②在石油集输过程中,油田水样和原油中微生物群落的相似性分别为83.3%和88.2%,微生物群落演替不明显,微生物群落结构较为稳定。岳冰冰等[13]应用 Biolog 微平板技术,研究了大庆油田石油污染区域不同土层微生物群落对碳源的利用特性。结果表明:石油污染明显提高了土壤微生物群落的代谢活性,不同土层之间的微生物代谢强度存在显著差异。石油污染土壤的微生物群落具有独特的群落结构和特点。
微生物降解石油的研究多数着重于单株菌对石油烃的利用能力、影响因素或分析降解过程中的中间产物等方面,而忽视了石油污染对微生物群落结构之间的相互作用,从而对石油污染土壤微生物的群落组成和动态变化了解较少。本研究对喀什地区泽普油田石油产区的菌株多样性进行探讨的同时,对分离到的石油降解功能菌株进行了研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
选用泽普油田产区石油污染的土壤为受试样品。
1.1.2 试剂
16S rRNA和18S rRNA通用引物(由上海捷瑞生物有限公司合成)。
1.1.3 实验仪器
LDZX-40KB型高压灭菌锅(上海申安医疗器械厂);766-O型干燥箱(上海锦屏仪器仪表有限公司通州分公司);THZ-98AB恒温振荡器(上海一恒科学仪器有限公司);GXZ智能型光照培养箱(宁波江南仪器厂);UA-VIS检测器(岛津公司);PCR仪(ABI9700);UA–VIS检测器、NDJ–1型旋转粘度计(上海昌吉地质仪器有限公司);岛津高效液相色谱仪HPLC(型号:250×4.6 mm,5 μm,模式:低压梯度,甲醇和水(4:1)作溶剂,流速:0.800 ml/min,压力:17.2 MPa,柱箱温度:30 ℃)。
1.1.4 培养基
牛肉膏培养基和马丁氏培养基。
1.2 方法
1.2.1 菌株多态性分析
1.2.1.1 分离菌株的形态学观察
采样、制备土壤悬液、土壤稀释液的制备和微生物的分离参考文献[14,15]。基于革兰氏染色观察微生物的形态特征[16]。
1.2.1.2 分离菌株多糖的TLC分析
参考文献[10]测定菌株多糖的TLC。
1.2.1.3 分离菌株菌株多糖的HPLC分析
通过HPLC分析多糖细胞组分。
1.2.1.4 分离菌株的16/18S rRNA序列分析
按照CTAB法提取细菌基因组DNA;用天根酵母提取试剂盒(50次)提取酵母的总基因组;提取分离菌株的基因组DNA,通过PCR技术扩增其16S rRNA或18S rRNA基因序列,进而分析其种属差异。(将基因组DNA作为PCR扩增的摸板,终浓度约为1 nmol/100μl。所用的引物均是通用正向引物P1和通用反向引物P2。DNA扩增反应在25 μl反应体系中进行,包括9.5 μl无菌水、1 μl 引物1、1 μl 引物2、12.5 μl r-Taq和1 μl模板DNA。16S rRNA PCR反应条件:94 ℃,5 min;56 ℃,30 s;72 ℃,1 min;18S rRNA PCR反应条件:94 ℃,5 min;54 ℃,30 s;72 ℃,2 min。用DNA胶回收试剂盒对克隆基因进行回收和纯化;扩增产物直接进行测序,委托北京奥科鼎盛公司测序;测序结果通过http://www.ncbi.nih.nlm.gov网站进行BLAST序列比对。同时,利用Mega4.1软件构建系统进化树)。
1.2.2 石油降解菌株的降解能力测定
1.2.2.1 溶血实验
将实验菌接种于血琼脂平板中,要求每一支菌对应一个平板,接种方法为划线法。然后置37 ℃恒温箱中培养1～2 d后,观察结果,若透明圈不明显者可放置10～22 ℃下,18 h左右后再观察。
1.2.2.2 排油圈检测
取一干净的培养皿,加蒸馏水,水面上加2滴原油形成油膜,在油膜中心加摇瓶发酵液。若中心油膜被挤向四周形成一圆圈,圆圈直径与表面活性剂含量和活性成正比,说明此液中含有的菌种已排油,有降解菌产生。
1.2.2.3 原油黏度的测定
利用粘度计测定原油的的黏度。选用相同的转子和转速分别测定原油和石油发酵培养液,根据得出的偏转角度和系数求得黏度η(mPa·s )。即:η=k·α( k-系数,α-偏转角度读数)。
1.2.2.4 原油降解产物的紫外光谱分析
用紫外光照射有机分子,分子吸收紫外光后,从电子能级基态跃迁到激发态,得到紫外吸收光谱。可根据得到的紫外吸收光谱图对原油降解产物进行分析。将含有石油和不含石油的石油发酵培养基倒入比色皿中,用紫外光谱仪进行分析,得到紫外光谱图。
1.2.2.5 原油降解菌株降解产物的HPLC分析
注:A:细菌多糖(1:对照,2、3、4、5、6分别表示分离的细菌1、细菌2、细菌3、细菌4和细菌5的多糖层析斑点);B:真菌多糖(1:对照;2、3、4、5分别表示真菌1、真菌2、真菌3和真菌4)。
Note:A:polysaccharide of Bacteria (1:control;2,3,4,5,6 stands for TLC spot from bacterium 1,bacterium 2,bacterium 3,bacterium 4 and bacterium 5,respectively); B:polysaccharide of Fungi(1:control;2,3,4,5 stands for TLC spot from fungus 1,fungus 2,fungus 3 and fungus 4).
同降解菌株多糖分析,不同的是本次实验中流动相为60%甲醇和40%灭菌的双蒸水,流速为0.8 ml/min。
2 结果与分析
2.1 石油产区微生物的分离
通过涂布平板分离,利用牛肉膏培养基和马丁氏培养基分别筛选出细菌和真菌。通过革兰氏染色进行形态学观察,结果表明5株细菌均是革兰氏阳性的杆菌,4株真菌呈椭圆形。
2.2 石油产区分离菌株多糖的TLC分析
对培养的菌体细胞进行10% SDS裂解,其水解液用于TLC分析。结果表明,5株细菌所含的多糖与对照斑点(A1)不在同一个位置,因此初步推断5株细菌不含对照糖混合液中的葡萄糖、半乳糖和木糖。而且,细菌1和细菌2的斑点大小、颜色和位置相似,细菌3、细菌4和细菌5不相似(见图A)。真菌的TLC结果表明,4株真菌的层析斑菌与对照多糖混合液的层析斑不同,因此初步推断本研究分离到的4株真菌隶属不同的种属(见图1B)。通过TLC对分离的9个分离菌株进行多糖分析后初步得出结论:泽普油田分离样品中含有4株细菌(见图1A)和4株真菌。
2.3 石油产区分离菌株多糖的HPLC分析
经过HPLC分析,细菌和真菌的细胞水解液里均不含有葡萄糖、半乳糖和木糖,由此区别不了所有细菌和真菌种属的不同。
2.4 石油产区分离菌株的16/18S rRNA序列分析
16S rRNA序列分析结果表明,从油田分离得到的细菌1(B1)和细菌2(B2)的16S rRNA序列完全一致,与Bacillus cereus具有99%的相似度,在Bacillus分支上(见图2)。
从油田分离的细菌3(B3)、细菌4(B4)和细菌5(B5)的测序结果完全一致。以B4和B5构建进化树发现,其共处一个分支(见图3),与Enterobater sp.XW122(AY941837)具有99%的同源性。
4株真菌的测序结果表明,Y1和Y3、Y2和Y4的序列分别一致。以Y1和Y2构建进化树发现,真菌Y1(593bp)和Y2(594bp)菌株的18S rRNA的部分基因序列在同一个分支上(见图4),均与Penicillium aurantiogriseum strain DAOM 214787(JN938945)具有99%的同源性。
2.5 石油降解菌株的降解能力测定
2.5.1 溶血实验
溶血实验结果表明,本研究分离得到的细菌B2能够使鸡血的血细胞溶血。这初步表明B2菌株能降解石油。
2.5.2 排油圈检测
B2的排油圈实验结果表明,在直径为12 cm的培养皿上,排油圆圈直径约为5 cm。因此,排油圈的存在可以说明,B2的石油发酵培养基中含有石油降解菌株。
2.5.3 石油黏度测定
实验结果表明,在同一转子的前提下,含有原油的石油发酵培养基在转速小的时候体现不出黏度系数,随着转速的加大,黏度系数在减小。在相同转速和转子的条件下,接种有降解石油菌株的石油发酵培养液比原油的粘度小(见表2)。因此,含有原油的石油发酵培养基中存在降解菌株并且降解菌株对原油具有一定的降解能力。所以含有原油的石油发酵培养基的黏度系数比同一转速的原油要低。含有原油和不含原油的B2菌株石油发酵培养液在转速为12、30和60 r/min时,其读数不同。
2.5.4 分离菌株石油降解产物的紫外光谱检测
本研究对含有原油和不含原油的石油B2发酵培养液进行了紫外光谱的检测,结果表明,含有原油的发酵培养基在λ=280 nm处出现峰值(见图5)。不含原油的石油发酵培养基在λ=287 nm处也出现了峰值(见图6)。
因此,参考该实验的对照组(图7),紫外光谱实验结果表明,含有原油和不含原油发酵培养液存在降解菌株的降解行为,因为石油发酵培养基只有经过降解菌株一定程度的降解,方可检测到不饱和信号。
2.5.5 分离菌株石油降解产物的HPLC检测
通过HPLC,本研究选择以正丁醇、二甲苯、异戊醇、三氯甲烷和环己烷为对照组,用B2石油降解发酵培养液对石油降解菌株进行了降解能力的初步测定,以期验证该石油发酵培养液中是否含有这对照组中的物质。检测结果表明,石油发酵培养液在4～5 min中出峰,其响应面为4.099和4.474,而正丁醇、二甲苯、异戊醇、三氯甲烷和环己烷在3～4 min内出峰,其响应面分别为3.652、3.660、3.644、3.653和3.654。因此,初步推断,该石油发酵培养液的降解产物不含正丁醇、二甲苯、异戊醇、三氯甲烷和环己烷,但是出现的峰值初步可以推断B2菌株降解了石油。
3 讨论
基于物种多样性、生物多糖多样性的HPLC和TLC分析及16SrRNA序列分析,本研究初步得出泽普油田石油产区的微生物群落存在Bacillus和penicillium属的细菌和真菌。样品中的细菌和真菌具有低丰度。石油降解菌株的比例仅为1.1%。李玉瑛等[10]认为利用石油烃物质的土壤微生物并不多,但当土壤被石油污染后,部分在石油烃污染物的长期选择下,能够利用石油烃作为碳源和能源而大量生长。Atlas RM[5]曾报道,降解烃类的微生物所中比例不到微生物群落总数1%,而当有石油污染物存在时,降解烃类微生物比例增加到10%。微生物群落结构的分析表明,形态观察的方法因其粗略导致微生物群落的辛普森多样性指数偏低,序列分析的方法会使辛普森多样性指数比较稳定。而用TLC分析方法,因能够反映微生物的生理生化产物而更有多态性。
同时,本研究还通过紫外光谱和HPLC初步检测到了具有降解石油的B2菌株。目前,石油降解同其他污染物的降解一样,研究的热点在于分离降解性能强的菌株,通过分子技术构建工程菌株的尝试也在进行。除了研究其降解机制外,石油降解的研究还侧重于研究降解条件的优化,诸如降解菌对底物的优化以达到矿化作用,不同降解菌株的协同降解。关于微生物群落结构的分析有助于优化混合菌株研究,提高分解石油的效果。
4 结论
泽普油田石油产区微生物的群落结构具有一定丰度的细菌和真菌,在分离的菌株中,石油降解菌仅占1.1%。在不同转速下,原油和含有B2的原油发酵液黏度分别为2.07±0.33和0.67±0.20 mPa·s,在0.05水平上有显著性差异,参考排油圈检测等实验的结果,证明在分离菌株中细菌2(B2)对石油具有一定的降解能力。
摘要：目的:在研究泽普油田产区菌株多态性的基础上,对石油降解功能菌株进行探讨。方法:通过稀释平板涂布法分离微生物;采用TLC和HPLC方法对分离菌株进行多糖成分鉴定,并进行16S rRNA和18S rRNA序列分析;采用溶血圈实验、排油圈法、石油黏度测定等方法,测定石油降解菌株降解能力。结果:分离菌株中有5株细菌和4株真菌,且菌株多糖的TLC分析结果与形态学鉴定结果基本相同;5株分离细菌中,2株细菌隶属于Bacillus属,3株细菌隶属于Enterobacter。另外4株真菌被鉴定为隶属于Penicillium属;分离菌株B2能降解石油。结论:泽普油田石油产区微生物的群落中存在一定丰度的细菌和真菌,含有B2的原油发酵液黏度为0.67±0.20 mPa.s.和原油在0.05水平上有显著性差异。推断B2对石油具有一定的降解能力。
功能分离 篇5
花椒籽的主要成分
在花椒籽当中, 包含有很多不同的成分, 例如脂肪酸、蛋白质、氨基酸、矿质元素和生育酚等物质。经过采用气相色谱法对花椒籽进行分析实验, 能得出其中主要含有棕榈油酸、油酸、亚麻酸、亚油酸、硬脂酸、棕榈酸和十七碳烯酸等。其中, 亚麻酸、亚油酸和油酸为主要成分, 能够达到58% ~ 88% 的总含量。在原料花椒籽当中, 含有14% ~ 16% 的蛋白质, 在经过脱脂处理后, 其饼粕当中的蛋白质含量能够达到48% 以上。而在脱脂处理的花椒仁当中, 能够达到更高的蛋白质含量, 约为64%。经过相关部门的检验分析, 证明了在脱脂处理后的花椒仁和花椒饼蛋白质当中, 含有较为齐全的氨基酸组成, 而各种必需氨基酸的含量也相对较高。相比于大豆, 除了赖氨酸以外的其他必需氨基酸含量, 花椒籽都要更高, 由此可以看出花椒籽是一种较为完全的蛋白质资源。利用原子吸收分光光度计检测和分析精制之后能够发现, 花椒籽主要包含锰、锶、铁、镁、钾、钙、钠等矿质元素, 其中, 镁、钾、钙、钠等物质的含量较高, 锰、锶、锌、铁等物质也较为丰富, 而一些重金属元素的含量要远远低于使用卫生标准。利用高效液相色谱对花椒籽进行检测, 发现在每一百克花椒籽当中, 含有27.1 毫克的 α- 生育酚、0.3 毫克的 γ- 生育酚、27.4 毫克的维生素E总量, 但是其中并没有发现 β- 生育酚的成分。
花椒籽蛋白的提取
在提取花椒籽蛋白的过程中, 可采用传统的碱溶酸析法进行制备。提取条件是p H值为12 的溶液酸碱性, 按照1:15 的比例将原料与溶剂进行混合。首先在p H为6 的环境下进行沉淀和离心, 然后在p H为3.6 的环境中进行二次沉淀。在得到花椒籽蛋白后, 加水将溶液p H调至中性环境, 最后进行喷雾干燥。通过这种方法, 能够达到56.4% 的花椒籽蛋白回收率。
除此之外, 还可以利用较为高效的膜分离法进行提取。通过相应的预处理, 得到花椒籽蛋白溶液, 通过超滤浓缩将一部分离子成分、低聚糖、可溶性有毒成分、溶剂等除去, 从而得到花椒籽蛋白。通过超滤的方式, 能够对全部的可溶性花椒籽蛋白进行浓缩和纯化, 不会有所损失。在超滤之后, 利用20% 的三氯乙酸溶液对全部透过物进行检测, 证明其中没有蛋白质, 只有一些肽类物质和一些小分子含氮物质。采用超滤处理的防范, 能够提升可溶性清蛋白自由水剂萃取物当中的含量, 并且迅速除去大部分有毒化合物。在脱毒实验当中, 花椒籽饼粕蛋白质氯化钠萃取液当中, 可以利用渗透和超滤的方式, 完全除去其中的植酸盐。采用超滤处理方法处理水相酶解法得到的花椒籽蛋白溶液, 在202 ~ 203MPa操作压力下, 将温度控制在50℃, 选取p H为9 ~ 10 的溶液环境, 能够得到纯度较高, 且不含毒素的花椒籽蛋白, 回收率远远高于传统方法, 能够达到90% 以上。
花椒籽蛋白质的功能性质
随着p H值的变化, 花椒籽蛋白质的溶解度也会随着发生变化, 并且其变化的趋势与其他很多蛋白质基本相同。在等电点左侧, 随着p H的上升, 花椒籽蛋白质的溶解度会下降。在等电点附近, 溶解度会下降到最低值。而在等电点右侧, 随着p H的上升, 花椒籽蛋白质的溶解度也会上升。但是, 如果p H高于一定限度, 蛋白质的溶解度还会发生下降。随着温度的上升, 花椒籽蛋白当中的持水力会有所降低, 这主要是由于在温度上升的过程中, 蛋白质分子会发生构象变化, 相互之间产生凝聚, 从而降低了持水力。对于花椒籽蛋白质的起泡性来说, 其浓度会产生一定的影响。如果浓度上升, 蛋白质的起泡性也会上升。当处于1% ~ 2% 的浓度之间时, 起泡性将会大幅度上升。同时, 当花椒籽蛋白质浓度处于0.1% ~ 0.5% 之间的时候, 随着浓度的上升, 蛋白质的乳化性和乳化稳定性都会有所提高。如果其浓度在0.1% ~ 0.2% 之间的时候, 乳化稳定性将会迅速提升, 而后其浓度继续提高, 乳化稳定性的增幅就会逐渐减小。
结论
功能分离 篇6
1 材料与方法
1.1 动物雄性SD大鼠, 体重250g~300g, 由山西医科大学实验动物中心提供。
1.2 试剂胶原酶P购自瑞士罗氏公司;双硫棕 (DTZ) 、HEPES、葡萄糖、多聚赖氨酸 (分子量15~30万) 购自美国Sig-ma公司;1640培养基、胎牛血清购自美国Hyclone公司;Dis-paseⅡ购自美国Amresco公司;青链霉素 (双抗) 购自北京索莱宝公司;AO-PI购自南京建成生物科技有限公司;大鼠胰岛素放射免疫试剂盒购自北京北方生物技术研究所。
1.3 主要仪器超净工作台 (北京世安科技林净化技术有限公司) ;CO２细胞培养箱 (北京博奥恒信生物科技有限公司) ;台式冷冻离心机 (长沙湘仪离心机仪器有限公司) ;奥林巴斯激光共聚焦显微镜IX81 (日本奥林巴斯IX51) 。
1.4 方法
1.4.1 原代大鼠胰岛及胰岛细胞分离培养无菌条件下, 大鼠断头处死, 迅速打开胸腹, 在胆总管汇入十二指肠的入口处用止血钳夹住, 经胆总管缓慢注入13mL 4 ℃的1mg/mL胶原酶P溶液, 38 ℃水浴消化11min, 取出立即加入20 mL 4℃ 培养液 (含10%胎牛血清) 终止消化, 剧烈振摇胰腺至细沙状, 用孔径350μm的滤网过滤, 1 200r/min, 离心2 min, 去上清, 加入10mL分离液Histopaque 1077至管中重悬组织, 将10mL 1640培养基慢慢顺管壁注入管中, 3 200r/min, 离心23min。收集界面间的悬浮胰岛, 在含10%胎牛血清, 100U/mL青霉素, 100μg/mL链霉素的1 640 培养基中培养, 并置于37℃, 5% CO２, 100%湿度的孵箱中培养［４］。将胰岛用含3 mmol/L EDTA的无钙镁PBS溶液脱钙后, 加入DispaseⅡ (5mg/mL) 酶液, 培养箱孵育6min, 用4℃培养液终止消化, 吹打使胰岛分散, 1 000r/min, 离心2min, 将胰岛细胞接种在培养皿中, 按胰岛培养条件培养［４］。
1.4.2 大鼠胰岛的DTZ纯度鉴定DTZ 10 mg溶于10 mL DMSO, 用Hanks液 (pH7.8) 1∶1 000稀释, 0.22μm孔径滤膜过滤, 与胰岛制备物混合, 室温10 min后镜检［５］;大鼠胰岛的AO/PI活性鉴定:用Hanks液配制储存液, AO:670μmol/L, PI:750μmol/L, 4 ℃避光保存, 使用前取0.01mL AO与1mL PI混合, 用Hanks液10倍稀释, 0.22μm孔径滤膜过滤, 与胰岛混合10min, 在荧光显微镜下采用490nm激发光, 510nm发射光镜检［６］。
1.4.3 胰岛素分泌实验配置葡萄糖浓度分别是2.8mM, 8.3mM, 16.7mM的KRBH孵育液。方法:1取6个Eppendorf管标号, 各加1mL 2.8mM葡萄糖的KRBH液, 每管挑入5个胰岛, 37℃孵育30 min后, 弃上清。2 每管再加入1 mL 2.8mM葡萄糖的KRBH液孵育, 37℃ 孵育30 min, 收集上清, 标号, -20℃保存待测。3依次给予8.3mM葡萄糖、16.7mM葡萄糖孵育, 方法同上, 收集上清, -20℃保存待测。用放射免疫法检测上述待测样品。
1.4.4 激光共聚焦检测细胞内部钙离子浓度胰岛用Fluo 4-AM (4μM) 染料在37℃的条件下孵育半小时, 孵育完用含2.8mM糖的Hanks液轻轻冲洗两遍, 防止染液残留影响之后的细胞内钙离子浓度的测定, 再加入2mL含2.8mM糖Hanks液。使用奥林巴斯激光共聚焦显微镜IX81观察, 设置激光波长494nm, 发射波长516nm。所得到的比值F/F0 (细胞荧光减去背景荧光和自身荧光) 反应细胞内钙离子浓度的变化［４］。
1.5统计学处理计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 统计分析用Sigmaplot 12.0统计软件, 采用两组t检验或配对t检验进行分析, P<0.05有统计学意义;激光共聚焦的数据用FV10-ASW 3.0软件 (日本奥林巴斯公司) 进行分析。
2 结果
2.1 原代大鼠胰岛一般只离体培养7d, 在体视显微镜下观察, 胰岛质地饱满, 呈椭圆形或圆形, 透光率较小, 直径在100~300μm;胰岛细胞在倒置显微镜下观察呈球形, 部分细胞之间相连成细胞团。胰岛中包含α, β, δ和pp细胞, 但是在体积上有明显差别, β细胞是α细胞的2~3倍, δ细胞比α细胞更小, β细胞直径11~13.5μm。
2.2 DTZ和AO/PI对胰岛纯度及活性鉴定分别在40 倍, 100倍的显微镜下观察, 可见全部胰岛被DTZ染成猩红色;在490nm激发光, 510nm发射光的荧光显微镜下观察, 培养过夜的胰岛97%以上可被AO/PI染成绿色。
2.3 胰岛素分泌实验胰岛分别在葡萄糖浓度为2.8mM (2.8G) , 8.3mM (8.3G) , 16.7mM (16.7G) 的KRBH溶液中孵育半小时后, 所测胰岛素值分别为: (11.7 ± 1.4) uIU/mL, (38.2 ± 8.7) uIU/mL, (86.3 ± 5.1) uIU/mL, 胰岛素分泌量随葡萄糖浓度增加而增加。
2.4 激光共聚焦技术检测胰岛细胞中钙离子浓度实验中, 在2.8mM葡萄糖 (n=10) 的基础上, 8.3mM葡萄糖 (n=10) 可以明显升高胰岛细胞内的钙离子浓度;16.7 mM葡萄糖 (n=10) 在8.3mM的葡萄糖的基础上进一步的升高了胰岛细胞中的钙离子浓度。2.8Gvs8.3G (P<0.0 5) ;2.8Gvs1 6.7G (P<0.001) ;8.3Gvs 16.7G (P<0.01) 。
3 讨论
胰岛细胞移植为治疗胰岛素依赖性糖尿病开辟了一条新的途径［７］。胰岛移植不仅可纠正糖代谢紊乱, 还能避免因血管病变引起的眼、肾、脑和心血管并发症, 但胰岛的分离纯化是一个较复杂的过程, 所获胰岛的产量和质量受很多因素影响, 稍有偏差即会直接影响治疗效果, 因此备受关注［８］。如何获得高纯度及高活性的胰岛仍是亟待解决的问题。
目前成年大鼠胰岛分离纯化多采用机械研磨与Ficoll密度梯度离心法［９］, 而本实验采用单一的Histopaque-1077是即用型的, 减少了Ficoll不同密度分离剂的配制及除菌的步骤。由于纯化时只有Histopaque-1077和1640培养基两个密度, 纯化梯度易于形成, 使得胰岛的纯化变得简便, 缩短了分离大鼠胰岛的时间。此法减少了多步分离过程中不确定的因素对胰岛质量的影响, 尽可能快的给予离体胰岛营养, 利于获得纯度高, 活性良好的胰岛。Histopaque-1077 较Ficoll等能提供一个更好的渗透环境, 能更好地保持胰岛的活性与功能。实验证实, 胶原酶P消化胰腺及利用Histopaque 1077分离得到的大鼠胰岛纯度高、活性、功能良好。同时我们总结了大鼠胰岛分离纯化过程中一些体会:1胰腺灌注的成功与否是分离纯化胰岛的关键, 文献报道多采用4.5号头皮针穿刺灌注, 为防止针尖过于锐利, 刺破胆管壁致胶原酶外溢, 我们采用与此针头同样粗细的细塑料管 (尖端较钝) 进行灌注。2灌注时用线结扎位置要在最低一支胆管与主干的汇合支以下, 以防止部分酶液倒流至肝内。3应采用4℃的胶原酶灌注, 因温度高时胶原酶过早消化胰管和腺泡, 灌注好的胰腺应置于0℃ 的冰袋上剔除非胰腺组织, 这些非胰腺组织无法消化且会黏附正常胰腺组织, 不利于过滤。4胰腺消化分散后, 应立即加入20mL 4℃培养液, 混匀终止消化。如果培养液用量太少, 则不能终止胶原酶的作用, 造成过度消化, 破坏胰岛完整性, 影响分离效果［１０］。
DTZ是一种螯合锌、铜、铅等的指示剂, 因为大鼠的胰岛β细胞含锌, DTZ染液可将胰岛染成猩红色, 所以DTZ对胰岛是特异性染色［５］;AO为浸润性染料 (膜通透性) , 可侵入活细胞与双链DNA结合发出绿色荧光;PI为排斥性染料 (膜不通透性) , 不能进入活细胞, 与死亡 (膜通透性改变) 细胞的核酸结合, 发出红色荧光［６］。实验中, 所有胰岛可被染成猩红色, 表明用此种实验方法分得的胰岛纯度较高;AO/PI可将97%以上胰岛染成绿色, 表明胰岛活性良好。葡萄糖依赖性的胰岛素分泌实验证实了胰岛功能良好。胰岛细胞中钙离子浓度会升高会促进胰岛素分泌。我们对胰岛细胞中钙离子浓度进行检测后发现, 利用高浓度葡萄糖刺激胰岛时, 可明显升高胰岛中钙离子浓度。利用胶原酶P消化胰腺及利用Histopaque 1077分离液离心纯化胰岛是一种较简单可靠的方法。
摘要：目的 探讨成年大鼠胰岛分离、纯化的方法, 为成人胰岛的分离纯化奠定基础。方法 通过用胶原酶P消化胰腺及利用Histopaque 1077分离液离心分离纯化雄性SD大鼠胰岛, 用双硫棕 (DTZ) 染色, 吖啶橙-碘化丙啶 (AO/PI) 染色和胰岛素分泌实验来鉴定胰岛的纯度、活性和功能;利用激光共聚焦技术检测胰岛细胞中钙离子浓度。结果 分离获得的胰岛可被DTZ和AO/PI分别染成猩红色和绿色;体外刺激胰岛素分泌实验, 2.8mM、8.3mM、16.7mM葡萄糖情况下胰岛素分泌量分别是: (11.7±1.4) uIU/mL、 (38.2±8.7) uIU/mL、 (86.3±5.1) uIU/mL;在2.8mM葡萄糖基础上, 8.3mM葡萄糖明显增加胰岛细胞中钙离子浓度, 16.7mM葡萄糖在8.3mM葡萄糖基础上又进一步升高钙离子浓度。结论 采用胶原酶P消化法及Histopaque 1077分离液离心分得的胰岛纯度高, 活性、功能良好, 随着葡萄糖浓度的增加, 胰岛细胞中钙离子浓度明显增加。
关键词：胰岛,分离,钙离子,原代大鼠
参考文献
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功能分离 篇7
1 材料与方法
1.1 组织的采集及总RNA的提取
在常德市金华屠宰厂采集牛的乳腺组织,用上海英骏生物技术有限公司的Trizol试剂盒提取总RNA,用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水溶解,采用紫外分光光度计测定纯度和含量,稀释至100 ng/μL,-20 ℃保存,备用。
1.2 引物的设计和RT-PCR
以人TIRAP基因的mRNA序列为信息探针,采用网上在线工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)在GenBank中搜寻同源的牛ESTs序列。选取同源性大于80%的牛ESTs序列,构建ESTs重叠群(contig),以contig作为设计引物的靶序列,结合人的基因结构信息,用Primer Premier 5.0软件设计RT-PCR引物,其序列为F 5′-ATGGCATCATCAACCTCCTCC-3′,R 5′-ATCAAGCATCAGCCAAGGGTC-3′。
应用宝生物工程(大连)有限公司的反转录试剂盒,按照产品说明书以总RNA为模板扩增第1链cDNA;然后以第1链cDNA为模板分别用引物F和R进行RT-PCR(退火温度为59 ℃),扩增TIRAP基因cDNA片段。扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测,纯化、回收后送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。
1.3 TIRAP基因序列的生物信息学分析
对经RT-PCR所得的基因片段进行测序后,分别采用NCBI在线工具和DNAStar 6.0软件进行序列同源性比对和cDNA序列结构分析。根据开放阅读框推导该基因编码的氨基酸序列,采用网上在线工具(http://www.expasy.org/、http://smart.embl-heidelberg.de/和http://psort.nibb.ac.jp/form2.html)进行蛋白质分子质量、等电点、结构域、二级结构等结构特征和功能的分析。
2 结果与分析
2.1 TIRAP基因cDNA的克隆
根据所设计的引物,应用LA聚合酶和高GC Buffer,对TIRAP基因的编码区进行RT-PCR,其结果通过1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测,见图1。
P.TIRAP基因的RT-PCR产物;M.DL-3 000 Marker。
2.2 TIRAP基因cDNA序列分析
对经RT-PCR得到的TIRAP cDNA片段回收、克隆、测序后得到cDNA长为707 bp的条带,其编码区为699 bp(1～699 bp),编码232个氨基酸,分析其碱基含量,其中A+T为31.90%,G+C为68.10%。将该cDNA序列与牛基因组数据库进行比对,检索到与牛29号染色体上的基因组序列(NW_001494526.1)的相似率达到100%,且有3个“断裂”点,可知牛TIRAP基因位于29号染色体上,并且该基因的DNA含有3个外显子和2个内含子。
2.3 TIRAP克隆的cDNA所推导的蛋白质特性分析
2.3.1 氨基酸组成
由克隆得到的牛TIRAP cDNA序列推导出TIRAP蛋白全长为232个氨基酸(见图2),分子质量为24 433.50 u,等电点为6.95。对氨基酸组成分析结果显示,丝氨酸(Ser)的含量最高,达到15.09%;其次为甘氨酸(Gly),占10.78%;极性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)63个,占27.16%;疏水性氨基酸(A、I、L、F、W、V)68个,占29.31%。
注:下划线部分为蛋白质的TIR结构域;加框部分为 核定位信号序列。
2.3.2 结构域分析
采用网上在线工具(http://www.expasy.org/prosite/)预测了TIRAP蛋白的结构域(见图2)。结果表明,此蛋白含有TIR结构域(95～179 aa),在细胞信号转导过程中TIR结构域可能介导同型蛋白之间的相互作用,从而提示牛的TIRAP蛋白在TLRs信号转导中起着重要作用。
2.3.3 TIRAP蛋白的亚细胞定位预测
采用网上在线工具(http://psort.nibb.ac.jp/form2.html)预测了牛TIRAP蛋白的亚细胞定位。结果表明,该蛋白位于细胞核的概率为43.5%,位于细胞质的概率为30.4%,位于线粒体的概率为21.7%,位于细胞骨架的概率为4.3%。此外,还在第10个氨基酸处发现了核定位信号序列,即PGSRSKK。
2.3.4 牛TIRAP蛋白α螺旋和β折叠预测分析
利用DNAStar6.0软件中的Protean程序预测了Garnier算法下的TIRAP蛋白的二级结构,见图3。结果显示,牛TIRAP蛋白的二级结构包含9个α螺旋,5个β折叠,21个T转角,20个无规则卷曲。分析人、鼠、狗等物种的TIRAP蛋白,发现它们也都具有类似的结构,这些结构对维持蛋白质的结构和功能起着重要作用。
2.3.5 疏水性分析
利用网上在线工具(http://www.expasy.org/tools/protscale.html)预测了TIRAP蛋白的疏水性。结果表明,在蛋白质序列的第6～110位氨基酸表现为较强的亲水性,而111～161位氨基酸则表现为较强的疏水性。
2.4 TIRAP蛋白质同源性分析
采用NCBI的Protein Blast工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)将TIRAP蛋白的氨基酸序列与其他物种的TIRAP蛋白的氨基酸序列比对。结果发现:该蛋白与人(登录号为AAH32474)、小鼠(登录号为NP_473437)、大鼠(登录号为XP_001055833)和狗(登录号为XP_851910)蛋白的同源性分别为76%、65%、64%和76%,TIR结构域的同源性均达到85%左右,说明TIRAP蛋白的TIR结构域比较保守,其他区段的氨基酸变异很大。
3 讨论
TIRAP蛋白为人和小鼠的TLRs信号通路的下游信号分子[1,2]。Yamamoto M等[5]进一步研究了TIRAP/MAL和MyD88双基因敲除小鼠。结果发现,该小鼠巨噬细胞受脂多糖(LPS)刺激后,干扰素(IFN)诱导性基因的表达正常,LPS诱导的树突状细胞(DC)共刺激分子(CD40、CD80、CD86)表达未受到影响,从而证明TIRAP与MyD88在TLRs介导的信号转导中具有相似的作用,可通过TIR结构域与TLRs的TIR结构域相互作用,形成异源二聚体,调节下游的信号转导[3]。试验克隆得到牛TIRAP基因cDNA的编码区,推导出牛TIRAP蛋白包含232个氨基酸,经过生物信息学分析发现,该蛋白包含TIR结构域,且与人、小鼠、大鼠和狗TIRAP蛋白的TIR结构域的同源性均达到85%。亚细胞定位结果表明,TIRAP蛋白位于细胞核、细胞质和线粒体等多种细胞器上。由本研究结果可知,奶牛TIRAP蛋白具有与小鼠和人相似的TIR功能结构域,推测奶牛TIRAP蛋白可能与人和小鼠TIRAP蛋白的功能相似,即通过TIR结构域与TLRs相结合,并与下游信号分子作用,引起胞内的核因子表达,产生炎症反应,使机体产生抗病性。奶牛乳房炎是受病原体感染所致的疾病,与TLRs中的TIR结构域及其信号转导有关[6]。综上所述,本研究结果提示奶牛TIRAP蛋白可能在乳房炎抗性的分子机制中发挥重要功能。
参考文献
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功能分离 篇8
中科院宁波材料所高分子事业部陈涛研究员的智能高分子材料团队长期致力于二维高分子纳米复合油水分离材料的研究,通过表面接枝高分子刷和多级组装技术,获得多种新型复合材料,可实现高效分离油水乳液和净化水质。科研人员采用多孔陶瓷作为衬底,抽滤纳米碳管(CNTs)成膜,采用自引发的光接枝光聚合的方法接枝疏水性的高分子聚苯乙烯(PS)到CNTs的表面,进而协同利用CNTs薄膜的高粗糙度表面,获得超疏水性的二维杂化薄膜材料。该膜可用于微米和纳米级油包水乳液的大通量、高效分离。在此基础上,将得到的超疏水性的PS/CNTs薄膜反转并转移到另一个基底上,再次通过SIPGP将亲水性的聚甲基丙烯酸二甲胺乙酯单向接枝到CNTs膜的表面,从而得到具有亲水/疏水结构的双面复合薄膜(PDMAEMA/CNTs/PS),实现对油包水和水包油乳液进行选择性分离的效果。针对现有油水分离材料不耐腐蚀的问题,该团队在CNTs表面接枝修饰较低表面能的全氟癸基三乙氧基硅烷(PFDTS),从而简便制备了形貌、流速可控的PFDTS/CNTs薄膜,实现高效、快速的乳化油水分离。该薄膜具有较好的耐酸碱、耐高温低温和阻燃性能,为提高油水分离材料的实用性奠定了良好的基础。
摘要：<正>中科院宁波材料所高分子事业部陈涛研究员的智能高分子材料团队长期致力于二维高分子纳米复合油水分离材料的研究,通过表面接枝高分子刷和多级组装技术,获得多种新型复合材料,可实现高效分离油水乳液和净化水质。科研人员采用多孔陶瓷作为衬底,抽滤纳米碳管(CNTs)成膜,采用自引发的光接枝光聚合的方法接枝疏水性的高分子聚苯乙烯(PS)到CNTs的表面,进而协同利用CNTs薄膜的高粗糙度
功能分离 篇9
1 试验材料与方法
a.土壤样品来源 常年堆放秸秆垛下面的土壤;腐烂的秸秆;森林里有机质丰富的土壤。
b.初筛分离平板培养基 KH2PO42.0g、 (NH4) 2SO41.4g、MgSO4·7H2O0.3g、CaCl20.3g、FeSO4·7H2O 0.005g、MnSO40.0016g、ZnCl20.0017g、CoCl20.002g、蒸馏水1000mL, pH值5.5~6.0, 121℃/30min灭菌, 以滤纸为惟一碳源。
c.羟甲基纤维素钠复筛培养基 CMC-Na20g、NaH2PO42.5g、KH2PO41.5g、蛋白胨2.5g、酵母膏0.5g、蒸馏水1000mL、琼脂20g, pH值7.0~7.2、121℃/30min灭菌。
d.滤纸条培养基 KH2PO42g、MnSO41.6mg、ZnCl21.7mg、CoCl22.0mg、 (NH4) 2SO41.4g、MgSO4·7H2O0.3g、CaCl20.3g、FeSO45mg、蒸馏水1000mL, pH值5.5。于直径为1.5cm、长15cm试管中加入上述无机盐培养基5mL, 加1条去淀粉处理的新华滤纸 (6cm×1cm) 垂直于试管中, 加棉塞121℃/30min灭菌。
e.刚果红鉴别培养基 (NH4) 2SO42.0g、MgSO40.5g、KH2PO41.0g、NaCl0.5g、CMC-Na2.0g、刚果红0.2g、琼脂20g、蒸馏水1000mL。
f.秸秆纤维素的制备 将水稻秸秆剪成2~3cm小段, 烘干后粉碎至60目, 加入2%的氢氧化钠溶液至固液重量比为1∶5, 在80℃水浴处理1h, 水洗至中性, 烘干备用。
g.滤纸的预处理 将大块滤纸剪成直径近于培养皿大小的圆形, 用1%的醋酸浸泡一昼夜除去淀粉, 用碘液检验, 再用2%NaHCO3洗至中性, 晒干待用。
h.纤维素分解菌的筛选分离方法 将所采土样在灭过菌的滤纸平板上点样, 每个平板4~5个点, 28~29℃培养7d进行初筛。再将初筛出的菌株通过接种于CMC-Na培养基上, 入培养箱中28~29℃培养3d进行增殖, 然后编号放冰箱保存待用。将增殖后的菌株用接种针点种 (5mm菌碟) 于鉴别培养基平板上, 每个平板上点3个点, 28~29℃培养48h, 测溶解圈直径, 将溶解圈大的菌株纯化4℃冰箱保存。
i.滤纸分解度的观察 将发酵液经滤纸过滤, 再经4000r/min离心15min, 再经0.22μm的细菌过滤器过滤所得上清液即为粗酶液, 在试管中加入酶液3mL的酶液, 再加入pH值4.4的柠檬酸缓冲液2mL摇匀后加入滤纸条 (1cm×6cm) 和几滴二甲苯, 置于50℃恒温水浴中静置反应24h后稍加震动, 观察其分解强度并用失重法测定其降解度:滤纸边缘膨胀 (+) ;滤纸整齐膨胀并下弯 (++) ;滤纸不定形 (+++) ;全成糊状 (++++) 。
2 试验结果与分析
2.1 纤维素降解菌的初步分离
从各地采集的样品中共分离到比值大于1的菌株22株, 其中包括木霉菌20株、青霉菌1株、细菌1株, 该细菌的溶解圈直径为30.44mm, 真菌中比值大于1.5的有8株, 分别是M1、M2、M3、M13、M19、M21、DZ、M49, 其中M2、M19生长速度最快, 3d可长满皿, 且产孢量大。其它生长比较缓慢。选择上述两种木霉和一株青霉为试验对象进行下一步试验。其溶解圈的大小如表1所示。
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2.2 纤维素降解菌对滤纸降解的测定
由表2可以明显看出, 选定的3株菌对滤纸都有较强的降解作用, M2和M19菌株在酶反应24h后, 滤纸成糊状, 另外各菌种在同等条件下对秸秆都有一定的降解能力。但在不同温度条件下降解率不尽相同, 两株菌在37℃下降解率分别为53.22%和52.37%, 在30℃条件下降解率有所下降。
3 结论与讨论
纤维素的彻底降解是在微生物区系中多种微生物长期相互作用的结果, 这一过程仅靠一种微生物是很难完全实现的。分解纤维素的酶是由多种组分组成的酶系。因此, 在进行纤维素大分子降解的研究过程中要考虑到微生物产酶体系之间的协同效应, 尤其是不同真菌之间具有较强的相互作用。试验筛选出分解秸秆的具有高活性的3株菌株, 通过对滤纸率进行初步的测定, 表明3株菌株均具有较高的降解能力。对菌种的鉴定、抗药性的测定以及在低温条件下对纤维素的降解能力等有待进一步研究。
参考文献
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