溶解细菌纤维素的方法

溶解细菌纤维素的方法（精选7篇）

溶解细菌纤维素的方法 篇1

摘要：目的:筛选新型产纤维素酶菌株, 促进纤维素资源利用。方法:利用刚果红染色法, 从农产品表面筛选产纤维素酶细菌, 利用16 S rDNA序列信息, 初步确定较高活性的产酶菌株的分类地位。结果:筛选到1株产酶活性较高的菌株Y1。测序获得长度为1 405bp的16S rDNA序列, 提交到美国国立生物技术信息中心NCBI基因库中, 序列号是FJ796220。结论:菌株Y1是Pantoea ananatis, 该文为利用分子生物学技术进行快速细菌分类提供了方法参考。

关键词：纤维素酶,Pantoea ananatis,16S rDNA

纤维素是自然界中分布广泛且产量最丰富的一种碳水化合物资源, 但是由于其难于分解, 加上目前获得的纤维素酶的活性较低, 导致纤维素资源的利用率非常的低。我国纤维素资源产量非常丰富, 仅仅是秸秆和皮壳每年就可达7×108t。但是这些原料很多被焚烧掉, 这样做既危害生态平衡, 又加重了环境的污染。但是, 如果将这些纤维素资源通过生物或酶的降解作用, 水解成葡萄糖, 则是非常有价值的工业原料。其前提是开发高效的纤维素酶。纤维素酶在工农业生产中有着广泛的应用, 其底物是纤维素分子[1,2]。纤维素分子由吡喃型D-葡萄糖残基以β-1, 4-糖苷键相连接而构成, 可被纤维素酶系所降解。目前对于真菌纤维素酶的研究较多, 但对于细菌纤维素酶研究相对较少[3]。细菌由于其种类繁多, 适应环境各异, 其纤维素酶种类也有较大差别, 是开发不同种类纤维素酶基因的宝库, 有深入研究的价值。

在菌种资源开发研究中, 首先是筛选相关生产性能的菌株, 对其进行分类鉴定。通过常规生化实验方法可以有效地对菌株进行鉴定, 但由于这种方法的工作量较大, 不利于大量、快速的分析。现代生物技术的发展为微生物鉴定提供了简便快捷的方法。目前国际上对于细菌菌种的分类往往采用分析16S r DNA序列的方法, 与同源序列进行比对, 快速确定菌株分类地位。生物信息学是应用信息科学研究生物体系和生物过程中信息存贮、信息内涵和信息传递的学科。它是数学、统计、计算机与生物命科学的交叉新兴学科, 它广泛地渗透到生物学相关的很多研究领域中, 更是食品生物工程研究中不可缺少的重要工具。课题组筛选到一株具有较高的纤维素酶活性菌株Y1, 总结了利用16S r DNA序列对细菌进行初步鉴定的一般方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

课题组从胡萝卜、生姜、牛蒡等农产品果实和叶表面筛选产纤维素酶菌株。

1.1.2 培养基[4]

LB (Luria-Bertani) 培养基 (L-1) :胰蛋白胨10g, 酵母膏5g, Na Cl 10g。

筛选培养基 (L-1) :羧甲基纤维素10g, 酵母膏5g, 蛋白胨10g, KH2PO41g, Mg SO40.2g, Na Cl 10g, 葡萄糖2g, 琼脂12g。

1.1.3 试剂

生物化学试剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司。DNA marker、Taq DNA聚合酶、d NTP mixture等分子生物学试剂购自天根生化科技 (北京) 有限公司。

1.2 筛选产酶菌株[4]

通过固体筛选培养基分离培养单菌落, 经过2~4d培养, 使用浓度为0.5%刚果红将养基染色5min, 再使用5%的Na Cl溶液进行脱色。若菌落周围出现透明圈, 则说明该菌株产纤维素酶。

1.3 菌株形态分析

在显微镜下观察Y1细胞形态, 并分析其菌落特征。

1.4 菌株基因组DNA的提取[5]

1.5 产纤维素酶菌株的16S r DNA序列分析

引物序列为:F:5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3';R:5'GGTTACCTTGTTACGACTT 3'。

PCR程序是: (1) 94℃预变性5min; (2) 94℃变性30s, (3) 57℃退火60s, (4) 72℃延伸90s, 进行22次循环扩增; (5) 72℃延伸10min。委托上海生工生物工程技术服务有限公司将16S r DNA测序。在NCBI网站登录获得的序列, 获得accession number。利用Gene Bank基因库中的信息, 分析菌株的分类学地位。使用DNAMAN程序建立演化树和同源树。

2 结果与分析

2.1 获得产纤维素酶菌株

从筛选到的多株菌株中确定产酶活性较高的菌株Y1。显微镜下观察菌株Y1菌体呈杆状, 菌落分散分布, 菌落呈边缘平滑的圆形, 直径在1~2mm左右, 颜色是不透明的淡黄色, 菌落湿润且有光泽。

2.2 基因组DNA的提取结果

菌株Y1的基因组DNA进行0.5%琼脂糖凝胶电泳的结果如图1A, 这显示出提取的基因组DNA分子量较大, 浓度大约100ng/μl, 适合用作基因扩增的模板。

2.3 16S r DNA基因扩增结果

通过PCR扩增了菌株Y1相应的基因片段, 琼脂糖凝胶电泳分析结果表明, 扩增出特异目的条带 (图1B) 。引物的特异性较好, 泳道上没有明显的杂带。

2.4 16S r DNA测序分析

获得菌株Y1长度是1 405bp的16S r DNA序列, NCBI序列号是:FJ796220。序列比对显示:Y1的序列与Pantoea ananatis strain BD 561的16S核糖体序列相似性最高, 达99%。说明Pantoea ananatis Y1是一株尚未研究过的新菌株。采用DNAMAN软件对Y1和相近物种序列比较分析结果如图2, 其同源树如图3。序列比对表明, Y1与4株Pantoea ananatis的序列相似性最高。同源树也显示出Y1与这4株菌的同源性最高。

A.菌株Y1基因组DNA电泳结果;B.菌株Y1 16S r DNA序列扩增结果;M:D2000 DNA marker。A.Electrophoresis of Y1 genomic DNA;B.Y1 16S r DNA;M:DNA marker.

3 讨论

本文通过食品生物技术的方法对筛选到的一株产纤维素酶活性较高的细菌进行了鉴定分析。分析的具体方法是:筛选获得菌株, 提取其基因组DNA, 通过PCR扩增16S r DNA序列, 在NCBI网站上获得序列相似性序列, 使用序列分析软件获得同源树, 初步确定所分析菌株的种类。本文使用的两个引物8F和1 492R是16S r DNA序列分析的通用引物, 使用这两个引物可以获得长度约1 500bp的序列。对于这样长度的16S r DNA序列分析, 一般采用两个测序反应即可将其序列测通, 从而可以获得其全长序列。本文分别使用8F和1 492R进行双向测序, 根据序列的重叠特征, 获得了长度达1 405bp的准确序列, 初步确定产纤维素酶菌株Y1是Pantoea ananatis。由于Pantoea ananatis合成类胡萝卜素途径与高等植物相似, 因此有关于此种菌类胡萝卜素合成的研究[6]。另外, 研究人员在Pantoea ananatis ATCC 43072中克隆到编码4-木糖醇脱氢酶基因xdh的795bp开放阅读框[7]。本文的Pantoea ananatis Y1是从近百株产纤维素酶菌株中筛选到的产纤维素酶活性较高的菌株。对于其纤维素酶基因的克隆分析, 会推动新型纤维素酶基因的开发和利用。

参考文献

[1]方诩, 秦玉琪, 李雪芝, 等.纤维素酶与木质纤维素生物降解转化的研究进展[J].生物工程学报, 2010, (7) :4-9.

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[4]侯进慧, 蔡侃, 郑宝刚, 等.一株牛蒡根际纤维素降解芽孢菌的分离鉴定和发酵分析[J].食品科学, 2010, 31 (21) :312-315.

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溶解细菌纤维素的方法 篇2

1 纤维素黄酸酯生产过程

纤维素黄酸酯是浆粕 (包括棉浆、木浆和竹浆, 即聚合度不同的纤维素, 以不同的比例混合) 与NAOH (浸渍碱液) 反应, 将纤维素上直立键上的羟基氢夺走使纤维素活化生成碱化纤维素, 然后通过物理方法 (压榨、粉碎) 将反应结束后的多余碱液去除掉得到膨松的碱纤维素, 碱纤维素在老成箱内与氧反应将纤维素进行氧化降解, 调整其平均聚合度。在真空条件下碱纤维素与二硫化碳进行反应形成纤维素黄酸酯。黄化后纤维素黄酸酯在溶解系统内进行研磨、粉碎、乳化, 制得合格的溶解性粘胶。

2 溶解性粘胶指标分析

溶解性粘胶的分析包括半分析和全分析。半分析是指测定镍网值和粘度, 每批溶解性胶都要进行测量, 半分析操作相对简单, 现由车间自己测量。全分析包括溶解性粘胶的甲纤、含碱、镍网值、粘度、酯化度。由于本文主要介绍粘胶溶解优化后对镍网值、粘度影响, 因此下面将分别介绍镍网值及粘度测定方法及测定目的。

2.1 镍网值的测定

2.1.1 目的。

了解纤维素黄酸酯溶解效果, 以便对纤维素黄酸酯生产系统参数调节, 稳定生产。

2.1.2 所需仪器。

500ml取样杯;电动搅拌器;筒状粘胶过滤器皿;量筒 (250ml) ;秒表;镍网250目。

2.1.3 测定步骤。

加入150ml蒸馏水于500ml取样杯中, 然后再加入溶解好的纤维素黄酸酯100ml, 开启电动搅拌器搅拌1分钟使混合均匀, 然后静置30秒钟, 将粘胶全部倒入筒状过滤器皿中, 从流出第一滴开动秒表, 测定常压下一分钟流出体积, 即为此批纤维素黄酸酯镍网值。

2.1.4 注意事项:

(1) 测量用镍网提前放入筒状粘胶过滤器底部压实, 避免纤维素黄酸酯不经过镍网。 (2) 测量用镍网每批进行更换新的, 保证测量准确。

2.2 溶解后纤维素黄酸酯粘度测定

2.2.1 目的。

纤维素聚合度大小直接影响着粘胶的粘度, 粘度高低会影响过滤纺丝, 需要控制。

2.2.2 原理。

落球法:以钢球经过上下两刻度 (20cm) 之间的时间来表示。

2.2.3 仪器。

粘度管;恒温水浴;钢球 (0.130±0.001g, d=1/8英寸) ;秒表;0~50℃温度计。

2.2.4 测定步骤。

将粘胶倒入粘度管中, 浸入20度水浴中恒温20分钟, 然后投入钢球, 用秒表记录钢球经过上下两刻度 (20cm) 之间的时间, 以表示粘度的大小。

2.2.5 计算。

粘度 (S) =钢球经过20cm所经过的时间。

2.2.6 注意事项:

(1) 自粘度管中间落下, 不要接触粘度管内壁。 (2) 锈的钢球, 其影响重量和摩擦力。 (3) 对粘度影响很大, 应该在20度时恒温后测定。 (4) 倾倒时不要产生气泡。

3 纤维素黄酸酯溶解系统改善

3.1 纤维素黄酸酯溶解问题。

纤维素黄酸酯溶解效果不好, 溶解性粘胶镍网值低, 同时溶解粘胶粘度与纺丝要求粘度差距大, 对生产过滤系统、纺丝成型都造成一定问题。

3.2 纤维素黄酸酯溶解问题分析。

溶解系统即粘胶生产工艺中将黄化制成纤维素黄酸酯溶解在低温碱溶液 (本行业领域内通常把2℃-5℃的碱称为低温碱) 里经溶解循环泵、细均化制得一定组成的粘胶溶液的工艺过程。溶解效果的好坏, 直观反映是溶解胶网值低、粘胶过滤性能差。从溶解过程发现在溶解过程中管道压力、粘胶泵功率以及溶解曲线, 这三方面的数据反映每一批纤维素黄酸酯的溶解效果的好坏。目前溶解系统的主要由溶解循环泵、溶解机搅拌、细均化器构成。溶解循环泵又名双螺杆泵:电机功率45Kw, 工作能力100m3/h, 转速805rpm, 起到输送及循环粘胶作用;溶解机:容积40-50m3, 搅拌电机功率2.2k W, 转速24rpm, 黄化后的粘胶循环、溶解, 贮存粘胶;细均化器:电机功率45k W, 工作能力60m3/h~70m3/h, 均化间隙2mm~4mm, 将粘胶中的胶块粉碎, 使其充分溶解, 利于过滤和熟成。

3.3 纤维素黄酸酯溶解问题解决。

确定了问题重点, 我公司对细均化器齿盘进行了拆检, 发现细均化器齿盘齿由于长时间使用磨损严重, 纤维素黄酸酯不能很好的被粉碎, 进而影响纤维素黄酸酯溶解效果。查明了问题, 我公司安排对一组溶解系统进行改造试验, 更换新的细均化器用齿盘, 通过改造测得相关溶解系统数据见表1。细均化器更换齿盘后, 纤维素黄酸酯溶解明显改善, 镍网值得到提高, 溶解性粘胶粘度下降同时与纺丝要求粘度差距降低;溶解循环管道压力和粘度泵功率不同程度的上升, 且涨幅较大。从更换前后数据对比看细均化器更换齿盘后粘胶的溶解效果得到了改善。对溶解曲线进行比较, 从溶解开始到溶解平稳, 更换后所用的时间明显比更换前所用的时间要少10分钟左右。

结语

通过长期工艺生产对溶解系统数据统计及总结, 我们根据溶解系统过程中反应的出来的数据进行整理总结, 对均化齿盘进行有目的的更换、修复, 使纤维素黄酸酯溶解效果得到改进, 优化溶解系统、保证过滤性能, 减小对纺丝成型影响。

摘要：溶解是纤维素黄酸酯在溶解系统内进行研磨、粉碎, 以保证溶解性粘胶质量, 衡量溶解性粘胶质量的主要指标是其酯化度、镍网值。本文介绍了在生产中遇到的粘胶溶解问题及对溶解问题的改善。

关键词：纤维素黄酸酯,镍网值,细均化器,溶解效,措施改进

参考文献

溶解细菌纤维素的方法 篇3

1 纤维素溶解与再生技术的新发展

由于分子链上含有大量的羟基,纤维素的分子链之间以及分子内存在着大量的氢键,几乎所有的羟基都能形成氢键,使得纤维素大分子牢固地结合着,其分子链为刚性,并且在结构上具有高度的规整性(间同立构)。其分子内和分子间的氢键可如图1所示。虽然氢键是一种次级键,其键能远不如共价键大,但是由于纤维素中的氢键数量众多,要使这些氢键完全破坏需要很大的能量。氢键在分子中起到物理交联点的作用,使纤维素分子形成三维网状结构,这使得纤维素分子链的结构相当稳定。除了分子内和分子间能形成氢键外,纤维素上众多的羟基使得纤维素也能与水分子形成氢键。研究发现,水分子和纤维素形成的氢键,不仅涉及到纤维素的羟基,还有纤维二糖的连接氧桥O4和葡萄糖残基吡喃环的氧O5。

由于氢键的大量存在以及结晶区和非晶区共存的复杂形态结构,天然纤维素具有不熔化和在大多数溶剂中不溶解的特点[1]。这使得纤维素的加工性能很差,成为天然纤维素在应用中的最大局限。可以这样说,纤维素的利用很大程度上取决于它的溶剂,但是纤维素的溶剂十分有限,开发新型的溶解能力强的纤维素溶剂成为纤维素工业重要的一部分。

评价一种纤维素溶剂是否具有实用化前景,应当考虑以下几个方面的因素:

(1)溶解能力,包括纤维素在溶剂中的溶解度、溶解速度、纤维素在溶解过程中的降解程度等;

(2)再生纤维素材料的性能,如强度和模量;

(3)溶剂的毒性、溶解与加工过程中的稳定性、溶剂的可回收性等。

下面介绍几种可以溶解纤维素的溶剂,以及使纤维素再生的方法。

1.1 Na OH/CS2溶剂体系

传统的黏胶法是用Na OH/CS2体系作为纤维素的溶剂来生产人造丝。首先是用木材、棉短绒等纤维素为原料制成浆粕,将其浸于18~25℃、浓度为18%左右的Na OH溶液中1~2h,再压榨到浆粕质量的2.6~2.8倍,生成碱纤维素。经过老化后使纤维素的聚合度大大降低。降解后的纤维素再与CS2反应得到纤维素黄原酸酯,该衍生物可溶于强碱中制得黏胶液。黏胶经熟成、脱泡、过滤后,再经纺丝机从喷丝头的细孔中压入由硫酸、硫酸钠和少量硫酸锌的凝固浴中凝固、再生、拉伸成丝。凝固液中的H2SO4使纤维素黄原酸酯酸化,加入Na2SO4的目的是将高浓度的盐传递入盐浴中,这是黏胶快速凝固的必要条件,而Zn SO4可与纤维素黄原酸钠酯交换形成黄原酸锌酯使纤维素分子交联。一旦黏胶液经硫酸中和及酸化后,纤维素黄原酸酯发生水解还原又生成纤维素,伴随着牵引拉伸快速凝固为再生纤维素纤维,即黏胶纤维。但是这种传统方法生产黏胶需要使用CS2,会对环境造成较严重的污染,而且黏胶的生产工艺经过化学变化,纤维中含有有害物质。用这种方法生产再生纤维素在发达国家已经被淘汰。

1.2 铜氨溶液

铜氨(氢氧化铜的氨水溶液,为Cu(NH3)4C(OH)2络合物)也是纤维素的良溶剂[2]。铜氨中的Cu2+可以优先与纤维素吡喃环C2、C3位的羟基形成五元螯合环,破坏纤维素分子内与分子间的氢键,因而纤维素纤维可以溶解在高浓度的铜氨溶液中。如果将纤维素的铜氨溶液喷丝后在水凝固浴中成型,再在硫酸溶液的第二凝固浴中使铜氨纤维素分子化学分解再生出纤维素,称为铜氨人造丝。若在常温下用15%左右的Na OH处理棉纤维,则其长度缩短而直径增大,出现溶胀现象,经拉紧和水洗后,纤维光泽度会增加,且易于染色,这种处理方法称为丝光处理。铜氨再生纤维素具有真丝般的光泽与手感,是一种重要的服装材料。铜氨溶剂的缺点是不稳定,对氧和空气非常敏感。溶解过程中倘若有氧的存在,会使纤维素发生剧烈的氧化降解,损害产品的质量。

1.3 胺氧化合物系列

英国Courtaulds公司开发了一系列胺氧化合物,可以直接溶解纤维素,例如N,N-二甲基乙酰胺/氯化锂(DMAC/Li Cl)和N-甲基吗啉-N-氧化物(NMMO)。

N,N-二甲基乙酰胺/氯化锂(DMAC/Li Cl)多组分溶剂可以很好地溶解纤维素[3],而且在溶解过程中纤维素没有明显的降解现象。一般认为,Li+与DMAC的羰基形成偶极-离子络合物,该络合物阳离子与纤维素羟基中的氧原子作用,而Cl-与纤维素的羟基中的氢原子形成氢键,从而破坏了纤维素分子内和分子间的氢键。Cl-沿纤维素链堆积并与巨阳离子[Li-DMAC]+形成平衡。在该体系中,纤维素分子受到电荷-电荷间排斥和膨胀效应的影响而强行分开,纤维素分子间的缔合受到破坏,直至纤维素完全溶剂化。纤维素的DMAC/Li Cl溶液可以采用水作为凝固剂得到再生纤维素,所得纤维质量较好,高于普通黏胶纤维。但是DMAC/Li Cl溶剂体系溶解范围较窄,且价格昂贵。

N-甲基吗啉-N-氧化物(NMMO)是近年来开发出的新溶剂,可以很好地溶解纤维素[4]。NMMO具有强的偶极性,可以与纤维素上的羟基形成氢键,从而破坏纤维素的分子内和分子间的氢键,因此NMMO作为溶剂可以在加热条件和充分机械搅拌下完全溶解纤维素。该体系用水作凝固剂,溶剂回收简单。此法所得的纤维具有很高的结晶度和取向度,相邻晶胞之间作用力强,所得纤维的强度高(尤其是湿强度高)、尺寸稳定性好,是一种性能优异的新型高性能纤维,被国际人造纤维和合成纤维局命名为Lyocell。该再生纤维具有纤维素纤维手感柔软、悬垂性好、湿强度高、模量高、延伸性好、吸湿性好和穿着舒适等优点,特别适合用作轻薄高档服装面料。但是NMMO的极易被氧化,甚至会发生爆炸,在储存和生产中存在一定的危险性。另外,NMMO价格昂贵,必须使其回收率高于99.5%以上方具有经济价值。但是,苛刻的回收技术和投资巨大的回收设备使得Lyocell纤维的价格居高不下。

1.4 Na OH/尿素水溶液体系

张俐娜等人创建了新的快速溶解纤维素的Na OH/尿素水溶液(7wt%Na OH/12wt%尿素)体系[5],成功地纺出新型纤维素丝。有趣的是,纤维素在室温下不能完全溶解在Na OH/尿素水溶液中,但是将Na OH/尿素水溶液预冷至-12℃~-10℃却可以快速溶解纤维素。张俐娜等人用变温红外光谱和广角X-射线衍射等手段对Na OH/尿素水溶液进行分析,发现Na OH/尿素水溶液在低温下形成了高度稳定的氢键网络结构,创建了新的复合物。通常在Na OH水溶液中,OH-和Na+离子分别以[OH(H2O)n]-和[Na(H2O)]m+形式存在。在室温时,水和缔合水之间的快速交换使[OH(H2O)n]-和[Na(H2O)]m+难以形成和保持新络合物结构。而在低温条件下,慢的交换使缔合离子则容易保持它们的结构。因此,在-12℃时,[OH(H2O)n]-更易于与纤维素链结合形成新的氢键缔合物,导致纤维素分子内和分子间氢键破坏,使纤维素溶解。用同步辐射源广角X-射线衍射和透射电子显微镜对体系进一步进行分析,张俐娜等人认为,低温创建了纤维素分子与溶剂分子间稳定和较大的氢键网络结构,导致大、小分子自组装形成尿素管道包合物。在溶液中尿素水合物形成一层表面“夹套”,将Na OH水合物及纤维素分子链包裹在里面形成管道包合物。这种水溶性包合物不仅把纤维素分子带进水溶液中,而且阻止纤维素分子本身的自聚,从而使纤维素形成分子级分散。Isogai等人[6]研究了纤维素在无水Na OH中的溶解情况,探讨了溶解过程对纤维素分子量、结晶形态以及结晶度的影响。他们对微晶纤维素的溶解过程进行了详细探讨,得到的最佳实验条件为:将微晶纤维素在浓度为8~9wt%的Na OH中充分溶胀后,在-20℃下将其冷冻为固体状,然后在室温下使其解冻,用水调节Na OH的浓度至5wt%,经过这样处理后所研究的所有种类的微晶纤维素均能完全溶解在Na OH中。所得到的再生纤维素既有Ⅱ型纤维素,也有无定形结构。

1.5 离子液体溶剂

国内外的很多科技工作者都投入了大量的精力开发新型纤维素溶剂体系,离子液体的出现有望成为纤维素的一种新型的绿色溶剂[7]。离子液体是由有机阳离子和无机阴离子构成的离子化合物,在室温或室温附近温度下呈液体状态,又称低温熔融盐。与传统有机溶剂、水和超临界流体等相比,具有许多优良的性能,包括:对很多化学物质包括有机物和无机物具有良好的溶解性能;具有较高的离子传导性;热稳定性较高;液态温度范围较宽;极性较高,溶剂化性能较好;几乎不挥发、不氧化、不燃烧;黏度低、热容大;对水和空气均稳定;易回收,可循环使用;设备简单、易于制造。现已发现,多种咪唑型的离子液体对纤维素均有良好的溶解性能,如1-烯丙基-3-甲基咪唑氯盐([amim]Cl)、1-乙基-3-甲基咪唑氯盐([emim]Cl)等[8,9,10]。一般认为,通过溶剂对纤维素大分子间的相互作用,破坏纤维素分子内和分子间存在的大量氢键是使纤维素在溶剂中溶解的前提。以[amim]Cl为例:在加热条件下,离子液体中的离子对发生解离,形成游离的阳离子[amin]+和阴离子Cl-,阴离子Cl-与纤维素大分子链中羟基上的氢原子形成氢键,而游离的阳离子[amin]+与纤维素大分子链中羟基上的氧原子作用,从而破坏了纤维素中原有的氢键,导致纤维素在离子液体中的溶解。纤维素的离子液体溶液具有相当的稳定性。张军等人发现[11],纤维素在[amim]Cl中溶解完全后,得到透明的、琥珀色的溶液。当冷却到室温后,溶液能继续保持液体状态,即使在室温下保存三个月,纤维素也不会析出,纤维素/[amim]Cl溶液也不会发生固化和结晶。由于离子液体[amim]Cl和[bmim]Cl均是亲水性,可以以任意比例与水互溶,因此纤维素的离子液体溶液可以以水为凝固剂进行纤维素的再生,是相当环境友好的制备再生纤维素的方法。此外,当纤维素的浓度超过10wt%后,纤维素/离子液体溶液在偏光显微镜下具有光学各向异性的溶致液晶特征。纤维素的液晶溶液在挤出或流涎工艺过程中,纤维素的刚性分子链容易沿着剪切力的方向取向,从而可以制备超高强度和超高模量的再生纤维素纤维[12]。

2 纤维素的生物质利用

生物质能一直是人类赖以生存的重要能源。随着化石能源短缺和化石燃料所带来严重的环境污染,开发以生物质为重要组成部分的可再生资源已刻不容缓。据估计,到21世纪中叶,采用新技术生产的各种生物质替代燃料将占全世界总能耗的40%以上。充分利用天然纤维素资源,特别是采取生物多级循环利用方式,将丰富的木质纤维素资源高效和洁净地转变为我们所需要的能源,这是解决化石能源短缺的重要途径。太阳能是人类取之不尽、用之不竭的可利用能源,植物利用太阳能合成的天然纤维素,是巨大的可再生资源。而通过生物与化工技术的结合,利用天然纤维素获得人类所需要的能源,则是当今面临的重大战略课题之一。以木质纤维素为原料,利用生物酶工程技术、微生物发酵技术,可以成功地制备乙醇燃料、氢及生物柴油,这方面的研究与发展已引起世界各国的广泛关注[13,14,15]。

2.1 从纤维素制备乙醇

当前燃料乙醇的工业生产主要是由玉米或糖类的生物发酵制得。然而,能用于生产燃料乙醇的粮食是有限的。而植物的秸秆、枝叶等纤维物质是地球上最大的可再生资源,随着人们环境意识的不断增强以及各国政府对环境问题的日益关注,以廉价且来源广泛的天然纤维素类物质生产燃料乙醇具有很大的发展前途[16]。目前,日本等国就是采用农、林产废物等未利用资源直接发酵生产乙醇。

一般,天然纤维素制备乙醇的过程主要包括3个阶段,可由图2表示。首先对原料进行预处理。预处理是指溶解和分离生物质主要成分中的一种和几种:纤维素、半纤维素、木质素和其他可溶性物质。预处理可以降低纤维素的分子质量,打开其密集的晶状结构,以利于进一步的分解和转化。预处理过程中,半纤维素通常直接被水解成单糖(木糖、阿拉伯糖等),剩下的不溶物质主要是纤维素和木质素。其中,利用纤维素制备乙醇是一个研究重点。

通常需经过3个步骤才可以从纤维素制得乙醇:由于天然纤维素原料的结构非常复杂,必须经过处理使其降解成为小分子糖才能被微生物所利用,所以第一阶段需通过物理的、化学的或酶技术将纤维素聚合物降解为单糖;第二阶段是微生物(一般采用酵母)将糖转化为乙醇;第三阶段是通过蒸馏回收乙醇。

早期的研究主要是采用酸法水解糖化纤维素成葡萄糖,然后通过酵母发酵成乙醇。工业中应用较多的酸法水解是在高温和高压下进行稀酸水解,反应时间很短,只需要几秒或几分钟。酸水解的优点是反应速率较快,但存在的问题是酸水解需消耗大量的酸、对反应设备存在腐蚀性且能耗高。

利用微生物对纤维素进行发酵或降解,是大自然处理纤维素的有效方法。例如,在中性和微碱性土壤的表层中,中温好氧性细菌在纤维素的迅速降解过程中起着很大作用。在沤肥和垃圾处理中,高温厌氧纤维素细菌对纤维素的降解起到主要作用,其代谢产物以有机酸和醇类为主。自然界的很多微生物(酵母菌、细菌、霉菌等)都能在无氧的条件下通过发酵分解糖,并从中获取能量[18]。自然界中能发酵产生酒精的微生物很多,作为工业应用的应满足繁殖快、活性高、耐高乙醇浓度及抗杂菌等要求。通过筛选和培育,近年来通过生物工程技术的应用,人们已获得了多种适用的菌种。在美国,酶解纤维素制备乙醇成为当前主要研究方向。酶解法制备乙醇有3种方法,一是直接微生物转化(direct microbial conversion,DMC),这是当前着力研究的一项技术。此项技术利用产纤维素酶的分解菌直接发酵纤维素生产乙醇,将纤维素酶的生产、纤维素酶解糖化、葡萄糖发酵和木糖发酵结合在一个反应器中进行,且只用一种微生物。在此工艺中,原料不需要进行酸解或酶解预处理,设备简单,成本低廉,发酵周期短,不足之处是酒精的产出率不够高。二是间接发酵法,先利用纤维素酶将纤维素分解,然后利用酵母发酵酶解液产生乙醇。此种方法在工艺上要分两步进行,糖化液需要分离收集;三是同步糖化发酵法,就是纤维素酶解过程和酵母的酒精发酵过程同时进行,这种方法酶水解产物葡萄糖能够不断被发酵成乙醇。筛选优良产纤维素酶菌株、探索发酵工艺条件、利用基因工程方法建立降解纤维素高的菌株,是目前纤维素酶解法生产乙醇需要着重研究的内容。

2.2 从纤维素制备氢气

氢是一种理想的清洁能源燃料,具有清洁、高效、环保等特点,在未来的氢能发电、氢燃料电池、氢能电动汽车以及航空航天等领域具有重要用途。与通过热化学分解、电解水和石油裂解等方法获得氢气相比,发酵生物产氢能耗低、产氢反应条件温和,是清洁能源生成、资源再生与可持续发展的良好结合,近年来已经成为能源、环境、化学、生物等多学科交叉和聚焦的热点研究领域。目前,以谷物为原料,用微生物发酵制备乙醇是理想的氢源燃料。这一途径在人少地多的发达国家或许可行,然而从我国的国情出发,则应以木质纤维素类生物质,如农副产品下脚料、农作物秸秆等为主要的制氢原料。由于微生物可降解大分子有机物产氢,使其在生物转化可再生能源物质(纤维素及其降解产物和淀粉等)产氢中显示出其优越性,并且可以与有机废水的处理过程耦联在一起,因此成为未来制氢工业发展的重要方向[19,20]。

产氢生物主要包括光合生物,如厌氧光合细菌、蓝细菌和绿藻,以及非光合生物,如严格的厌氧菌、兼性厌氧菌和好氧细菌[21]。迄今为止,生物制取处理的对象主要为含糖和淀粉类碳水化合物的有机废水,对于含纤维素类生物质的生物制氢,例如农副产品下脚料、农作物秸秆等的生物制取研究则甚少报道。我国是传统的农业大国,生物质资源极为丰富,除少量被用在饲料外,大多被废弃或焚烧,不仅造成资源的浪费,也造成严重的环境污染问题。如能将这些可再生的生物质资源转化为氢能,不仅可以减少由于生物质废弃物的堆积、焚烧所造成的环境污染问题,还可降低人们对于化石矿物燃料等一次性资源的依赖程度。

2.3 从纤维素制备生物柴油

生物柴油燃料又称为“阳光燃料”,是以动植物油脂为原料经过化学酯化反应制得的改性脂肪酸单酯,包括脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯和脂肪酸丙酯等。它具有与从石油中炼制的柴油相似的燃烧特性,故被称为生物柴油。与石油柴油相比,生物柴油具有很多优点,如较好的低温发动机启动性能、较好的润滑性能;燃烧残留物呈微酸性,使发动机机油的使用寿命延长;硫含量低,使得二氧化硫和硫化物的排放低;燃烧后废气中微小颗粒物含量低,不含对环境会造成污染的芳香族烷烃;含氧量高,使其燃烧时排烟量减少;生物分解性高,有利于环境保护。可见,生物柴油是清洁的可再生能源,是一种典型的“绿色能源”,大力发展生物柴油对经济可持续发展,推进能源替代,减轻环境压力,控制城市大气污染具有重要的战略意义。生物柴油产业已经成为新兴的高技术产业。可用于生产生物柴油的动植物油脂来源很广,如蓖麻油、桐油、亚麻油、玉米油、猪油、鱼油、牛油等都可作为原料,但目前生产生物柴油的主要原料是大豆油和菜籽油,采用强碱催化剂由酯交换法制得。据统计,生物柴油制备成本的75%是原料成本。显然,用食用油脂为原料生产生物柴油不符合中国国情,因此采用廉价原料及提高转化率从而降低成本是生物柴油在我国能否实用化的关键。研究发现,某些微生物能在一定条件下将碳水化合物转化为油脂并储存在菌体内。这种油脂主要是由不饱和脂肪酸组成的甘油三酯,是生产生物柴油的潜在原料。微生物油脂的原料可以是工业废弃物,如造纸工业排放的黑废液中含有戊糖和己糖的亚硫酸纸浆、农作物秸秆等。从这些原料中制得的五碳糖和六碳糖糖液可用于微生物发酵的原料,从而获得可以制取生物柴油的微生物油脂。目前,国内外利用天然纤维素原料生物转化生物柴油的研究都处在起步阶段,产油微生物合成油脂的调控机制还有待进一步阐明。

3 结语

随着环境危机的日益加剧和化石能源的逐渐枯竭,天然高分子材料和生物质能源的开发和研究可谓时势所需。作为地球上最丰富的可再生有机资源,纤维素具有绿色、可再生、环境友好等特点。研究和开发以天然纤维素为原料的化工产品已经成为21世纪可持续发展化学工程研究领域的重要课题之一。如何充分发挥纤维素的优点,开发出高附加值的产品,还有许多基础性和应用性的工作有待深入进行。我们期待,纤维素材料将在未来发挥越来越重要的作用。

摘要：纤维素是一类重要的天然高分子聚合物,具有广阔的应用前景。本文综述了纤维素的溶解与再生技术以及纤维素生物质利用技术的新发展。其中,纤维素的溶解与再生包括NaOH/CS2体系、铜氨溶液、胺氧化合物、NaOH/尿素水溶液以及离子液体,综述了各体系溶解与再生纤维素的技术要点与优缺点;生物质能利用包括从纤维素制备乙醇、氢气以及生物柴油。

溶解细菌纤维素的方法 篇4

关键词：甘蔗渣,离子液体,溶解,性能

甘蔗是一种重要的糖料作物, 现广泛种植于热带及亚热带地区。甘蔗渣是甘蔗制糖的主要副产品, 其组分中纤维素占32%~48%、半纤维素19%~24%、木质素23%~32%、灰分约4%[1]。我国作为第3大甘蔗种植国, 年产甘蔗渣达600~650万t[2], 然而由于甘蔗渣的木质化程度较高, 其利用率较低[3]。目前仅有少量甘蔗渣被用作燃烧发电或制浆造纸, 大部分被直接废弃焚烧, 造成了资源浪费和环境污染。近些年国家对农业废弃物综合利用的重视程度不断提高, 开展以甘蔗渣为原料制备生物能源和生物基化学品的研究, 提高其利用程度, 对促进我国甘蔗产业可持续发展、建设资源节约型和环境友好型社会具有重要的意义。

纤维素是甘蔗渣的主要组分, 在生物质转化利用方面具有巨大潜力[4]。但由于天然纤维素复杂的氢键网络结构和较高的结晶度使其不溶于水和多数有机溶剂, 极大地限制了其应用[5]。离子液体作为一种新型的纤维素“绿色溶剂”, 近几年来受到人们广泛关注[6]。离子液体的阴阳离子通过破坏纤维素分子内和分子间氢键, 从而使其溶解[7], 向纤维素/离子液体溶液中加入反溶剂可使纤维素再生沉淀出来。控制溶解和再生条件, 可获得不同形态、结晶结构的再生纤维素, 这些再生纤维素材料在制膜、纺丝、生产无纺布等工业领域具有广阔应用前景[6]。据相关文献[8]报道, 1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐 ([Emim]Ac) 作为一种良好的纤维素溶剂, 具有粘度低、溶解能力强、溶解温度低、对生物催化影响小等优点。与其他阴离子相比, CH3COO-是弱酸的配位碱, 更易于OH-结合, 因此纤维素的溶解速度更快, 溶解浓度更高, 在纤维素溶解加工方面具有很好的应用前景[9]。Frank等[10]研究发现[Emim]Ac对纤维素具有优良的溶解性能, 最高溶解度可达到20%。Handy[11]曾指出含有羧基阴离子的咪唑盐属于绿色和安全的离子液体, 通过毒理评价显示是一类基本无毒的离子液体。本研究选取甘蔗渣纤维素作为原料, 在微波加热下以离子液体[Emim]Ac为溶剂溶解甘蔗渣纤维素, 考察温度对离子液体的剪切黏度以及甘蔗渣纤维素溶解时间、再生得率的影响, 并利用红外光谱 (FT-IR) 、热重分析 (TGA) 、X射线衍射 (XRD) 、扫描电镜 (SEM) 等测试手段对溶解再生前后甘蔗渣纤维素的结构和性能进行分析, 对提高甘蔗废弃物资源利用具有重要意义。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

甘蔗渣, 由广东湛江丰收糖厂提供, 通过稀酸碱脱除木质素和半纤维素[12], 提取甘蔗渣纤维素 (SBC) 。

N-甲基咪唑, 溴代乙烷、乙酸钾、无水甲醇, 均为分析纯。

微波反应器 (Qpro-M型) , 加拿大Questron公司;冷冻干燥机 (FD-1型) , 上海吉众生物科技有限公司;红外光谱分析仪 (Spectrum GXⅠ型) , 美国Perkin-Elmer公司;X衍射仪射线仪 (Rint-Ultima+型) , 日本理学公司;热重分析仪 (STA449C/4/G型) , 德国Netzsch公司;扫描电镜 (S-4800) , 日本HITACHI公司;流变仪 (MarsⅢ型) , 德国HAAKE公司。

1.2 方法

1.2.1 离子液体[Emim]Ac的制备

[Emim]Ac参考相关文献[13]所述方法合成。首先使N-甲基咪唑和溴代乙烷反应生成[Emim]Br, 通过旋转蒸发仪除去挥发性组分。然后以甲醇为溶剂, 使[Emim]Br和乙酸钾在其中进行离子交换反应, 待除去溶剂和未反应组分后得到合成产物[Emim]Ac。

1.2.2 离子液体[Emim]Ac剪切黏度测定

在温度30-100℃之间, 利用旋转流变仪测定[Emim]Ac的剪切粘度。

1.2.3 甘蔗渣纤维素在离子液体[Emim]Ac中的溶解和再生

准确称取1.00g甘蔗渣纤维素与100.00g[Emim]Ac混合均匀, 在微波加热以及磁力搅拌条件下进行溶解。溶解温度分别为60℃、70℃、80℃、90℃、100℃、110℃、120℃、130℃、140℃。利用偏光显微镜观察甘蔗渣纤维素的溶解情况, 待其完全溶解后停止加热并计算溶解时间。将溶液自然冷却后按照溶液与水的体积比为1:5 (v/v) 加入去离子水, 磁力搅拌混合均匀, 离心分离得到再生纤维素, 冷冻干燥后称重, 计算再生得率。

1.2.4 红外光谱分析

利用Spectrum GXⅠ型红外光谱分析仪进行测定, 采用KBr压片法制样, 波数范围选择400~4000cm-1。

1.2.5 X-射线衍射分析

采用日本理学公司的Rint-Ultima+型X衍射仪射线仪测定。测试的技术参数:Cu靶 (Kα, 测定波长λ=0.154nm) , 工作电压40kV, 工作电流20mA, 扫描速度0.04°s-1, 扫描范围为5°~50°。根据Segal公式[14]计算结晶指数:

式中, CrI为结晶指数, I002是最强衍射峰的强度, Iam是无定形区的衍射强度, 对于天然纤维素为2θ接近18°时的衍射强度[15,16]。

1.2.6 扫描电镜分析

采用日本日立公司的S4800场发射扫描电镜观察样品的表面微观形貌。

1.2.7 热重分析

采用STA449C/4/G型热重分析仪上进行, 加热温度范围25-700℃, 升温速率10℃/min。

2 结果与分析

2.1[Emim]Ac结构的红外光谱分析

图1为合成产物[Emim]Ac的红外谱图。由图1可知, 3151cm-1和3085cm-1出现的吸收峰代表了咪唑环上C-H的伸缩振动, 2984cm-1的吸收峰代表了脂肪链C-H的伸缩振动, 1574cm-1的吸收峰代表了基团中C=O和C=N的伸缩振动, 通常C=O的特征吸收峰在1800~1650cm-1, 但由于咪唑环的存在, 导致C=O的特征吸收峰发生了偏移。1086cm-1为C-Br的特征吸收峰, 说明离子交换反应不充分, 少量[Emim]Br残留难以去除。对于[Emim]Ac的红外光谱分析结果与王升泽等[13]的研究结果基本一致。

2.2 温度对[Emim]Ac剪切黏度的影响

在不同温度下测得的[Emim]Ac剪切黏度结果见图2。由图可见, [Emim]Ac的剪切黏度随着温度升高不断降低, 当温度由30℃升高至70℃, [Emim]Ac的剪切黏度由0.0311Pa·s急剧下降至0.0082Pa·s, 这是因为温度升高会导致分子运动增强, 同时也增大了阴阳离子之间的距离, 减弱离子间的相互作用力, 从而导致黏度降低。但温度超过70℃后, 剪切黏度随温度升高而降低的趋势不断减缓。

2.3 温度对纤维素溶解时间和再生得率的影响

图3是甘蔗渣纤维素在[Emim]Ac中溶解时间、再生得率随温度变化的结果。从图3可见, 甘蔗渣纤维素在离子液体中的溶解时间随着溶解温度升高而显著缩短。这是因为, 离子液体的粘度随着温度升高而降低, 因而减小了溶剂进入样品基体的阻滞, 有利于溶剂进入纤维素基质的扩散;此外, 温度升高使分子热运动加速, 增加了离子液体中阴阳离子攻击纤维素氢键的频率和概率, 从而使溶解时间缩短。然而甘蔗渣纤维素的再生得率随温度升高呈现出先上升后下降的趋势, 当温度由60℃升高至100℃, 再生得率从84.96%增加到93.09%, 但温度超过100℃时, 再生得率急剧下降。纤维素溶解于离子液体的过程中会发生一定程度的降解[17], 溶解时间和温度均会影响纤维素的降解作用, 有研究结果[5]表明, 随着温度升高或溶解时间延长, 再生纤维素的聚合度均呈下降趋势。由结果可知, 当温度低于100℃时, 溶解时间是影响纤维素降解的主要因素, 甘蔗渣纤维素的再生得率随着溶解时间缩短而上升;但当温度超过100℃, 温度对纤维素降解作用的影响较大。因此, 甘蔗渣纤维素在[Emim]Ac中的最佳溶解温度为100℃, 此时溶解时间较短且再生得率最高。

2.4甘蔗渣纤维素及再生纤维素红外分析

图4为溶解前后甘蔗渣纤维素的红外谱图。图中位于3383、2899、1113、894cm-1的吸收峰分别代表了纤维素分子中-OH键伸缩振动、-CH键伸缩振动、C-O-C不对称伸缩振动及β-糖苷键的特征峰。这些纤维素的特征信号峰的位置在溶解前后基本相同, 说明溶解再生后纤维素未发生衍生化。再生纤维素的谱线中, 位于1436cm-1处的吸收峰消失, 说明在离子液体[Emim]Ac溶解过程中, 纤维素分子间部分氢键被破坏, 氢键作用减弱。此外, 位于3383cm-1处的吸收峰强度减弱, 也进一步证明离子液体的处理导致纤维素分子中氢键作用减弱[18]。

2.5 甘蔗渣纤维素及再生纤维素XRD分析

图5是离子液体[Emim]Ac溶解前后甘蔗渣纤维素的XRD谱图, 从衍射峰位置来看, 甘蔗渣纤维素在2θ为16°和22°处出现纤维素Ⅰ型的特征峰, 而再生甘蔗渣纤维素在2θ为12°和20°处出现纤维素Ⅱ型的特征峰, 说明经过离子液体处理后甘蔗渣纤维素的晶型结构发生改变。通过Segal公式计算纤维素的结晶指数, 结果表明, 经过离子液体溶解、再生后, 甘蔗渣纤维素的结晶指数由最初的73.34%降至38.26%, 说明离子液体处理导致纤维素分子间氢键作用减弱, 部分结晶区向无定形区转化。

2.6 再生前后甘蔗渣纤维素扫描电镜分析

图6为离子液体[Emim]Ac溶解前后甘蔗渣纤维素的扫描电镜图, 由图6 (a) 可见, 溶解前甘蔗渣纤维素结构紧密, 表面光滑, 基本没有孔隙和裂痕。而图6 (b) 所示, 再生甘蔗渣纤维素表面粗糙, 有大量的孔隙, 并且出现了断层, 说明在溶解过程中, 离子液体渗透入纤维素结构中, 破坏了纤维素原本致密的结构。

2.7 再生前后甘蔗渣纤维素热重分析

通过热重分析方法研究溶解前后蔗渣纤维素的热稳定性, 结果见图7。离子液体处理前, 甘蔗渣纤维素的起始分解温度为331.7, 最大分解温度为351.2℃, 而再生纤维素的起始分解温度和最大分解温度分别降至270.5℃、338.5℃, 这是因为经离子液体处理后甘蔗渣纤维素分子间和分子内氢键被破坏, 从而导致其热稳定性下降。

3 结论

(1) 采用两步法合成了离子液体[Emim]Ac, 并测定其在30~100℃范围内的剪切黏度, 结果表明:随着温度升高, [Emim]Ac剪切黏度显著降低, 但温度超过70℃后, 剪切黏度随温度升高而降低的趋势减缓。

(2) [Emim]Ac在微波加热下溶解甘蔗渣纤维素时, 温度对溶解时间和再生得率的影响较大。当温度低于100℃时, 随着温度升高, 溶解时间缩短, 再生得率提高;但当温度超过100℃, 由于纤维素的降解加剧导致再生得率下降。因此, 最佳溶解温度为100℃。

溶解细菌纤维素的方法 篇5

1资料与方法

1.1 一般资料

我院RRI患儿86例, 均符合1987年4月成都会议判定的RRI诊断标准。其中男46例, 女40例;年龄1～10岁, 中位年龄4岁。随机分为治疗组和对照组各43例。2组一般资料比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。

1.2 方法

治疗前均采集静脉血, 检测免疫球蛋白。2组患儿均给予抗感染药物等常规对症治疗, 在此基础上治疗组每天晨起空腹口服细菌溶解产物胶囊1粒, 每月连服10d后停药20d, 3个月为1个疗程。定期随访观察12个月, 并记录治疗后呼吸道感染的症状、次数、病程及不良反应情况。治疗结束后3个月复查免疫球蛋白。

1.3 疗效判定标准

有效:疗程结束后6个月内反复呼吸道感染次数减少, 发作1～2次, 症状减轻, 病程缩短;无效:疗程结束后6个月内发病次数、症状、病程均未明显改善。

1.4 统计学方法

计数资料以率 (%) 表示, 组间比较采用χ2检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

治疗后, 治疗组有效率为93.0%明显高于对照组的79.1%, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。见表1。

注:与对照组比较, *P<0.05

3讨论

RRI是儿科的常见疾病, 常见于<3岁的儿童, 严重影响儿童的生长发育。因其病情反复发作或迁延不愈, 不仅给患儿带来了很大的痛苦, 同时也增加了家庭的经济负担, 而反复使用抗生素也对患儿的生长发育产生不良影响。小儿RRI与感染、环境等因素及机体免疫功能低下有直接关系[3]。由于患儿免疫功能处于明显低下状态, 所以应注意提高患儿机体细胞的免疫功能, 以提高机体的抗病能力。

儿童时期免疫系统还不够成熟, 血液中各种免疫球蛋白的含量均较低, 特别是IgA及分泌型IgA (S-IgA) , 致使呼吸道黏膜抵抗病毒、细菌或其他病原微生物入侵的能力较差, 从而诱发各种感染[4]。目前, RRI常规抗感染治疗虽被认为是完全适宜的, 但由于病原的基因突变、抗生素的广泛使用等原因, 使耐药菌株数量明显增加, 同时也增加了治疗的难度及抗生素的使用剂量。虽然抗生素只适合于急性感染的治疗, 用以改善症状, 但不会对再次感染产生效果, 需对发生的感染进行预防性治疗。

细菌溶解产物胶囊为8种常见呼吸道细菌 (即流感嗜血杆菌、草绿色链球菌、肺炎克雷伯菌、肺炎双球菌、臭鼻克雷伯菌、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、卡他奈瑟菌) 的冻干溶解物[5]。在人体的实验中, 本品能刺激外周血单核细胞及肺泡巨噬细胞的活性, 加快T淋巴细胞的成熟, 提高唾液分泌型IgA及支气管肺泡灌洗中IgA的水平。细菌溶解产物胶囊是通过刺激黏膜免疫系统的非特异性及特异性免疫而达到上述免疫药理学效果。本文治疗组予以细菌溶解产物胶囊治疗, 取得良好疗效, 且无明显不良反应。

综上所述, 细菌溶解产物胶囊作为口服活性免疫刺激药物可改善RRI患儿免疫系统功能, 有助于小儿RRI的恢复并减少复发。该药口服方便、安全性高且不良反应少, 为临床治疗和预防小儿RRI提供了一种较安全可靠的方法, 值得临床推广应用。

摘要：目的 探讨细菌溶解产物胶囊辅治小儿反复呼吸道感染 (RRI) 的临床疗效。方法 将86例RRI患儿随机分为治疗组和对照组各43例。2组均予常规治疗, 治疗组在常规治疗基础上予细菌溶解产物胶囊治疗。比较2组临床疗效。结果 治疗组有效率为93.0%明显高于对照组的79.1%, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。结论 细菌溶解产物胶囊辅治小儿RRI安全有效, 不良反应少, 值得临床推广应用。

关键词：细菌溶解产物胶囊,呼吸道感染, 反复

参考文献

[1]张会娜, 刘卫红, 李萍, 等.北京市东城区3～6岁儿童反复呼吸道感染影响因素多元回归分析[J].中国妇幼保健, 2009, 24 (15) :2069-2070.

[2]叶国英.泛福舒治疗儿童反复呼吸道感染50例临床观察[J].海峡药学, 2010, 22 (3) :115-116.

[3]张爱启, 张磊, 付姝丽.泛福舒对反复呼吸道感染儿童免疫功能的影响[J].现代生物学进展, 2009, 9 (19) :3690-3691.

[4]廖莹.泛福舒胶囊治疗小儿反复呼吸道感染的疗效观察[J].中国现代医生, 2009, 47 (7) :81-82.

溶解细菌纤维素的方法 篇6

纤维素是自然界中极为丰富的可再生的天然高分子资源[1]。纤维素及其衍生物在纺织、造纸、医药卫生、食品以及涂料工业上有广泛而重要的应用, 对人类社会的进步和发展产生了重要的影响[2,3]。由于其结构的特殊性, 纤维素分子内和分子间存在极强的氢键, 使得其很难溶于水和一般溶剂中, 因此寻找纤维素的新型溶剂成为这方面研究的热点。目前, 研究得较多的纤维素溶剂如NMMO溶剂体系等不同程度地存在不稳定、有毒害、不易回收及价格昂贵等缺点[4,5]。室温离子液体是近年来绿色化学新兴的研究领域之一[6], 其具有溶剂性良好、强极性、不挥发等性能[7], 被认为是一类极具应用前景的环境友好溶剂[8]。咪唑类离子液体在溶解纤维素方面应用较多[9,10,11], 但传统咪唑离子液体存在溶解温度高、溶解度低等缺点。因此, 开发新型纤维素溶剂成为当务之急。

低温共熔溶剂是由能形成熔融混合物的有机物质, 按一定比例混合熔融后冷却, 形成熔点比原料熔点低很多的物体, 其不同于低温熔盐, 但性质与离子液体类似。传统的低温熔盐是由季铵盐和金属盐合成的[12,13,14,15,16], 其熔点虽然比原料低, 但作为溶剂而言还是相对较高, 一般都在100℃以上。本实验用固体有机物尿素、己内酰胺、乙酰胺合成了一系列新型的低温共熔溶剂, 其熔点较低, 在50℃呈液态。低温共熔溶剂在纤维素的溶解方面还未见报道, 本研究可以为寻找或合成纤维素的溶剂提供思路。

1 实验

1.1 实验试剂

尿素、己内酰胺和乙酰胺, 分析纯 (北京化学试剂公司) ;棉浆粕, 工业级 (河北吉藁化纤有限责任公司) 。

1.2 低温共熔溶剂的合成

本研究合成了3种体系低温共熔溶剂:尿素/己内酰胺、尿素/乙酰胺和己内酰胺/乙酰胺。将一定比例的尿素和己内酰胺加入到烧杯中, 慢慢加热搅拌, 待固体完全熔化后自然冷却, 密封, 得到尿素/己内酰胺低温共熔溶剂。整个操作过程在手套箱中进行。其他两种体系的合成方法与尿素/己内酰胺低温共熔溶剂的合成方法相同。

1.3 性能测试

采用显微熔点仪测量低温共熔溶剂熔点;采用DDS-11型 (上海雷磁仪器厂) 电导率仪测定电导率;使用美国BIO-RAD公司生产的FTS-135傅里叶红外光谱仪对制得的低温共熔溶剂进行分析, 采用KBr压片法测定。

1.4 低温共熔溶剂溶解纤维素

取配制好的溶剂固定在加热套中, 温度控制在指定温度。准确称量一定质量纤维素浆粕, 撕碎后分批加入溶剂中, 边搅拌边加入, 直到纤维溶解为止, 计算纤维溶解度。溶解过程中, 每隔10min用玻璃棒蘸取少量纤维混合液样在偏光显微镜下观察并记录浆粕溶解形貌。纤维素溶解度为:

式中:S为纤维素溶解度, m为溶解的纤维素质量 (g) , M为溶剂的质量 (g) 。

1.5 纤维素再生

纤维素溶解一定时间后, 采用离心机对纤维素溶剂进行离心, 转速为12000r/min, 离心15min。取上层透明液体至烧杯中, 取出纤维素热溶液迅速用玻璃棒涂抹在水平放置的玻璃板上, 用另一块玻璃板压在上面, 尽量将气泡赶净。用大量的蒸馏水冲洗浸泡8h后, 抽去模板, 将离子液体洗脱干净后, 自然风干1h, 放入50℃真空干燥箱内干燥24h, 最后将透明的再生纤维素膜置于干燥器中保存待用。

1.6 纤维素溶解再生前后的表征

利用傅里叶红外变换光谱仪, 采用干燥KBr压片, 对再生前后纤维素进行红外测试, 分析其结构变化, 判断其在溶解过程中是否发生了衍生化反应;利用X射线衍射仪对再生前后纤维素进行测试, 分析其晶型变化。

2 结果与讨论

2.1 低温共熔溶剂的熔点

尿素与己内酰胺在不同比例下混合加热后得到一系列新的物质, 对其进行熔点熔程的分析, 经优化和筛选得出, 以尿素和己内酰胺为原料制备的新物质在物质的量比为1∶3时熔点最低, 为30℃ (表1) , 比原料的熔点低很多 (纯组分己内酰胺的熔点为68.0℃, 尿素的熔点为132.5~134.5℃) 。表1中同时给出了其他两个体系形成的低温共熔溶剂的熔点。尿素、乙酰胺和己内酰胺都是极性分子, 它们都是靠氢键规则排列成一定形状的固体。以尿素/己内酰胺低温共熔溶剂为例, 当两者加热混合时, 分子内的氢键被破坏, 尿素与己内酰胺形成新的分子间氢键。尿素与多个己内酰胺分子形成氢键, 氢键键能减小, 分子排列不整齐, 结晶度下降, 导致新体系凝固点降低。即尿素与己内酰胺通过分子间氢键连在一起, 形成新的氢键网状结构, 破坏了原来分子的结晶排列, 形成新的超分子体系, 减弱了原来固体的分子内作用力。理论上, 能形成分子氢键的两种固体有机物都可以合成这类低温共熔溶剂。有机物包括固体醇、固体酮、固体糖、固体胺等。

2.2 电导率

尿素与己内酰胺在最佳配比合成的低温共熔溶剂的电导率随温度的变化曲线如图1所示。

由图1可见, 低温共熔溶剂的电导率在10-4~10-5 S/m数量级, 随温度的升高, 电导率增加。低温共熔溶剂的电导率远低于低温熔盐或离子液体的电导率, 说明其与离子液体不是一类物质, 基本没有离子存在。电导率一般用来表征物质传送电流的能力, 这种能力与带电质点的移动和自由质点的振动有关, 因此, 带电质点的数量和移动的能力会影响电导率。本实验制备的低温共熔溶剂的电导率低, 说明体系中自由移动的带电质点比较少。对于这种体系, 移动的粒子不是单个的离子, 而是形成的超分子和自由分子。超分子的移动导致更大的超分子的形成, 在此过程中, 超分子还可以分解成较小的超分子。因此, 电导率不是由离子引起的, 而是由超分子和自由分子的移动引起的, 所以低共熔溶剂电导率比较低。另外, 从图2中可以看到, 温度与电导率之间的关系符合Arrhenius方程:σ=A·exp[-Ea/ (RT) ]。

2.3 红外光谱分析

图3中己内酰胺的C-H振动峰在2920.4cm-1, C-N的伸缩振动的红外吸收峰出现在1395.0cm-1, C=O振动吸收峰在1671.4cm-1附近。图4中尿素的N-H振动吸收峰在3454.5cm-1和1617.2cm-1附近。对比图3-图5可以看出, 尿素的N-H峰消失, 己内酰胺的C-H振动峰变弱, 己内酰胺的C=O峰从1671.4cm-1移到1649.4cm-1。由此可以推断, 尿素和己内酰胺分子内的氢键消失。

2.4 纤维素的溶解性

从表2可看出, 3种溶剂对纤维素有一定的溶解能力, 但均较小。溶解能力顺序为尿素/己内酰胺>己内酰胺/乙酰胺>尿素/乙酰胺。低温共熔体没有削弱纤维素氢键中阴阳离子的相互作用, 只有与纤维素氢键之间的竞争。低温共熔体除了内部形成的氢键外, 还与纤维素形成氢键, 溶解纤维素, 所以对形成氢键能力和氢键类型进行分析对于理解对纤维素的溶解有重要意义。1个胺基可以形成3个氢键 (氮原子上2个氢原子和氮原子的孤对电子) , 1个羰基氧可以形成2个氢键。1个尿素分子有1个羰基和2个胺基, 可以形成8个氢键。同理, 1个己内酰胺分子可以形成4个氢键, 1个乙酰胺分子可以形成5个氢键。由图6可见, 尿素与己内酰胺之间可以形成3个氢键, 尿素的羰基氧原子还有形成1个氢键的能力, 可以进攻纤维素的羟基进而与纤维素形成氢键, 同时尿素与己内酰胺形成氢键的胺基氮原子上有1个孤对电子, 还可以与纤维素形成氢键, 而尿素的另外一个胺基可以与纤维素形成3个氢键, 则尿素与纤维素总共可以形成5个氢键。图6中乙酰胺与己内酰胺分子之间同样生成3个氢键, 乙酰胺的羰基氧也可与纤维素形成1个氢键, 但是甲基不能形成氢键, 故其与纤维素总共可以形成3个氢键, 不如尿素/己内酰胺形成的氢键个数多, 因此它对纤维素的溶解度不如尿素/己内酰胺大。由图6还可看出, 尿素与乙酰胺间共形成5个氢键, 羰基氧均不能与纤维素形成氢键, 只有尿素的2个胺基与纤维素还可以形成3个氢键, 胺基氮原子形成的氢键不如羰基氧形成的氢键键能强, 所以尿素/乙酰胺不如己内酰胺/乙酰胺对纤维素的溶解度大。根据以上分析, 低温共熔体对纤维素的溶解度取决于其与纤维素形成氢键的个数及氢键的强度, 即与纤维素形成氢键的总键能, 总键能越大, 对纤维素的溶解度越大。即低温共熔体自身形成内部氢键之后剩余形成氢键的能力越强, 对纤维素的溶解度越大。

上述3种共熔体溶剂为酰胺类溶剂, 主要通过其羰基上的氧原子和氨基上的氮原子与纤维素上的羟基形成氢键。由于纤维素分子间的氢键是C3和C6原子上的羟基之间形成的氢键, 所以纤维素在该类溶剂中的溶解就是纤维素羟基间氢键与酰胺-纤维素羟基间氢键的竞争, 较稳定的氢键占上风。该类溶剂能够溶解纤维素, 说明酰胺-纤维素羟基形成的氢键与纤维素分子内或分子间氢键相当或者稍强。虽然低温共熔溶剂可以溶解纤维素但是溶解度并不太大, 只有能与纤维素羟基形成较强氢键的溶剂才对纤维素有较大的溶解度。

2.5 纤维素和再生纤维素结构

2.5.1 IR

纤维素和再生纤维素的红外光谱图如图7所示。从图7中看出, 纤维素与再生纤维素的IR相似, 说明再生纤维素与纤维素有相似的结构。另外, 从图7中还可以看出, 再生纤维素的O-H伸缩振动峰从3400cm-1移动到3413cm-1, 说明再生纤维素中自由羟基 (即没有交联形成氢键的羟基) 增加了;CH2弯曲振动峰从1429cm-1移动到1423cm-1, 在一定程度上说明C6-OH中的氢键发生断裂[17]。

2.5.2 XRD

图8为纤维素和再生纤维素的XRD图。从图8中可以清晰地看到, 纤维素的XRD谱显示典型的纤维素Ⅰ结构, 在15.26°、22.54°和34.64°出现了纤维素Ⅰ晶型的特征峰[18]。纤维素再生后, XRD图在12.36~20.68°出现了一个宽的晶型峰, 说明纤维素结构变成了典型的纤维素Ⅱ结构。

3 结论

用固体有机物尿素、己内酰胺和乙酰胺合成了尿素/己内酰胺、尿素/乙酰胺和己内酰胺/乙酰胺3种体系低共熔溶剂。两种有机物通过分子间氢键连在一起, 破坏了原来分子的结晶排列, 形成新的超分子体系, 减弱了原来固体的分子内作用力, 使得合成的低共熔溶剂的熔点比原料的熔点低很多。

3种溶剂对纤维素有一定的溶解能力, 主要通过其羰基上的氧原子和氨基上的氮原子与纤维素上的羟基形成氢键。溶解能力顺序为尿素/己内酰胺>己内酰胺/乙酰胺>尿素/乙酰胺。纤维素在再生前后有相似的结构, 但晶型从Ⅰ型转变为Ⅱ型。

摘要：对固体有机物尿素、己内酰胺、乙酰胺以不同配比制备的尿素/己内酰胺、尿素/乙酰胺和乙酰胺/己内酰胺3种低温共熔溶剂进行了研究, 并考察了其物理化学性质 (熔点、电导率等) 。结果表明, 随着物质的量比的不同, 低共熔溶剂的熔点不同, 最佳物质的量比分别为1∶3、1∶2和1∶1, 在最佳物质的量比下的熔点分别为30℃、48℃和18℃。低温共熔溶剂的电导率在10-410-5 S/m数量级, 随温度的升高, 电导率增加, 电导率与温度符合Arrhenius方程。IR测试结果显示, 固体有机物各自分子内的氢键消失, 形成了新的氢键。初步探讨了纤维素在3种体系中的溶解性能, 结果显示, 3种溶剂对纤维素有一定的溶解能力。通过分析得出, 该类共熔体溶剂为酰胺类溶剂, 主要通过其羰基上的氧原子和氨基上的氮原子与纤维素上的羟基形成氢键。IR和XRD测试结果表明, 纤维素和再生纤维素有相似的结构, 但纤维素的晶型从Ⅰ型转变为Ⅱ型。

溶解细菌纤维素的方法 篇7

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 牛粪来源

本实验10份新鲜的牛粪样品是从山东农业大学南校区的奶牛场中的10头奶牛中采取的，每份样品大约1 g左右。采取时准确记录了相应奶牛的膘情、毛色与体重。

1.1.2 培养基与试剂

纤维素粉、硫酸镁、氯化钙、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化锌、氯化钴、硫酸氨、磷酸二氢钾、琼脂粉、蒸馏水、普通肉汤、营养琼[1](NA)(均购自上海伯奥生物科技有限公司);蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水按文献方法自制;硝酸盐还原剂、氧化酶试剂、微量生化试验管，药敏纸片(购自杭州天和微生物试剂有限公司)。

1.1.3 仪器及设备

光学显微镜、恒温箱、高压灭菌器、无菌实验台、微量移液器等(由山东农业大学动物科技学院传染病实验室提供)。

1.2 方法

1.2.1 无机盐纤维素琼脂平板培养基的制备

取纤维素粉20 g、硫酸镁0.3 g、氯化钙0.3 g、硫酸亚铁0.005 g、硫酸锰0.004 g、氯化锌0.007 g、氯化钴0.002 g、硫酸氨1.4 g、磷酸二氢钾2.0 g、琼脂粉20 g、蒸馏水1 000 ml混合后用氢氧化钠溶液调pH值8.0，灭菌后制成平板培养基备用。

1.2.2 纤维素分解性细菌的分离培养

以无菌操作的方法，采取少许生理盐水稀释好的牛粪，划线于无机盐纤维素琼脂平板培养基上，37℃培养3～7d，并随时观察记录培养基内的细菌的生长情况，然后进行可疑细菌的分离，最后挑取单个菌落到普通琼脂斜面进行纯培养。与此同时对10份样品进行准确的细菌计数。

1.2.3 形态学观察

取无机盐纤维素琼脂平板培养基的单个菌落涂片，革兰氏染色镜检，观察记录菌体形态和染色特征。

1.2.4 生化鉴定

取微量生化管及各种生化培养基，将分离菌纯培养物的菌种接入后封口，置于37℃培养箱中培养18～24 h，观察结果。

1.2.5 药敏试验

将获得的菌株的菌液，均匀涂抹于营养琼脂平板，每菌株两板，然后将药敏纸片平均分布，37℃培养24 h。按抑菌圈直径大小作为敏感性高低的标准，抑菌圈直径越大表明细菌对该药的敏感性越高。抑菌圈直径15.1～20 mm者为高敏度敏感;直径10.1～15 mm者为中度敏感;直径在10 mm以下者为低度敏感。观察统计抑菌效果。

2 结果

2.1 纤维素分解性细菌的分离培养

在10份牛粪内容物中，有8份分离出纤维分解细菌，分离的阳性率为80%。纤维分解细菌在无机盐纤维素琼脂平板培养基上的生长特性：在恒温培养的第3天，细菌无生长现象，在恒温的第5天，由牛粪内容物堆的周边首先显示出湿润的特性，而后外源逐渐的扩大和增强，浮在培养基表面的纤维素膜也相应变得透明和松软，颜色由浅黄变为深黄，并且越来越鲜艳。第7天后，中心部分颜色变浅，随着整个细菌的生长纤维素膜被完全分解而消失。由于无机盐纤维素琼脂平板培养基上其他细菌不能生长，只有纤维素分解性细菌可以利用其中的营养物质，所以可以确定该细菌就是纤维素分解性细菌。但具体属于哪一个种属还有待于生化试验的进一步确定。

2.2 形态学观察

革兰氏染色后镜检，纤维分解细菌从形态特征、染色特征和分解纤维素的功能上看，可能属于纤维单胞菌属，有时见到细菌的革兰氏阳性的梭菌，革兰氏阳性，偏端芽孢，长约1.5～3.0µm的短小梭菌，多单在，偶有2～3个菌体相连，有芽孢。每ml肉汤培养物约含7×108～4×109CFU (Colong Forming Unit菌落形成单位)。

2.3 生化鉴定

通过分离菌生化试验结果，可以得出该细菌符合纤维单胞菌属中的细胞纤维单胞菌的特征。纤维化纤维单胞菌已被认为是一些分解纤维素细菌的同物异名，在文献中都有不同的报道(结果见表1)。

2.4 药敏试验

贴药敏片的培养基经37℃培养24 h，其中头孢呱哃、氟哌酸、头孢唑啉、丁胺卡那敏感率高，而头孢呋新、青霉素等药物的敏感性较低(结果见表2)。

3 小结与讨论

3.1 关于细菌的筛选

本实验在国内首次使用了无机盐纤维素琼脂平板培养基对牛粪中的纤维素分解性细菌进行分离，由于在此培养基中只有纤维素分解性细菌能够利用其中物质进行存活，所以3～7后从该培养基中所分离的细菌一定是纤维素分解性细菌。

注：抑菌圈直径15.1～20 mm者为高度敏感;直径10.1～15mm者为中度敏感;直径在l0mm以下者为耐药。

3.2 关于该细菌与反刍动物营养的关系

纤维素分解性细菌在牛粪中的存在与分布很普遍，阳性个体非常多。本实验从10份牛粪样品中分离出8份阳性结果，分离率80%。牛粪内容物中纤维分解性细菌的含量多少是和畜体营养膘情有直接关系的。经过初步的观察与分析，牛粪样品中能分离出阳性细菌所代表畜体的营养膘情显然是优良等级的。而分解菌是阴性的所代表畜体的营养膘情显然是瘦弱等级的。而在8份阳性样品中纤维素分解性细菌数目多的畜体的营养膘情显然要好于含菌少的畜体。这种现象的原因机制是纤维素分解性细菌多的反刍动物瘤胃对秸杆类饲草的营养转化率高，从而反刍动物的瘤胃对纤维素的利用效果好，这样的反刍动物的营养膘情一般是优良等级。同样道理反刍动物瘤胃中含此菌少，瘤胃营养转化率就低，那么就会造成动物营养吸收不良，该动物的营养膘情为瘦弱等级。据有关报道：在人工条件下，如果能提高纤维分解菌的生活条件可大大提高该细菌群体对该秸杆类饲草的转化率，使其粗蛋白由5.00%提高到24.62%, 粗脂肪由0.67%提高到12.50%。所以加强这方面开发，在提高反刍动物的生产性能研究中将是一个突破点，具有很好的临床应用前景。

3.3 关于药敏试验

实验结果显示该菌对头孢呱哃、氟哌酸、头孢唑啉、丁胺卡那敏感率高，而对头孢呋新、青霉素、等药物的敏感性较低。从这一结果可以得到启示，反刍动物服用抗生素时，如果头孢呱哃、氟哌酸、头孢唑啉、丁胺卡那类药物服用过多，将会大量杀死该菌，从而阻碍该细菌对纤维素的分解。如果这种情况时间过长，就会造成反刍动物的一些消化系统疾病如消化不良、营养转化障碍等，久而久之就会造成反刍动物的膘情差，以及体质瘦弱等现象。临床上很多反刍动物的消化系统疾病可以用此原因解释，所以在对反刍动物用药前，一定做相关的药敏试验。

摘要：本文主要介绍了牛粪中纤维素分解性细菌的分离筛选、鉴定与临床意义。实验内容包括:到奶牛场随机采取10份粪便作为样品, 然后对其进行细菌学检验以鉴定该细菌、分析该细菌与反刍动物营养的关系, 并进一步对其做了药敏试验鉴定。经鉴定该菌对头孢呱哃、头孢唑啉、氟哌酸、丁胺卡那等药物比较敏感, 长期使用这些药物可能大量杀死该类细菌, 从而引起反刍动物的消化系统疾病。同时本实验还使用无机盐纤维素培养基从牛粪中分离出了此类细菌。该实验的细菌分离方法以及药敏实验的结果在反刍动物的生产实践中具有很好的临床应用前景。

关键词：纤维素分解性细菌,分离筛选,药敏实验,临床意义

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