分离提取（精选11篇）
分离提取 篇1
我国海洋生物资源非常丰富,具有较好的应用和开发前景。在大量前期工作的基础上,笔者发现口虾蛄醇提取物对人低分化鼻咽癌细胞系CNE-2Z细胞生长及人鼻咽癌裸鼠移植瘤具有抑制作用[1,2,3]。对口虾蛄醇提取物进行系统溶剂法分离得到石油醚、乙酸乙酯及正丁醇3种提取物,乙酸乙酯提取物对鼻咽癌细胞CNE-2Z的抑制率远高于其他两组,表明口虾蛄醇提物抑制鼻咽癌CNE-2Z细胞生长的活性成分主要存在于乙酸乙酯提取物中[4]。因此,本文以口虾蛄醇提物中乙酸乙酯浸膏得率为评价指标,采用正交试验设计探索最佳的提取工艺。
1 实验材料
口虾蛄(购于湛江港口,由广东海洋大学鉴定);METTLER AE240电子分析天平(梅特勒-托利多上海有限公司);其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 正交试验设计
为系统考察液液萃取法对乙酸乙酯提取物浸膏得率的工艺参数,经过多次单因子对比试验结果分析,选用提取温度(A)、提取次数(B)、液料比(C)3个因素作为考察因素,以测得的乙酸乙酯浸膏得率为评价指标,选用L9(34)正交表进行实验,见表1。
2.2 供试品的制备
精密称取口虾蛄乙醇粗提物20 g,按1∶3的比例(浸膏冰)加入相应体积的蒸馏水,充分搅拌,使其分散成均匀的乳浊液。将此乳浊液倒入分液漏斗中,再往其中加入一半体积的石油醚Ⅱ,充分振荡,静置,分去石油醚层。之后加入一半体积的乙酸乙酯,其萃取步骤同石油醚Ⅱ。上层浅黄色澄清的溶液为乙酸乙酯层,合并提取液,过滤,蒸干,即得乙酸乙酯浸膏。
2.3 浸膏得率的测定
精密吸取以上供试品10 ml于干燥至恒重的蒸发皿中,水浴蒸干后真空干燥3 h,冷却30 min,迅速精密称重,计算浸膏得率,结果见表2。
2.4 正交试验结果
表3的直观分析结果表明,口虾蛄乙醇提取物的影响因素大小为A>B>C;采用SPSS 13.0进行方差分析,结果见表3,显示温度对提取效率影响显著(P<0.05),提取次数、液料比两因素对提取效率无显著影响(P>0.05)。综合分析,最佳的提取工艺条件为A1B2C2,即温度60℃,提取2次,料液比为1∶5。
2.5 液液萃取法与系统溶剂法的比较
液液萃取法:精密称定口虾蛄乙醇粗提物20 g,加入石油醚Ⅱ60 ml,萃取3次,弃去醚层,加入60 ml乙酸乙酯,萃取3次,合并萃取液,过滤后蒸发称重。
系统溶剂法:精密称定口虾蛄乙醇粗提物20 g,依次加入石油醚Ⅱ,乙酸乙酯各60 ml,提取3次,合并提取液,过滤后蒸发称重。
结果显示,按浸膏得率测定乙酸乙酯浸膏得率,采用液液萃取法和系统溶剂法的乙酸乙酯浸膏得率分别为7.4%和5.1%,表明用液液萃取法提取乙酸乙酯浸膏效果更高。
2.6 验证试验
为确保提取工艺的重现性及可行性,按最佳提取工艺条件进行了3次验证试验。结果乙酸乙酯浸膏得率分别为7.3%、7.6%、7.2%,平均值为7.4%,RSD为2.82%,重现性较好,说明提取工艺条件基本稳定。
3 讨论
本实验在保证口虾蛄乙酸乙酯提取物抗肿瘤活性不变的前提下,所进行的正交试验结果表明,温度对提取物得率影响显著。升高萃取温度可以提高萃取物的挥发度,从而使得率提高,但是升高温度对抗肿瘤活性成分的稳定性有一定影响。随着萃取次数增加,乙酸乙酯提取物得率亦增加,超过2次时,萃取得率趋于稳定。由于溶解溶质需一定的时间才能达到溶解平衡,溶解达到平衡后,再增加萃取次数,萃取得率不会增加太大,因此,最佳萃取次数选择2次。料液比越小提取率越高,料液比太大,萃取液浓度则大,所以在保证一定提取率的基础上选择料液比为1∶5较为合适。
综合考虑,口虾蛄乙醇提取物的最佳提取工艺为温度60℃,提取2次,料液比为1∶5。通过优化实验,有效地提高了口虾蛄乙酸乙酯提取物的得率,为进一步试验提供依据,同时,3批验证试验结果表明该工艺稳定可行。
摘要：目的:优选口虾蛄乙醇提取物的分离提取工艺。方法:采用L9(34)正交设计法,考察提取温度(A)、提取次数(B)、液料比(C)3个因素,以乙酸乙酯浸膏得率为评价指标。结果:最佳的提取工艺条件为A1B2C2,即温度60℃,提取2次,料液比为1∶5。结论:3批验证试验结果表明,该工艺重现性良好,稳定可行。
关键词：口虾蛄,提取工艺,正交设计
参考文献
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[3]顾帝水,黄培春,孔霞.口虾蛄提取物对人鼻咽癌裸鼠移植瘤生长的影响[J].现代中西医结合杂志,2005,14(14):1825-1827.
[4]孔霞,黄培春,陈锦.口虾蛄乙酸乙酯提取物对鼻咽癌细胞生长和分化的影响[J].宁夏医学杂志,2007,6(6):494-495.
分离提取 篇2
由于苷结构特点及性质,提取苷类化合物一般需要注意三方面：
酸 ┐
├ 提取过程中避免接触 ┐
碱 ┘ ├ 才能提得原存于植物体中的原生苷。
酶 设法抑制或破坏酶的活性。 ┘
各种苷类分子，由于苷元不同、连接糖的种类和数目也不同，因而极性差异很大，很难用统一的方法提取苷类，目前常根据大多数苷类在甲醇、乙醇或乙酸乙酯中溶解度较大，而采用这些溶剂提取。
下面介绍一种系统溶剂提取法，此方法按溶剂极性由小到大的次序提取得到极性不同的苷。
苷的分离纯化
·溶剂处理法
分离提取 篇3
关键词：虎杖;黄酮;α-葡萄糖苷酶;抑制剂;体内活性
中图分类号：R284.2文献标识码：A文章编号：1673-2197（2007）11-037-06
1 概述
1.1 虎杖
虎杖为蓼科蓼属草本植物。虎杖的根及茎，为我国传统中药，可祛风利湿，散瘀定痛，止咳化痰。迄今已从虎杖中分离得到的化学成分主要有蒽醌及蒽醌甙；芪类化合物；酚性成分；黄酮类化合物。现代药理研究表明虎杖具有降血糖作用，对动物实验性糖尿病，能降低其糖尿病的发生率和死亡率。
1.2 α-葡萄糖苷酶抑制剂与糖尿病
α-葡萄糖苷酶抑制剂通过抑制存在于小肠粘膜微绒毛膜表面的麦芽糖酶和蔗糖酶等水解酶，能够延缓或减少肠道对碳水化合物消化与吸收，具有降低餐后血糖的作用。α-葡萄糖苷酶抑制剂是一种安全有效的新型口服降糖药。
1.3 本课题的主要研究工作
本课题的研究内容是从原药材虎杖中提取对α-糖苷酶有抑制活性的有效部位——虎杖黄酮，考查其物理、化学性质、酶学性质及温度、pH稳定性质。
2 试剂与仪器
2.1 材料
中药虎杖；D101型大孔吸附树脂。
2.2 试剂
2.2.1 α-葡萄糖苷酶酶活力测定试剂配制
磷酸钾缓冲液；α-D-葡萄糖苷酶；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）；还原型谷胱甘肽；Na2CO3终止液；对硝基酚（PNP）。
2.2.2 己糖激酶酶活力测定试剂配制
Tris-HCl缓冲液；葡萄糖；辅酶Ⅱ溶液；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；MgCl2溶液；己糖激酶酶溶液；ATP溶液；还原型辅酶Ⅱ标准液。
2.2.3 提取及成分分析试剂
三氯化铁试剂；茚三酮试剂；双缩脲试剂；香草醛-盐酸试剂；Frhde试剂；α-萘酚试剂；磷钼酸试剂。
2.3 仪器与设备
电热恒温水浴锅；752紫外光栅分光光度计；低速离心机；热恒温鼓风干燥箱；旋转蒸发器；冻干机；-86℃冰箱；电子分析天平等。
3 实验方法
3.1 虎杖中有效成分的提取分离
3.1.1 虎杖中黄酮类成分的提取
乙醇浸提：200g虎杖，用60%乙醇浸提,过滤，滤液用60%的无水乙醇浸提，过滤，反复共3次，得初提液。减压浓缩，回收乙醇，得到浸膏。
水醇法除叶绿素：乙醇浓缩液加蒸馏水离心,沉淀即为叶绿素，弃去。
石油醚脱脂：浸膏用蒸馏水洗下，石油醚脱脂，回收石油醚。脂类物质无抑制剂活性，水相有强的抑制剂活性。
乙醇洗脱：用40%乙醇洗脱至无色，再用70%乙醇洗脱至无色，最后用无水乙醇洗脱至流出液呈无色。
3.1.2 大孔吸附树脂处理
预处理:取200mlD101大孔吸附树脂，用无水乙醇浸泡1天。
装柱：采取湿法装柱，加入无水乙醇连续冲洗至洗出液与蒸馏水1∶2混合后不产生混浊为止，改用大量蒸馏水冲洗至无醇味，用pH=9的NaOH溶液洗柱。
洗脱：样品溶于少量蒸馏水，加至柱上端。先用水洗脱，至洗出液无色；再分别用40%乙醇、70%乙醇溶液洗脱，最后用无水乙醇溶液洗脱。40%、70%和100%乙醇洗脱液分别减压浓缩。
3.2 提取物成分分析
3.2.1 检测氨基酸
样品中滴加数滴茚三酮溶液，加热至沸腾，冷却后如显蓝紫色表明含氨基酸。
3.2.2 检测蛋白质
样品中加入适量双缩脲试剂，冷却后如果显紫红色表明可能含蛋白质或肽类。
3.2.3 检测酚类
样品中加入三氯化铁试剂，如显蓝绿色表明可能含有酚类。将样品点样于滤纸上，喷洒香草醛-盐酸试剂，具有间苯三酚或间苯二酚结构的物质显红色。
3.2.4 检测糖类
样品中加入α-萘酚试剂，再滴加少量浓硫酸。如果样品液于浓硫酸接触面产生紫红色环，即表明可能存在糖类、甙类或其它还原性物质。
3.2.5 检测皂甙
样品的乙醇提取液蒸去乙醇后的残渣溶解或悬浮于醋酐中，滴加1滴浓硫酸，如果显示紫红色并且溶液上层逐渐变绿，表明含甾体三萜类或皂甙。
样品中加入Frhde试剂数滴，当皂甙遇此试剂时初呈橘红色，渐变紫黑色。
3.2.6 检测黄酮类
取乙醇提取液，加入镁粉，再加入浓盐酸，如果产生的泡沫处显桃红色则可能含有黄酮类物质。
三氯化铝反应：将样品溶于甲醇中，加三氯化铝甲醇溶液，3-羟基黄酮、5-羟基黄酮与Al3+产生螯合物而呈鲜黄色。
3.2.7 检测生物碱类
取提取液，加入磷钼酸溶液，若出现白色或黄褐色无定形沉淀，再加氨水沉淀转变为蓝色，则可能含有生物碱类。
3.2.8 检测蒽醌类
样品溶于无水乙醇，点样于滤纸上，喷KOH溶液，在紫外下显黄、橙、紫色荧光，则表明含有蒽醌类物质。
3.2.9 检测鞣质
取明胶于试管，加入样品水溶液，若产生沉淀，则表明含有鞣质。
3.2.10 发泡性实验
取提取物，加水煮沸后滤出水液，振摇产生持久性泡沫，则皂甙检验为阳性。
3.3 有效成分的酶学性质
3.3.1 抑制剂的溶解性
在抑制剂粉末中分别加入蒸馏水、95%乙醇、乙酸乙酯、乙醚、氯仿、环己烷溶液，观察其溶解情况。
3.3.2 有效成分对pH的稳定性试验
先将虎杖提取物用pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的缓冲液配成浓度为0.5mg/ml的溶液，取不同pH的提取物溶液测定其对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，取不同pH的提取物溶液测定其对己糖激酶的激活活性。
3.3.3 抑制剂对温度的稳定性试验
先将的抑制剂溶液分别于20、40、60、80、100℃保温,迅速冷却至室温，然后各取20μl测定对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。
3.3.4 虎杖提取物与α-葡萄糖苷酶和己糖激酶作用时间对酶活的影响
在试管中依次加入磷酸钾缓冲液、还原型谷胱甘肽、α-葡萄糖苷酶和虎杖提取物溶液，37℃分别保温0.5、1、2、4、6min,加PNPG反应后测定抑制活性。
在Tris-HCl缓冲液溶液中，依次加入葡萄糖溶液，辅酶Ⅱ，G-6-PDH，氯化镁溶液，己糖激酶和虎杖提取液,在37℃下保温0.5、1、2、4、10min，加ATP溶液为反应开始，在340nm处扫描6min内吸光度的变化。
3.3.5 虎杖提取物不同加量对酶活性的影响
在各试管中加入磷酸缓冲液，还原型谷光甘肽，α-葡萄糖苷酶，然后分别加入0、5、10、15、20、25、30、35、40μl浓度为0.25mg/ml的虎杖提取物溶液，再用磷酸缓冲液补充测酶活体系为1ml,测定对α-葡萄糖苷酶抑制活性。
在各试管中依次加入Tris-HCl缓冲液溶液，葡萄糖溶液，辅酶Ⅱ，G-6-PDH，10μl氯化镁溶液，己糖激酶,然后分别加入0、20、40、60、80、100、200μl桑叶提取物溶液,再用Tris-HCl缓冲液补充体系总体积为0.99ml，在37℃下保温，加ATP溶液为反应开始，在340nm处扫描6min内吸光度的变化。
3.4 抑制剂溶液吸收峰分布情况
将抑制剂粉末配成0.2mg/ml水溶液，用紫外—可见分光光度计扫描200～800nm，观察其吸收峰出峰情况。
3.5 总黄酮含量测定方法
3.5.1 标准曲线的绘制
称取芸香叶苷对照品0.1730g,加甲醇溶解并稀释。吸取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml分别至25ml容量瓶中，各加水至6.0ml,加1.0ml5%亚硝酸钠，放置6min,加10%硝酸铝1ml,放置6min,加氢氧化
钠10ml,放置15min,在500nm处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。芸香叶苷：1.73mg/ml甲醇溶液。
3.5.2 样品含量测定方法
称取样品3.6mg，溶于1.8ml甲醇中，配成2mg/ml溶液：取0.05ml于比色皿中，加水0.55ml，加入5％亚硝酸钠0.1ml，放置6min，滴加10％硝酸铝0.1ml后，放置6min，加入lmo1／L氢氧化钠1ml，加水0.7ml（使总体积为2.5ml），放置15min，500nm处测定吸光度。在标准曲线中查找浓度，计算即可得出样品的黄酮含量。
3.6 虎杖提取物对小鼠的降血糖作用
3.6.1 糖尿病小鼠模型的建立
四氧嘧啶糖尿病小鼠：取65只正常小鼠，禁食16h,腹腔注射四氧嘧啶后，喂养72h，禁食4h后测血糖浓度，选取血糖值在11.0mmol/L以上者。
3.6.2 球后静脉丛取血
手持毛细管从小鼠内眦部插入，到达球后静脉丛，血液即从管内流入收集管。
3.6.3 分离血浆
取血后立即进行离心，10000r/min离心20min，上层为无色透明的血浆。
3.6.4 测定血糖
测定原理：采用葡萄糖氧化酶（GOD）法；过氧化物酶（POD）。
4 实验结果
4.1 抑制剂的性质测定
4.1.1 抑制剂的一般性质
分离得到的抑制剂为橙黄色粉末状固体，可溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿等极性溶剂，难溶或不溶于环己烷等非极性溶剂；遇碱后颜色迅速由黄色转变为深红色,遇酸则颜色变浅；在强酸作用下，该抑制剂会发生聚合，产生红棕色沉淀。由于黄酮类分子中结合有糖分子，羟基数多，能表现出强亲水性。实验结果说明该样品具有较强的极性，含有亲水性基团。
4.2 提取物成分鉴定
从表4可看出，经过成分化学分析，样品中不含有氨基酸，以及还原糖类物质；可以初步推测其主要成分为黄酮类物质，同时含有少量蛋白质和蒽醌类物质。
4.3 抑制剂的吸收峰分布：
抑制剂样品的水溶液在200～800nm波长范围内扫描吸收峰如图1～3所示。
样品的扫描图谱在220～280nm左右有一个强烈的吸收峰。扫描结果提示在获得的抑制剂分子中含有苯环或者其它具有紫外吸收的基团。此外，成份分析试验的结果也表明抑制剂分子中含有大量的酚羟基。
4.4 虎杖提取物的酶学性质
4.4.1 不同浓度乙醇的洗脱物对α-葡萄糖苷酶活性的影响
如图4所示，40%乙醇洗脱物对α-葡萄糖苷酶的抑制率最高，其次是70%乙醇洗脱物，最后是100%乙醇洗脱物。由此可推断，该虎杖黄酮提取物中对α-葡萄糖苷酶有抑制活性的物质极性较弱，初步推测可能是黄酮苷元。
由于40%的乙醇洗脱物对α-葡萄糖苷酶的抑制率最高，所以接下来重点对40%的乙醇洗脱物进行酶学实验。
4.4.2 虎杖提取物对pH的稳定性
抑制剂样品对pH的稳定性实验结果如图5所示。由图可见，该样品在pH4～11的范围内抑制率维持在80%以上，只有当pH>11时抑制活力才有显著的下降。而在pH=3时，由于抑制剂已经有部分聚合，导致抑制活力比较低。
4.4.3 虎杖提取物对温度的稳定性
样品对温度的稳定性试验实验结果如图6所示。由图可见，在20～100℃范围内，抑制剂对α-葡萄糖苷酶的抑制活性不随温度的变化而发生明显的改变，说明该抑制剂有良好的热稳定性。
4.4.5 虎杖提取物与酶作用的速率
该提取物与α-D-葡萄糖苷酶作用非常迅速，如图7所示，该提取物与酶反应2分钟时，作用率达94.54％，4分钟时已基本作用完全。
4.4.5 虎杖提取物的量对酶的活性的影响
40%乙醇洗脱物对α-D-葡萄糖苷酶具抑制作用。如图8所示，当洗脱物样品（0.25mg/ml）量为25μl时,抑制率可达92.4%,表明该抑制剂成分对α-葡萄糖苷酶具有较强的抑制活性。
4.5 样品中黄酮总含量测定
4.5.1 芸香叶苷标准曲线
4.5.2 样品中总黄酮含量
在500nm处测得不同浓度乙醇洗脱物的吸光度如下表所示，将其代入回归方程后经计算可得出抑制剂中总黄酮的含量。
由表5可得，在乙醇梯度洗脱时，随着乙醇浓度的增高，洗脱物中总黄酮的含量逐渐降低。
4.6 动物实验结果
4.6.1 餐后血糖
选取18只小白鼠，先禁食10h，分成3组（给药组，拜糖苹组，生理盐水对照组），先空腹取血，再灌胃，灌胃后10min左右灌淀粉，在0.5h，1h，2h分别取血。灌药量：拜糖苹100mg/kg，淀粉5g/kg，虎杖提取物300mg/kg。
根据图10，说明该虎杖提取物对正常小鼠的餐后血糖的升高有较好的抑制作用，但与拜糖苹相比，该虎杖提取物对餐后血糖的抑制作用稍弱。
4.6.2 四氧嘧啶糖尿病小鼠模型的建立
取正常小鼠65只编号，禁食16h，腹腔注射四氧嘧啶，正常饲养72h后，禁食4h，测定其血浆血糖浓度。经过分析计算，选取其中的24只小鼠（血糖值在11.0mmol/L以上），并分组如下（见表6），各组小鼠之间的平均血糖值之差≤3mmol/L。
4.6.3 虎杖提取物连续给药对四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖含量的影响
四氧嘧啶糖尿病小鼠24只，分为3组，分别灌胃虎杖提取物（200mg/kg），格华止（100mg/kg），生理盐水，连续8天。末次灌胃后禁食4h，断尾取血测定血浆血糖浓度,结果如图11。
根据图11，表明该虎杖提取物连续给药对四氧嘧啶糖尿病小鼠有降血糖作用，其作用大小与降糖药格华止十分接近。
综合正常小鼠的餐后血糖实验和四氧嘧啶糖尿病小鼠的连续给药实验，两个实验的结果都表明，该虎杖提取物有较好的体内降血糖作用。
5 讨论
本文从虎杖中提取了黄酮类物质，并研究虎杖黄酮提取物的物理、化学以及酶学性质，尤其是对α-糖苷酶的抑制作用情况。
在动物实验中，做了正常小鼠的餐后血糖实验和四氧嘧啶糖尿病小鼠的连续给药实验。两个实验的结果都表明，该虎杖提取物有较好的体内降血糖作用。
从中药虎杖中分离得到的活性较高的α-葡萄糖苷酶抑制剂，是一种作用迅速，与酶的亲和力较好的抑制剂，并且它对于温度和pH有较大的适应范围，因此可作为糖苷酶抑制剂应用于降血糖和治疗糖尿病，开发研制新一代安全有效的抗糖尿病中药，为患者带来福音，发挥出中药虎杖所蕴含的巨大的商业价值，更好地弘扬祖国医学。
参考文献：
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［5］ 孙文基.天然药物提取分离与制备［M］.北京:中国医药科技出版社,1994.
柱层析技术提取和分离银杏内酯 篇4
自20世纪80年代开始, 许多国家采用现代分离技术对银杏叶的主要活性成分银杏内酯进行研究, 传统分离方法主要有溶剂萃取分离法和柱色谱分离法[2,3]。传统方法存在着步骤多、过程复杂和生产成本高等问题。本文将溶剂萃取和柱色谱分离技术结合起来, 对提取溶剂和柱色谱条件进行了考察, 成功开发出一种程序简单、成本低且稳定可靠的银杏内酯分离提取工艺。
1 材料、试剂及仪器
材料:浙江康恩贝集团产标准银杏叶提取物EGB (粒度100-200目, 总黄酮醇苷>24%, 总内酯>6%) 。
试剂:乙醇、乙酸乙酯、丙酮、层析用酸性A1203 (分析纯) ;层析用硅胶 (青岛海洋化工厂分厂) ;银杏内酯A对照品 (SIGMA公司, 批号G4028) , 银杏内酯B对照品 (SIGMA公司, 批号G6910) , 银杏内酯C对照品 (SIGMA公司, 批号18309) 。
仪器:Waters2695高效液相色谱仪 (美国Waters公司) , 数据处理软件Waters Millennium 2010 色谱工作站。
2 实验部分
2.1 提取溶剂的选择
取EGB粉末4份, 每份10 g, 分别用乙酸乙酯、乙醇、丙酮和水各300 mL搅拌溶解30 min, 其中对乙酸乙酯、乙醇加热促溶, 其余溶剂在室温下进行。过滤, 蒸干滤液, 照2.4项下HPLC方法分析银杏内酯含量, 结果见表1。
结果表明, 使用水作溶剂时效果较差, 使用另外3种有机溶剂所得到的银杏内酯纯度较高。由于银杏内酯A、B、C 的分子极性依次增强, 而不同极性的有机溶剂对其具有不同的选择溶解性。因此, 分别选用丙酮、乙酸乙酯和乙醇依次溶解EGB, 可分别溶出GA、GB、GC。
2.2 不同梯度洗脱液的选择
取EGB 10 g, 分别用丙酮、乙酸乙酯、乙醇依次溶解。丙酮浓缩液上酸性氧化铝柱, 以丙酮—乙酸乙酯混和液梯度洗脱;乙酸乙酯浓缩液上酸性氧化铝柱, 以乙醇—乙酸乙酯混和液梯度洗脱;乙醇浓缩液上硅胶柱, 以乙酸乙酯—石油醚梯度洗脱。收集洗脱液, 蒸干, 照2.4项下HPLC方法分析洗脱液, 结果分别见表2、表3和表4。
由表2可知, 丙酮浓缩液上酸性氧化铝柱, 以丙酮体积分数为20%的丙酮—乙酸乙酯混和液洗脱较为合适。
由表3可知, 乙酸乙酯浓缩液上酸性氧化铝柱, 以乙醇体积分数为10%的乙醇—乙酸乙酯混和液洗脱较为合适。
由表4可知, 乙醇浓缩液上硅胶柱, 以乙酸乙酯体积分数为60%的乙酸乙酯—石油醚混和液洗脱较为合适。
2.3 银杏内酯提取、分离、纯化方法总结
通过以上分析, 可将银杏内酯的提取、分离、纯化方法总结如下:EGB粉末经丙酮、乙酸乙酯、乙醇依次溶解后, 再经柱层析分离、纯化。具体工艺流程见表5。
2.4 HPLC法定量测定银杏内酯纯度
2.4.1 色谱条件
色谱柱:Hypersilbds C18 (4.6 mm ×200mm, 5 μm) ;流动相:水-甲醇 (70∶30) ;检测器:DAD;检测波长:220nm;流速:0.8 mL/min;柱温:25℃;进样量:20μL。
2.4.2 溶液的制备
①对照品溶液的制备:分别精密称取银杏内酯A、B、C对照品, 用甲醇制成每1mL中各含1mg的混和液, 作为对照品溶液。②供试品溶液的制备:取上述柱层析样品0.15 g, 加水10 mL, 置水浴中温热使溶解, 加2%盐酸溶液2滴, 用乙酸乙酯振摇提取3次 (10 mL、10 mL、10 mL) , 合并提取液, 用5%的醋酸钠溶液20 mL洗涤, 分取醋酸钠溶液, 再用乙酸乙酯10 mL洗涤。合并乙酸乙酯提取液及洗液, 用水洗涤2次, 每次20 mL, 分取水液, 用乙酸乙酯10 mL洗涤, 合并乙酸乙酯液, 回收溶剂至干, 残渣用甲醇溶解并转移至5 mL容量瓶中, 加甲醇至刻度, 摇匀, 过滤, 续取滤液, 即得。
2.4.3 测定法
精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL, 分别注入液相色谱仪, 测定峰面积, 按外标法分别计算银杏内酯A、B、C的含量。
2.4.4 测定结果
5批银杏叶提取物样品测定结果见表6, 对照品及供试品色谱见图1。
(n=5)
注:图中峰自左至右依次为银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C
3 讨论
本文根据3种银杏内酯在不同极性的有机溶剂中具有不同的溶解性和溶解速度, 分别用丙酮、乙酸乙酯和乙醇对标准EGB进行三级溶解, 并为每级溶解液选择了合适的柱层析吸附剂和洗脱液, 成功开发出一种程序简单、成本低且稳定可靠的银杏内酯分离提取工艺。利用柱层析分离技术从银杏提取物中分离纯化银杏内酯是一种廉价高效的方法, 值得推广。
摘要：目的:建立银杏提取物中银杏内酯的分离、纯化方法。方法:银杏内酯A、B、C (简称GA、GB、GC) 分子极性依次增强, 分别用丙酮、乙酸乙酯、乙醇依次溶解银杏提取物, 并选择合适的柱层析吸附剂与洗脱液, 以分离、纯化银杏内酯。采用高效液相色谱 (HPLC) 法检测, 对所得银杏内酯A、B、C进行测定。结果:本方法可将银杏内酯的纯度由6%以下提高至80%以上, 并将其逐一分离。结论:该方法廉价、高效, 可用于银杏内酯的提取、分离及纯化。
关键词：银杏内酯,柱层析,高效液相色谱法
参考文献
[1]KALTAI M, HOSFORD D, GUINNOT P.Platelet activationgfactor (PDF) A review of its effects antagonists and possiblefutrue clinical implications[J].Drugs, 1991, 42 (2) :643.
[2]VAN BEEK T A, LELYVELD G P.Preparative isolation andseparation procedure for Ginkgolides A, B, C and bilobalide[J].Nat Prod, 1997 (60) :735-738.
分离提取 篇5
教师活动
学生活动
设计意图
布置课前预习
填写教学案
思考
总结
通过生物与生活的联系，激发学生学习生物的兴趣，培养自学和质疑能力。
放映实验视频
认真看并注意总结
培养观察和思考能力规范操作
请一组的同学来总结实验步骤
1.提取色素2.制备滤纸条3.画滤液细线4.分离色素5.观察实验结果
培养归纳总结能力
以小组为单位，进行实验操作。在常规操作中设计不同的途径进行探究，要探究的问题很多，我们重点选择三个方面进行探究。(教师提醒学生注意药品使用方法和事项)
学生准备实验：(熟悉材料和用具)新鲜绿叶，干燥定性滤纸，试管，棉塞，试管架，研钵，玻璃漏斗，尼龙布，脱脂棉，毛细吸管，毛笔，盖(载)玻片，无水乙醇，层析液，二氧化硅，碳酸钙(以上仪器和材料均有若干)
活动方式：每组5-6人，2人严格按书中步骤和顺序，其他人在整体步骤不变的情况下可替换试剂或材料或改变顺序，对疑惑进行现场辨析和解决。
学生思维由感性认识上升到理性认识，培养了学生动手能力，自己动手解决实际疑问的能力。体验了探究过程中实验的魅力。进一步体验实践支撑理论的哲学理念。
【探究质疑一】研磨过程的探究
每组学生对第一步提取色素中的研磨步骤做三种处理
1、分别在A、B、C三个研钵中加入2克剪碎的新鲜菠菜叶
2、A中加少量二氧化硅和乙醇
B中加少量二氧化硅、碳酸钙和水
C中加少量二氧化硅、碳酸钙和乙醇
3、经研磨、过滤得到三种不同颜色的溶液(A黄绿色、 B几乎无色、C深绿色)
4、分析实验结果得出结论：碳酸钙可以防止色素被破坏;色素可以溶于酒精但不溶于水。
通过动手知道了加二氧化硅、碳酸钙和乙醇各自的作用。在比较实验中培养了比较、分析、归纳能力，在总结过程中培养了学生的表达能力及反思能力。
【探究质疑二】划线的要求及划线工具的探究
每组学生对第三步画滤液细线都做两种处理待用
1、细线细齐直
2、细线不整齐，沁过一片
同时用什么方法和工具画也可以探究：如用钢笔蘸色素画，用毛细吸管蘸色素画，用载玻片或盖玻片边缘像盖章地画，学生自己探究划线的效果和方法
最后结果：
1、.四条色素带分离清楚
2、四条色素带重叠堆砌辨认不清
学生思考总结
在质疑过程中，培养学生浓厚的探究兴趣。
【探究质疑三】层析液淹没与不淹没滤液细线的探究(提醒学生在应用层析液时加盖)
每组学生对第四步分离色素都做两种处理待用
1、将层析液淹没滤液细线
2、不淹没滤液细线，只是线下接触层析液
观察结果：
1没有色素的分离，色素全部溶解在层析液中。
2、有明显的色素分离现象。
学生归纳总结
提高学生观察、思考、总结能力。
要求每一小组将做的实验结果进行展示和分析
学生展示自己的成果并做分析，进行得失的总结，分析成败的原因。
培养归纳总结分析能力和语言表达能力
【课堂小结】
对每组的总结进行点评
学生回顾、思考、清理。
总结有利于学生对所学知识的整体构建与把握，强化本节课学习重点。
提醒学生洗手
学生去洗手并清洁实验台
培养学生良好卫生习惯并热爱和珍惜生命
【课堂练习】
习题1.在圆滤纸的中央，点上叶绿体色素的提取液进行层析，随着层析液从滤纸中央向四周扩散，形成四个色素带，排在最里面的色素是( )
A.叶黄素B.胡萝卜素C.叶绿素a
D.叶绿素b
习题2.某位同学在做叶绿体色素的提取分离实验时，操作情况如下所述，结果实验失败，请指出其错误所在：
(1)将5克菠菜叶完整放入研钵中，加入无水乙醇、石英砂、CaCO3，迅速研磨。
(2)用毛细管吸取少量滤液，沿铅笔处小心均匀地画出一条滤液细线，并连续迅速重复2-3次
(3)把画好细线的滤纸插入层析液中，并不断摇晃，以求加快色素在滤纸上的扩散。
通过第1、2题的连续设置，将整个提取和分离过程有效揉合在一起，考察学生知识的落实程度。
分离提取 篇6
【关键词】高中生物 实验提取与分离完善的策略
【中图分类号】G633.91【文献标识码】A 【文章编号】2095-3089（2016）05-0182-01
生物是一门多实验学科的课程，它大量的学科知识都来源于实验，对于高中阶段的学生来说，生物课中的实验研究就显得尤为重要了。我们要在生物教材中不断的学习与探索，让学生既能学到学科知识，又能学到实验方法。本文就对绿叶中色素的提取与分离中的实验进行适量的探讨与完善，使实验更简单，学生更容易接受。[1]
一、“绿叶中色素的提取与分离”实验研究的必然性
“绿叶中色素的提取与分离”是高中生物实验课的课程中最为重要的一课。我们在学习光合作用的这一课时，按照其生物课教学目标的指示，想要进行良好的光合作用，就必须掌握并学习好叶绿素的提取与分离技术，因为在进行光合作用普光的时候，叶绿体是光合作用开展的主要场所，它也是光合作用在进行光照的过程中最为重要的组成部分，所以，我们在高中生物课的教学目标指引下，如若要熟练的掌握好“叶绿体中色素的提取与分离”才能更好的完全理解进行光合作用，色素的类别、色彩以及提取的作用，从而进一步掌握自我对光合作用的理解。[2]
二、“绿叶中色素的提取和分离”的实验探讨与完善的策略
（一）材料的完善与装置的改进
1.改善实验材料
将原有的实验材料赤根菜换成为竹叶菜。原因是竹叶菜的色度较为浓绿，菜叶片比较薄，它的含水量较少，黑褐色变化的过程不太明显，其次选择它的原因是竹叶菜的色素量较高，在不停的研制后液体量可变得非常浓稠，而且它是绿色植物中一种常见的植物，所以在选取过程中材料容易找到。[3]
2.改进滤纸条
将原已准备好的滤纸晒程干燥状态，在将滤纸条的长宽度进行调整。然后在滤纸条的末端剪去两个角，再在该角处1.5cm地方，用彩笔做记号。
3.改进层析装置
教材中所使用的层析装置是试管。试管的入口较小，它能有效的减少层析液体的挥发，但由于试管内部空间狭小，导致滤纸条容易贴在试管壁上，从而导致实验容易失败。针对这一点现将层析装置改为简单的层析瓶。这样才能使滤纸条不贴在试管壁上。[4]
（二）实验过程的改进
1.过滤网的改进： 由于单层纱布的透光性好，所以在过滤时选择单身纱布较好，这样既可以是叶绿素更好的进行光合作用，又可以避免叶绿素直接与空气接触，防止叶绿素被挥发和损坏。
2.叶绿素色度的分层：使用已经准备好的滤纸条，用彩笔画出滤液的高度，在标记滤液高度的时候要均匀的摇晃液体，使色度层次清晰可见，等首次划线部分完全干之后再重复前面的方法才能重新画2至3次，让色素的颜色变深，以至于可以保证分层之后的色度清晰可见，效果最好。在把分好层的绿叶素色度，根据上述装置的改进，笔者觉得在使用烧制器皿方面用烧杯的方法最好，我们可以依照烧杯的高度研制备用的滤纸条，让滤纸条的长度高于烧杯1厘米，再将其高出的部分折成直角样子，然后用透明的胶带放在培育的皿杯中。在将分层装置底层层析液体隔开烧杯内壁，在放置过程中尤其小心不要随意摆动装有液体层的烧杯，要阻止滤纸条碰触到烧杯内层壁上的层析液体。且分层的时候，滤液中线也不要沾到分层中的液体，不然会导致色度会溶进分层的液体中，从而导致叶绿素中的色素度的色度量变少，严重的结果将会使得叶绿素分层失败。[5]
以上装置的改进与实验的阐述，教师可以依照指导学生的实际情况后得出的结果，再对课本中的其他实验进行相似的改进与探究。教师也要在教授实验的时候，注重培养学生的观察能力；分析事物的能力、控制事物的变因以及能正确的传达、预测推理能力。将实验中将要出现的情况进行假设实验结果的分析能力。
三、结语
综上所述， 在新课程标准的改革之下，高中生物课的教学目标不再只是要学生掌握生物课本中的知识了，而更多的是，高中阶段的学生在学习课本知识的同时，要掌握并熟练运用生物实验室的器材进行自我的实验操作。因此，教师在上高中的生物实验课时，不仅要善于培养与伐善学生对生物实验课潜在的能力，也要开展好并实施好传统生物的实验课。对于实验操作的经验上来说，要把实验性与探究性作为实验课研究的主要目的，要将自己多年的实验经验，以最简便的方式和最通俗易懂的语言传递给学生。让学生在进行实验课操作的时候能更好的让他们自己发现探究意识的趣味性和动手能力的重要性，从而提升学生自我解决问题的能力和在试验操作中既能与知识完美的结合。[1]
参考文献：
[1]张姝.谈科学过程技能在高中生物探究性实验教学中的培养——以“绿叶中色素的提取和分离”为例[J].山东教育学院学报，2010，02：83-85.
[2]赵艳玲. 新课程下高中生物探究实验存在的问题及实验教学的策略研究[D].东北师范大学，2008.
[3]张梦瑶. 浅析高中生物“绿叶中色素的提取和分离”的实验完善[J]. 亚太教育，2015，34：38.
[4]苏晶晶，韩琳，陈德来. “绿叶中色素的提取和分离”实 验材料的选择[J].中学生物教学，2015，（ 08） ： 63.
天然有机物的提取与分离 篇7
1 超临界流体萃取技术
超临界流体萃取是一种新型的提取分离技术,它利用流体在临界点附近某区域内与待分离混合物中的溶质具有异常相平衡行为和传递性能,这种流体可以是单一的,也可以是复合的。超临界流体是一种介于液体与气体之间的流体,其密度接近普通液体,其粘度接近普通气体,具有低粘度、高扩散性、无污染和高选择性等良好溶剂的特性,且可以利用温度与压力的变化来调整流体的性质。在超临界萃取技术中,通常用的萃取剂为CO2,因为它是一种无毒、不燃和化学惰性的物质,价格便宜,纯度高,容易获得,且对环境无污染,其密度对温度和压力变化十分敏感,且与溶解能力在一定压力范围成正比例,可以通过控制温度和压力改变物质溶解度。因此,CO2特别适合天然产物有效成分的提取。
超临界流体萃取特点:(1)萃取和分离合二为一;(2)萃取效率高,过程易控制;(3)萃取温度低,可较完好保存中药有效成分不被破坏,不发生衍生化,特别适宜于对热敏感、易氧化分解成分的提取;(4)萃取流体可循环使用。其缺点是:样品量受限,回收率受样品中基体的影响。要萃取极性物质需加入极性溶剂以继续在高压下操作,设备投资较高等。
超临界流体萃取技术在中药提取分离中的应用前景广阔,特别对于一些资源少、疗效好、剂量小、附加值高的产品极为适用。近年来我国利用SEF技术对中草药的研究和开发也取得了很大的进步[2],研究开发出了成熟的CO2-SEF工艺技术的中草药有银杏叶、金银花、紫草、生姜、大蒜等近30种。此技术在其他方面也有广泛的应用,例如在食品方面的应用。目前已经可以用FC-CO2从葵花籽、红花籽、花生、小麦胚芽、可可豆中提取油脂,这种方法比传统的压榨法回收率高,而且不存在溶剂分离问题。
2 超声波提取技术
天然植物有效成分大多数为细胞内物质,在提取时往往需要将植物细胞破碎,现有的机械破碎法难以将细胞有效破碎。化学破碎法又容易造成被提取物的结构性质等变化而失去活性,因而难以取得理想的效果。超声波提取是集物理学、化学和工程学于一体的一门综合技术[3]。将超声波应用于提取植物的有效成分,操作简便快捷,无需加热,提取率高,速度快,效果好,且结构未被破坏,显出明显的优势。
药用植物的化学成分较为复杂,常规法提取效果常不理想,近年来用超声波提取收到了良好的效果,尤其是生物碱、苷类、挥发油等成分的提取。用超声波从曼陀罗、萝芙木、吐根、天麻、马钱、益母草等植物中提取生物碱均可得到同样的效果,用超声波提取苷类,取样量小,所用溶剂少,检验周期短。在绞股蓝、党参、人参根中应用超声波提取皂苷,与传统方法相比,也具有省时、节能、杂质少、提出率高等优点。于淑娟等[4]对超声波协同纤维素酶和菠萝蛋白酶法提取灵芝多糖进行了研究,超声波高频振荡及其产生的“空化效应”可破坏细胞壁的维持力,提高酶解纤维素的效率,尽快地释放出细胞多糖物质。
3 微波提取技术
微波辅助萃取是利用微波能来提高萃取率的一种新技术,在提取过程中,微波辐射导致植物细胞内极性物质吸收微波能,产生热量,由于细胞内温度迅速上升,水汽化产生的压力会将细胞膜冲破,形成微小孔洞;若进一步加热,则导致细胞内部和细胞壁水分减少,细胞收缩,表面出现裂纹。空洞和裂纹的存在使胞外溶剂容易进入细胞内,溶解并释放出胞内产物。在微波的作用下,某些待测组分选择性地加热,使之与基体分离,进入微波吸收能力较差的萃取剂中,这是由于物质结构不同,吸收微波能的能力各异。
近年来,国内外将微波技术应用于天然药物活性成分的浸提过程,有效提高了回收率,取得了可喜的进展,且迅速朝着工业化方向发展。目前,微波技术用于提取生物活性成分的报道不断出现,已涉及到几大类天然有机化合物如挥发油、苷类、多糖、生物碱及有机酸等。韩伟伟等[5]用微波辅助提取法提取青蒿素,与传统提取法相比,提取率明显提高。郝守祝等用此法提取大黄游离蒽醌并与传统法相比较,此法的提取效率明显高于蒸煮法,且操作简单。MAE的特点为投资少、设备简单、适用范围广,选择性高,操作时间短,溶剂好量少,与传统煎煮法相比,克服了药材细粉易凝聚、易焦化的弊端。缺点是:(1)使用极性溶剂;(2)提取后要过滤,这就不利于与气相色谱等仪器联机而实现自动化。
4 酶法提取技术
酶提取技术是近几年来用于中药工业的一项生物工程技术。中草药成分复杂,既有有效成分,也有非需成分。传统的提取方法提取温度高,提取率低,成本高且不安全。而用适当的酶,可通过酶反应较温和地将植物组织分解,加速有效成分的释放和提取。酶技术在食品工业、饲料工业、精细化工等行业应用越来越多,在天然产物提取中的应用近年来也有所发展。如单一材料补骨脂、香菇、银杏叶、决明子等的有效成分提取和除去杂质。
酶技术用于药材提取,反应温和,提取效果较好,收率好,节约能耗,所以应用前景广阔。高大维等人[6]研究了冷冻预处理协同酶浸渍提取灵芝、木耳、螺旋藻多糖,取得了满意的结果。上海中药一厂首先应用酶法成功地制备了生脉饮口服液。在动物药材的提取中,酶法应用得更广泛。
5 仿生提取技术
仿生提取法综合运用医学仿生与化学仿生的原理,同时又将整体药物研究与分子药物研究法相结合,是将生物技术手段应用到中药研究中的一种尝试。仿生提取法主要是针对口服给药的提取。将原料药经模拟人体胃肠道环境,根据人体消化道的生理特点,消化管和血管之间的生物膜是类脂质膜,允许脂溶性物质通过,分子性药物更容易吸收。仿生提取法是中药口服药制备中的一项重大革新,具有较高的学术价值和推广应用前景。
6 固相微萃取技术
固相微萃取[7~10]是近年来出现的一种集萃取、浓缩、解吸于一体的样品前处理新方法。它主要与气相色谱和高效液相色谱联用,能快速有效地分析样品中的痕量有机物。SPME主要针对有机物进行分析,根据有机物与溶剂之间相似相溶的原则,利用石英纤维表面的色谱固定相对分析组分的吸附作用,将组分从试样基质中萃取出来。1990年Pawliszyn等首次发表了关于SPME的论文并开始了深入研究.随着技术的发展,SPME已成功地运用于气体、液体甚至固体样品中有机化合物的前处理及痕量分析,在环境监测、食品检验、医药卫生、生物化学、天然产物等领域应用广泛。此技术在对中草药挥发性成分的分析中开始应用,如中药石菖蒲、新鲜紫苏、肉桂、冷杉叶以及蛇麻草中各种挥发性成分的鉴定等。
7 大孔树脂吸附色谱技术
大孔树脂吸附法是利用大孔吸附树脂对欲分离物质的吸附作用和筛选作用达到分离的目的。大孔树脂柱色谱是以大孔吸附树脂为固定相,使天然物提取液通过装有大孔树脂的柱子,其中的有效成分有选择性地吸附在树脂上,而杂质成分不被吸附,在经适当的溶剂洗脱,收集含有效成分的流出液,合并浓缩,回收溶剂,便可除掉天然提取液中的杂质成分,达到有效成分与提取液中糖类、色素等杂质分离的目的。这是一种纯化精制天然有机化合物的新工艺,具有快速、高效、方便、灵敏、重现性好等优点。
由于大孔吸附树脂在水溶液中吸附力较强,具有良好的选择性,而在有机溶剂中吸附力极小,因此大孔树脂主要用于分离提纯中药皂苷类、生物碱、黄酮类、多肽类等水溶性成分或极性化合物。皂苷是广泛存在于自然界的一类化合物,也是许多中草药发挥疗效的主要活性成分,已应用于临床。皂苷本身的特性和大孔吸附树脂分离纯化的优势决定了大孔吸附树脂技术能够在皂苷的分离纯化中得以推广和发展。蔡雄等[11]用D101大孔树脂富集纯化人参总皂苷,洗脱率达90%以上。制川乌、制草乌是中药处方中常用的对药,其主要成分是亲水性乌头原碱类的氨基醇类生物碱。杨桦等[12]用正交设计法优选大孔吸附树脂提取分离制川乌、制草乌饮片中乌头类总碱的工艺条件,可分离出样品液中85%以上的乌头类生物碱。在黄酮类化合物的分离中,麻秀平等[13]比较了10种大孔吸附树脂对银杏叶黄酮的吸附性能及动力学过程,筛选实验结果表明,弱极性树脂AB-8是一种对银杏叶黄酮吸附性能优良的吸附剂,吸附容量大,吸附、解吸容易。在用此法分离其他中药成分方面,萧伟祥等[14]报道了用大孔吸附树脂柱色谱法从茶中分离纯化茶多酚,结果PA树脂对茶多酚,XDA大孔树脂对咖啡碱,具有较高的吸附量和选择性,用85%乙醇洗脱,可分别用于茶多酚和咖啡碱的吸附分离。
8 高速逆流色谱技术
高速逆流色谱技术是一种不用任何固态载体的液相色谱技术,其原理是基于组分在旋转螺旋管内的相对移动而互不混溶的两相溶剂间分布不同而获得分离,其分离效率和速度可以与HPLL相媲美。HPLL分离效率高,产品纯度高;不存在载体对样品的吸附和污染;制备量大,溶剂消耗少;操作简单,能从极复杂的混合物中分离出特定的组分。在中试规模和产业化中应用时,还需对逆流色谱的分离机理进行更深入的探讨,并需要解决现有仪器设备在放大过程中的一些关键技术问题。高速逆流色谱技术应用于天然产物的分离可实现:(1)制备高纯度的药用成分对照品和必须控制的杂质成分;(2)配合活性跟踪与入药部位的设计,主机分离制备活性部位或活性成分;(3)中药材和中药方剂指纹的建立,提供更丰富的信息和数据;(4)进行中试批量生产和工业生产。如中科院工程研究所探索了利用此技术制订中药指纹图谱的方法,以丹参原药材为模式植物,初步建立了丹参的高速逆流色谱指纹图谱。该技术有望成为中药有效成分质量标准研究的一种新方法及中药生产的一种新型分离技术。此外,高速逆流色谱技术还可与其它新型分离技术相结合分离中药有效成分。巢志茂等[15]将高速逆流色谱与双水相萃取技术相结合,以双水相系统作为高速逆流色谱技术的固定相和流动相,对牛漆多糖成分进行分离纯化,成功地分离出多糖部分和蛋白多糖部分。
辣椒素提取及初步分离纯化研究 篇8
辣椒素可促进肾上腺分泌儿茶酚胺, 并有抑制细菌的作用, 具有镇痛止痒、抗炎消肿[3]、调节食欲、促进脂肪代谢[4]、催泪催嚏、防治风湿与抗肿瘤[5]等作用, 在医药工业中已得到广泛应用。因辣椒素具有纯天然、低毒害、无污染、有多种生物功能等特点, 因而在食品工业和饲料工业中作为添加剂广泛使用。高纯度的辣椒素晶体在军事上是制造催泪弹、催泪枪和防卫武器的主要原料, 具有重要的研究价值[9]。因此研究从辣椒中有效提取分离辣椒素具有重要的意义。
1 材料与仪器
1.1 实验材料
干红辣椒 (购自山西省忻州市高城乡) , 辣椒碱标准品 (购自贵州五倍子公司, 其纯度≥98.5%) 、95%乙醇为药用级别、乙醇 (分析纯, 江苏强盛化工有限公司出品) 、木质颗粒活性炭、盐酸 (分析纯, 江苏强盛化工有限公司出品) 、乙醚 (分析纯, 天津市富宇来精细化工有限公司) 、甲醇 (色谱纯, 天津市四友精细化工有限公司) 、恒温水浴锅、TDL80-2B型台式离心机。
1.2 实验仪器
万能粉碎机 (30B型, 常州市苏力干燥设备有限公司) ;萃取浓缩设备 (型号YC-EC-30、YC-VC-10, 元成机械股份有限公司) ;UV-1800紫外分光光度计 (北京瑞利仪器有限公司) ;岛津UV-2350可见-紫外分光光度仪;日本岛津高效液相色谱仪 (LC-10ATVP溶剂输入泵, SPD-10AVP紫外检测器) ;HW-2000色谱工作站 (南京千谱软件有限公司) 。
2 方法与结果
2.1 辣椒素提取工艺
辣椒素的提取工艺流程见图2。
2.2 辣椒素分离纯化工艺
(1) 辣椒碱标准曲线的制备。取120μg/mL的辣椒碱乙醇溶液, 将此溶液以无水乙醇稀释成下列浓度:10、17、34、50、60μg/mg。在280nm波长下测定各溶液的吸光值 (A) , 处理得回归方程A=0.0093C+0.0123, R2=0.9992。见图3。
(2) 活性炭分离纯化工艺结果。见表1。
辣椒素粗提物经活性炭纯化后, 其溶液颜色由深红变成浅红色, 辣椒碱转移率为60.1%。
(3) pH法分离纯化工艺结果。根据辣椒素分子中含有酚羟基, 呈弱酸性, 可与强碱发生反应的原理, 进行纯化。比较加入碱液后, 辣椒素中辣椒碱在沉淀层及溶液层中含量的分布, 从而计算出辣椒碱的转移率, 验证该方法对辣椒碱的影响, 其紫外吸收值如表2。
辣椒素粗提物经pH法纯化后, 沉淀层颜色仍为深红色, 其中辣椒碱的转移率为55.7%。
(4) 萃取-结晶法结果。利用辣椒素物质均含有酚羟基的特点, 采用乙醚萃取、氢氧化钠溶液反萃辣椒素, 再结晶的方法分离制备辣椒素化合物, 比较萃取结晶前后, 辣椒素中辣椒碱的转移情况, 其紫外吸收值如表3。
辣椒素粗提物经萃取结晶后, 结晶物呈淡红色, 其中辣椒碱的转移率为87.1%。
2.3 HPLC法测定辣椒碱转移率
前述采用UV对不同纯化辣椒碱的工艺进行了探索, 在确定了乙醚-酸碱萃取分离辣椒素的工艺后, 为了准确检测在萃取过程辣椒碱的转移率, 选择HPLC[11]测定辣椒粗提物及萃取结晶后辣椒碱的含量。
(1) 色谱条件。仪器:岛津液相色谱仪LC-20A;色谱柱为ODS-C18柱 (4.6mm×150mm, 5mm) ;检测器:SPD-10A紫外检测器;柱温:40℃;流动相:甲醇-水 (60∶40) ;流速:1.0mL/min;检测波长:280nm。
(2) 辣椒碱对照品溶液的配制及HPLC图谱。见图4。
(3) 辣椒素结晶物溶液的配制及HPLC图谱。取0.8g萃取结晶物加乙醇至10mL, 取1mL加无水乙醇至10mL。取1mL加无水乙醇至30mL, 其高效液相色谱如图5。
精密量取供试液, 进样20μL, 用外标法 (峰面积) 计算辣椒碱含量, 辣椒提取物萃取结晶过程中辣椒碱的转移率为81.1%。
3 讨论
本次实验主要解决的难点在于从辣椒粗提物中分离辣椒素, 共采取了3种不同方法, 结果分析如下:
活性炭分离纯化辣椒素方案:结果表明辣椒碱洗脱不完全, 辣椒碱转移率低。
pH法分离纯化辣椒素方案:该方法所得到的结晶物为深红色, 达不到分离辣椒素与辣椒色素的目的。其可能原因是辣椒色素有一部分可溶解于NaOH溶液中, 造成结晶物颜色呈深红色。
萃取-结晶法:该方案所得到的溶液呈浅红色, 其紫外分光光度图谱显示, 在400nm后基本无吸收, 说明辣椒素与辣椒色素得到初步分离, 辣椒碱的转移率为81.1%。该方案工艺成本低, 辣椒碱转移率高, 操作简单, 可作为分离纯化辣椒素的最终方案。
4 结语
从本实验结果来看, 相比活性炭纯化法及pH法, 乙醚萃取—结晶法分离纯化辣椒素的效果较好, 辣椒碱转移率高, 工艺成本低, 操作简单, 辣椒素物质得到初步分离, 有利于辣椒素类物质的精制, 可作为工业化分离纯化辣椒素的方案。
摘要：目的:从辣椒中提取并分离纯化辣椒素。方法:采用70%乙醇提取辣椒素;以辣椒碱的含量为指标, 运用紫外-可见分光光度法及高效液相色谱法比较活性炭法、pH法、乙醚萃取结晶法三种方法分离纯化辣椒素的效果。结果:采用乙醚萃取辣椒粗提物, 乙醚相用氢氧化钠水溶液萃取, 所得氢氧化钠萃取液调pH值后结晶, 得到辣椒素粗品, 辣椒碱总收率为81.1%。结论:乙醚萃取结晶工艺得到的辣椒素含量高, 回收率高, 工艺成本低, 可作为辣椒素的生产方案。
关键词：辣椒,辣椒素,活性炭法,pH法,乙醚萃取结晶法
参考文献
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分离提取 篇9
1 芦荟主要化学成分概述
芦荟是一种百合科多年生常绿肉质草本植物, 叶成座状或生于茎顶, 簇生, 常披针形或叶宽短, 边缘有尖齿状刺。芦荟作为天然草本植物易于栽种, 花叶兼备, 颇受大众喜爱。其花序多为伞形、圆锥形和穗状, 色红、黄或带有赤色斑点, 花瓣六片, 雌蕊六枚, 花朵常被基部连合成筒状[2]。芦荟在世界各地均有分布, 印度及马来西亚、非洲大陆和热带地区、我国元江地区均有野生芦荟分布。
芦荟主要成分为大黄素甙、芦荟甙、异芦荟大黄素甙等, 具有泻下通便、消疳杀虫、清肝泄热的作用, 可用于治疗小儿惊痫、热结便秘、疳热虫积等病症。芦荟在民间已经存在3000多年的历史, 随着科学技术的不断进步, 芦荟的有效成分、药用价值及生物活性被不断的发现和应用, 芦荟产品的研究和开发已经进入崭新的时代。目前世界范围内芦荟品种多达300余种, 主要药用品种为库拉索芦荟、好望角芦荟和斑纹芦荟[4]。芦荟根、叶、花均可入药, 具有多种治疗作用, 受到医学领域的广泛重视。现阶段从芦荟中已检出18种微量元素、21种有机酸、11种游离氨基酸、维生素、糖类、酚类、甙类等70多种成分。据研究表明, 芦荟的主要化学成分包括蒽醌类化合物、糖类、氨基酸、脂类及有机酸、矿物质、酶及其他成分[5]。
芦荟主要的有机化学成分是羟基蒽醌类化合物, 如芦荟甙、芦荟霉素、芦荟泻素、芦荟熊果甙等。其中芦荟甙和芦荟泻素具有健胃、通便的药用价值, 芦荟熊果甙具有抗溃疡作用, 芦荟霉素具有抗菌、抗病毒、抗癌的作用。芦荟中所含的糖类是指甘露糖、葡萄糖及由甘露糖和葡萄糖组成的多糖。其中芦荟叶肉粘液中所含有的主要成分为甘露聚糖, 属于线性多糖聚合物。部分品种的叶肉中还含有少量的鼠李糖和阿拉伯糖。芦荟中的多糖对艾滋病和癌症具有良好的防治作用, 甘露聚糖则具有一定的抗肿瘤作用。
芦荟中新鲜汁液中含有丰富的氨基酸, 如谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸等, 共8中人体必需且不能自行合成的氨基酸。芦荟中的脂类成分主要包括烷烃、脂肪酸、甾醇类物质等, 已知有机酸为乳酸、苹果酸、琥珀酸等。芦荟中有机酸的含量会随季节变化而变化, 夏季有机酸含量有普遍怎增高趋势。芦荟中含有的矿物质多达几十种, 不同产地的芦荟中的矿物质含量和种类也有所不同。现阶段, 从芦荟汁液中检出的酶主要有脂肪酶、淀粉酶、氧化酶、纤维素酶等。此外, 日本添田百枝博士在日本木立芦荟中发现除酚类化合物外, 还有三种耐酸、耐热、耐碱的化学成分, 即阿劳米嗪, 阿劳埃乌罗辛和阿劳埃汀这三种物质均具有一定的药用价值。
2 芦荟有效成分的分离、提取、提纯
对于芦荟有效成分的研究, 首先应对其中含有的有效成分进行提取, 并将有效成分从复杂的提取物质中分离和提纯出来, 对其有效成分的化学结构、药理作用进行研究, 阐明构效关系[6]。芦荟有效成分的提取是从植物原料中分离有效成分的重要操作单元, 提取方法和提取工艺的不同直接关系芦荟产品中有效成分的含量。芦荟有效成分的常用提取方法为水提法、有机溶剂提取、水蒸气蒸馏、化学处理、酸性或碱性有机溶液提取、酶解或抑制酶解、升华法等。
芦荟有效成分提取通常采用的是水提法和有机溶剂提取法, 其中水提法根据所应用提取工艺的不同又可分为浸提、煎提、渗漉。有机溶剂提取法中溶液的选择对芦荟有效成分的提取十分重要, 适当的溶液能够保证所提取的有效成分较多、无效杂质较少。最常用的有机溶液是乙醇和水, 水极性大, 对大多数的化学成分具有较强的溶解能力, 因此水提取物质所含成分较多, 杂志含量较高。乙醇在芦荟有效成分提取中的应用仅次于水, 极性适宜, 可与水进行任意比例的混合改变溶液极性, 且沸点较低, 可反复回收和再利用[7]。
芦荟的化学成分大致包括亲水性成分、亲脂性成分和中等极性成分, 适合应用乙醇进行有效成分提取, 且有效避免了提取液的霉变。随着科学技术的发展许多新型提取技术也逐渐应用于芦荟有效成分的提取中, 如超声提取法、半仿生提取法、超临界瘤体萃取法。其中超声提取法提取芦荟有效成分的的提取率较高, 在超声提取的过程可产生强烈的振动和空化效应、高速度、搅拌作用等, 使植物药材细胞受到破坏, 加速溶媒向药材细胞的渗透, 使芦荟有效成分的提出率增加。超声提取法速度较快, 有利于提高芦荟有效成分提出量。马稳等采用超声辅助法提取芦荟中的芦荟甙, 筛选出最佳提取工艺为乙醇浓度60%, 料液比1∶60 (g/m L) , 超声时间为40min, 所得芦荟甙率为1.792%。此外马稳等还报了芦荟中芦荟大黄素的提取工艺, 在乙醇浓度70%, 料液比1∶80, 辐射时间25min的提取条件下, 芦荟大黄素的所得率为1.25%。而采用超临界CO2流体萃取芦荟大黄素, 在萃取压力为25MPa, 萃取温度为30℃, 料液比为1∶2∶5, 静萃取时间为60min, 动萃取时间为30min的条件下萃取率高达3.83mg/100g。
芦荟的一些药理生理活性是基于多种成分的协同作用, 起到主要作用的只是其中某种或某类有效成分, 其他成分只是起到增效作用。因此要研究芦荟中具有药理活性的有效成分, 需要对芦荟的化学成分进行分离和提纯[8]。高分子大孔吸附树脂适应性较强, 吸附选择性好、应用范围广, 可有效吸附芦荟中不同化学性质的化合物, 目前已经成为芦荟有效成分分离和提纯的主要方式。此外, 聚酰胺柱层析技术具有吸附速度快、选择性好、分离纯度高等特点, 在芦荟的分离和提纯中已经得到广泛应用。实验研究证明以乙醇为流动相, 采用聚酰胺柱层析法结合高效液相色谱法提纯芦荟中的蒽醌苷元, 所得芦荟大黄素的纯度高达92.56%。近年来逆流色谱技术在芦荟分离和提纯的研究中也得到广泛应用, 其优点是分离和提纯的操作条件较温和, 适用于制备性分离。采用逆流色谱技术对库拉索芦荟中芦荟苷进行制备性分离, 氯仿、正丁醇、甲醇、水, 溶剂比例为4∶0.28∶3∶2, (V V) , 流速2m L/min, 转速870r/min, 利用TLC、HPLC对分离出的组分进行分析, 其中芦荟苷A、B的纯度分别为96%和93%。
3 总结
大量研究表明, 芦荟在抑菌、抗肿瘤、创伤愈合、养胃护肝、保护皮肤、糖尿病治疗等方面具有药理作用。芦荟中除芦荟甙、芦荟大黄素、异芦荟苷、蛋白质类、糖类等有效成分, 还包括二氢香豆素等物质, 需要进一步研究开发。为保证芦荟产业的可持续发展, 进一步研究芦荟产品的深加工技术, 并将产品原料进行综合有效利用, 开发附加值较高芦荟产品, 对扩大产业增值和增效空间具有重要意义。
摘要：芦荟属独尾草科多年生草本植物, 原产于地中海和非洲, 属百合科芦荟属, 为常绿植物。传统上习惯将芦荟作为泻药食用, 近年来在化妆品领域得到较为广泛的应用。随着研究的不断深入, 芦荟所具备的抗氧化、抗肿瘤、抑菌、消炎、免疫调节等作用也被相继报道。由于芦荟具有重要的药用价值和商业价值, 已成为天然产物研究开发领域的重点课题, 其中所包含的多种有效成分如多糖、二氢香豆素、蒽醌等均被分离出来并进行生物活性评价。基于此, 本文根据相关资料对芦荟有效成分的分离、提取、提纯进行综述。
关键词：芦荟,有效成分,分离和提纯
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分离提取 篇10
中药所含的成分十分复杂, 既有有效成分, 又有无效成分和有毒成分。中药分离的目的是得到“有效成分”。为了提高中药的疗效, 减低毒副作用, 提高中药制剂的内在质量, 选用合理的方法提取分离中药的有效成分是非常重要的。
1 传统分离方法
中药制药业中最关键的工序是提取和分离有效成分, 传统的提取分离方法主要是采用有机溶剂萃取, 主要有煎煮法、回流法、浸渍、渗漉法、水提醇沉法、醇提水沉法、酸碱法、沉降、过滤、离心、盐析法、离子交换法和结晶法等。而传统的提取分离方法普遍存在着有效成分提取率低、杂质清除率低、能耗高、生产周期长等缺点, 直接制约了中药制药产业的发展[1]。
2 现代分离方法
近年来, 在中药提取分离方面出现了许多新工艺, 这些新工艺的应用, 使得中草药提取既符合传统的中医理论, 又能达到降低成本, 提高有效成分的收率和纯度的目的[2], 推动了中药的现代化进程, 为我国的中药走向国际市场奠定了基础。现将提取分离新技术介绍如下。
2.1 中药有效成分提取新技术的进展
2.1.1 微波辅助萃取技术 (microwave assisted extraction, MAE)
MAE是微波和传统的溶剂萃取法相结合后形成的一种新的萃取方法。微波辅助萃取技术的应用原理是在微波场中吸收微波能力的差异使得基体物质的某些区域或萃取体系中的某些组分被选择性加热, 从而使得被萃取物质从基体和体系中分离, 进入到介电常数较小、微波吸收能力相对差的萃取剂中。目前, 微波辅助萃取技术受到药学工作者的极大关注。姜宁等采用正交实验, 研究微波法提取五倍子中的单宁酸, 结果表明微波辅助提取法显著优于传统的水提取方法, 提取率是水提法的1.5倍[3]。微波辅助萃取喜树碱[4]与索氏提取、超声提取和搅拌提取相比, 提取率最高、耗时最少。微波辅助萃取决明子中的大黄素、川芎中的阿魏酸等也取得同样显著效果。
2.1.2 酶工程技术 (cellulase engineering technique)
近年来, 酶工程技术应用于提取分离生物碱、黄酮、皂苷、香豆素、多糖等成份。坚固的植物细胞壁是提取有效成分的主要屏障。如选用恰当的酶, 通过酶反应使细胞壁的组成成分和黏液质等杂质成分水解或降解而除去, 则可加速有效成分的释放提取。这是一项很有前途的新技术。
施英英等用酶法从葛粉中提取活性成分异黄酮, 采用木聚糖酶和纤维素酶协同处理后, 总异黄酮得率可达113.8%, 为常规醇提法的1.64倍。张卫红等采用复合酶解法在低温下提取茶叶中的活性物质茶多酚, 提取率高达98%以上, 茶多酚中的活性成分儿茶素相对含量较传统沸水提取法高出9%~10%。
2.2 中药有效成分分离新技术的进展
分离纯化已成为天然产物研究的“瓶颈”, 使得开发新的天然产物分离技术成为大势所趋。近年来, 科学技术的不断发展, 使得天然产物有效成分的分离纯化技术取得了很大的进展。
2.2.1 色谱 (Chromatography) 分离技术
高速逆流色谱 (High speed countercurrent chromatography, HSCCC) , 是用离心力固定液态固定相的逆流色谱, 改变了以往逆流色谱耗时这一缺点。固定相不需要载体, 因而消除了气液色谱中由于使用载体而带来的吸附现象, 被广泛地应用于植物化学成分的分离制备研究, 主用于黄酮、苯丙素、生物碱、萜类、多酚及甾体等化合物的分离。
除高速逆流色谱外, 还包括超高效液相色谱;超临界流体色谱;亲和色谱;分子烙印亲和色谱;生物色谱法;萃取技术与色谱技术联机耦合等。
2.2.2 膜分离技术 (Membrane Separation Technique, MST)
膜分离技术是通过特定膜的渗透作用, 借助于外界能量或化学位差的推动, 实现对两组分或多组分的气体或液体进行分离、分级、提纯和富集的技术, 是现代分离技术领域最先进的技术之一。膜技术种类繁多, 使用膜技术可以在原生态体系环境下实现物质分离, 可高效浓缩富集产物, 有效除去杂质, 其优点是在常温下操作, 无相变、能耗低。
目前国内的超滤膜和反渗透膜技术已经比较成熟, 这为中药生产的提取、分离、浓缩、纯化一体化工程技术的解决提供了保证。Vincze等采用膜分离技术收集中草药沙棘中的沙棘汁, 并进一步生产产品 (如速溶茶) 。Cai应用选择性膜从甜菜碱样中提取分离甜菜碱, 除盐率达到99.4%, 收到卓越的成效。
2.2.3 分子印迹技术 (Molecularly imprinted technique, MIT)
分子印迹技术是利用具有高度分子识别功能的聚合物材料为固定相, 对目标分子进行分离、筛选、纯化的一种高选择性仿生技术, 其技术核心是制备分子印迹聚合物 (molecularly imprintedpolymers, MIPs) 。由于中药活性成分含量低、结构复杂且类型多样、分离困难。高效液相色谱法、硅胶柱色谱法等常规的分离方法溶剂消耗量大、效率低, 且容易造成微量的有效成分丢失。MIT与上述色谱分离技术相比, 具有分子识别性强、固定相制备简便快速、操作简单、性质比较稳定、溶剂消耗量小、模板和MIPs都可以回收再利用等优点, 在中药有效成分的提取分离中应用较为广泛。
目前分子印迹技术多用于黄酮类、多元酚类、生物碱类、甾体类和香豆素类的分离纯化。朱全红等以长春碱为模板分子, 用本体聚合的方法制备长春碱MIP, 成功用于分离、富集长春花提取物中的长春碱。何锡文等以中药黄栌中的黄酮类成分非瑟酮为模板分子, 采用本体聚合法在丙酮中制备了非瑟酮MIP, 非瑟酮与其结构相似物槲皮素在该聚合物填充的固相萃取柱上得到了很好的分离。
但是作为一种新型的分离手段, 分子印迹技术本身还存在许多有待解决的问题。但由于其具备很高的选择性以及优良的理化特性, 其必然会随着技术本身的不断发展和应用的逐渐增多, 而在中药活性成分分离纯化领域发挥越来越大的作用。
3 中药提取分离技术的发展方向
随着科学技术的高速发展, 越来越多的新技术、新方法将会运用到中药有效成分的提取分离研究上, 将会大大加快先导化合物的发现, 推动创新中药发展。可以预见, 新技术在中药有效成分提取分离领域中的广泛运用, 必将极大地推动中药产业的发展和中药现代化进程。
中药成分复杂, 不同的提取方法对不同药物有效成分的提取率不同, 其用法用量、提取工艺条件对成品质量的影响也很大, 所以应根据中药材与期望的目标产物特性, 选择不同方法进行提取, 或多种提取方法的联合运用, 最大可能保留活性成分, 提高有效组分的提取率。随着现代中药提取技术的应用, 中药生产必将向过程可控产物明确、质量严格的方向发展, 从根本上提高中药产品的科技含量, 以实现我国中药产业跨越式发展。
摘要：综述了近年来中药有效成分提取分离方法的原理和应用进展, 包括微波萃取、酶法提取、分子印迹技术等。分子印迹是一项新技术, 该技术已经应用于黄酮、多元酚、生物碱、甾体、香豆素等的分离纯化。由于分子印迹技术具有选择性强、操作简单、溶剂消耗量小等特点, 在中药现代研究中展现了良好的应用前景。此外对其尚存在的问题进行了简单论述。
关键词：中药,有效成分,提取,分子印迹技术
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分离提取 篇11
为此, 本文综述目前国内外制备和纯化茶叶中茶多酚、咖啡碱、茶多糖等物质的主要方法, 并对各种方法的特点进行评价, 希对茶叶有效成分的提取分离研究有利。
1 茶多酚
1.1 生理作用
茶多酚又称茶鞣或茶单宁, 是形成茶叶色香味的主要成分之一, 也是茶叶中有保健功能的主要成分之一。茶多酚在茶叶中的含量一般在20%~35%。茶多酚主要包括黄烷醇类, 羟基-4-黄烷醇类、花色苷类、黄酮类和酚酸类, 其中以黄烷醇类化合物 (主要是儿茶素类) 最为重要, 其含量约占多酚类总量的80%左右。
20世纪60年代以来, 国内外学者对茶多酚的提取分离技术及其生物和生理活性等方面做了广泛深入的研究。据研究报道:茶多酚具有清除自由基、抗氧化、抗衰老、抗癌变、防辐射、降血脂和胆固醇、抗动脉粥样硬化以及抑菌等作用[2,3]。胡秀芳[4]等研究表明:茶多酚其高效的抗氧化清除自由基能力, 对皮肤的保护可以防止皮质胶原蛋白的氧化, 与抗氧化物歧化酶 (SOD) 功效相近, 且茶多酚分子量小, 更易被人体皮肤吸收, 同时茶多酚本身所具有的抑菌、消炎、除臭、抗辐射等功能更使其适用于人体皮肤。张国营[5]、Chung S.Yang[6]等先后报道了在一定浓度范围内茶多酚对肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、食道癌、皮肤癌等多种癌变有良好的预防效果。曹明富[7]研究发现, 茶多酚对机体造血和免疫系统受到电离辐射损伤时, 不仅有明显的防护效应, 且对辐射损伤有一定的修复治疗作用。
1.2 提取方法
目前, 关于茶多酚的单一提取分离方法已有不少报道, 主要有如下4类。
(1) 茶叶原料→溶剂提取→浓缩→有机溶剂萃取去杂→干燥→茶多酚粗品[8]。此法提取过程中涉及到的溶剂有水、乙醇、甲醇、丙酮、正乙烷等。常用去杂方法有氯仿脱咖啡碱, 石油醚除色素、活性炭脱色等。尚存在提取率低、有毒溶剂残留、生产成本高等缺点。
(2) 茶叶原料→沸水浸提→过滤→沉淀→转溶→萃取→干燥→茶多制品[8]。该法常用的沉淀剂有C u (OH) Ac, Pb (OH) Ac, Ca (OH) 2, Ca2+, Mg2+等。重金属碱式盐易给产品的安全性带来不良影响, 氢氧化物属强碱, 对生产设备有腐蚀性。
(3) 茶叶原料→热水浸提→过滤→树脂吸附→解吸→浓缩→干燥→茶多酚制品[8]。该法存在洗脱所耗试剂太多, 成本较高的缺点。
(4) 茶叶原料→SFE萃取→茶多酚粗品→纯化→高纯度TP[9,10]。该法使用的压力为10 MPa~20 MPa, 温度为80~100℃, 萃取剂中常加入乙醇水溶液作夹带剂。超临界流体萃取为现代分离技术, 设备投资费用较高, 一时难以投入大规模生产。
2 咖啡碱
2.1 生理作用
咖啡碱属兴奋剂, 茶叶中含量约2%~5%, 在一定浓度范围内, 对人体具有强心、利尿、解毒等生理作用和保健作用, 是医用咖啡因的重要来源[1,2]。刘立军等[11]通过细胞生物学筛选发现茶叶咖啡碱对肿瘤发生的启动、促癌和增殖阶段均有不同强度的抑制作用。
2.2 提取方法
咖啡碱的单一提取方法主要有溶剂法、升华法、吸附法和超临界二氧化碳气提法 (简称SFE法) [12]四类。目前, 溶剂法存在着产品纯度低、安全性差 (常用有毒试剂作萃取剂) , 工艺复杂等缺点;升华法存在升华的咖啡碱定向定位富集困难, 收集时损耗较大等缺点;吸附法存在洗脱剂用量多或有毒洗脱剂的使用;SFE法生产成本较高, 尚处在实验室研究阶段。
3 茶多糖
3.1 生理作用
茶多糖是一类与蛋白质结合在一起的酸性多糖或酸性糖蛋白, 在茶叶中含量为0.5%~3.1%, 其多糖部分是由不同单糖组成的杂多糖, 主要组成的单糖有半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、岩藻糖等。具有降血糖、抗炎、抗凝、抗血栓、抗辐射及增加碳粒廓清速度等药理作用。王丁刚、王淑如[13]等研究了茶多糖对正常小鼠血糖浓度、四氧嘧啶高血糖模型小鼠血糖浓度的影响, 结果表明茶多糖具明显降血糖作用。
3.2 提取方法
目前, 茶多糖的单一提取分离方法己研究得较深入, 大致可归纳为醇沉淀法、超滤法、CTAB沉淀法[14]三类:汪东风[15]等研究表明, 温水提取与沸水提取茶多糖, 其果胶含量及溶解性能等均不相同。因此, 茶多糖提取技术的关键是既能提高其纯度又能较好地保持其生物活性。
4 茶叶有效成分提取研究进展
近几年来, 对茶叶有效成分的复合提取技术研究较多, 它具有一次投料得到多种产品, 充分利用茶叶资源;成本低, 效益高;废弃物少、污染少等优点。阿有梅等[16]、朱冬雪等[17]报道了同时提取咖啡碱和茶多酚的工艺研究。曹栋等[18]、吴明光等[19]采用多阶分步萃取技术制备了茶多酚、咖啡碱和叶绿素。陈荣义[20]等采用ZJL大孔离子交换树脂和ZJX大孔吸附树脂从茶叶中提取茶氨酸、咖啡因、茶多酚和茶多糖4种产品, 其提取率分别为0.94%、1.9%、12.35%、1.1%。曹利、苟小峰[21]等用XDA负载PA膜包络体的复合树脂提取茶叶提取液中茶多酚、咖啡碱, 并取得了良好的效果。
茶叶有效成分的复合提取技术替代其单一组分的提取已成为茶叶深加工技术研究热门课题。当前, 茶叶复合提取工艺尚存在不足之处是;复合提取的各组分得率均低于单一成分的提取[22];茶多酚和咖啡碱的分离采用二氯甲烷等有毒试剂, 产品安全性差[18,19]等。另外, 在茶叶有效成分提取制备中, 茶叶常采用沸水或有机溶剂浸提。但有机溶剂提取较水浸提成本高, 产品安全性低;传统的沸水浸提耗时长, 温度高, 严重影响茶多酚制品儿茶素的组成, 导致其生物活性降低[23]。为了充分利用茶叶资源, 提高主要有效成分的提取得率, 避免分离茶多酚和咖啡碱时二氯甲烷等有毒溶剂的使用, 提高其生物活性, 近年出现了几种新型的提取技术, 主要有超声波辅助浸提法[24,25]、微波辅助浸提法[26,27]和低温酶解提取法[28,29]。
(1) 超声波辅助浸提法是利用超声波的机械破碎和空化作用, 加快茶多酚等浸提物从茶叶向溶剂中的扩散速率, 缩短浸提时间。根据相关报道, 该法可大大缩短浸提时间, 且避免长时间高温处理造成的茶多酚的氧化。
(2) 微波辅助浸提法是最近几年刚开始进行实验室研究的一种新方法, 基本原理是在微波场中, 细胞的极性物质, 尤其是水分子吸收微波能后产生大量热量, 使胞内温度迅速上升, 水分气化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲破, 形成微小的孔洞和裂纹, 使胞外溶剂容易进入细胞内, 溶解并释放出胞内物质。该方法具有短时、高效和节能等优点, 但微波场对细胞内有效物质的结构及活性的影响还存在较大争异。
(3) 低温酶解法是用添加外源酶来破解茶叶的细胞壁、细胞间质, 促使茶多酚等胞内物快速扩散, 达到提高有效成分提取率的方法。近年来, 利用酶技术进行的植物、动物细胞有效成分提取的研究屡见报道, 在茶饮料生产技术中曾有用果胶酶提高产品澄清度的研究报道, 用添加纤维素酶、果胶酶等来提取茶叶有效成分的研究报道较少, 但酶方法所具有的高度专一性、快速、高效、反应条件温和易于工业化等优点。
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