分离菌株（共10篇）
分离菌株 篇1
褥疮是因为患者长期卧床, 身体局部长期在压力作用下, 神经营养紊乱及局部血液循环障碍, 不能供给皮肤和皮下组织所需的营养, 以致局部组织失去正常功能而形成溃疡和组织坏死[1]。近年来褥疮的发病率呈上升的趋势, 而褥疮在治疗上也存在一定的困难。发生褥疮的患者中, 大多是老年病如脑血管病、老年痴呆症等, 尤其是行动不便长期卧床、体质衰弱、肢体感觉迟钝者居多。一旦发生褥疮, 不仅给患者带来痛苦, 加重病情, 延缓疾病康复的时间, 严重时还会因继发感染引起败血症而危机生命[2]。褥疮溃疡处就像一个开放性的伤口, 它暴露在空气中, 创面上多有需氧菌、厌氧菌和兼性厌氧菌的混合感染, 大多数是金黄色葡萄球菌, 化脓性链球菌[3]。预防和控制感染对于褥疮的治疗显得尤为重要。为了能够及时有效控制褥疮感染、减轻患者痛苦, 本文从患部采集标本后及时进行了菌种的鉴定和药物敏感性试验, 选择了敏感抗生素, 使患者的感染得到了及时的控制。
资料与方法
试验用品:手提式压力蒸汽消毒器 (北京市朝阳区将台医疗设备厂) , JJ-CJ-IFD洁净工作台 (吴江市净化设备总厂) , 恒温培养箱 (上海跃进医疗器械一厂) , 电子天平 (上海菁海仪器有限公司) , Vitek 2 Compact (法国生物梅里埃公司) , Mueller-Hinton琼脂 (青岛高科园海博生物技术有限公司) , 培养皿 (扬州市光华医疗器械厂) , 量筒, 烧杯, 三角瓶, 涂布棒, 镊子, 酒精灯, 酒精, 接种环。
药敏纸片 (20片/瓶) :链霉素10μg/片、红霉素15μg/片、氧氟沙星5μg/片、阿米卡星30μg/片、头孢曲松30μg/片、青霉素G 10 IU/片、林可霉素2μg/片、氨苄青霉素10μg/片, 均购自北京天坛药物生物技术开发公司。
实验方法: (1) 分离菌株的分离培养:将该褥疮患者感染部位提取标本接种于MH培养基中, 置37℃培养箱中培养18~24 h, 之后取单菌落再次活化。 (2) 菌悬液的配置:挑分离菌株的单菌落用无菌生理盐水制成菌悬液, 调菌悬液浓度0.5麦氏标准浊度。 (3) 涂布平板:用无菌棉拭子蘸取上述调好的菌悬液, 挤出多余菌液后均匀涂布于MH琼脂平板中, 放置室温干燥3 min。 (4) 贴药敏纸片:用镊子将链霉素、红霉素、氧氟沙星、阿米卡星、头孢曲松、青霉素G、林可霉素、氨苄青霉素的药敏纸片贴在涂好菌的平板上, 并轻压纸片使其紧贴琼脂表面, 每个平板贴4种药敏纸片, 各纸片相距至少24 mm, 纸片距平板边缘>15 mm, 并设阴性对照, 将平板置35℃培养箱中培养16~18 h观察结果。 (5) Vitek 2系统对分离菌株的测试:通过法国生物梅里埃公司的Vitek 2系统对分离菌株进行鉴定和药物敏感性分析。
结果
褥疮分离菌株的培养:本例褥疮患者收治入院时, 为了选择有效的抗生素, 减轻患者的痛苦, 使患者能够早日痊愈, 我们用无菌棉拭子采集了其溃疡处标本, 分离到一株细菌, 显微镜观察呈球形, G-。
K-B纸片琼脂扩散法结果:分离菌株对红霉素、链霉素、氧氟沙星、阿米卡星敏感, 对头孢曲松、青霉素、氨苄青霉素、林可霉素不敏感。
Vitek 2系统检测结果:为了确保结果的可靠性我们同时用法国生物梅里埃Vitek 2系统对分离菌株进行了菌种的鉴定和药物敏感性试验, 分离菌株被证实是肺炎克雷伯菌, 同时, Vitek 2系统结果显示, 该菌对阿米卡星、链霉素、妥布霉素、庆大霉素、氧氟沙星、环丙沙星、左氧氟沙星等抗生素敏感。
褥疮感染患者药物的选择:根据以上试验结果, 通过综合分析患者的肝肾情况、药物的不良反应, 选用左氧氟沙星对患者的感染进行了治疗, 收到良好效果, 患者的感染得到控制。
讨论
褥疮一旦发生, 即给患者带来躯体和经济的双重痛苦, 褥疮易导致细菌感染继而引发骨膜炎或骨髓炎[4], 感染若得不到及时有效控制, 往往危及生命[5]。
抗生素的问世使得人类感染性疾病得到了有效的控制, 但是由于其不正规的使用, 目前微生物出现的耐药性, 甚至现在还出现了超级细菌[6]。又成为人类不得不面对的一个很头痛的问题, 所以, 面对微生物严重耐药的现状, 通过药物敏感性试验选择有效的药物显得尤为重要, 磨刀不误砍柴工, 不仅能够选择有效的药物使患者得到及时的救治, 减轻患者的痛苦, 而且避免了药物滥用带来的微生物的耐药性, 其为临床用药的选择具有举足轻重的作用。
参考文献
[1]张凯松, 刘建中, 洪宇明, 等.褥疮愈合膏治疗重度褥疮效果的研究[J].国际外科学杂志, 2011, 38 (8) :519-522.
[2]覃华勤.中药在褥疮治疗中的应用进展[J].中国民间疗法, 2013, 21 (5) :77-78.
[3]Unemo M, Nicholas RA.Emergence of multidrug-resistant, extensively drug-resistant and untreatable gonorrhea[J].Future Microbiol, 2012, 7 (12) :1401-22.
[4]李映, 钟惠, 范会珍.蒙脱石散联合局部氧疗法治疗压疮的疗效观察[J].临床护理杂志, 2011, 10 (1) :77-78.
[5]李特, 万钢.中西医治疗褥疮的研究进展[J].中国老年保健医学, 2014, 12 (4) :63-64.
[6]Nazir T, Abraham S, Islam A.Emergence of Potential Superbug Mycobacterium Tuberculosis, Lessons from New Delhi Mutant-1Bacterial Strains[J].Int J Health Sci (Qassim) , 2012, 6 (1) :87-94.
分离菌株 篇2
蜡状芽孢杆菌菌株Jp-A的分离鉴定及其降解苯酚特性
从某钢铁厂处理废水的活性污泥中驯化分离一株能高效降解苯酚的细菌(Jp-A).通过形态观察、生理生化实验和16srRNA序列分析,初步鉴定Jp-A为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus).在实验条件下,该菌在16、24和32 h内能将浓度分别为5、10和15 mmol・L-1的苯酚完全降解,而30 mmol・L-1的苯酚则完全抑制该菌的`生长.该菌也能以甲苯、氯酚类和硝基酚类等芳香烃类物质作为唯一碳源和能源生长.双加氧酶检测表明,其通过间位途径开环裂解苯酚,该途径的关键酶邻苯二酚2,3-双加氧酶主要定位在细胞膜上,为诱导酶,补加葡萄糖能抑制该酶的产生.
作 者：李淑彬 陈振军 丘李莉 伍娟 赖展鹏 LI Shubin CHEN Zhenjun QIU Lili WU Juan LAI Zhanpeng 作者单位：华南师范大学生命科学学院,广州,510631刊 名：应用生态学报 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY年，卷(期)：17(5)分类号：Q93关键词：苯酚 蜡状芽孢杆菌 生物降解 双加氧酶
分离菌株 篇3
关键词：湖南石门；砷矿区；砷抗性菌；氧化还原；最适生长条件
中图分类号： X172 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）04-0300-03
收稿日期：2013-08-29
基金项目：国家自然科学基金（编号：40930742）；国家重点基础研究发展计划（编号：2014CB846004）。
作者简介：管思琪（1987—），女，江苏南通人，硕士，从事环境微生物研究。
通信作者：王睿勇。Tel：（025）83592685；E-mail：wangry@nju.edu.cn。隨着社会经济发展，自然环境正面临着空前压力，砷污染日益加重便是其中之一。砷（As）是一种类金属，广泛存在于岩石圈、水圈和生物圈[1]，可能导致膀胱癌、肾癌、肝癌、肺癌、皮肤癌等的发生，被美国环境保护署列为典型致癌物[2]。砷可导致急性中毒和慢性中毒，在砷污染严重地区比如孟加拉国和印度引起极大关注。在我国很多地区也存在不同程度的砷污染，目前超过10个省、自治区发现了饮用水型砷中毒，因此，含砷化合物污染和防治已引起人们的普遍关注[3]。
砷污染对人类主要影响来自地方性的砷中毒和饮用水中砷含量超标。2001年，世界卫生组织建议将饮用水中砷的最高限度由原来的50 μg/L调整为10 μg/L[4]，如何治理砷污染，特别是如何从源头上防止砷污染引起了人们的广泛关注。目前主要的砷污染治理方法是将高毒性的砷转化为低毒性的砷，或者将水体中的砷转化为低水溶性或不溶于水的物质。近年来，研究者发现砷抗性菌可以通过对砷的氧化/还原、吸附/去吸附、甲基化/去甲基化、沉淀/溶解等途径来降低环境中砷的毒性[5-7]。砷抗性菌对砷的各种作用为治理砷污染提供了新的思路。
矿业活动是导致砷污染的重要原因之一。从1850年工业革命到21世纪初，全球人为活动向环境排放的砷含量逐年增加，其中矿业活动产生的砷量占72.6%[8]。全球砷矿分布不均，其中，砷探明储量的70%集中在中国。湖南石门有国内外最大的雄磺矿，距今已有1 500年的开采历史，年产砷矿3 000 t左右，在矿物开采过程中，极大污染了周围的大气、水和土壤环境，曾经引起居民砷中毒事件的发生。本试验以该矿区的尾砂、水样为研究对象，筛选分离砷抗性菌，对其进行鉴定，并研究抗性菌对砷的氧化还原能力，为砷抗性菌的生物修复利用奠定基础。
1材料与方法
1.1含砷尾砂、水样采集及其地化分析
尾砂来源于湖南省石门县白云乡界牌村的磺厂矿部选矿厂（29°38.727′N，111°2.049′E）；水样来自矿厂一号窿二平硐口（29°38.760′N，111°2.130′E），现场测定pH值。采回的新鲜样品充分混匀后，取一部分立刻进行细菌分离，剩余的样品经冷冻干燥，参照孙青等的方法[9]测定元素含量。
1.2试验方法
1.2.1抗砷菌的富集、分离与纯化抗砷富集培养基：1 L 去离子水中加入（NH）2SO4 2.0 g、乙酸钠2.0 g、酵母提取物0.5 g 、胰蛋白胨1.0 g、葡萄糖0.2 g，pH值为7.5±0.2。培养基灭菌后，无菌加入NaAsO2至终浓度为10 mmol/L。制备固体培养基时，1 L培养基加入10.0 g琼脂。取尾砂1.0 g或水样20 mL加入100 mL抗砷富集培养基中，30 ℃、120 r/min摇床培养3 d；取1 mL富集培养液转接到新的抗砷富集培养基中，转接2次；将第3次转接的富集培养物梯度稀释后，涂布于抗砷富集培养基平板上，30 ℃培养3 d后划线分离至纯培养，获得单菌落，转接斜面保存备用。
1.2.2抗砷菌的鉴定 参照东秀珠等的方法[10]进行。
1.2.3抗砷菌的抗性试验采用含有As的R2A培养基进行抗性鉴定。将R2A培养基中As（Ⅲ）浓度调节为10、20、30、40、50、60 mmol/L，将As（Ⅴ）浓度调节为20、40、60、80、100、120 mmol/L；然后分别接入菌液，接种细胞密度约为 1×106个/mL，30 ℃、120 r/min条件下培养120 h；600 nm下测定吸光度D值，确定As（Ⅲ）的最小致死浓度和最大抗砷浓度。以大肠杆菌为对照菌株。
1.2.4菌株氧化、还原砷能力确定采用高锰酸钾法。原理：高锰酸钾具有强氧化性，与As（Ⅲ）接触时氧化As（Ⅲ），同时自身还原而褪去红色。检验方法为：取50 μL R2A培养液、4 μL 0.01 mol/L高锰酸钾溶液和946 μL无菌水摇匀。空白1为不加砷、高压灭菌的R2A培养基50 μL，空白2为不接种、高温高压灭菌的R2A培养基50 μL，检测样为含有 10 mmol/L As（Ⅲ）或As（Ⅴ）的R2A培养基50 μL。
将菌种接入As（Ⅲ）浓度为10 mmol/L的R2A培养基，30 ℃、120 r/min下培养168 h。72 h和168 h各检测1次，空白样1中红色不褪去，空白样2中红色褪去，样品红色不褪去或变淡，即该菌种具有砷氧化功能（图1）。
nlc202309011517
将菌种接入As（Ⅴ）浓度为10 mmol/L的R2A培养基，30 ℃、120 r/min下培养168 h，72 h和168 h各检测1次，空白样1中红色不褪去，空白样2中红色不褪去，样品红色褪去，即该菌种具有砷还原功能（图2）。
1.2.5菌株SM-T1的最适生长条件试验
1.2.5.1pH值对SM-T1生长的影响分别将As（Ⅲ）浓度为10 mmol/L的R2A培养基初始pH值调为5.0、6.0、70、8.0、9.0，接种SM-T1种子液，孢子浓度控制在 1×106个/mL，30 ℃、120 r/min条件下培养48 h，测定D值，确定细菌在不同pH值下的生长情况。
1.2.5.2温度对SM-T1生长的影响将温度分别设置为15、20、25、30、35 ℃，接种SM-T1种子液，孢子浓度 1×106个/mL，120 r/min下培养48 h，测定D值，确定细菌在不同温度下的生长情况。
1.2.5.3不同砷浓度对SM-T1生长的影响在获得最适pH值和最适温度条件下，将As（Ⅲ）浓度设置为0、10、20、30 mmol/L，接种SM-T1种子液，孢子浓度1×106个/mL，120 r/min 条件下培养72 h，每隔4 h用分光光度计测定D值1次，确定细菌在不同浓度As（Ⅲ）条件下的生长曲线。
2结果与分析
2.1尾砂和水样的化学分析结果
本研究共采集10个尾砂样品和3个水样，典型样品的元素分析结果（表1）表明，尾矿SM-T-1和SM-T-6的砷含量极高，超过了质量的30%，除Ca、Mg、Al外，2个样品的其他金属含量也均高于其他尾矿样品；水样SM-S-4的砷含量也达到了24.0%，除Ca、Mg外，主要金属含量也均高于其他样品。参照国标GB 15618—1995《土壤环境质量标准》，所有样品砷含量均达到重度污染程度。水样分析表明，pH值为中性，砷含量严重超标，达到30 mg/L以上。
2.2抗砷菌的富集培养、分离、纯化和鉴定
经过含AS（Ⅲ）浓度为10 mmol/L的抗砷培养基富集培养、相同浓度抗性平板筛选及多次划线分离，所有样品都分离得到了抗砷菌株，说明砷抗性菌在该环境中普遍存在。对分离获得的13株细菌（均为好氧杆菌）进行形态学和生理学鉴定，结合16S rDNA序列分析，初步鉴定这13株细菌为Pseudomonas otitidis和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。典型菌株的16S rDNA序列分析结果如图3所示。
2.3菌株的抗砷试验
由表2可见，13个菌株都有很强的抗砷能力：除菌株 SM-S-7 外，其他菌株对As（Ⅲ）的抗性都超过40 mmol/L，对AS（Ⅴ）的抗性超过60 mmol/L。对砷抗性最强的是菌株SM-T1，其对As（Ⅲ）和As（Ⅴ）的抗性分别达到60 mmol/L和 100 mmol/L；As（Ⅲ）的毒性虽然比As（Ⅴ）的毒性要大得多，但是13个菌株对两者的抵抗能力差异不大，这可能是菌株对砷发生氧化还原作用所致。
2.4抗砷菌对砷的氧化、还原作用
用高锰酸钾法鉴定结果表明，大部分菌株对As（Ⅴ）有还原性，As（Ⅴ）被还原为As（Ⅲ）后，As（Ⅲ）对细胞的毒性更强，这可能也是这些菌株对As（Ⅲ）和As（Ⅴ）耐受能力差别不大的原因。
2.5菌株SM-T1最适生长条件
3小结与讨论
通过在湖南石门璜矿采集含砷尾砂样品和水样，在实验室利用选择性培养基富集培养和分离，获得13株对砷有抗性的菌株；对菌株的鉴定表明，它们属于Pseudomonas otitidis和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。对砷的抗性试验表
明，13个菌株均能在较高浓度的砷培养液中生存，主要通过还原砷达到对砷的高抗性作用，其中，菌株SM-T1对As（Ⅲ）和As（Ⅴ）的抗性分别达到了60 mmol/L和100 mmol/L。
对典型抗性菌株SM-T1研究表明，菌株SM-T1能在pH值5.0～9.0、温度15～35 ℃范围内生长，最适生长pH值为7.0～8.0、最适生长温度为20 ℃。在砷浓度未达到致死浓度时，砷浓度对SM-T1生长影响较大，对其最终的生长状况影响较小，细菌可以进行正常旺盛的细胞分裂。这为进一步利用砷抗性菌开展含砷环境的生物修复奠定了良好基础。
参考文献：
[1]Cullen W R，Reimer K J. Arsenic speciation in the environment[J]. Chemical Review，1989，89（4）：713-764.
[2]Chen M，Ma L Q，Harris W G. Arsenic concentrations in florida surface soils：influence of soil type and properties[J]. Soil Sci Soc J，2002，66：632-640.
[3]王薇，徐炎华. 水体中砷污染和治理概况[J]. 微量元素与健康研究，2005，22（5）：59-61.
[4]Gomez-Caminero A，Howe P，Hughes M，et al. Environmental health criteria 224 arsenic and arsenic compounds[R]. Geneva：World Health Organization，2001.
[5]Turpeinen R，Pantsar-Kallio M，Hggblom M，et al. Influence of microbes on the mobilization，toxicity and biomethylation of arsenic in soil[J]. Science of the Total Environment，1999，236（1/3）：173-180.
[6]Silver S，Phung L T. Genes and enzymes involved in bacterial oxidation and reduction of inorganic arsenic[J]. Applied and Environmental Microbiology，2005，71（2）：599-608.
[7]Kashyap D R，Botero L M，Franck W L，et al. Complex regulation of arsenite oxidation in Agrobacterium tumefaciens[J]. Journal of Bacteriology，2006，188（3）：1081-1088.
[8]Han F X，Su Y，Monts D L，et al. Assessment of global industrial-age anthropogenic arsenic contamination[J]. Naturwissenschaften，2003，90（9）：395-401.
[9]孫青，邢辉，何斌，等. 安徽铜陵狮子山硫化物矿山酸矿水中微生物功能群的研究[J]. 岩石矿物学杂志，2009，28（6）：547-552.
[10]东秀珠，蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京：科学出版社，2001：370-398.
铜绿假单胞菌临床分离菌株分析 篇4
1材料与方法
1.1 菌株来源
2009年1月至2011年12月本院临床各科室送检标本中共分离到356株铜绿假单胞菌, 排除同一患者重复分离相同菌株。质控菌株铜绿假单胞菌 (ATCC27853) 来自卫生部临检中心。
1.2 菌种鉴定与药敏试验
使用法国生物梅里埃公司生产的鉴定试剂和ATB Expression系统进行菌种鉴定, 采用K-B纸片扩散法进行药敏试验, 所有结果判断均按照美国CLSI/NCCLS推荐的标准进行, 药敏纸片购自于英国OXOID公司。
1.3 统计学方法
使用WHONET5.4软件系统进行统计分析。
2结果
2.1 菌株在临床标本中的分布
3年内本院共分离出356株铜绿假单胞菌, 按照标本来源类型进行分类, 以痰液标本为主, 共分离出237株, 占66.6%, 从分泌物中分离出38株, 占10.7%, 其余为中段尿、血液、穿刺液等, 结果如表1所示。
2.2 铜绿假单胞菌在临床各科室分布
铜绿假单胞菌在ICU科室分离率最高, 占68.8%, 其次为呼吸内科和神经外科, 比例分别为15.2%和7.3%, 结果如表2所示。
2.3 铜绿假单胞菌的耐药率
铜绿假单胞菌对9种抗菌药物的耐药情况如表3所示。
3讨论
铜绿假单胞菌在自然界中分布广泛, 也是人体的正常菌群, 它广泛存在于人体的呼吸道、消化道、肠道等部位, 一旦机体应用免疫抑制剂、抗肿瘤药物和广谱抗生素导致机体免疫力低下, 会引起严重的感染。抗生素的大量应用也使得耐药菌株越来越多, 多重耐药更加严重[2]。这一菌株可以感染人体的任何部位, 主要引起呼吸系统感染, 本研究结果显示, 痰是分离铜绿假单胞菌最多的标本, 达到66.6%, 且主要集中在ICU和呼吸内科科室, 与国内外很多文献报道一致[3,4], 可能与这些科室的住院患者类型有关, 这些患者多为老年患者, 对多种抗生素反应不是很敏感, 而且免疫力低下多见, 更易于感染和分离出铜绿假单胞菌。
356株铜绿假单胞菌对9种抗菌药物的药敏结果显示, 此菌对多种抗菌药物均有不同程度的耐药, 并且有多重耐药, 这可能与此菌的多重耐药机制和长期不合理应用大量抗生素有关[5]。本院分离的铜绿假单胞菌对喹诺酮类的药物左氧氟沙星耐药率最高, 达到57.0%, 可能与近几年来此类药物的广泛使用有关, 由于很多患者在没有看医生的情况下自行使用抗菌药物, 导致耐药率增加。有文献报道[6], 铜绿假单胞菌起初对β-内酰胺类的抗生素敏感, 常常被用来治疗此菌的感染。但是, 近年来许多菌株已经产生多重耐药机制, 本研究显示铜绿假单胞菌对β-内酰胺类的药物氨曲南有43.3%的耐药率, 仅次于左氧氟沙星。以亚胺培南为代表的碳青霉烯类的抗菌药物被公认为是控制铜绿假单胞菌感染的首选药物之一[3], 但是本院中此菌对亚胺培南的耐药率为中等耐药, 达到29.5%, 可能与此类药物在临床广泛应用, 导致铜绿假单胞菌外膜孔蛋白 (OprD2) 缺失有关, 因为该蛋白的表达降低或缺失会引起亚胺培南耐药。本院研究中对铜绿假单胞菌相对敏感的是三代头孢抗菌药物头孢哌酮/舒巴坦和氨基糖苷类药物, 所以临床经验性用药应首选这两类药物。
因此, 在临床用药中, 不能盲目应用不恰当的抗生素, 应进行药敏试验选择合适的抗菌药物。此研究对本院三年内分离的铜绿假单胞菌进行分析, 可以指导临床医生合理治疗和经验性用药, 有效的控制细菌的耐药趋势, 降低耐药菌株的产生, 同时监测此菌的临床流行情况, 对有效预防以及治疗该菌引起的感染也具有重要的指导意义。
参考文献
[1]明德松, 吴一波, 朱焱, 等.铜绿假单胞菌耐碳青酶烯类抗菌药物机制分类检测的研究.中华医院感染学杂志, 2005, 15 (2) :215-216.
[2]吴容, 府伟灵.重庆地区铜绿假单胞菌医院感染及耐药性分析.中华医院感染学杂志, 2004, 14 (1) :97-99
[3]胡莹, 杨红英, 杨旭, 等.2005至2009年铜绿假单胞菌感染分布及耐药性分析.检验医学, 2011, 26 (11) :797-798.
[4]Johnson JK, Smith G, Lee MS, et al.The role of patient-to-patient transmission in the acquisition of imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa colonization in the intensive care unit.J Infect Dis, 2009, 200 (6) :900-905.
[5]周齐艳.265株铜绿假单胞菌临床感染的分布与耐药性分析.2008, 3 (27) :40-41.
分离菌株 篇5
具抗肿瘤活性放线菌菌株YIM 90022的分离和系统发育分析
从青海盐碱土壤样品中分离到一株兼性嗜碱放线菌YIM 90022,该菌株的发酵产物具有很强的体外抗胃癌、肺癌、乳腺癌、皮肤癌、肾癌和子宫癌肿瘤细胞株活性.基于16S rRNA基因序列的系统发育分析表明,菌株YIM90022属于拟诺卡氏属(Nocardiopsis)的成员,与该属的4个有效发表种N.exhalans DSM 44407T,N.prasina DSM 43845T,N.metallicus DSM 44598T和N.listeri DSM 40297T系统发育关系最密切,与其分别以98.8%,98.5%,98.4%和97.8%的16S rRNA基因核苷酸序列相似性聚为一簇.但菌株YIM 90022不与这4个有效种中任何一个单独相聚,形成了一个独立亚分枝.结合形态特征、生理生化特性、细胞化学分类特征,以及rep-PCR基因指纹分析等方面的研究结果,菌株YIM 90022可能为拟诺卡氏菌属的`一个潜在新种.菌株YIM 90022在大多数培养基上生长良好,气生菌丝和基内菌丝丰富,在酵母膏麦芽膏琼脂、燕麦片琼脂等培养基中产生可溶性色素.生长pH范围6.0～12.0,最适pH 8.5;能在含0～15%NaCl(W/V)的培养基上生长.
作 者：陈义光 李文均 崔晓龙 姜成林 徐丽华 CHEN Yi-guang LI Wen-jun CUI Xiao-long JIANG Cheng-lin XU Li-hua 作者单位：陈义光,CHEN Yi-guang(云南大学,云南省微生物研究所,云南省生物资源保护与利用重点实验室,昆明,650091;吉首大学生物资源与环境科学学院,吉首,416000)李文均,崔晓龙,姜成林,徐丽华,LI Wen-jun,CUI Xiao-long,JIANG Cheng-lin,XU Li-hua(云南大学,云南省微生物研究所,云南省生物资源保护与利用重点实验室,昆明,650091)
刊 名：微生物学报 ISTIC PKU英文刊名：ACTA MICROBIOLOGICA SINICA 年，卷(期)： 46(5) 分类号：Q93 关键词：拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis) 抗肿瘤活性 16S rRNA基因 Rep-PCR基因指纹分析 系统发育分析分离菌株 篇6
石油的主要成份包括烷烃、苯、甲苯和二甲苯等多种有机物组分,其中的复杂芳香烃类化合物有致癌、致突变作用。而且石油在加工和运输等环节均可由于油气挥发、油罐及输油管线渗漏而造成大气环境、土壤以及地下水源的污染[1]。因此,石油污染问题亟待解决。目前,生物降解是解决石油污染问题的关键途径之一。
国内外对石油生物降解方面的研究历时已久。1964年,Zobell CE等对海洋细菌降解石油烃的速率进行了研究[2]。此后,国外学者研究多集中于烃类代谢机制、生物修复、报告基因在生物降解中的应用[3]和降解性质粒等方面[4]。另外,Atlas RM[5]报道,当有污染物胁迫时环境中石油降解微生物的比例会增加。Mishra S等[6]研究表明石油污染物的降解是微生物群落共同作用的结果。
而国内的研究多主要集中在微生物对石油的降解能力[7]、影响生物降解的因素[8]和降解机制等领域[9]。李玉瑛等[10]从石油污染的土壤中及无污染而经芳香烃驯化后的土壤中分离出可以利用石油烃物质的细菌,并对其降解石油烃的能力作了进一步探讨,而且从齐鲁石化炼油区的土壤中分离到6株石油降解细菌。黄永红等[11]通过构建16S rDNA克隆文库,对油藏系统的微生物群落结构和种群的遗传多样性进行分析。结果表明,油藏系统中微生物存在部分未知菌种,大部分微生物为外源微生物。刘永军等[12]通过对石油集输系统中微生物群落结构进行研究,得出以下结论:①油田产水中微生物群落远比原油中的菌群丰富,②在石油集输过程中,油田水样和原油中微生物群落的相似性分别为83.3%和88.2%,微生物群落演替不明显,微生物群落结构较为稳定。岳冰冰等[13]应用 Biolog 微平板技术,研究了大庆油田石油污染区域不同土层微生物群落对碳源的利用特性。结果表明:石油污染明显提高了土壤微生物群落的代谢活性,不同土层之间的微生物代谢强度存在显著差异。石油污染土壤的微生物群落具有独特的群落结构和特点。
微生物降解石油的研究多数着重于单株菌对石油烃的利用能力、影响因素或分析降解过程中的中间产物等方面,而忽视了石油污染对微生物群落结构之间的相互作用,从而对石油污染土壤微生物的群落组成和动态变化了解较少。本研究对喀什地区泽普油田石油产区的菌株多样性进行探讨的同时,对分离到的石油降解功能菌株进行了研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
选用泽普油田产区石油污染的土壤为受试样品。
1.1.2 试剂
16S rRNA和18S rRNA通用引物(由上海捷瑞生物有限公司合成)。
1.1.3 实验仪器
LDZX-40KB型高压灭菌锅(上海申安医疗器械厂);766-O型干燥箱(上海锦屏仪器仪表有限公司通州分公司);THZ-98AB恒温振荡器(上海一恒科学仪器有限公司);GXZ智能型光照培养箱(宁波江南仪器厂);UA-VIS检测器(岛津公司);PCR仪(ABI9700);UA–VIS检测器、NDJ–1型旋转粘度计(上海昌吉地质仪器有限公司);岛津高效液相色谱仪HPLC(型号:250×4.6 mm,5 μm,模式:低压梯度,甲醇和水(4:1)作溶剂,流速:0.800 ml/min,压力:17.2 MPa,柱箱温度:30 ℃)。
1.1.4 培养基
牛肉膏培养基和马丁氏培养基。
1.2 方法
1.2.1 菌株多态性分析
1.2.1.1 分离菌株的形态学观察
采样、制备土壤悬液、土壤稀释液的制备和微生物的分离参考文献[14,15]。基于革兰氏染色观察微生物的形态特征[16]。
1.2.1.2 分离菌株多糖的TLC分析
参考文献[10]测定菌株多糖的TLC。
1.2.1.3 分离菌株菌株多糖的HPLC分析
通过HPLC分析多糖细胞组分。
1.2.1.4 分离菌株的16/18S rRNA序列分析
按照CTAB法提取细菌基因组DNA;用天根酵母提取试剂盒(50次)提取酵母的总基因组;提取分离菌株的基因组DNA,通过PCR技术扩增其16S rRNA或18S rRNA基因序列,进而分析其种属差异。(将基因组DNA作为PCR扩增的摸板,终浓度约为1 nmol/100μl。所用的引物均是通用正向引物P1和通用反向引物P2。DNA扩增反应在25 μl反应体系中进行,包括9.5 μl无菌水、1 μl 引物1、1 μl 引物2、12.5 μl r-Taq和1 μl模板DNA。16S rRNA PCR反应条件:94 ℃,5 min;56 ℃,30 s;72 ℃,1 min;18S rRNA PCR反应条件:94 ℃,5 min;54 ℃,30 s;72 ℃,2 min。用DNA胶回收试剂盒对克隆基因进行回收和纯化;扩增产物直接进行测序,委托北京奥科鼎盛公司测序;测序结果通过http://www.ncbi.nih.nlm.gov网站进行BLAST序列比对。同时,利用Mega4.1软件构建系统进化树)。
1.2.2 石油降解菌株的降解能力测定
1.2.2.1 溶血实验
将实验菌接种于血琼脂平板中,要求每一支菌对应一个平板,接种方法为划线法。然后置37 ℃恒温箱中培养1～2 d后,观察结果,若透明圈不明显者可放置10～22 ℃下,18 h左右后再观察。
1.2.2.2 排油圈检测
取一干净的培养皿,加蒸馏水,水面上加2滴原油形成油膜,在油膜中心加摇瓶发酵液。若中心油膜被挤向四周形成一圆圈,圆圈直径与表面活性剂含量和活性成正比,说明此液中含有的菌种已排油,有降解菌产生。
1.2.2.3 原油黏度的测定
利用粘度计测定原油的的黏度。选用相同的转子和转速分别测定原油和石油发酵培养液,根据得出的偏转角度和系数求得黏度η(mPa·s )。即:η=k·α( k-系数,α-偏转角度读数)。
1.2.2.4 原油降解产物的紫外光谱分析
用紫外光照射有机分子,分子吸收紫外光后,从电子能级基态跃迁到激发态,得到紫外吸收光谱。可根据得到的紫外吸收光谱图对原油降解产物进行分析。将含有石油和不含石油的石油发酵培养基倒入比色皿中,用紫外光谱仪进行分析,得到紫外光谱图。
1.2.2.5 原油降解菌株降解产物的HPLC分析
注:A:细菌多糖(1:对照,2、3、4、5、6分别表示分离的细菌1、细菌2、细菌3、细菌4和细菌5的多糖层析斑点);B:真菌多糖(1:对照;2、3、4、5分别表示真菌1、真菌2、真菌3和真菌4)。
Note:A:polysaccharide of Bacteria (1:control;2,3,4,5,6 stands for TLC spot from bacterium 1,bacterium 2,bacterium 3,bacterium 4 and bacterium 5,respectively); B:polysaccharide of Fungi(1:control;2,3,4,5 stands for TLC spot from fungus 1,fungus 2,fungus 3 and fungus 4).
同降解菌株多糖分析,不同的是本次实验中流动相为60%甲醇和40%灭菌的双蒸水,流速为0.8 ml/min。
2 结果与分析
2.1 石油产区微生物的分离
通过涂布平板分离,利用牛肉膏培养基和马丁氏培养基分别筛选出细菌和真菌。通过革兰氏染色进行形态学观察,结果表明5株细菌均是革兰氏阳性的杆菌,4株真菌呈椭圆形。
2.2 石油产区分离菌株多糖的TLC分析
对培养的菌体细胞进行10% SDS裂解,其水解液用于TLC分析。结果表明,5株细菌所含的多糖与对照斑点(A1)不在同一个位置,因此初步推断5株细菌不含对照糖混合液中的葡萄糖、半乳糖和木糖。而且,细菌1和细菌2的斑点大小、颜色和位置相似,细菌3、细菌4和细菌5不相似(见图A)。真菌的TLC结果表明,4株真菌的层析斑菌与对照多糖混合液的层析斑不同,因此初步推断本研究分离到的4株真菌隶属不同的种属(见图1B)。通过TLC对分离的9个分离菌株进行多糖分析后初步得出结论:泽普油田分离样品中含有4株细菌(见图1A)和4株真菌。
2.3 石油产区分离菌株多糖的HPLC分析
经过HPLC分析,细菌和真菌的细胞水解液里均不含有葡萄糖、半乳糖和木糖,由此区别不了所有细菌和真菌种属的不同。
2.4 石油产区分离菌株的16/18S rRNA序列分析
16S rRNA序列分析结果表明,从油田分离得到的细菌1(B1)和细菌2(B2)的16S rRNA序列完全一致,与Bacillus cereus具有99%的相似度,在Bacillus分支上(见图2)。
从油田分离的细菌3(B3)、细菌4(B4)和细菌5(B5)的测序结果完全一致。以B4和B5构建进化树发现,其共处一个分支(见图3),与Enterobater sp.XW122(AY941837)具有99%的同源性。
4株真菌的测序结果表明,Y1和Y3、Y2和Y4的序列分别一致。以Y1和Y2构建进化树发现,真菌Y1(593bp)和Y2(594bp)菌株的18S rRNA的部分基因序列在同一个分支上(见图4),均与Penicillium aurantiogriseum strain DAOM 214787(JN938945)具有99%的同源性。
2.5 石油降解菌株的降解能力测定
2.5.1 溶血实验
溶血实验结果表明,本研究分离得到的细菌B2能够使鸡血的血细胞溶血。这初步表明B2菌株能降解石油。
2.5.2 排油圈检测
B2的排油圈实验结果表明,在直径为12 cm的培养皿上,排油圆圈直径约为5 cm。因此,排油圈的存在可以说明,B2的石油发酵培养基中含有石油降解菌株。
2.5.3 石油黏度测定
实验结果表明,在同一转子的前提下,含有原油的石油发酵培养基在转速小的时候体现不出黏度系数,随着转速的加大,黏度系数在减小。在相同转速和转子的条件下,接种有降解石油菌株的石油发酵培养液比原油的粘度小(见表2)。因此,含有原油的石油发酵培养基中存在降解菌株并且降解菌株对原油具有一定的降解能力。所以含有原油的石油发酵培养基的黏度系数比同一转速的原油要低。含有原油和不含原油的B2菌株石油发酵培养液在转速为12、30和60 r/min时,其读数不同。
2.5.4 分离菌株石油降解产物的紫外光谱检测
本研究对含有原油和不含原油的石油B2发酵培养液进行了紫外光谱的检测,结果表明,含有原油的发酵培养基在λ=280 nm处出现峰值(见图5)。不含原油的石油发酵培养基在λ=287 nm处也出现了峰值(见图6)。
因此,参考该实验的对照组(图7),紫外光谱实验结果表明,含有原油和不含原油发酵培养液存在降解菌株的降解行为,因为石油发酵培养基只有经过降解菌株一定程度的降解,方可检测到不饱和信号。
2.5.5 分离菌株石油降解产物的HPLC检测
通过HPLC,本研究选择以正丁醇、二甲苯、异戊醇、三氯甲烷和环己烷为对照组,用B2石油降解发酵培养液对石油降解菌株进行了降解能力的初步测定,以期验证该石油发酵培养液中是否含有这对照组中的物质。检测结果表明,石油发酵培养液在4～5 min中出峰,其响应面为4.099和4.474,而正丁醇、二甲苯、异戊醇、三氯甲烷和环己烷在3～4 min内出峰,其响应面分别为3.652、3.660、3.644、3.653和3.654。因此,初步推断,该石油发酵培养液的降解产物不含正丁醇、二甲苯、异戊醇、三氯甲烷和环己烷,但是出现的峰值初步可以推断B2菌株降解了石油。
3 讨论
基于物种多样性、生物多糖多样性的HPLC和TLC分析及16SrRNA序列分析,本研究初步得出泽普油田石油产区的微生物群落存在Bacillus和penicillium属的细菌和真菌。样品中的细菌和真菌具有低丰度。石油降解菌株的比例仅为1.1%。李玉瑛等[10]认为利用石油烃物质的土壤微生物并不多,但当土壤被石油污染后,部分在石油烃污染物的长期选择下,能够利用石油烃作为碳源和能源而大量生长。Atlas RM[5]曾报道,降解烃类的微生物所中比例不到微生物群落总数1%,而当有石油污染物存在时,降解烃类微生物比例增加到10%。微生物群落结构的分析表明,形态观察的方法因其粗略导致微生物群落的辛普森多样性指数偏低,序列分析的方法会使辛普森多样性指数比较稳定。而用TLC分析方法,因能够反映微生物的生理生化产物而更有多态性。
同时,本研究还通过紫外光谱和HPLC初步检测到了具有降解石油的B2菌株。目前,石油降解同其他污染物的降解一样,研究的热点在于分离降解性能强的菌株,通过分子技术构建工程菌株的尝试也在进行。除了研究其降解机制外,石油降解的研究还侧重于研究降解条件的优化,诸如降解菌对底物的优化以达到矿化作用,不同降解菌株的协同降解。关于微生物群落结构的分析有助于优化混合菌株研究,提高分解石油的效果。
4 结论
泽普油田石油产区微生物的群落结构具有一定丰度的细菌和真菌,在分离的菌株中,石油降解菌仅占1.1%。在不同转速下,原油和含有B2的原油发酵液黏度分别为2.07±0.33和0.67±0.20 mPa·s,在0.05水平上有显著性差异,参考排油圈检测等实验的结果,证明在分离菌株中细菌2(B2)对石油具有一定的降解能力。
摘要：目的:在研究泽普油田产区菌株多态性的基础上,对石油降解功能菌株进行探讨。方法:通过稀释平板涂布法分离微生物;采用TLC和HPLC方法对分离菌株进行多糖成分鉴定,并进行16S rRNA和18S rRNA序列分析;采用溶血圈实验、排油圈法、石油黏度测定等方法,测定石油降解菌株降解能力。结果:分离菌株中有5株细菌和4株真菌,且菌株多糖的TLC分析结果与形态学鉴定结果基本相同;5株分离细菌中,2株细菌隶属于Bacillus属,3株细菌隶属于Enterobacter。另外4株真菌被鉴定为隶属于Penicillium属;分离菌株B2能降解石油。结论:泽普油田石油产区微生物的群落中存在一定丰度的细菌和真菌,含有B2的原油发酵液黏度为0.67±0.20 mPa.s.和原油在0.05水平上有显著性差异。推断B2对石油具有一定的降解能力。
分离菌株 篇7
本研究旨在评价头孢喹诺对上海市养殖场临床分离菌株的体外抗菌作用, 为头孢喹诺的临床使用提供参考依据。从上海市养殖场分离并鉴定大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和链球菌各若干株, 采用微量肉汤稀释法测定头孢喹诺对各菌株的最小抑菌浓度 (MIC) 、最小杀菌浓度 (MBC) , 推算MIC50。和MIC90, 并绘制头孢喹诺对这4种细菌的杀菌动力学曲线。头孢喹诺对金黄色葡萄球菌、链球菌、沙门氏菌和大肠杆菌的MIC50分别为0.063、0.063、0.032、0.125微克/毫升, MIC90分别为0.125、0.125、0.125、0.25微克/毫升;在很小的浓度变化范围内头孢喹诺能够快速抑菌, 在抑菌浓度为1倍或2倍MIC时, 24小时内能杀灭金黄色葡萄球菌、大肠杆菌或链球菌、沙门氏菌。头孢喹诺对上述几种临床分离细菌具有很强的抑菌效果和杀菌活性。
分离菌株 篇8
目前已经在多种微生物中发现壳聚糖酶,但还没有关于Beta proteobacterium的报道。该菌种的发现扩大了产壳聚糖酶的菌株资源。我国还没有商品化的壳聚糖酶制剂,开发利用该酶的意义重大,开发该酶的工业生产菌株资源也就更加重要。作者对Beta proteobacterium sp.T1产壳聚糖酶进行分离纯化,为壳聚糖酶的纯化研究提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种
实验室保存的菌种Beta proteobacterium sp.T1。
1.1.2 试剂
壳聚糖(D.D=93.4%,大连鑫蝶公司);DNS试剂(实验室配制);DEAE Cellulos 52(Whatman公司产品);葡聚糖凝胶G-100(Sigma公司产品);考马斯亮蓝G250(上海化学试剂公司);丙烯酰氨(上海源聚生物科技有限公司);N,N-甲叉双丙烯酰氨(Fluka)。
1.1.3 仪器
BIO-RAD凝胶成像分析仪(美国伯乐公司);JY-600C电泳仪(北京君意);2100型&UV-2100型分光光度计(上海尤尼柯);GL-20G-Ⅱ冷冻离心机(上海安亭);PHS-3E型pH计(上海精密科学仪器厂);垂直板电泳槽(北京君意JY-SCZ2);恒流真空泵(上海HL-2);电脑记录仪(四川 3057);自动部分收集器(上海 BSZ-100);紫外检测仪(上海 HD-3);柱层析设备(上海)。
1.1.4 培养基
①菌种活化培养基:
KH2PO4 0.44%;Na2HPO4 0.2%;(NH4)2SO4 0.16%;NaNO3 0.2%;MgSO4·7H2O 0.1%;CaCl2 0.002%;KCl 0.3%;蛋白胨0.1%;酵母膏0.1%;葡萄糖0.5%;pH 6.0。
②最佳发酵产酶培养基:
KH2PO4 0.44%,Na2HPO4·12H2O 0.2%,NH4NO3 1.0%,MgSO4·7H2O 0.1%,CaCl2 0.002%,KCl 0.3%,酵母膏0.1%,葡萄糖1.0%,胶体壳聚糖1.0%,pH 6.0。
1.2 方法
1.2.1 壳聚糖酶活力测定
参照Imoto & Yagishita的方法并作适当改进,以每毫升发酵酶液每分钟生成的微摩尔还原糖数为1个酶活单位。
1.2.2 壳聚糖酶发酵液的制备
取活化好的菌液,按2%接种量(菌体密度达1.0×107个/mL左右)接入装有150mL最佳发酵产酶培养基的摇瓶(500mL)中,25℃、pH值6.0条件下摇床培养(140r/min)18h。发酵液5 000r/min冷冻离心30min,立即取出,小心倾出上清液,上清液中含有所需要的壳聚糖酶,检测上清液的酶活力。
1.2.3 壳聚糖酶的分离纯化
在4℃、磁力搅拌器作用下向发酵上清液中加入经研磨的固体(NH4)2SO4进行分级盐析,取20%~70%盐析沉淀物,经pH7.5、0.05mol/L Tris-HCl缓冲液透析。透析酶液经PEG20000浓缩,浓缩液上经pH7.5、0.05mol/L Tris-HCl缓冲液平衡的DEAE Cellulose 52阴离子交换柱(Φ1cm×19cm),然后用0.0~1.0mol/L的NaCl溶液(含0.05mol/L的Tris-HCl)进行梯度洗脱。流速控制在0.50mL/min。洗脱液经紫外检测并分部收集(5.0mL/管)。分别测定出峰部分试管的酶活力,将有活性的部分合并。酶活力部分经PEG20000浓缩,用pH5.6、0.05mol/L HAc-NaAc缓冲液平衡的Sephadex G-100凝胶柱(2cm×45cm)进一步纯化,洗脱流速为0.20mL/min,洗脱液经紫外检测并分部收集(5.0mL/管)。分别测定出峰部分试管的酶活力,将有活性的部分合并。
1.2.4 蛋白质含量测定
采用Bradford法[1],以牛血清蛋白质作标准蛋白。
1.2.5 SDS-PAGE分析
采用不连续垂直平板电泳系统,对不同纯化步骤的壳聚糖酶进行SDS-PAGE纯度分析[2]。
2 结果与分析
2.1 壳聚糖酶纯化结果
2.1.2 DEAE Cellulose 52柱层析
用0.0~1.0mol/L的NaCl溶液(含0.05mol/L的Tris-HCl)进行梯度洗脱,得到4个蛋白峰。对4个酶峰进行活性测定,结果见图1。
由图1可知,在0.05mol/L、pH7.5的Tris-HCl缓冲液条件下有部分蛋白质未与DEAD-52结合,直接用3~4倍柱体积的0.05mol/L、pH7.5的Tris-HCl缓冲液洗脱,形成第一个检测峰,检测此峰所对应的收集管无酶活力。在0~0.5 mol/L NaCl梯度洗脱时形成2个蛋白峰,其中一个有酶活力,收集此峰对应的收集管。还有一部分蛋白与DEAE Cellulose 52结合得比较牢固,因此用含1.0mol/L NaCl缓冲液直接洗脱层析柱,得到一个蛋白峰,同时使柱子再生。检测此部分洗脱下来的蛋白质没有酶活力。收集有酶活的峰相对应的收集管,经PEG20000浓缩后,进行下步操作。
壳聚糖粗酶液经DEAE Cellulose 52阴离子交换层析,大部分杂蛋白被除去,纯化了13.19倍,收率为66.58%。
2.1.3 SephadexG-100柱层析
以0.05mol/L、pH5.6的HAc-NaAc缓冲液洗脱,洗脱曲线中共有3个蛋白峰,对3个峰进行酶活力测定,结果见图2。
经酶活力检测发现3个蛋白峰中只有中间所对应的收集管有酶活力,前后两个小峰都没有酶活。收集有酶活力峰所对应的收集管,经PEG20000浓缩后进行下一步操作。
经SephadexG-100凝胶层析后纯化了26.32倍,收率为44.30%。
2.2 SDS-PAGE分析
采用SDS-PAGE方法测定纯化后壳聚糖酶的纯度及分子量,结果见图3。由图可见大部分杂蛋白是在DEAE Cellulose 52阴离子交换层析时除去的。经DEAE Cellulose 52、SephadexG-100两次层析纯化后的酶蛋白在电泳图上表现为单条带,即得到电泳纯壳聚糖酶,对应于标准蛋白Marker的迁移率求得该壳聚糖酶的分子量约为29.5kDa。
A.粗酶液;B.经DEAE Cellulose 52纯化后酶液;C.经SephadexG-100纯化后酶液;M.标准蛋白质(从上到下依次为:兔磷酸化酶B、牛血清白蛋白、兔肌动蛋白、牛碳酸酐酶、胰蛋白酶抑制剂)。
3 讨论
壳聚糖酶的纯化已有一套较成熟的技术,一般采用离子交换层析和凝胶过滤层析相结合的方法就可以得到电泳纯的酶蛋白。基于此,作者先后采用DEAD Cellulose 52阴离子交换层析和SephandexG-100凝胶过滤层析,得到了较纯的壳聚糖酶,经SDS-PAGE电泳呈单条带,分子量约29.5kDa。
在壳聚糖酶学性质方面,王钦宏等研究的假单胞菌ⅧT39壳聚糖酶分子量为51.3kDa;方祥年等报道球孢白僵菌Beauveria Bassiana 1316-V1壳聚糖酶分子量为36kDa。与之相比,Beta protebacerium sp.T1壳聚糖酶的分子量较低。葛正红等研究青霉菌Penicilium sp.壳聚糖酶分子量为30kDa;段杉等研究无花果沙雷氏菌Serratia ficaria壳聚糖酶分子量为29kDa,与Beta protebacerium sp.T1壳聚糖酶的分子量较为接近。广西大学孙菲等[3]已经在产壳聚糖酶菌株筛选的基础上对产酶条件进行优化及壳聚糖酶分离纯化;浙江工业大学邱乐泉等[4]用固定化法研究壳聚糖酶的理化性质。
参考文献
[1]汪家政,范明.蛋白质技术手册[M].北京:科学出版社,2001:42-47.
[2]郭尧君.蛋白质电泳实验技术[M].北京:科学出版社,2003:123-138.
[3]孙菲,陈山岭,李宜海,等.壳聚糖酶高产菌株的筛选、产酶条件的优化及壳聚糖酶的分离纯化[J].现代食品科技,2006,22(3):21-23.
分离菌株 篇9
自1972年日本学者Koki Horikoshi首次用嗜碱细菌制得碱性果胶酶以来[7], 至今已分离鉴定出几十种碱性果胶酶, 但其中能应用于工业化生产的不多, 仅Novo Nordisk公司在1999年研制出用基因工程菌生产的碱性果胶酶Bio-Prep, 以及于2003年推出的一种碱性果胶裂解酶ScourzymeL, 但高昂的生产成本限制了其广泛应用[8]。因此, 如何提高、提纯PGL的产量并降低生产成本是其开发应用的关键。本实验针对从土壤中分离得的一株相对酶活较高的菌株, 进行优化、提纯方面的研究, 为进一步应用于工业生产提供依据。
1. 材料和方法
1.1 菌种
枯草芽孢杆菌TCCC11286, 这是本实验中心菌种库的编号, 筛选编号为521
1.2 试剂
1.3 培养基
(1) LB培养基 (g/L) :蛋白胨20、酵母粉10、NaCl 20于121℃下灭菌20min
(2) 种子培养基 (g/L) :蔗糖20、蛋白胨10、玉米浆30、MgSO41、K2HPO418.4、KH2PO46、pH=7于121℃下灭菌20min
(3) 发酵液 (g/L) :乳糖20、蛋白胨3、CaCl23、果胶20、酵母膏3、MgCl20.2、pH=7.0~7.5于121℃下灭菌20min
(4) 筛选培养基 (g/L) :果胶5、酵母膏5、蛋白胨5、MgSO42、K2HPO41、琼脂20、pH=7.0~7.5于121℃下灭菌20min
(5) 斜面培养基 (g/L) :葡萄糖10、蛋白胨5、牛肉膏5、NaCl 5、琼脂条20、pH=7.0于121℃下灭菌20min
(6) 优化发酵培养基 (g/L) :果胶20、淀粉20、NH4NO315、MgCl20.2、MgSO42、CaCl23、K2HPO44、pH=8.0于121℃下灭菌0min
(7) 测生长曲线用无机盐种子培养基 (g/L) :蔗糖20、 (NH4) 2SO440、MgSO4·7H2O 0.2、K2HPO44、KH2PO40.3、pH=6.5~7.0于121℃下灭菌20min
(8) 测生长曲线用无机盐发酵培养基 (g/L) :蔗糖40、 (NH4) 2SO440、MgSO4·7H2O 0.4、K2HPO4-KH2PO40.05mol/L、FeSO40.2 pH=6.5~7.0于121℃下灭菌20min
1.4 筛选方法
1.4.1 富集培养
将从公园中采集到的月季、马兰、竹、美人蕉、菊、迎春、松的培养土分别称取5g土样溶于45ml去离子水中, 吸取5ml菌悬液加入到45ml (用250ml锥形瓶配制, 121℃灭菌20min) 的富集培养基中, 作摇床培养, 培养温度为37℃, 转速为100rpm, 培养24h。
1.4.2 初筛
将富集培养的样品稀释分离后涂布在筛选培养基中, 放入37℃倒置培养24h观察, 并在平板倒入少量 (1%) 十六烷基三甲溴化铵, 静置10min观察并测量菌落周围出现透明圈的直径 (d/cm) 和菌落直径 (d/cm) , 有透明圈者则为有果胶酶活性的菌株。将产果胶酶的菌种接种于斜面培养基贮藏于4℃下。
1.4.3 复筛
将初筛得到的51株菌接种到斜面, 37℃, 培养24h后, 接种到摇瓶进行一级发酵, 200r/min, 24h后对发酵液进行酶活测定。
1.5 培养方法
再挑取单菌落接入种子培养液中。 (种子培养液按25ml/250ml的量于锥形瓶中分装, 并单独灭菌) , 作摇床培养, 转速为200rpm, 在37℃下培养24h。然后种子液按8%的接菌量接入发酵培养基中, (发酵培养基按50ml/500ml的量分装于500ml的锥形瓶中, 并单独灭菌) , 作摇床培养, 转速为200rpm, 在37℃下培养24h后测酶活。
1.6 菌种鉴定
1.6.1 菌体形态特征
将菌种接种于平板LB培养基上, 培养24h后, 用双目生物显微镜在油镜下观察菌体形态。
1.6.2 菌落形态特征
将菌种接种于平板LB培养基上, 培养24h后, 按常规方法观察菌落形态。
1.6.3 生理生化鉴定
按照伯杰氏细菌鉴定手册方法进行
1.6.4 16SrDNA测序鉴定
这部分工作由天津科技大学生物工程学院菌种鉴定中心完成
1.7 碱性果胶酶酶活测定方法
取20μl发酵液稀释酶液加入到2ml含0.2%聚半乳糖醛酸的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液 (pH9.0) , 45℃反应15min, 用3ml0.03mol/L的磷酸溶液终止酶反应, 在235nm处测定其吸光值。
一个标准酶活单位 (1U) 定义为:每分钟使聚半乳糖醛酸裂解产生1μmol的不饱和聚半乳糖醛酸的酶量。不饱和聚半乳糖醛酸在235nm处的摩尔吸光系数为4600L/mol·cm[9].
1.8 酶液的分离纯化
1.8.1 果胶酶粗酶液的制备
分别挑一环521菌接种于2个250ml锥形瓶中, 每瓶分装25ml种子培养基 (灭菌) , 作37℃摇床培养, 200r/min, 培养24h后, 以8%的接菌量接入10个500ml锥形瓶中, 每瓶分装50ml优化发酵培养基中 (灭菌) , 作37℃摇床培养, 200r/min, 培养24h后, 于4000r/min, 4℃下离心10min, 取上清液。分别测定其酶活力和蛋白含量。
1.8.2 硫酸铵梯度盐析提纯
将以上酶液中酶活力在0.3~0.8μg/ml的锥形瓶中的酶液混合得310ml酶液。取70ml的酶液分装于7个250ml的锥形瓶中, 以如下的比例浓度加入硫酸铵沉淀过夜。
分别将7个瓶中的酶液在4000r/min, 4℃下离心10min, 分别收集上清液测酶活力及蛋白含量;将每个样的离心后的沉淀溶于等体积的PH9.0的甘氨酸-NaOH-CaCl2缓冲溶液中, 测定酶活力和蛋白含量, 并与相对应的酶液的酶活力作对照。取分离效果显著的浓度作为其余240ml酶液处理的最适浓度, 并分别测定上清与沉淀的酶活力与蛋白含量。
1.8.3 透析和浓缩
将上清液分装于透析袋中静置于去离子水中, 4℃下透析过夜, 然后, 取出透析袋, 在周围洒上分子量为20000的PEG, 静置于4℃下浓缩过夜。
1.8.4 Sephadex G-75柱层析
20×1000mm的玻璃柱装好Sephadex G-75萄聚糖凝胶, 先用0.02mol/L PH 8.0 NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液平衡, 上样, 以0.02mol/L pH 8.0 NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液洗脱, 流速30ml/h, 收集各组分, 用于酶活和蛋白含量测定
2. 结果和讨论
2.1 菌体形态特征
521枯草芽孢杆菌的形态特征:单个细胞0.7~0.8×2~3微米, 着色均匀。无荚膜, 无鞭毛。最适生长温度为37℃, 在保藏培养基上37℃培养10h后菌体呈杆状。产芽孢, 芽孢0.6~0.9×1.0~1.5 (μm) , 椭圆到柱状, 位于菌体中央或稍偏, 芽孢形成后菌体膨大。
2.2 菌落形态特征
菌株521的菌落呈不规则形, 由无色变淡粉红再时间长变为黑色, 腊状, 光滑, 不透明, 边缘较整齐。
2.3 16SrDNA测序鉴定
经16SrDNA测序鉴定521菌株为枯草芽孢杆菌
2.4 碱性果胶酶的一般酶学性质研究
2.4.1 生长曲线和产酶曲线
521菌株的纯无机盐发酵培养基发酵生长情况及产酶情况如下图3-2所示。可以看出, 521菌在5h~18h为对数生长期, 菌量生长快速。同时在11h~17h时开始大量产酶, 并在13h和17h出现两个明显的酶活峰, 以13h出现的酶活峰为最高。表明果胶酶出现在细胞代谢和生长旺盛时期, 与细胞生长增殖有关。因而加大菌体含量可大大提高酶活力。
2.4.2 碱性果胶酶的动力学曲线
酶反应动力学常数Km和Kcat可表达酶反应性质、反应条件和酶反应速度之间的关系。对于特定的反应、特定的反应条件来说, 米氏常数Km (Michaelis constant) 是一个特征常数, 米氏常数 (Michaelis constant) (Km) 它的意义如下:它的数值等于酶促反应达到其最大速度Vm一半时的底物浓度[S], 单位为mol/L。它可以表示酶和底物之间的亲和能力, Km值越大, 亲和能力越弱, 反之亦然。其中Km值最小的那个反应的底物就是酶的最适底物。Km是一种酶的特征常数, 只与酶的种类有关而与酶的浓度无关, 与底物的浓度也无关, 这一点与Vm是不同的, 因此, 我们可以通过Km值来鉴别酶的种类。但是它会随着反应条件 (T、pH) 的改变而改变。竞争性抑制剂米氏常数不变, 最大反应速度减小;反竞争性抑制剂米氏常数减小, 最大反应速度减小。
影响酶促动力学常数的主要有以下五点:底物浓度, 酶的量, pH值, 温度, 抑制剂和激活剂。
底物浓度:主要应由酶的Km值决定。当[S]>>Km, 反应成0级反应;当[S]<<Km, 反应成1级反应;当[S]在Km值附近时, 反应介于0级与1级反应之间。所以测Km值时, 底物浓度要适宜。当[S]>10Km, 速度达到理论最大反应速度的91%;当[S]过小时, 一是底物溶液的配制不好掌握, 二是反应速度太小;一般酶的Km值多在10-5~10-3mol/L, 所以[S]应在0.05~5mmol/L之间。而且随着[S]的增大, 反应速度也应逐渐增大。
酶的浓度:酶的浓度越大, 反应速度越快。酶的浓度太大, 会导致反应速度太快, 吸光度无法测量;酶的浓度太小, 又会导致反应速度太慢, 时间扫描时形成的时间-吸光度曲线趋于平缓, 效果不明显。所以, 酶浓度应控制在使反应在3~5min内到平衡的范围内, 一般在10-12~10-7mol/L之间。
图中的横轴截距为-Km, 纵轴截距为Km/Vmax, 斜率为1/Vmax, 求得
即当果胶酶的酶促反应速度达到最大速度的一半时 (0.127g/s) 时, 底物浓度为0.4123g/L。
2.4.3 pH对果胶酶酶活力的影响
2.4.3. 1 碱性果胶酶最适作用pH的确定
pH通过改变酶和底物分子解离状态影响反应速率, 酶催化活性最高时反应体系pH称为酶促反应的最适pH。如图2-4所示, 最适作用pH是8.0。
2.4.3. 2 碱性果胶酶的pH稳定性
从图2-5可以看出, 当酶液在不同pH缓冲液范围内耐受30min后, 碱性果胶酶在pH8.0~12均具有酶活性。在pH9.5时酶活达到最高, 最高耐受范围在pH12, 从图的整体趋势可以看出, 果胶酶中聚半乳糖醛酸裂解酶的碱性稳定范围在p H9.5~12。这种特性很适合工业生产中耐碱性的条件。
2.4.4 温度对碱性果胶酶酶活力的影响
2.4.4. 1 碱性果胶栈酶的最适作用温度
温度对果胶酶的酶促反应速率具有双重影响。当温度下降时, 酶活力也呈下降趋势, 当温度升高时酶活力又呈上升趋势, 但当温度太高时, 则由于酶蛋白的热变性而会使酶活降低, 所以, 酶促反应的最适温度就是这两种作用综合的结果, 即使酶促反应速率表现最快时反应体系的温度。如图2-6所示, 果胶酶的最适作用温度为45℃。
2.4.4. 2 果胶酶酶促反应的温度稳定性
如图2-7所示, 酶促反应在45℃作用30min时, 具有最大酶活, 随着温度的升高酶活呈下降的趋势, 在65℃还具有酶活性;
2.4.5 金属对碱性果胶酶酶活力的影响
将等体积的酶液与浓度为1mmol/L的Co2+、Cu2+、Mn2+、Fe3+、Fe2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、K+、Ba2+溶液混合, 充分作用30min, 然后测定酶活。以空白水为对照, 结果如表2-8所示, Ca2+和Cu2+具有明显的激活作用, Mg2+对酶促反应没有影响作用, 而Co2+、Mn2+、Fe3+、Fe2+、Zn2+、K+、Ba2+对酶具有抑制作用。
2.4.6 碳源种类对产酶的影响
碳源一菌体合成自身骨架的主要物质来源, 是影响菌体生长和代谢产物合成的关键因素。本实验以原始发酵培养基中乳糖、果胶、酵母膏为碳源作为对照, 分别取总碳摩尔数相同 (以10g/L的葡萄糖为基准) 的豆饼粉+玉米粉、乳糖、葡萄糖、糊精、淀粉、蔗糖、果胶、淀粉+果胶作为替换的碳源, 对照相对比活率。结果如图2-9, 521菌对于豆饼粉+玉米粉的利用率比较高, 酶活相对提高50%, 同时对淀粉+果胶的利用率也比较高, 酶活相对提高了44%。考虑到, 在实际工业生产中, 淀粉+果胶的水溶解度均比豆饼粉+玉米粉要好, 而且成本低, 因而成为优化培养基的首选。
2.4.7 氮源种类对产酶的影响
氮源是菌体合成自身蛋白和遗传物质的主要来源, 也是代谢产物中氮元素的来源之一。本实验以原始发酵培养基中以蛋白胨为氮源作为对照, 分别称取总氮摩尔数相同 (以10g/L为基准) 的酵母浸粉、尿素、硝酸铵、硫酸铵、硝酸钠作为替换的氮源, 对照相对比活率。结果如图2-10, 521菌对于硫酸铵的利用最好, 相对酶活提高了8%。说明521菌对于无机NH4+具有高利用率, 可以考虑在大规模发酵生产中使用富含铵根离子的物质。
通过不同离子、碳源、氮源对产酶的影响结果, 确定521菌的优化培养基为 (g/L) :果胶20、淀粉20、NH4NO315、MgCl20.2、MgSO42、CaCl23、K2HPO44、p H=8.0。在这个优化培养基条件下, 经过发酵, 以8%的接种量, 250ml三角瓶装25ml培养基, 在37℃, 200r/min回转式摇床上培养24h后测酶活达到28μ/ml, 比目前国内报道的最高酶活34U/ml略低, 但比原始酶活提高了30%。
2.5 酶的分离纯化
2.5.1 果胶酶粗酶液的制备、盐析
用优化培养基作为521菌的发酵培养基, 经发酵后获得的粗酶液首先用硫酸铵盐析。由于中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响, 一般在低盐浓度下随着盐浓度升高, 蛋白质的溶解度增加, 此谓盐溶;当盐浓度继续升高时, 蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出, 这种现象称盐析, 将大量盐加到蛋白质溶液中, 高浓度的盐离子 (如硫酸铵的SO42-和NH4+) 有很强的水化力, 可夺取蛋白质分子的水化层, 使之“失水”, 于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。在一般文献报道中, 大多分离纯化蛋白酶均使用50%~70%的硫酸铵, 本实验采用30%的硫酸铵盐析, 结果收集的上清液中, 提纯总收率达到了141。
2.5.2 Sephadex G-75柱层析
粗酶液在经过盐析、透析和浓缩后, 经过SephadexG-75柱层析, 进一步除盐, 并根据组分中蛋白分子量大小的不同, 依次洗脱, 从而分离蛋白组分。以时间为横坐标, 以收集的每管液体的酶活为纵坐标, 绘出其洗脱曲线如图2-11。
可以看出, 在洗脱曲线中, 在20min和100min处明显有两个酶活峰, 均具有聚半乳糖醛酸裂解酶。
最后酶液的分离提纯结果如下表2-1所示。
3. 结论
本研究从公园的不同花土中分离得到一株相对高产碱性果胶酶的产生菌并进行了鉴定, 鉴定为枯草芽孢杆菌, 编号为TCCCC11286。
菌株TCCCC11286所产碱性果胶酶的温度稳定性在45℃~60℃, 最适作用温度为45℃, PH稳定性为9.5~12, 最适作用PH为8.0, 这些耐高温和耐碱性的特点很适合在实际纺织工业中碱性环境下处理织物的特点, 因而具有很好的开发前景。
通过产酶条件的初步优化, 该菌株的产酶能力相对提高30%。从氮源和碳源的考察中可知, 菌株TCCCC11286对于铵根离子和淀粉的利用能力较强, 可以考虑在大规模发酵生产中使用廉价的富含铵根离子的化学物质和低成本的淀粉。
在菌株TCCCC11286所产碱性果胶酶的分离纯化中, 本实验采用了30%的硫酸铵盐析、SephadexG-75柱层析等方法, 由于酶液中含杂离子浓度小, 得到很好的纯化分离酶的效果。这种处理方式在实际生产中由于所需盐量少, 也节约了酶提纯的成本。本实验的方法为进一步开发工业用菌提供了很好的理论和数据依据。
摘要：从公园的花土中分离出一株相对高产碱性果胶酶的菌株, 经16srDNA鉴定为枯草芽孢杆菌, 命名为TCCCC11286。在初步的酶学性质研究中表明, 它耐高温耐碱, 最适作用温度为45℃, 到60℃仍有酶活, 最适作用pH为8.0。经过培养基的初步优化, 菌株TCCCC11286对于富含铵根离子的化学物质和淀粉具有很好的利用能力。本实验还对酶的分离纯化进行了初步研究。
关键词：枯草芽孢杆菌,优化,分离纯化
参考文献
[1]丁凤平, 张秀芝.碱性果胶酶PATE及其测定方法.中国生化药物杂志.1993.64 (2) :42～43
[2]周文龙等.酶在纺织中的应用.北京:中国纺织出版社, 2002.
[3]Hoondal GS, Tivari RP, Tewari R.Microbial akaline pectinases and their industrial applications a review.ApplMicrobiol Biotechno2002.
[4]FrediB, Marianne L, KarlH E.Enzym atec degumming of ram ie bast fibers.J Biothechnol.2000.76:43～50.
[5]JingZ, GunnarH, GunnarJ.Polygalacturonase is the key component in enzymatic retting of flax.J Biothechnol.2000.81:85～89.
[6]刘昌龄, 王秀玲.碱性果胶酶:成本有效、对环境有利的前处理的关键.印染译丛.2000 (4) :41～44
[7]JunweiC, WeihuaS, YongP.High-producers of polygalacturo-nase selected from mutants resistant to rifampin in alkalophilic.Bacillus sp.NTT33.Enzyme&Microbial Technol.2000.27:545～548.
[8]张健红, 李寅, 刘和.一株碱性果胶酶高产细菌的分离、系统发育分析和产酶条件的初步优化[J].应用与环境生物学报, 2005.11 (3) :354～358.
分离菌株 篇10
乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)是一类利用糖类发酵产生乳酸的无芽孢、革兰氏阳性细菌,已被FDA认证为公认安全(generally recognized as safe,GRAS)的食品添加剂[7],研究表明乳酸菌除了具有调节肠道平衡、抗肿瘤活性、控制内毒素和降低血清胆固醇等生理功能,同时也具有潜在的抗氧化能力[8,9]。目前关于抗氧化乳酸菌的筛选已有较多的报道,而从发酵特性角度出发筛选抗氧化乳酸菌的研究仍鲜见报道。该文以鱼类腌制品发酵剂的标准和过氧化氢耐受性作为初筛指标,再以抗脂质过氧化率、羟自由基清除率和还原力进行复筛,对乳酸菌的发酵上清液、菌体细胞液和无细胞提取物3个组分的抗氧化活性进行分析,以期筛选出符合腌干鱼发酵的抗氧化乳酸菌,为进一步控制腌干鱼制品过度脂质氧化,建立快速低盐发酵腌干鱼技术提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验菌株分离自台山市广海镇李贵记水产品加工厂腌干鱼的29株乳酸菌菌株,编号为L1~L29;MRS培养基、PCA培养基、营养肉汤和微量生化鉴定管购于广东环凯微生物科技有限公司;细菌基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司);抗坏血酸(VC)(美国Sigma公司);邻菲罗琳、过氧化氢(H2O2)、三氯乙酸(TCA)、PBS缓冲液、亚油酸、硫代巴比妥酸(TBA)、硫酸亚铁(Fe SO4)、铁氰化钾(K3[Fe(CN)6])、三氯化铁(Fe Cl3)等均为分析纯试剂。
1.2 主要仪器
Sunrise-basic TACAN吸光酶标仪(瑞士TECAN有限公司);UV-2550紫外分光光度计(日本岛津公司);VITEK-2全自动微生物鉴定系统(法国梅里埃生物公司);PCR仪(美国BIO-RAD公司);T25均质机(德国IKA公司);SHP-150生化培养箱(上海精宏设备有限公司);SA-900-1JZ超净工作台(上海稼丰有限公司);Sigma-3K30高速冷冻离心机(美国Sigma公司);HWS24恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司);PB-10精密p H测试仪(德国Sartorius公司)。
1.3 实验方法
1.3.1 腌干鱼发酵特性分析
将待测乳酸菌根据腌制品发酵剂的特性,参考文献[10]~[12],进行产硫化氢(H2S)、产H2O2、葡萄糖发酵产酸、葡萄糖发酵产气、产氨、产黏液、亚硝酸盐还原酶、明胶液化、耐6%和8%的盐实验,确定其是否符合腌制品发酵剂的特性。
1.3.2 样品的制备
参照文献[15]的方法,将活化三代的菌体培养物在4℃、6 000 r·min-1的条件下离心20 min,获得发酵上清液;将菌体沉淀用p H 7.4的PBS缓冲溶液洗涤,在4℃、6 000 r·min-1的条件下离心10 min,重复3次,再将菌体沉淀用PBS缓冲溶液重悬且调节浓度为1×109CFU·m L-1,获得菌体细胞液;取一半的菌体细胞液进行冰浴超声破碎10 min,在4℃、6 000 r·min-1下离心20 min,收集上清液获取胞内提取物。
1.3.3 乳酸菌对H2O2的耐受能力
将活化好的乳酸菌培养物在4℃、6 000 r·min-1的条件下离心20 min,用PBS缓冲溶液洗涤菌体2次后,再用PBS缓冲溶液重悬,调节菌体浓度为1×109CFU·m L-1,配制含H2O2体积分数为0、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%的PBS溶液,向PBS溶液中加入1 m L菌液,震荡1 min,再分别加入2mg过氧化氢酶降解剩余的H2O2。取菌液涂布于MRS固体培养基,在37℃下培养48 h,对其进行计数,做3次平行实验取其平均值[13,14]。
式中Ac为添加H2O2时计数结果;Ap为添加PBS缓冲液计数结果;A0为不加H2O2时计数结果。
1.3.4 抗脂质过氧化能力实验
参照文献[16]~[17]的方法,并略有改进为:取1 m L亚油酸乳化液加入1 m L的PBS缓冲液(p H 7.4)、1 m L FeSO4(1%),再加入0.5 m L样品,37℃水浴震荡40 min,向混合液中加入0.2 m L TCA(4%)和2 m L TBA(0.8%),沸水浴30 min后迅速冷却,在4℃、6 000 r·min-1的条件下离心10 min,取上清液于532 nm下测其吸光值A,以0.5 m L超纯水代替样品作为对照组测其吸光值Ac。并分别配制不同质量浓度(0~0.40 mg·m L-1)的VC溶液作为阳性对照,测其抗脂质过氧化率,将不同菌株组分的抗脂质过氧化率换算为VC当量。
式中A为样品的吸光度值;Ac为对照组的吸光度值。
1.3.5 清除羟自由基实验
参照文献[18]~[19]的方法,并分别配制不同质量浓度(0~0.40mg·m L-1)的VC溶液作为阳性对照,测其羟自由基清除率,将不同菌株组分的羟自由基清除率换算为VC当量。
1.3.6 还原力实验
参照文献[20]的方法,在0.5 m L的PBS缓冲液(p H 7.4)中加入0.5 m L样品和0.5 m L的1%铁氰化钾,50℃水浴震荡20min,在混合液中加入0.5 m L TCA(10%),于4℃、4 000 r·min-1离心10 min,取1 m L上清液加入1 m L超纯水和1 m L Fe Cl3,摇匀充分混合,静置10 min后,于700 nm下测其吸光度值。
1.3.7 菌株生长曲线测定
参照文献[12]的方法进行。
1.3.8 梅里埃VITEK-2微生物系统鉴定
将上述筛选的乳酸菌抗氧化发酵剂分别涂布于MRS平板,在37℃下培养24 h,用显微镜对其菌落形态进行观察。挑取纯化后的菌株,采用法国梅里埃VITEK-2全自动微生物鉴定系统进行鉴定,具体步骤严格按照系统说明进行。
1.3.9 16S r DNA序列测定与系统发育树建立
将优选后的菌株涂布于MRS培养基进行分离,在37℃下培养24 h,选用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株的DNA。使用细菌16S r DNA通用引物,其引物序列为(正向引物7F:5'-GAGTTT-GATCCTGGCTCAG-3';反向引物1525R:5'-AGAA-AGGAGGTGATCCAGCC-3'),对16S r DNA基因进行PCR扩增,将PCR的产物送至北京六合华大基因科技有限公司进行测序。将测序后获得的16S r DNA序列在NCBI的数据库进行BLAST分析,在Gen Bank获取相关的模式菌株后,使用Clustal X和MEGA 5.0软件采用邻位相连法构建细菌的16S r DNA基因系统发育树。
1.3.1 0 数据分析
数据用Microsoft Excel 2010统计处理并作图,利用SPSS 17.0软件分析差异显著性。
2 结果与分析
2.1 乳酸菌发酵特性分析
作为腌干鱼制品的发酵剂需同时满足耐盐,不产H2S、H2O2、黏液以及还原酶阴性等特性,该实验以腌干鱼制品发酵剂的要求为筛选标准,将分离自传统腌干鱼的29株乳酸菌进行发酵特性分析,其结果见表1。符合耐8%Na Cl、耐10℃和45℃;产H2S、产H2O2、产气、产黏液,硝酸盐还原酶、明胶液化实验均为阴性的乳酸菌有13株,分别是L1、L4、L7、L8、L11、L13、L15、L17、L18、L21、L21、L24、L25和L27,合格率为44.8%(13/29),因此选择这13株符合发酵剂标准的乳酸菌作为出发菌株,对其进行抗氧化活性的测定。
2.2 乳酸菌发酵剂抗氧化特性分析
2.2.1 对H2O2的耐受力
H2O2是一种强氧化剂,可直接造成机体的氧化损伤或者作为羟自由基的前体物质,因此通过比较H2O2的耐受能力强弱,可以衡量菌体的抗氧化活性高低。各实验菌株在不同浓度H2O2下的存活情况见图1。
当H2O2体积分数为0时,菌的成活率以100%计算。13株乳酸菌对H2O2的耐受性存在着明显的差异(图1)。H2O2体积分数为0.25%时,13株菌均表现出比较强的H2O2耐受能力,成活率为82.02%~94.83%。H2O2体积分数为0.50%时,13株菌成活率为35.87%~58.98%,其中成活率最高的是L11(58.98%)。H2O2体积分数为0.75%时,13株菌成活率为11.84%~37.91%,L25对H2O2耐受能力最强,共有7株菌在H2O2的体积分数为0.75%时成活率在30%以上,分别为L4、L8、L11、L13、L15、L21和L25。H2O2体积分数为1.0%时,菌株的生长明显受到抑制,有3株菌已经无法生长(成活率为0%),对H2O2耐受性最强的L11也仅为13.56%。实验结果表明,实验菌株的生长率随着H2O2水平的升高而逐步下降,并且菌株间对H2O2的耐受能力表现出一定的差异性。综合以上菌株对H2O2的耐受力,选取H2O2体积分数为0.75%时成活率在30%以上的7株菌作为复筛出发菌株。
注:ND表示未进行检测Note:ND means sample has not been detected.
2.2.2 抗脂质过氧化率
亚油酸不饱和体系容易受亚铁离子催化发生氧化反应生成丙二醛(MDA),MDA可与硫代巴比妥酸结合生成红色缩合物355-三甲基恶唑24-二酮,其在532 nm处有强吸收峰,其吸光度值越大表明物质抑制脂质氧化能力越弱[21,22]。
乳酸菌各组分均具有一定抗脂质过氧化能力,且发酵上清液组的抗脂质过氧化能力强于菌体细胞液和胞内提取物组(表2)。在菌体浓度为1×109CFU·m L-1时,各菌株发酵上清液的抗脂质过氧化率为5%~34%。其中L11发酵液的抗脂质过氧化能力最强(34.08±0.03)%,相当于VC质量浓度为(0.22±0.02)mg·m L-1,与其他菌株相比差异性显著(P<0.05)。菌体细胞液的抗脂质过氧化率为2%~7%,L21的抗脂质过氧化率最高(7.56±0.02)%,约相当于其发酵上清液的46%,与0.03 mg·m L-1的VC发挥同样的抗脂质过氧化作用。各菌株胞内提取物的抗脂质过氧化率为2%~13%,其中L4的抗脂质过氧化率最高(13.06±0.02)%,约相当于其发酵上清液的60%,与0.07 mg·m L-1的VC发挥同样的抗脂质过氧化作用。实验数据表明,乳酸菌L4和L11的抗脂质过氧化率相对较强,且乳酸菌中具有抗脂质过氧化能力的物质主要以胞外分泌物形式存在于发酵液中,使其发酵上清液中抗脂质过氧化率较高。
2.2.3 羟自由基清除率
羟自由基是一种氧化性很强的自由基,对蛋白质和脂质具有较强的氧化作用,·OH主要是由O2-、H2O2通过Fenton反应Fe2++H2O2→Fe3++·OH+OH-和Haber-Weiss反应O2-+H2O2→O2+OH-+·OH产生的[23]。此实验通过以邻菲罗琳作为氧化还原指示剂来评价抗氧化活性乳酸菌不同组分在Fenton体系中清除羟能力高低。
注:同一列右上角字母不同表示差异性显著(P<0.05);后表同此Note:Values with different letters at top right corner in the same column are significantly different(P<0.05);the same case in the following tables.
乳酸菌各组分对羟自由基均有一定的清除作用,发酵上清液组的羟自由基清除能力强于菌体细胞液和胞内提取物组,这与抗脂质过氧化率的结果是一致的,然而各组分对羟自由基的清除率与抗脂质过氧化率不成正比(表3)。在菌体浓度为1×109CFU·m L-1时,各菌株发酵上清液对羟自由基的清除率为10%~45%。其中对羟自由基清除能力最强的是L4(45.02±0.02)%,相当于(0.39±0.02)mg·m L-1VC,与其他菌株相比差异性显著(P<0.05)。L11对羟自由基清除能力也相对较高。菌体细胞液对羟自由基清除率为8%~34%,不同菌株对羟自由基清除率的差异较大(P<0.05),L4和L11均高于30%。胞内提取物对羟自由基清除率相对低于其他两个组分,L11的胞内提取物对羟清除能力相对较强,约相当于其发酵液的83%。实验数据表明,L4和L11的羟自由基清除能力优于其他菌株,具有更好的抗氧化活性。
2.2.4 还原力
有机物的还原电位与抗氧化活性成正相关,还原电位越高其潜在的抗氧化活性则越强。抗氧化物质在铁氰化钾反应体系中生成的普鲁士蓝在700 nm波长处有强烈吸收,可以用普鲁士蓝生成量来反映物质的还原能力高低[24]。
同种菌株不同组分间的还原力差距非常大(P<0.05),其中发酵上清液的还原力远高于菌体细胞液和胞内提取物,菌体细胞液的还原力略高于胞内提取物(图2)。在菌体浓度为1×109CFU·m L-1时,L4和L21的发酵上清液组在700 nm处的吸光度值均高于1.3,还原力比较强。菌体细胞液和胞内提取物的还原力相对发酵上清液弱很多,L21的菌体细胞液还原力最强(0.324)。L21的抗脂质过氧化率和羟自由基清除能力虽然低于L4和L11,但其还原力均高于两者。菌株胞内提取物还原力最强的L11仅是其发酵上清液的10.82%。实验数据表明,L4和L21在700 nm处的还原力相对较高,具有较强的潜在抗氧化活性。
综合抗脂质过氧化率、羟自由基和还原力等体外抗氧化指标发现乳酸菌L4、L11和L21具有优良的抗氧化活性,可作为潜在的抗氧化发酵剂。
同一组上角字母不同表示差异性显著(P<0.05)Values with different letters at top corner in the same group are significantly different(P<0.05).
2.3 抗氧化发酵菌株24 h生长曲线
将上述筛选到的3株抗氧化菌株进行液体培养,监测其在24 h间的生长情况,结果见图3。抗氧化菌株L4、L11和L21生长趋势相似,培养8 h后3株菌的OD650均明显升高,进入对数生长期。在培养16 h后OD650达到较高水平,进入生长稳定期。在整个生长过程中,抗氧化乳酸菌L21的生长速度略高于其他2株乳酸菌,其OD650明显高于其他2株菌。
2.4 菌种的鉴定
2.4.1 VITEK-2微生物系统鉴定结果
法国梅里埃VITEK-2微生物鉴定系统是利用多波长色谱和借助微生物信息编码技术,将纯化完毕的菌株通过真空填充到特定的鉴定卡片,对菌株进行各种生理生化代谢反应,在菌库进行聚类分析,与已知的参比菌种数据库进行对比获取待测菌株的类型。该方法与根据《伯杰氏细菌鉴定手册》进行鉴定的方法相比,其操作简便、耗时短、可靠性高。该研究通过VITEK-2微生物鉴定系统对优良抗氧化菌株L4、L11和L21进行鉴定,结果表明L4可能为Pediococcus pentosaceus(戊糖片球菌),其匹配度为93%;L21为Lactobacillus paracasei(类干酪乳杆菌),其匹配度为95%;而L11的相似匹配度较低仅有68%,可能为Lactococcus lactis ssp.lactis乳酸乳球菌乳酸亚种(表4),因此还需要借助16S r D-NA分析对其进一步鉴定。
2.4.2 16S r DNA分析及系统发育树的构建
对优良抗氧化菌株L4、L11和L21的基因组进行DNA提取,用琼脂糖凝胶对16S r DNA PCR扩增产物进行电泳(图4),3株菌的分子量均在750 bp左右,符合预期的结果。将纯的PCR产物送至华大基因公司进行测序,测序结果在NCBI的数据库和Clustal X进行BLAST同源性分析,并利用MEGA5.0软件采用邻位相连法(neighbor-joining)构建优良抗氧化菌株的16S r DNA基因系统发育树(图5),可以看出L4与P.pentosaceus(KF048926.1)的同源性为98%,L11与L.plantarum(DI352769.1)的同源性为91%,戊糖片球菌和植物乳杆菌之间的亲缘关系非常近,其16S rRNA基因序列具有高度相似性,参照《常见细菌系统鉴定手册》,对L4和L11进行鼠李糖发酵产酸实验,结果发现L4呈阳性而L11呈阴性,因此可确认L4为P.pentosaceus(戊糖片球菌),L11为L.plantarum(植物乳杆菌)。L21与L.casei(干酪乳杆菌,EU715321.1)的同源性为92%,可确认L21为L.casei。
3 讨论
中国是最早利用乳酸菌发酵食品的国家之一,拥有丰富的乳酸菌菌种资源,这为筛选乳酸菌作为天然抗氧化剂提供了良好的条件[9]。乳酸菌具有体内缓解氧化应激能力和体外抗氧化性能,其本质是清除各种活性氧和自由基,抑制蛋白质和脂类氧化。目前国内外关于抗氧化乳酸菌的筛选已有较多的报道,但从发酵特性角度出发,筛选出既符合腌制品发酵要求又具有抗氧化活性乳酸菌的研究仍较少见。RAFFAELLA等[25]报道了植物乳杆菌(L.plantarum FP3)发酵樱桃茎的提取液的抗氧化活性,结果表明L.plantarum FP3的抗脂质过氧化率和对DPPH·(11-二苯基-2-苦肼基自由基)的清除率分别为33.20%和52.10%,证明该菌具有较高的抗氧化能力;日本有学者从鲫鱼寿司分离筛选出4株植物乳杆菌和1株肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides),经过体外实验测定,乳酸菌7FM10和1RM3呈现出优良的抗氧化活性,经过这2株菌发酵后的豆奶和果汁对超氧自由基清除能力明显提高[26];研究6株分离自江苏如皋长寿村人群肠道的乳酸菌时发现,6株菌不同组分均有抗氧化活性,其中发酵乳杆菌L2、L4和屎肠球菌E2对1.0 mmol·L-1H2O2耐受能力较强[16]。文章采用鱼类腌制品发酵剂的标准和H2O2耐受性作为初筛指标,再以抗脂质过氧化率、羟自由基清除率和还原力进行复筛,对乳酸菌的发酵上清液、菌体细胞液和无细胞提取物3个组分的抗氧化活性进行分析,获得的戊糖片球菌L4、植物乳杆菌L11和干酪乳杆菌L21不仅符合鱼类腌制品发酵剂的标准而且具有优良的抗氧化活性,可将其作为抗氧化发酵菌株应用于腌干鱼生产中。
基于食品抗氧化活性研究已成为科研工作者新兴的研究热点,但中国对乳酸菌的抗氧化活性研究起步较晚,关于乳酸菌抗氧化作用机制和借助生物技术筛选出具有高抗氧化活性的乳酸菌有待进一步研究。现存关于乳酸菌抗氧化机制有:1)菌体含有SOD酶、NADH酶和CAT酶等抗氧化酶具有协同作用,能够消除自由基对细胞的氧化攻击作用[27,28];2)具有还原活性,其谷胱甘肽系统、硫氧还蛋白系统和“NADH氧化酶/NADH过氧化酶”系统发挥着重要的抗氧化作用[29];3)乳酸菌在人体内的抗氧化作用主要是通过调节肠道菌群组成,抑制体内的血液内毒素水平升高,从而起到缓解体内氧化应激的作用[30]。该研究通过体内抗氧化活性实验筛选出3株具有较强抗氧化活性的乳酸菌,在接下来的研究工作中将会结合细胞模型和体内实验对其抗氧化机制做更深次的探究,以期为乳酸菌抗氧化功能的开发和应用提供理论基础。
4 结论