产纤维素菌株（精选8篇）
产纤维素菌株 篇1
0 引言
细菌纤维素(bacterial cellulose,BC)作为一种新型生物材料,是由微生物合成,具有优于天然纤维的独特性能,其应用范围涉及了食品、造纸和医药等领域[1,2,3,4,5]。但是与植物纤维的大规模生产相比,细菌纤维素的生物研发存在产量低、成本昂贵的问题。针对这一问题,朱艳彬等[6]开发出低成本的培养基碳源——甲醇,将筛选出的纤维素产生菌驯化后接入甲醇废水中,得出其生长的营养因素为:蛋白胨和酵母膏为5g/L时,纤维素产量达到最高3.68g/L。齐香君[7]及邵伟[8]等对纤维素产生菌进行了发酵动力学研究,提出了发酵过程中菌体生长、纤维素合成、基质消耗的动力学模型,得出该模型与实验数据很好地拟合。本文采用人工模拟甲醇废水培养基,模拟甲醇废水产细菌纤维素的发酵工艺,研究木醋杆菌在静态培养条件下的动力学特性,确定菌体生长、细菌纤维素合成、底物消耗的动力学参数,得到动力学方程。该模型方程的建立,为实现甲醇产细菌纤维素静态发酵过程的优化提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus,编号1.1812)属于醋杆菌属(Acetobacter),购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
1.1.2 试剂
无水甲醇、葡萄糖、酵母粉、碳酸钙、琼脂、氢氧化钠、盐酸、3,5-二硝基水杨酸购自国药集团化学试剂有限公司,均为分析纯;纤维素酶R-10购自北京鼎国生物技术有限责任公司,为日本进口分装。
1.1.3 仪器
pH计(FE20,梅特勒-托利多);立式压力蒸汽灭菌器(YXQ-LS-30SII,上海博迅实业有限公司);空气浴振荡器(TH2-071HT,上海申能博彩生物科技有限公司);生化培养箱(LRH-150,上海一恒科技有限公司);气相色谱-质谱联用仪(QP-2010,日本Shimadzu)等。
1.1.4 培养基
基础培养基(即种子培养基)(g/L):葡萄糖100,酵母粉10,碳酸钙20。p H调节至6.8,115℃灭菌30min。
甲醇模拟废水培养基1#(g/L):甲醇2.7%(V/V),葡萄糖80,酵母粉10,碳酸钙20。pH调节至6.8,115℃灭菌30min,在培养基其他成分灭菌、冷却至60℃以下时,无菌操作加入甲醇。
甲醇模拟废水培养基2#(g/L):甲醇4.5(V/V),葡萄糖67,酵母粉10,碳酸钙20。pH调节至6.8,115℃灭菌30min,在培养基其他成分灭菌、冷却至60℃以下时,无菌操作加入甲醇。
1.2 方法
1.2.1 接种方法
于斜面上挑取一环菌,接入装有250m L种子培养基的500m L三角瓶中,30℃、160r/min培养4d,制成一级种子液。将一级种子液按10%的接种量接入装有250m L种子培养基的500m L三角瓶中,30℃、160r/min培养3d,制成二级种子液,作为接种液。
1.2.2 培养方法
将接种液按10%的接种量接入装有100m L甲醇模拟废水培养基的250m L三角瓶中,并以基础培养基作对照,30℃静置培养。
1.2.3 分析方法
1.2.3.1 pH值测定:采用pH值测定法。
1.2.3.2 菌浓测定:将发酵液加入0.2%纤维素酶溶液中,置于50℃水浴中水解24h后测定为总菌菌浓[8]。采用比浊法测OD600值作为菌浓。
1.2.3.3 残糖测定:采用3,5-二硝基水杨酸比色法[10]。
1.2.3.4 甲醇测定:采用顶空气相色谱法[11]。
1.2.3.5 细菌纤维素的提纯及产量测定
取发酵液于5 000r/min离心机中离心10min,弃去上清液并收集沉淀物质,去离子水清洗2遍,置于1%氢氧化钠溶液中煮沸1h;再用10%盐酸中和,于8 000r/min离心机中离心10min,弃去上清液后加入去离子水反复清洗至中性;得到沉淀物质经真空冷冻干燥16h后称重。
2 结果与分析
2.1 生长曲线与发酵过程分析
木醋杆菌在基础培养基及甲醇模拟废水培养基中发酵产细菌纤维素的曲线如图1所示。从图1中可以看出,周期为13d中发酵液p H、菌浓、残糖浓度、甲醇浓度、纤维素产量随发酵时间的变化。
图1为木醋杆菌发酵产细菌纤维素的曲线。由p H变化曲线可以得出,菌体繁殖阶段p H急剧下降,这是因为木醋杆菌将发酵液中的部分葡萄糖氧化为葡萄糖酸及其他酸性物质,这在Jung Wook Hwang等[12]的文献中也有相关报道。当基础发酵液p H下降到4.0时,菌浓不再明显变化,可能是发酵液酸度过低对菌体生长产生了抑制作用;甲醇模拟废水发酵液p H值在第7d以后下降较缓,稳定在5.0左右,此时残糖浓度也开始下降缓慢,可能是葡萄糖氧化能力降低,导致葡萄糖酮酸类物质变少[13]。Abdullah Eryavuzl等[14]和Emel Tamahkara等[15]利用不同的纤维素产生菌发酵,发现p H值为4~6时纤维素产量最高,从而推测甲醇模拟废水培养基可能更有利于木醋杆菌发酵产纤维素。
培养基中纤维素产量变化趋势与菌浓变化趋势类似,同时菌体生长曲线与耗糖曲线成对应关系,并且甲醇模拟废水发酵液中菌体生长曲线还与甲醇降解曲线成对应关系。由此得出,纤维素合成与细菌生长呈正相关,细菌纤维素的合成属于生长偶联型。
2.2 菌体生长动力学模型
选用Verhulst在1983年提出的Logistic方程[16]来描述菌体的生长动力学过程:
式中:X-总菌菌浓,用OD600表示;t-发酵时间,d;μ-比增长速率。
根据试验数据,采用最小二乘法拟合得μ基础=0.1790,μ1#=0.2467,μ2#=0.3263;(X0)基础=0.063,(X0)1#=0.051,(X0)2#=0.045。将模型参数带入(2)得3种培养基发酵过程的菌体生长动力学模型分别为:
根据上式将模型计算值与试验数据点作图进行比较,如图2所示。
注:0#—基础培养基;1#—甲醇模拟废水培养基1#;2#—甲醇模拟废水培养基2#。Remark:0#—Base culture medium;1#—Methanol wastewater simulated culture medium 1#;2#—Methanol wastewater simulated culture medium 2#.
基础培养基得到的菌体生长动力学模型模拟值与试验值拟合最好,拟合误差为3.23%;其次是甲醇模拟废水培养基1#,误差为6.73%;甲醇模拟废水培养基2#误差为8.77%。
2.3 产物合成动力学模型
由细菌纤维素产量曲线的变化趋势,发现细菌纤维素的合成在生长期和稳定期都在进行。生长过程既有细菌纤维素产生也有菌体生长,在一定时期内木醋杆菌不进行繁殖,但发酵过程继续进行,因此发酵过程属于部分生长偶联型,采用Luedeking-Piret方程[16]:
式中:P-细菌纤维素产量,%(质量分数);m1-非生长相关产物形成参数;m2-生长相关产物形成参数。
积分得:
将模型参数带入(4)得3种培养基发酵过程的产物合成动力学模型分别为:
根据上式将模型计算值与试验数据点作图进行比较,如图3所示。
注:0#—基础培养基;1#—甲醇模拟废水培养基1#;2#—甲醇模拟废水培养基2#。Remark:0#—Base culture medium;1#—Methanol wastewater simulated culture medium 1#;2#—Methanol wastewater simulated culture medium2#.
产物合成动力学模型得到的静态发酵过程模拟值与大多数试验值都能很好的拟合。基础培养基拟合最好,拟合误差为10.9%;其次是甲醇模拟废水培养基2#,误差为13.9%;甲醇模拟废水培养基1#在0d~4d拟合较差,总体平均误差为28.3%。
2.4 底物消耗动力学模型
根据物料平衡,发酵过程中的底物消耗主要用于菌体生长、产物合成及细胞代谢三部分。基础培养基中的底物只有葡萄糖,而甲醇模拟废水培养基底物包括葡萄糖和甲醇两种物质,因此将底物浓度转换成含碳量,采用与L-P方程类似的底物消耗动力学方程:
式中:YX-菌体对底物得率;YP-产物对底物得率;KeX-细胞代谢所消耗底物质量分数。
积分得:
将模型参数带入(6)得3种培养基发酵过程的底物消耗动力学模型分别为:
根据上式将模型计算值与试验数据点作图进行比较,如图4所示。
注:0#—基础培养基;1#—甲醇模拟废水培养基1#;2#—甲醇模拟废水培养基2#。Remark:0#—Base culture medium;1#—Methanol wastewater simulated culture medium 1#;2#—Methanol wastewater simulated culture medium2#.
底物消耗动力学模型得到的静态发酵过程模拟值与大多数试验值都能很好地拟合。甲醇模拟废水培养基2#拟合最好,拟合误差为13.9%;其次是甲醇模拟废水发酵液1#,误差为24.9%;基础培养基拟合较差,误差为26.7%。
3 讨论
为了降低纤维素生产成本,Akihiro Kurosumi等[17]将各类果汁废液作为碳源,制备出细菌纤维素。而对于利用甲醇产细菌纤维素的应用研究少有报道,邵伟等[18]将巴氏醋酸杆菌接入甲醇废水,能够制备细菌纤维素;提出了在蔗糖培养基中醋酸杆菌的动力学模型,模拟值与实验值平均拟合误差为3%。与之相比,本实验利用甲醇模拟废水培养基得到的动力学模型模拟值与实验值的平均拟合误差为16%,利用基础培养基平均拟合误差为14%。为实现甲醇产纤维素发酵过程的优化,需进一步改进发酵参数和实验方法,利用甲醇废水为原料继续探索,为大规模工业生产提供依据。
产纤维素菌株 篇2
摘要：从大庆油田油水采出液中经富集培养、划线分离、溶血圈测定和苯酚硫酸检测等方法筛选出一株产表面活性剂的菌株QS—M2，经生理生化分析和16S rDNA分子生物学鉴定，确定菌株Qs·M2为铜绿假单胞菌，提取其代谢产物经薄层层析和HPLc—Ms鉴定表明：主要的表面活性剂物质是鼠李糖脂类物质，其中单鼠李糖脂的主要组分为RhaC10、RhaC12：C12双鼠李糖脂的主要组分为Rha2C14CC12、Rha2C10C12和Rha2C10C10，该菌株产生的鼠李糖脂可将上清液的界面张力由72.0mN/m降至36.9mN/m，且鼠李糖脂的乳化性能较好，在72 h内乳化性能稳定，结果表明，鼠李糖脂类表面活性剂物质是Qs-M2菌株在微生物提高原油采收率过程中发挥作用的主要因素，
关键词：生物表面活性剂；菌株筛选；界面张力；乳化性能；鼠李糖脂
DoI：10.15938/j.jhust.2016.04.012
中图分类号：TQ920.6
文献标志码：A
文章编号：1007-2683（2016）04-0065-05
0引言生物表面活性剂是由微生物产生的一类严格集亲水基团和疏水基团于一体的具有表面活性的化学物质与化学表面活性剂相比，生物表面活性剂除具有润湿、乳化、分散、洗涤、起泡、增溶等功能外，还具有低毒性、可降解性和环境友好性、高效性等性能，在石油、环境保护、食品和医药、化妆品、洗化用品等诸多领域具有广泛的应用前景大量研究已经证明，利用微生物产生的生物表面活性剂能够有效的提高原油采收率其主要作用机理是降低油水界面张力，乳化原油，形成水包油的乳化液，提高岩石的亲水性能，然而，在一般的生产过程中，由于生物表面活性剂产量低、生产成本高、纯化工艺复杂，所以目前生物表面活性剂没有大规模的生产采用原油为唯一碳源筛选产生物表面活性剂的微生物菌株，经过驯化得到高效产生物表面活性剂的菌株，不仅降低生产成本而且适应油田环境，可以产生更好的驱油效果。
产生物表面活性剂的微生物主要是细菌和酵母菌，微生物代谢的目前最有效的生物表面活性剂是鼠李糖脂类，其产生菌多为假单胞菌属，假单胞菌属产生的鼠李糖脂的亲水基团一般由1-2分子的鼠李糖构成，疏水基团则由1-2分子具有不同碳链长度的脂肪酸构成，在生物合成过程中，这些基团之间可能相互链接而生成多种化学结构相近的同系物，鼠李糖脂组分的鉴定是阐述鼠李糖脂采油性能的前提和基础，而糖脂类物质的成分鉴定方法则从简易的利用鼠李糖脂水解后测定鼠李糖的色度逐渐发展为利用高效液相色谱一质谱联用、核磁共振等分析样品组成的复杂方法Mata-Sandoval等则利用高效液相色谱法分析得到了由铜绿假单胞菌UG2所产生的鼠李糖脂的主要组成为RhC10Rh2C10C12H2、RH2C10C12和Rh2C10C10，目前，高效液相色谱一质谱联用被认为是目前对鼠李糖脂组分研究最精确的方法之一，
本研究从大庆油田油藏采出液中筛选出一株高产糖脂类生物表面活性剂的菌株QS-M2，对QS-M2菌株进行生理生化分析和分子生物学鉴定；利用薄层层析实验和HPLC，MS方法对提纯的鼠李糖脂组分进行了鉴定和表征；同时，通过对糖脂类物质产量、界面张力、乳化性能等指标的测定，分析了筛选菌株的采油潜力。
1.材料和方法
1.1样品来源
样品来自于大庆油田采油三厂油藏采出液，
1.2培养基
LB液体培养基（g/L）：蛋白胨1%，酵母粉0，5%，NaCI1%，pH 7.0.LB固体培养基（g/L）：LB液体培养基基础上加1.5%琼脂粉，制成平板，石油液体培养基（g/L）：原油5%，NaCl0.21%，NH4cl0.07%，N%HPO412%，KH2PO40.07%，酵母粉0.6%，MgSOC40.5%，pH7.0，血平板培养基：购自北京奥博星生物技术有限责任公司。
1.3菌株的筛选和鉴定
1.3.1菌种富集、分离纯化
菌种富集、分离纯化参照文将100 mL石油液体培养基加入250 mL锥形瓶中，121℃灭菌20min，样品接种量为3%，37°C150 rpm培养48 h至培养基浑浊，采用平板划线法进行菌种的分离纯化，将所鉴定的纯菌划线至斜面，37℃培养1 d，4～C保存备用。
1.3.2产糖脂类菌株的筛选
1）产生物表面活性剂菌株的初筛，挑取单菌落接人5mL LB液体培养基，37°C150 rpm培养24h取1mL菌液4°C 12000 rpm离心除菌后，取上清10UL滴在血平板上，37°C培养24 h，观察透明溶血圈的出现筛选产表面活性剂的菌种。
2）苯酚硫酸法筛选产糖脂类菌株，发酵上清液加人0，5 mL 6%苯酚溶液，混匀，加入2，5 mL浓硫酸，混匀，沸水浴10 min，分光光度计490 nm处测定吸光度值，糖脂定性检测中，在490 nm处吸光值显著高于对照组，可确定为产糖脂菌种，
1.3.3产糖脂类菌株的鉴定
1）菌株生理生化分析，菌株的生理生化分析参照文，主要进行了革兰氏染色、淀粉水解、糖发酵、吲哚试验、VP试验、柠檬酸试验、明胶水解试验等。
2）菌株的分子生物学鉴定，菌株的分子生物学鉴定参照文
1.4糖脂类表面活性剂特性研究1，4，1糖脂类表面活性剂的组分鉴定
1）薄层层析实验，薄层层析实验参照文，
2）HPLC—MS鉴定，采用高效液相色谱一质谱联用法对纯化组分进行鉴定，单糖脂和二糖脂主要成分的物质的量百分比由各成分出峰面积的比例近似计算得到。
1.4.2糖脂类表面活性剂的性能检测
糖脂类表面活性剂的提取参照文，对提取的糖脂类表面活性剂进行界面张力、乳化性能和排油圈性能测定，
1）界面张力测定，使用界面张力仪检测上清界面张力，对照组为蒸馏水，
2）乳化性能测定，在20mL乳化管中中依次加入5mL不同浓度的表面活性剂溶液和5mL二甲苯。超声处理3min，静置，分别于Oh、24h、48h、72h观察并记录乳化相体积及变化，
3）排油性能测定，将0，5g苏丹红Ⅲ溶解于100mL液体石蜡中，搅拌均匀后，过滤除去不溶物及杂质，在90 mm平皿中加入30mL蒸馏水，滴加1mL苏丹红Ⅲ染色后的液体石蜡，待液体石蜡散开在水面上铺开形成一层均匀的薄膜后，在石蜡中心处缓慢滴加10txL上清液，观察排油圈直径并记录，
2.结果与讨论
2.1产糖脂类表面活性剂菌株的筛选结果
经富集培养、平板划线分离后，从大庆油田采油三厂油藏采出液中初步筛选出18株微生物菌株，对初筛的21株微生物菌株进行溶血圈检测，如图1所示，共得到14株产生物表面活性剂的微生物菌株，为了进一步筛选产糖脂类表面活性剂的菌株，进行了苯酚硫酸实验，发酵上清液经过在490 nm处吸光值显著高于对照组的菌株，可确定为产糖脂菌种，经过筛选共得到7株产糖脂类菌株，对7株产糖脂类菌株进行液体发酵7 d后，对提取的糖脂类粗品进行称重，其中菌株QS-M2的粗品产量最高，达到了0.725g/L后续实验中用到的菌株均为QS-M2菌株，
2.2产糖脂类菌株的鉴定结果
2.2.1QS-M2菌株的形态及生理生化特征
Qs—M2菌株形态学观察结果和生理生化特征如表l、2所示，QS-M2菌落圆形、表面光滑、浅绿色、边缘整齐、短杆状、菌落中心向上凸起、菌落不透明，QS-M2菌株属于革兰氏阴性菌，VP试验、柠檬酸盐试验、明胶水解试验为阳性，淀粉水解试验、吲哚试验、甲基红试验、硫化氢试验为阴性，
2.2.2 QS-M2菌株的分子生物学鉴定
QS-M2菌株的16S rDNA基因经克隆测序拼接后，在NCBI数据库中进行blast比对，如表3所示，16S rDNA序列分析的结果显示，该菌株为铜绿假单胞杆菌，
2.3QS-M2菌株产生的表面活性剂类型分析和组
分鉴定
2.3.1
薄层层析实验对表面活性剂的定性分析
如图2所示，以鼠李糖作为标准品（左侧），用薄层层析实验对QS-M2菌株产生的糖脂类表面活性剂进行定性分析，结果显示，与对照相似，QS-M2菌株产生的糖脂类表面活性剂显色为黄绿色，表明QS-M2菌株产生的糖脂类表面活性剂为鼠李糖脂，
2.4 QS-M2菌株产生的鼠李糖脂的性能测定
界面张力、排油圈性能和乳化性能是生物表面活性剂性能测定的重要指标_1引，如表4所示，界面张力随着鼠李糖脂浓度的增大逐渐降低并且稳定，最终界面张力由72.0mN/m降低至36.9mN/m，下降了35.1mN/m，排油圈直径随着表面活性剂浓度增大而增加，排油能力增强，
乳化指数是静置24h后乳化体积与总体积的百分比，乳化指数越高说明乳化效果越好，且乳化性能稳定，由表5可以得出，乳化层的体积并非随着表面活性剂浓度的增大而增大，而是达到了一定体积后，随着浓度的增加，乳化层体积下降，与50%吐温20溶液相比，乳化稳定性极高，长达72 h的测量时间里，乳化层体积几乎稳定不变，说明鼠李糖脂的乳化性能较高，并且乳化的稳定性能极好，
3.结论
1）从大庆油田油藏产出水样中经过富集培养、划线分离、溶血圈测定和苯酚硫酸检测等方法筛选出一株产表面活性剂的菌株QS-M2，其发酵产生的糖脂产量为0，225g/L
2）QS-M2菌株经形态学观察、生理生化分析和分子生物学鉴定，该菌株为铜绿假单胞菌（Pseudo，monas aeruginosa）。
3）QS-M2菌株产生的表面活性剂经薄层层析和HPLC-MS鉴定，主要的表面活性剂物质是鼠李糖脂，其中单鼠李糖脂的主要组分为RhaC10C10、RhaC12C12双鼠李糖脂的主要组分为Rha2C14C12、Rha2C10C12和Rha2C10C10。
产丝素蛋白酶菌株发酵条件的优化 篇3
在自然界中, 存在着各种各样可以水解蛋白质的蛋白酶, 但由于丝素蛋白是一种典型的β-角蛋白, 很难被普通的蛋白酶降解。土壤中存在着丰富的微生物资源, 目前认为环境中有90%以上的微生物还没有进行分离培养。蚕茧、丝绸在土壤中很快会腐烂、降解, 这说明其中存在着可以降解、利用丝素蛋白的微生物。
本文主要针对土壤中分离筛选出可降解丝素蛋白的放线菌菌株, 从发酵培养温度, 起始p H值, 培养基碳源、氮源、金属离子等方面对该菌株进行发酵条件初步优化, 通过测定发酵产酶酶活及丝素蛋白的降解率, 来寻找最佳产酶条件, 以期为利用酶法生产丝肽产品探寻一条有效新途径, 为蚕丝资源再利用拓展开辟一条新渠道。
1 材料与方法
1.1 菌种
从来源于宁波某小区的土壤中分离筛选出可降解丝素蛋白的高阳链霉菌。
1.2 丝素的脱胶处理
选择干净的蚕茧, 于烘箱放置10 min, 称量, 每10 g为一份。取1 L去离子水于烧杯中, 加入5 g Na2CO3, 加热至沸腾。待水温冷却至80℃, 加入10 g烘干蚕茧 (充分搅拌) , 于80℃水浴锅中脱胶30 min。30 min后取出, 过滤, 留脱胶丝。60℃蒸馏水清洗3遍, 再常温蒸馏水清洗3遍, 清洗好后拧干, 将脱胶丝展开自然风干后, 收集备用。
1.3 培养基
高氏一号培养基:淀粉20 g, Na Cl 0.5 g, KNO31 g, K2HPO40.5 g, Mg SO4·7H2O 0.5 g, Fe SO4·7H2O 0.01 g, 蒸馏水1 000 m L, 琼脂20 g, p H值7.0。种子培养基:Na Cl 0.5 g, K2HPO40.5 g, Mg SO4·7H2O 0.5 g, Fe SO4·7H2O 0.01 g, 蒸馏水1 000 m L, p H值7.0。发酵培养基:Na Cl 0.5 g, KH2PO40.4 g, K2HPO40.3 g, Mg SO4·7H2O 0.5 g, Fe SO4·7H2O 0.01 g, 蒸馏水1 000 m L, p H值7.0。
1.4 试验方法
1.4.1 菌株培养。
(1) 菌株活化。从土壤中分离筛选出可降解丝素蛋白的放线菌菌株, 接到高氏一号培养基, 30℃恒温培养箱培养7 d, 备用。
(2) 种子液制备。用接种环挑取长势较好的单菌落, 以1%接种量接入种子培养基中, 30℃, 150 r/min, 活化培养48 h。
(3) 摇瓶培养。将种子液以1%的接种量加入发酵培养基中, 通过改变发酵培养基的成份及培养条件, 150 r/min, 摇瓶培养96 h, 发酵结束后, 取发酵液于离心管中, 10 000 r/min, 离心10 min, 收集上清, 测定发酵液的酶活力和蛋白质降解率。 (1) 不同温度对产丝素蛋白酶菌株发酵的影响。以20、25、30、35、40℃为不同温度条件, 进行发酵条件优化。 (2) 不同初始p H值对产丝素蛋白酶菌株发酵的影响。以p H值6.0、7.0、8.0、9.0、10.0为不同初始p H值条件下, 进行发酵条件优化。 (3) 不同碳源对产丝素蛋白酶菌株发酵的影响。以乳糖、蔗糖、葡萄糖、淀粉、玉米粉作为碳源, 进行发酵条件优化。 (4) 不同氮源对产丝素蛋白酶菌株发酵的影响。以蛋白胨、牛肉膏、干扰素、KNO3、 (NH4) 2HPO4作为氮源, 进行发酵条件优化。 (5) 不同金属离子对产丝素蛋白酶菌株发酵的影响。以Mg2+、Zn2+、Ca2+、Fe3+、Fe2+作为金属离子, 进行发酵条件优化。
1.4.2丝素蛋白降解率的测定。
丝素蛋白降解率 (%) = (加入丝素蛋白干重-发酵液滤渣干重) /加入丝素蛋白干重×100[3]。
1.4.3丝素蛋白酶酶活的测定。
丝素蛋白酶酶活测定依据福林法[4]。
2 结果与分析
2.1 培养温度对产丝素蛋白酶菌株发酵的影响
产丝素蛋白酶菌株在不同培养温度 (20、25、30、35、40℃) 条件下, 发酵培养96 h后, 发酵产酶及丝素蛋白降解的影响结果见图1。
由图1可知, 在温度为20~30℃之间, 菌株产酶酶活随着温度升高而逐渐增强, 30~40℃之间, 产酶酶活随着温度升高而逐渐减弱, 并且在发酵温度为30℃时, 产酶酶活达到最高值。由此可知, 该菌株产酶最佳温度为30℃, 当生长温度低于或高于30℃时, 菌体生长均会受到限制, 生长量大大减少, 因此产酶会减少, 酶活亦大大降低。
在20~30℃温度范围内, 丝素蛋白降解速率随着温度升高不断增加, 而30~40℃范围内, 随着温度升高, 丝素蛋白降解速率反而出现下降趋势。在30℃时, 出现了最高的丝素蛋白降解速率, 这和此前产酶酶活力相一致, 由此说明, 在30℃时, 菌体生长良好, 产酶量最大, 酶活高, 对丝素蛋白降解程度较高。而温度低于或高于30℃, 均难得到理想的发酵效果。因此, 综合产酶酶活及对丝素蛋白的降解率, 可以选择30℃作为菌株发酵最佳温度。
2.2 培养基初始p H值对产丝素蛋白酶菌株发酵的影响
产丝素蛋白酶菌株在不同初始p H值 (6.0、7.0、8.0、9.0、10.0) 条件下, 发酵培养96 h后, 发酵产酶及丝素蛋白降解的影响结果见图2。
由图2可知, 培养基初始p H值为8时, 菌株产酶酶活力最高, 并且可以发现, 当p H值在7~9范围内时, 丝素蛋白酶酶活力变化不明显, 但当p H值低于7或高于9时, 酶活出现明显下降趋势。分析丝素蛋白的降解率可知, 当p H值为8时, 降解程度达到最高值, 同样在p H值为7~9之间, 丝素蛋白降解率变化亦不明显, 但p H值低于7时, 降解程度明显较低, 该结果与酶活活力变化均保持一致。综合以上结论可知, p H值为8可以作为该菌株发酵的最佳初始p H值。
2.3 碳源对产丝素蛋白酶菌株发酵的影响
产丝素蛋白酶菌株发酵培养基分别以乳糖、蔗糖、葡萄糖、淀粉、玉米粉作为碳源, 发酵培养96 h后, 发酵产酶及丝素蛋白降解的影响结果见图3和图4。
由图3可知, 添加丝素的培养基与不添加丝素的培养基相比, 选择的5种碳源物质均极大程度地促进了丝素蛋白酶的产生, 并且酶活也明显增加。尤其是以玉米粉和淀粉作为碳源的发酵培养, 产酶酶活分别达到较高值, 由此可见, 丝素的添加对于菌株产丝素蛋白酶有一定的诱导作用。
由图4可知, 当选择玉米粉、淀粉、葡萄糖作为碳源时, 添加丝素与不添加丝素, 对于丝素蛋白降解率并没有较大影响, 以这3种物质作为碳源, 均可以促进丝素蛋白降解程度的提高。但以乳糖和蔗糖作为碳源时, 添加丝素则可以大大促进丝素蛋白降解率的提高。
综上可知, 可以选择玉米粉作为最佳碳源物质, 既可以诱导产生酶活高的丝素蛋白酶, 又能较大程度促进丝素蛋白的降解, 而且玉米粉来源广泛, 价格低廉, 适合于工业化大规模生产。
2.4 氮源对产丝素蛋白酶菌株发酵的影响
产丝素蛋白酶菌株发酵培养基分别以蛋白胨、牛肉膏、干扰素、KNO3、 (NH4) 2HPO4作为氮源, 发酵培养96 h后, 发酵产酶及丝素蛋白降解的影响结果见图5和图6。
由图5可知, 所选择的5种氮源物质均可以很好地诱导菌株产酶, 并保持一定酶活力。但是, 缺少丝素的培养基中, 酶活明显较添加丝素组低, 由此, 猜测丝素可以作为促进丝素蛋白酶产生的诱导因子。
由图6可知, 在添加丝素的培养基中产生的丝素蛋白酶均可以降解丝素蛋白, 但是在不加丝素的培养基组中, 牛肉膏、蛋白胨、干扰素作为氮源的培养组其丝素蛋白降解率近于0, 由此可见, 该3种氮源物质虽能诱导蛋白酶产生, 但产生的蛋白酶降解丝素蛋白能力还有待进一步考证。根据以上检测结果, 可以选择KNO3作为最佳氮源物质。
2.5 金属离子对产丝素蛋白酶菌株发酵的影响
产丝素蛋白酶菌株分别以Mg2+、Zn2+、Ca2+、Fe3+、Fe2+作为金属离子, 发酵培养96 h后, 发酵产酶及丝素蛋白降解的影响结果见图7。
由图7可知, Mg2+、Zn2+、Ca2+、Fe3+、Fe2+作为金属离子, 对产丝素蛋白酶均有一定的促进作用, 其产酶酶活和丝素蛋白降解率均高于对照组, 尤其是Mg2+、Ca2+和Fe2+。但综合产酶酶活及蛋白降解程度, 可以选择Mg2+作为最佳金属离子。
3 讨论
微生物发酵过程中, 发酵的温度、培养基的初始p H值、碳源、氮源以及金属离子都会对发酵结果产生影响[5,6,7]。本试验主要选取以上几个影响因素, 对产丝素蛋白酶菌株的发酵条件进行优化, 最终可得:高阳链霉菌进行发酵时, 可选择培养温度30℃, 培养基初始p H值8.0, 培养基中添加丝素, 以玉米粉作为碳源、KNO3为氮源, 以Mg2+作为金属离子, 在以上条件下发酵96 h, 可收获较高酶活的丝素蛋白菌株, 并且丝素蛋白降解程度亦最高。本试验只是通过单一的单因素试验对发酵条件进行初步优化, 若要进一步详细确定发酵条件, 还有待更深入、更全面的研究。
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产纤维素菌株 篇4
菊粉 (Inulin) 是由果糖经过β-2, 1果聚糖苷键连接的多聚果糖, 菊粉酶 (Inulinase) 是一种能水解β-2, 1-D-果聚糖糖苷键的一类水解酶, 能生产菊粉酶的微生物包括霉菌、酵母菌、细菌等[1]。微生物产生的菊粉酶能水解大量存在于菊芋等植物块茎中的菊粉, 用于生产果糖浆、低聚果糖、燃料酒精等, 具有十分重要的生产价值和广阔的利用前景[2]。国外从20世纪70年代就开始对菊粉酶的研究, 我国起步较晚[3]。本文报道了产菊粉酶细菌的筛选, 并对高酶活菌株做了菌种鉴定, 为进一步研究奠定了基础。
2 材料与方法
2.1 材料
分离样品:山东威海滨海盐碱地生长菊芋的根际土壤;市售水果。
培养基: (1) 初筛培养基主要是:菊粉10.0g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、NaN O31.5g/L、NH4H2PO4 2.0 g/L、KCl 0.5g/L、FeS O4·7H2O4 0.1g/L、K2HPO4 1.0g/L、琼脂20.0g/L, 初始pH 6.0。 (2) 发酵培养基是菊粉30.0g/L、蛋白胨7.0g/L、NaC l 5.0g/L、K2HPO4·3H2O 3.0g/L, 初始pH 6.0。
2.2 方法
菌种筛选: (1) 透明圈初筛法。取菊芋的根际土壤加入捣碎的菊芋, 常温透气一周左右使其长菌;称取10g分离样品置于内含100m L无菌水和玻璃珠的三角瓶内, 180 r/min, 30℃振荡30 min, 使细胞分散;将土壤悬液稀释为10-1、10-2、10-3三个浓度, 然后每个稀释梯度取0.2m L在以菊粉为唯一碳源的平板上进行涂布分离, 每个稀释度涂布两个平板, 置于30℃的恒温培养箱中培养2—4天, 挑取菌落周围透明圈稍大者进行划线分离, 直至分离到单菌落。 (2) 复筛。将筛选到的菌株由斜面接种到50m L (250m L三角瓶) 液体发酵培养基中, 在30℃、180 r/min培养24小时, 制成种子液;然后按3%的接种量将种子液添加到50m L (250m L三角瓶) 相应液体培养基中, 在30℃、180 r/min条件下进行产酶试验, 定时取样, 4000 r/min离心10min后测定发酵液中的酶活, 从中筛选酶活较高的菌株即可。
菊粉酶活的测定:将发酵液在4000 r/min, 20 min离心去除细菌菌体, 取1m L上清液加入到4m L的2%菊粉溶液 (p H5.0、0.lmol/L醋酸缓冲液配制) 中, 55℃水浴中保温10min;取反应液0.5m L加入1.5m L DNS混匀, 沸水浴中反应5min, 迅速冷却并稀释至25m L, 在540nm下测定其吸光度, 根据葡萄糖标准曲线计算样品中的还原糖含量[4]。定义每分钟产生1μmol还原糖需要的酶量为一个酶活单位 (U/m L) 。
选育细菌的鉴定: (1) 常规鉴定。将试验菌株活化3—4代, 镜检合格后根据细菌分类学研究标准的方法对供试菌株进行形态学观察, 包括细胞形态、有无鞭毛及细胞大小特征, 用光学显微镜观察, 并从平板上挑取单菌落按标准的方法进行革兰氏染色。 (2) 分子鉴定。采用16S r DNA序列分析法。按照SK1201-UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒的说明书提取基因组。扩增16S r DNA的正向引物为7f (5′-CA-GAGTTTGATCCTGGCT-3′) , 反向引物1540r (5′-AG-GAGGTGATCCAGCCGCA-3′) 在25μL的PCR反应体系中含有:Template (基因组) 1μL、Primer up (10u M) 0.5μL、Primer down (10u M) 0.5μL、d NTP mix (10Mm each) 0.5μL、10×Taq reaction Buffer 2.5μL、Taq (5u/μL) 0.2μL。PCR反应参数为预变性94℃5min, 循环94℃30s、55℃35s、72℃1min, 35个循环, 延伸8min。PCR扩增产物由UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒进行琼脂糖切胶纯化后, 由上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定。 (3) 生理生化特征测定。以发酵液液体培养基为基础培养基, 分别配置成不同的盐度 (Na Cl, w/v) 及p H值梯度的培养基, 接种后振荡培养7天, 取培养液用分光光度计在600 nm波长下检测菌株的生长密度。实验设置的温度梯度为10℃、20℃、30℃、40℃、42℃、50℃。当实验温度为30℃时, 绝对盐度 (Na Cl) 梯度为1%、3%、5%、7%、0, p H值梯度为1.0、2.0、3.0、4.0、9.0、10.0。
16S r DNA序列比对及系统发育树构建:将测定的基因序列输入Genbank并运用Blast程序与数据库中已存在的细菌16S r DNA序列进行相似性比较分析;利用MEGA5.0软件绘制系统发育树, 确定其系统发生学地位。
3 结果与分析
3.1 菌株的分离、筛选
本试验以菊粉为惟一碳源, 筛选得产菊粉酶的菌株20株, 其中分离到三株产菊粉酶酶活较高的细菌F1、F2、F3, 将3株菌株分别转接入发酵培养基中, 在30℃、180 r/min的条件下培养2天, 发酵液经离心后获得菌株的粗酶液, 测定其菊粉酶酶活力, 其中F1产菊粉酶酶活力最高, 达1.73 U/m L, 然后选取该菌株进行研究。
3.2 F1菌株的鉴定
常规鉴定:形态观察发现, F1菌株在培养基上的菌落为圆形, 乳白色不透明, 菌落湿润、光滑, 边缘锯齿状。随着培养时间的延长, 菌落上有褶皱状突起, 颜色变为浅黄色;菌体直杆状, 革兰氏染色阳性, 符合芽孢杆菌属形态特征, 表明该菌株为芽孢杆菌 (Bacillus sp.) 。
分子鉴定: (1) PCR产物的检测。PCR实验以后进行琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明, 在1500 bp处有DNA条带, 证明PCR扩增成功, 见图1。 (2) 16S r DNA序列比对和结果分析。经克隆和测序分析后, 得到F1菌株的一段长度为1455bp的16S r DNA序列, 将序列提交到NCBI的Genbank进行Blast比对 (图2) 。序列分析表明, 该菌与Bacillus megaterium、Bacillus aryabhattai、Bacillus horikoshii的序列同源性都高达99%。
3.3 细菌生理生化实验结果
通过生理生化特征的研究表明, 菌株F1最佳绝对盐度 (NaC l) 为7.0%, 生长温度范围20—50℃, 最佳pH值为4.0, 这与芽孢杆菌属中菌株Bacillusmegaterium相符 (表1) , 初步鉴定为Bacillus megaterium。
注:+为阳性;-为阴性;ND为无数据。
4 讨论
在产菊粉酶菌种筛选方面, 国内外有关酵母菌和真菌的报道居多, 有关细菌的研究甚少[8,9,10]。本试验采用以菊粉为唯一碳源的平板划线分离法, 筛选得到产菊粉酶酶活较高的细菌菌株F1。通过对F1的形态观察、16SrD NA序列分析及生理生化实验的研究, 鉴定该菌为Bacillus megaterium;进一步优化Bacillus megaterium的产酶发酵条件、研究其酶学性质、酶的固定化条件并探讨其在工业上的实际应用具有重要意义。
摘要：从山东威海沿海滩涂菊芋生长的根际土壤中分离得到能产菊粉酶的菌株20株, 经过进一步摇瓶复筛, 获得了产菊粉酶活力较高的一株细菌F1, 其发酵液酶活达到1.73U/mL。通过形态学观察、16SrDNA序列分析及生理生化研究, 鉴定该菌为芽孢杆菌属的巨大芽孢杆菌 (bacillus megaterium) 。
关键词：菊粉酶,筛选,菌种鉴定
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产壳聚糖酶菌株的筛选及初步鉴定 篇5
甲壳素脱乙酰化后的产物是壳聚糖。一般而言, N-乙酰基脱去55%以上, 或者说能在1%乙酸或1%盐酸中溶解1%的脱乙酰甲壳素, 称之为壳聚糖。作为工业品的壳聚糖, N-脱乙酰度在70%以上。壳聚糖一方面来自甲壳素, 另一方面在自然界中也大量存在, 是迄今为止发现的唯一的天然碱性多糖。壳聚糖呈白色或灰白色, 平均分子量在1.2×105左右, 不溶于水、碱性溶液或普通有机溶剂, 但可溶于盐酸、硝酸、甲酸、乙酸等稀酸。
不同分子量的壳聚糖的性质各异, 分子量低于10k Da的水溶性壳聚糖, 具有降血糖、降血脂、抗真菌、抗细菌以及抑制肿瘤生长等功效, 在医药、食品等领域具有潜在的发展前景。目前制备低分子量壳聚糖的方法, 主要有化学法和酶解法。其中, 酶解法以条件温和、产率高、污染小等优点, 成为研究的热点。壳聚糖酶 (Chitosanase) 是一种专一性降解壳聚糖的水解酶, 能特异性作用于壳聚糖的β-D- (1, 4) -糖苷键, 得到聚合度低至2~7的水溶性壳寡糖。
甲壳素广泛分布于湖泊中, 也是湖水中化学耗氧量的重要来源。筛选、驯化产壳聚糖酶菌株, 经过培养后, 附着在生物骨料中投入水体中, 可以提高水体净化能力。
近年来, 国内外研究人员从自然界中分离到Beauveria bassiana, Pseudomonas sp., Mitsuaria chitosanitabida, Bacillus sp.等产壳聚糖酶菌株, 并对其分类学、发酵工艺以及酶学性质, 展开了一系列研究。本文筛选得到7株产壳聚糖酶菌株, 并对其中的5株菌, 进行了初步鉴定。
1 材料与方法
1.1 主要材料、试剂及培养基
壳聚糖:粉状、脱乙酰度≥90% (中脱乙酰度) , 粘度55.8mpa·s, 武汉某公司提供。
壳聚糖胶体溶液:1g壳聚糖, 加入30m L 0.2mol/L的HCl, 75℃水浴15h~20h至完全溶解, 用1mol/L的Na OH缓慢调p H5.0, 加蒸馏水定容, 配成一定浓度的溶液。
富集培养液:2%的胶体壳聚糖溶液, 加入0.2%的K2HPO4, 121℃、灭菌30min。
壳聚糖固体培养基:
甲液:1%壳聚糖胶体溶液;
乙液:K2HPO40.4%, KH2PO40.2%, Mg SO40.14%, Na Cl 0.1%, Ca Cl20.02%, 酵母粉0.1%, 琼脂4%, p H7.0;
壳聚糖固体培养基:甲、乙液分别于121℃条件下灭菌30分钟后, 等体积混合倒平板。
1.2 取样
分别从山上、菜地、池塘污泥、垃圾堆附近等地采集了7份土壤样品和1份来自青山湖的水样, 样品取回后置4℃冰箱冷藏。
1.3 富集培养
取适量土壤样品, 用无菌水稀释成悬浊液, 取0.5m L (水样直接取) 加至10m L富集培养液中, 28℃培养3d~5d。
1.4 初筛
采用梯度稀释法, 在壳聚糖平板上均匀涂布10-3、10-4、10-5稀释的培养液, 置28℃恒温箱中培养, 不时观察菌落生长情况, 3d后, 取生长良好且能产生透明圈的单菌落, 接至壳聚糖斜面培养基上培养, 保藏。
同时, 将挑选出的各菌株用无菌牙签点接种至壳聚糖固体平板上, 每个平板接3株或4株菌, 三组平行, 培养3d后, 取出平板, 置4℃冰箱中冷藏1d。测量各菌株的菌落直径 (d) 和透明圈直径 (D) , 计算D/d, 并求其平均值, 以d值和D/d值为指标, 挑选降解壳聚糖能力强的菌株。
1.5 菌株的形态和生理生化特征研究
1.5.1 形态特征鉴定
将产壳聚糖酶菌株接种于壳聚糖平板上, 置于30℃恒温箱培养。培养24h后, 挑取单菌落进行革兰氏染色, 用显微镜测微尺测定大小;培养72h后, 观察菌落形态。
1.5.2 氧化发酵试验 (O-F test)
休和利夫森二氏培养基:蛋白胨2g、Na Cl5g、K2HPO40.2g、葡萄糖10.0g、琼脂3.0g、1%溴里百酚蓝 (溴麝香草酚蓝) 溶液3m L (先用少量95%酒精溶解后, 再加水配成1%的水溶液) 、蒸馏水1000m L, p H7.0, 分装于试管中, 培养基高度约4mm~5mm, 121℃灭菌、20min;博德和霍尔二氏培养基:NH4H2PO40.5g、K2HPO40.5g、酵母膏0.5g、葡萄糖10.0g、琼脂3.0g、1%溴百里酚蓝溶液3m L、蒸馏水1000m L, p H7.0, 同上分装, 灭菌。进行穿刺接种培养, 每株菌做两组平行。每组包括4支:E1:不接种、不加石蜡密封;E2:不接种、石蜡密封;E3:接种、不加石蜡密封;E4:接种, 石蜡密封 (石蜡事先灭菌, 添加高度为1mm左右) 。30℃恒温培养, 1、3、5、7 d后, 与E1、E2对照, 观察试管培养基颜色变化。对用于本试验的菌株, 如果E3、E4管颜色均变黄, 说明该菌株为氧化型 (O) , 如果仅E4颜色变黄, 说明为发酵型 (F) 。
1.5.3 脲酶试验
培养基:蛋白胨1g, 葡萄糖1g, Na Cl 5g, KH2PO42g, 0.2%酚磺酞指示液6m L, 20%尿素溶液100m L, 琼脂20g, 水900m L。除尿素外, 将上述成分混合, 调p H值为6.8~6.9, 加热溶化后分装于试管中, 115℃灭菌、30min, 冷却至50℃~55℃, 加入经过滤除菌的尿素溶液, 摆斜面。划线培养, 于30℃恒温培养, 2、4d天后, 观察结果, 菌体周围培养基颜色呈桃红色者为阳性, 不变者为阴性 (以不加尿素的培养基作对照) 。
1.5.4 吐温80水解试验
蛋白胨10g, Na Cl 5g, Ca Cl2·7H2O 0.1g, 琼脂9g, 蒸馏水1000m L, p H7.4, 121℃灭菌20min。吐温60于121℃灭菌20min后, 培养基冷却至45℃左右时, 加入至终浓度为1%, 倒平板。划线接种, 培养7d, 每天观察结果。
1.5.5 耐p H值试验
LB培养基:胰蛋白胨1%, 酵母粉0.5%, Na Cl 0.5%, 调节培养基的p H值, 分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0, 30℃, 摇床培养3天, 观察生长情况, 确定耐生长p H值。
2 结果与分析
2.1 富集培养
培养5d后, 除水样外, 其它培养液变混浊, 有菌体产生, 个别有絮状沉淀。
2.2 平板分离
通过以壳聚糖为唯一碳源的平板筛选分离, 挑出7株产透明圈的菌株, 并对其编号, 点接种比较d值D/d值, 结果如表1示。
注:d表示菌落直径;D表示透明圈直径.
由表1初步认为, X1菌株降解能力最强, 其次为X5, 其它菌株降解能力相对较弱。
2.3 菌株形态与生理生化特征
从中挑选出X1、X2、X3、X5、X6共5株菌, 对进行形态与生理生化特征鉴定。结果均为G-、杆状、不产芽孢;在壳聚糖平板上, 菌落呈白色、圆形、隆起, 表面光滑、湿润、边缘平整, 周围有透明圈, 其它形态特征和生理生化特征见表2。
注:“+”表示positive, “-”表示negative.
根据以上结果将其归为氧化型革兰氏阴性菌, 具体的分类地位有等进一步鉴定。
3 讨论
自然环境中的微生物是一个非常混杂的群体, 从中分离到具有某种特性的微生物具有很大的随机性, 是否能取得成功在很大程度上依赖于快速、高通量的筛选方法和简便、可靠的检测手段。为此, 我们设计了一套有效的筛选方案和技术路线。
取样方面, 因为壳聚糖广泛存在于水生甲壳类动物、软体动物和节肢动物的外壳中, 所以我们主要集中在池塘及其周边自然环境中取样。样品通过以壳聚糖为唯一碳源和氮源的培养基进行富集培养, 限制其它微生物的生长, 使菌群中的特定微生物生长繁殖, 这样目标菌株在富集培养液占据绝对优势。富集培养后, 梯度稀释涂平板, 筛选能利用壳聚糖的微生物。其依据的原理是:壳聚糖平板呈白色不透明状, 能利用壳聚糖的微生物必然会分解壳聚糖成小分子, 菌落周围形成透明圈, 其产酶活性越高, 降解壳聚糖的能力越强, 透明圈相对大小就越大, 该方法易于观察, 效果明显。通过初步筛选, 最终得到了7株产壳聚糖酶的菌株。
产纤维素菌株 篇6
1 材料与方法
1.1 材料与培养基
1.1.1 菌株
地衣芽孢杆菌4株, 编号分别为703、704、705、706, 高温放线菌2株, 编号为720、722。
1.1.2 培养基
牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏3.0 g, 蛋白胨10.0 g, Na Cl 5.0 g, H2O 1 000 m L, 琼脂15.0g, p H7.0。
纤维素刚果红培养基:KH2PO40.5 g, Mg SO4·7H2O0.25g, 微晶纤维素1.88g, 明胶2.0g, 刚果红0.2g, 土壤浸出液100 m L, H2O 900 m L, 琼脂15g, p H 6.5。
CMC培养基:CMC-Na 15g, NH4NO31.0g, 酵母膏1.0 g, Mg SO4·H2O 0.5 g, KH2PO41.0 g, H2O 1 000 m L。
改良的PDA培养基:土豆200 g, 葡萄糖20 g, K2HPO41.0 g, Mg SO42.0 g, Ca CO32.0 g, H2O 1 000 m L p H 7.0。
液体产酶发酵培养基:CMC 10.00 g, 蛋白胨2.50 g, 牛肉膏0.50 g, Mg SO40.5 g, k H2PO41.0 g, Na2HPO41.00 g, Na Cl 1.00 g, H2O 1 000 m L, p H 7.0。
1.2 方法
1.2.1 菌株间的适应性试验
采用两两配对的方式, 进行完全组合。
细菌间采用两两培养交叉划线的方法, 观察菌株间生长的协同性及是否有拮抗作用等。
采用琼脂块法测定放线菌间和放线菌与细菌间的影响, 将在平板培养基生长了3 d的放线菌平板, 用打孔器打下一个小圆片, 再将其摆放在均匀涂布了细菌菌悬液或放线菌菌悬液的平板上。每皿3个重复。
1.2.2 菌株单独发酵与混合发酵对酶活力的影响
1.2.2. 1 发酵方法
单菌株发酵:取各菌株经发酵16 h的发酵液各0.6 m L接种至含100 m L液体发酵培养基的三角瓶中, 在55℃±2℃, 150 r/min, 培养36~48 h, 于第3 d和5 d分别取样测纤维素酶活及菌密度。
混合菌株发酵:将各处理接种至含100 m L液体发酵培养基的三角瓶中, 在55℃±2℃, 150 r/min, 培养36~48 h, 于第3 d和5 d分别取样测蛋白酶活、纤维素酶活及菌密度。
处理1:取各细菌菌株16 h的发酵液各0.15 m L混合。
处理2:取各放线菌菌株16 h的发酵液各0.3 m L混合。
处理3:取各菌株16 h的发酵液各0.1 m L混合。
1.2.2. 2 测定方法
平板测定:取菌株单独发酵液和混合发酵液各1滴滴加于同一纤维素刚果红培养基平板, 重复3皿。培养2 d, 取出, 记录水解透明圈的有无与透明圈的直径, 酶的水解能力用R表示, 公式如下:
R=D/d
R-酶的水解能力
D-水解透明圈的直径, mm
d-菌落的直径, mm
纤维素酶活测定:还原糖标准曲线与酶活的测定方法参照GB20287-2006《农用微生物菌剂》DNS比色法和房兴堂等、孙军德等的实验方法略作改动。以1 m L原样酶液, 1 min产生1 ug葡萄糖定义为1个酶活单位 (U) 。分别测定羧甲基纤维素酶 (CMC) 酶活力和滤纸酶 (FPA) 酶活力。测定方法如下:
原样酶液的制备:称取10.0 g或10.0 m L样品, 加入装有玻璃珠的三角瓶中, 再加入10 m L蒸馏水稀释10倍, 静置20 min, 200 r/min振荡30 min, 然后用四层纱布过滤, 滤液3 000 r/min离心10 min。离心后的上清液根据酶活力稀释至适当浓度, 即为原样酶液, 供测试用。
羧甲基纤维素酶 (CMC) 酶活力测定步骤:取4支大试管, 1支作为空白对照, 其余3支作为平行样品管。样品管中加1.0 m L原样酶液, 然后4支试管中分别加入4.0 m L已预热至60℃的CMC缓冲液, 在60℃的水浴锅中反应20 min取出, 每管立即加入3.0m L DNS显色液, 摇匀后在对照管中加入1.0 m L原样酶液。将4支试管放入沸水浴中, 显色5 min后立即取出, 流水冷却, 490 nm处测定其OD值。
滤纸酶 (FPA) 酶活力测定步骤:取4支大试管, 1支作为空白对照, 其余3支作为平行样品管。将样品管中加1.0 m L原样酶液, 然后4支试管中分别加入4.0 m L磷酸钠缓冲液并将1×6 cm的新华滤纸浸入其中, 在60℃的水浴锅中反应60 min取出, 每管立即加入3.0 m L DNS显色液, 摇匀后在对照管中加入1.0 m L原样酶液。将4支试管放入沸水浴中, 显色5 min后立即取出, 流水冷却, 490 nm处测定其OD值。
2 结果与分析
2.1 菌株复配试验
从菌株复配的结果看, 菌株间存在着很好的协同作用, 无论是细菌间还是放线菌与细菌间, 放线菌间均不存在抗性, 菌株间的生长不存在生长竞争的关系。细菌划线的交叉点上菌落正常生长, 有融合的现象, 菌苔更丰厚;放线菌与细菌间不存在拮抗作用, 细菌生长正常, 在放线菌周围, 细菌的生长似乎更活跃;放线菌之间, 相互间无抗性, 正常生长。
2.2 菌株单独发酵与混合发酵对酶活力与生长量的影响
从表1~表3的方差分析与显著性比较看:混合培养的高温菌群的酶活性较菌株单独发酵的酶活要高, 整个高温菌群的酶活与单一菌株的酶活力差异性大, 菌群的酶活力明显优于单一菌株的酶活。从纤维素酶活力的强弱分析, 处理3>处理2>处理1>各单菌株, 处理2与处理1的纤维素酶活力与705、722菌株间的差异不显著, 与平板法测定的纤维素分解能力基本一致;处理3的纤维素酶活最高, 与单一菌株的酶活力之间存在极显著的差异, 5 d时纤维素酶活达到68.99 U。说明有机大分子物质的降解是一个复杂的过程, 单一的酶类不能对大分子的物质进行有效的降解, 只有多种酶系的综合作用才能提高对大分子物质的降解能力。不同种的微生物之间存在着协同作用比同种微生物的协同作用好, 这验证了前面的菌株复配的结果。
注:11-720, 12-722, 13-703, 14-704, 15-705, 16-706, 10-放线菌混培, 17-细菌混培, 中间为6株菌的混合培养
备注:纤维素酶活LSD0.01=5.65 LSD0.05=5.01
3 结论与讨论
从目前的研究来看, 混合菌发酵降解木质纤维素比单菌株更具优势, 因为混合菌各菌株可通过对产物的相互利用减少反馈抑制作用, 并产生不同类型的纤维素酶, 通过酶系互补提高对纤维素的降解效率[6,7]。本研究的结果也很好地印证了这一理论, 纤维素的有效降解应该是一个复合酶系作用, 单一菌株的作用是有限的, 不足以完成整个的降解过程, 不同种群的相互作用更有利于纤维素的降解。目前, 关于菌株间协同降解的机理及其酶系的组成等还有待进一步的研究。
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产纤维素菌株 篇7
以往邻苯二酚产生菌突变往往采用亚硝基胍突变[10]或转座突变[11], 突变株类型受到一定限制, 同时大规模筛选突变产邻苯二酚菌株的工作过于繁琐, 高效筛选产邻苯二酚菌株的方法也有待建立。本作者拟通过硫酸二乙酯突变的方法使菌株突变, 同时建立96孔板培养和酶标仪检测的方法对突变菌进行高效筛选, 以期得到高产邻苯二酚的优良突变菌株。
1 材料及方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
所选用菌种为以前期从土壤中筛选到的1株邻苯二酚产生菌 (产邻苯二酚量为0.24mg/ml) 作为出发菌株。
1.1.2 试剂
4-氨基安替比林 (4-AAP) 、苯甲酸钠和邻苯二酚对照品均为分析纯, 国药集团化学试剂有限公司;硫酸二乙酯 (分析纯) , 中国金山化工厂 (上海) 。其它试剂也均为国产分析纯。
4-AAP溶液的配制按如下方法进行:精确称取0.100g的4-氨基安替比林, 用2ml 1mol/L NaOH和10ml 20% Na2CO3定容至100ml, 放入棕色玻璃瓶中备用。
1.1.3 仪器
722型光栅可见光分光光度计 (上海精密科学仪器有限公司) , Thermo酶标仪 (赛默飞世尔 (上海) 仪器有限公司) , 透射电子显微镜 (日本岛津仪器) 。
1.1.4 培养基
1.1.4.1 筛选培养基
筛选培养基A:苯甲酸钠3g, (NH4) 2SO4 0.2g, KH2PO4·7H2O 3.75g, 酵母膏0.25g, Na2HPO4·12H2O 1.75g, NaCl 0.25g, 去离子水425ml;
筛选培养基B:MgSO4·7H2O 0.5g, FeSO4·7H2O 0.5mg, CaC12·2H2O 0.5mg, CuSO4·5H2O 0.5mg, ZnCl2 0.5mg, 去离子水75ml。
筛选培养基A、B分别配制后于115℃、20min蒸汽灭菌, 常温无菌混合备用, 如需要液体培养基在接种前加入适量的抗菌素或其它溶液。固体筛选培养基在筛选培养基中加入2%的琼脂, 如需要在固体培养基倒平板前加入适量的抗菌素或其它溶液。
1.1.4.2 加富培养基:
在液体筛选培养基中加入7.5g蛋白胨和2.5g葡萄糖。
1.1.4.3 斜面培养基:
在固体筛选培养基中加入7.5g蛋白胨、2.5g葡萄糖。
1.2 方法
1.2.1 菌种的化学诱变
1.2.1.1 菌悬液的制备
取1环培养24h的斜面菌种, 接入装有10ml种子培养基的250ml三角瓶, 然后置于摇床上30℃、200r/min振荡培养12h。
1.2.1.2 菌种诱变
取新鲜制备的菌悬液5ml加入到装有15ml 0.1mol/L pH 7.0的磷酸缓冲溶液的250ml三角瓶中, 然后加入0.02ml硫酸二乙酯, 于30℃、200r/min摇床上分别处理2min、4min、6min、8min和10min后, 再分别加入0.5ml的25%硫代硫酸钠终止反应。将诱变菌液稀释到10-4、10-5、10-6 3个稀释梯度, 每个稀释梯度平行涂布3个平板, 同时做一组未加诱变剂的空白对照, 30℃恒温培养箱中培养72h。
1.2.1.3 存活率及致死率的计算
将培养好的平板取出进行菌落计数。根据平板上的菌落数, 按以下公式计算存活率。
存活率undefined
根据平板上菌落数, 按以下公式计算出用硫酸二乙酯处理2min、4min、6min、8min和10min后的致死率。致死率计算公式为:致死率=1-存活率。
1.2.2 96孔板初筛突变菌株
在平板菌落计数后, 选取致死率在60%～90%左右的平板, 用无菌牙签在无菌环境下挑取少量的菌到96孔板中。每个单菌落平行接种到3个孔, 分别加入0.2ml液体筛选培养基 (用于测定菌体OD值) 、0.05ml液体筛选培养基 (用于显色反应) 和0.2ml液体加富培养基 (用于菌种扩大培养) 。平板在30℃恒温培养48h后, 再在对应的0.05ml液体筛选培养基的孔中加入0.15ml的4-AAP进行显色反应。显色后静置20min后在酶标仪中分别用492nm波长 (检测显色效果) 和630nm波长 (检测菌OD值) 进行扫描检测。
1.2.3 96孔板筛选后的复筛
选取96孔板上显色效果明显以及吸光度和OD值结果较好的菌落, 将其对应孔的0.2ml液体加富培养基菌液转入到装有10ml液体筛选培养基的三角瓶中, 于30℃、200r/min的摇床上培养12h后, 对发酵液中CAT含量进行测定。
1.2.4 菌种遗传稳定性检测
将诱变获得的高产菌株斜面划线培养连续传代5次, 检测每代进行发酵后发酵液中CAT的产量。
1.2.5 菌种鉴定
参照伯杰氏细菌鉴定手册[12]以及文献方法[9]对所筛得突变菌株进行菌种鉴定。
1.2.6 发酵液中邻苯二酚含量的测定
取适量的发酵液, 8 000r/min离心5min去除菌体细胞, 收集上清液。取1ml上清液, 在确保空气为惟一的氧化剂条件下, 剧烈振荡下加入4-AAP溶液3ml, 继续振荡3min, 静置20min显色。对变色液在515nm的波长下测定吸光度A, 按照标准曲线换算出溶液中的CAT的浓度[9]。取3次平行测定的平均值作最终结果。
2 结果与分析
2.1 96孔板初筛结果
由于在诱变育种实验中要对平板中的正突变菌株进行筛选, 而一般情况下的正突变率非常低。因此就要大批量地对诱变后平板中的菌落进行筛选, 这无形中就增加了正突变菌株筛选的难度以及筛选的工作量, 而且很可能导致筛选不出所需要的正突变菌株, 导致整个诱变实验失败。
鉴于这种情况, 作者拟建立96孔板筛选法对产邻苯二酚突变菌株进行筛选。96孔板的每个孔中所需培养基量非常少, 且每孔菌株的生长情况和生理生化变化可以通过酶标仪扫描的方法同时进行检测, 极大降低实验试剂消耗和劳动强度, 因此96孔板的方法可用于大批量菌株的筛选。
96孔板筛选的方法可快速得到大量关于菌体生长和生成产物的信息。如何从这些初筛的数据中快速寻找出所需菌株需要研究确认。因此在得到了96孔板初筛数据的同时, 又对相应菌株进行了筛选准确度更高的复筛, 把初筛数据和复筛数据进行了关联 (见表1) , 以期提高96孔板初筛的可靠性。
从表1可以发现, 数值比较精确的摇瓶复筛结果与进行96孔板初筛所得到的3组数值看不出直接关联。因此选择了3组数据的组合形式作为一个综合的96孔板筛选菌的选择系数, 来作为筛选依据, 通过不同系数与摇瓶复筛结果的关联性来确定96孔板的筛选依据准确性, 结果见表2。
从表2中可以发现, 筛选培养基中吸光值与富集培养基中菌液OD值这个数值组合形式和复筛结果数值有较大关联, 相关系数达到90%以上, 表明邻苯二酚浓度高同时富集培养基中菌液生长状况好的突变菌株有可能在复筛中被选中。
2.2 96孔板初筛后再进行复筛的结果
突变菌株经过96孔板初筛后, 再经过摇瓶复筛, 得到63和68这两株产CAT能力最强的菌株。菌株63和68产邻苯二酚的能力分别为0.56mg/ml、0.87mg/ml, 其产CAT的能力分别比出发菌株提高了133.3%、262.5%。选择68号菌株进行菌种稳定性试验。
2.3 菌种稳定性
68号菌株经过斜面传代培养5次, 每代作3个平行测定突变菌株产CAT的能力, 结果见表3。
以t检验方式 (双样本异方差假设) 对各代数据进行差异显著性分析, 结果表明诱变菌株代间产邻苯二酚差异不明显, 这表明突变菌经过传代培养后遗传性能仍较稳定。
2.4 菌种的鉴定结果
(1) 菌落形态观察结果为:
菌落为圆形, 半透明, 灰白色, 带绿色荧光, 表面光滑, 边缘整齐。电镜观察结果为:无鞭毛, 无芽孢, 革兰氏染色观察菌体呈杆状, 革兰氏染色阴性。
(2) 生理生化反应结果见表4。
根据细菌形态学观察和结合生理生化实验结果初步鉴定该菌为假单胞菌属 (Pseudomonas sp.) 。
3 讨论
邻苯二酚为重要的精细化工产品, 生物合成法合成邻苯二酚较有机合成法具有反应条件温和副产物少等优点而受到研究者的关注[3,4]。相对于通过发酵优化的方法[4,6]来提高邻苯二酚的产量, 产邻苯二酚菌的突变和筛选[6,8,9,10,11]受到研究者更多的关注。以往邻苯二酚产生菌突变往往采用亚硝基胍突变[10]或转座突变[11], 突变株类型受到一定限制, 同时传统的摇瓶筛选菌株的方法工作量较大、筛选范围小也阻碍了产邻苯二酚优良菌株的快速筛选。本文采用硫酸二乙酯化学诱变的方法和96孔板筛选的方法来进行菌株高通量筛选。硫酸二乙酯作化学诱变剂在邻苯二酚菌株诱变上的研究尚未见报道, 使用该诱变剂可增加突变菌株突变类型。同时本文建立96孔板筛选法对产邻苯二酚突变菌株进行筛选。96孔板的每个孔中所需培养基量非常少, 且每孔菌株的生长情况和生理生化变化可以通过酶标仪扫描的方法同时进行检测, 极大降低实验试剂消耗和劳动强度。
通过研究确定化学诱变剂硫酸二乙酯的终浓度为0.1%, 诱变时间为8 min的诱变剂量, 菌株致死率为84.5%, 突变效果最好。通过诱变筛选, 获得2株产CAT较高的诱变菌株, 产CAT能力比出发菌株提高了262.5%。另外, 在96孔板筛选中, 筛选培养基中吸光值 (495nm) 和富集培养基中菌液浊度值 (OD630) 的加和值与复筛结果数值有较大关联, 相关系数达到90%以上, 表明邻苯二酚浓度高同时富集培养基中菌液生长状况好的突变菌株有可能在复筛中被选中, 可依据这个规则进行更大规模的产邻苯二酚菌株筛选, 满足生产上对高产邻苯二酚菌株的需要。
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产纤维素菌株 篇8
1 资料与方法
1.1 资料来源
本院检验科2008年至2011年妇科检验结果筛查出61份数据。
1.2 检验标准
产ESBLS菌株在我院, 使用的是用药敏推测法, 噻吩与哌酮他唑巴坦抑菌圈比>5mm就可以认为是带有ESBLS的菌株。此实验法, 按照《全国临床检验规程》标准检验, 操作规范按照CLSI (美国临床实验室标准化协会的英文缩写, 英文名为Clinical and Laboratory Standards Institute) 规范操作。其结果可靠准确。
1.3 评价标准
参照卫生部抗菌药物临床应用监测网制定的《卫生部办公厅关于抗菌药物临床应用管理有关问题的通知》、《卫生部医政发38号文》以及《抗菌药物临床应用指导原则》等合理评价该院妇科携带ESBLs菌株病例使用抗菌药物合理性, 进行观察。
2 结果
2.1 抗菌药的使用情况
病例中使用了头孢哌铜他唑巴坦钠、阿莫西里克拉维酸钾、硝基咪唑类抗生素、喹诺酮类抗生素、氨曲南、二代头孢、三代头孢、氨基糖苷类、阿奇霉素这些抗生素。
2.2 明确感染患者用药情况
病例中83.33%使用了β-内酰胺酶抑制剂。其中, 单独使用头孢哌酮他唑巴坦钠/阿莫西林克拉维酸钾等β-内酰胺酶抑制剂复合抗生素的病例12例, 占全部明确感染38.88%, 均为合理用药。使用了头孢三代β-内酰胺酶抑制剂的病例中, 联合硝基咪唑类抗生素的病例, 由于大多数妇科感染属于厌氧菌和需氧菌的混合感染, 在处方中有两种抗生素 (复合抗生素与抗生素联用的) , 除与硝基咪唑类抗生素 (16.67%) 联合应用的病例外, 均为不合理用药, β-内酰胺+大环内酯类在联合用药上是否合理存在争议。6例 (17.14%) 无使用β-内酰胺酶抑制剂, 其为不合理用药, 其选用药物与药敏实验不符。
2.3 隐性感染患者用药情况
绝大部分隐性感染患者用药为预防用药, 无明显表现症状。32%隐性感染患者中使用了β-内酰胺酶抑制剂, 40%无使用抗菌药物治疗, 8%使用多种抗生素 (均为不合理用药) 。复合抗生素+硝基咪唑类抗生素的病例亦可根据临床用药判断为合理用药。在阴道分泌物检验出ESBLs菌株的患者中进行清宫术、剖腹产术、子宫肌瘤剔除术等子宫手术后, 没有使用β-内酰胺酶抑制剂复合抗生素的预防治疗的病例, 25例隐性感染中无继发感染。
对ESBLs革兰阴性菌感染, 主要有效药物为“酶抑制剂+β-内酰胺类”的复方制剂, 以及具有高度稳定性β-内酰胺环的碳青霉素类。其他一些品种有效率较低, 只在联合用药时方考虑。根据药物对ESBLs菌的抗菌活性大小依次排序为:“酶抑制剂+青霉素类<“酶抑制剂>+头孢类<“碳青霉素类”>, 据此制定梯度用药方案, 对怀疑或确证ESBLs菌感染者, 首选“酶抑制剂+青霉素类”, 无效时再选上一级的, 依此类推。好处在于梯度用药可构筑三道防线, 第一道防线无效时还有第二道防线, 第二道无效时还有第三道。弊端在于偏于保守, 在严重感染时不利于快速控制症状。
3 讨论
明确感染患者中, 临床表现明确, 药敏实验能较好地指导临床用药。本次研究中, 明确感染患者用药55.6%属于合理用药;隐性感染患者80%属于合理用药。明确感染和隐性感染都存在超过三种抗生素联用的不合理用药情况。明确感染的治疗中, 存在颇多不合理情况。其中主要的原因为:医生除根据药敏结果用药外, 亦常常以经验指导用药。隐性感染患者用药为预防用药, 应使用一、二代头孢菌素预防[12], 涉及阴道时可加甲硝唑[13]。部分病例没有根据指导原则使用预防抗生素, 甚至使用多种抗生素联合预防, 均不符合合理用药原则。研究中还发现, 临床医生有超过40%以上的用药没有遵循指导原则, 滥用抗生素, 用药缺乏理论依据、文献支持。临床上使用抗生素时, 部分联合用药的方案应由国家统一规范化, 减少不合理联合用药导致的耐药菌产生。因此, 规范化管理医生处方, 监督抗菌药物的应用和注意灌输有关概念显得异常重要。
摘要：目的 观察携带有产ESBLs菌株患者的临床治疗观察, 从用药角度分析针对这一类患者的用药情况与效果观察, 为临床治疗ESBLs感染提供经验。方法 回归性观察2008年至2011年妇科检测到的携带有产ESBLS菌株的患者的用药记录, 病程记录, 检验结果等数据, 对其进行综合观察与讨论。结果 一共观察到61例明确检验出的产ESBLs菌株的病例, 其中25例 (约40.98%) 的临床病例属于隐性感染, 36例 (约59.01%) 的临床病例有明确感染征兆, 隐性感染的病例大多数用药属于预防用药, 只有28%使用到β-内酰胺酶抑制剂, 无使用β-内酰胺酶抑制剂预防术后感染中无出现感染, 明确感染30例 (83.33%) 使用了β-内酰胺酶抑制剂控制感染, 6例无使用β-内酰胺酶抑制剂。结论 大部分临床用药合理, 但还有一部分缺乏用药指征, 需加强管理。